專利名稱：人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及cDNA文庫(kù)領(lǐng)域，具體涉及一種人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)及制備方法。
背景技術(shù)：
口腔頜面部惡性腫瘤，行手術(shù)切除仍然是目前最重要和最有效的治療手段，而晚期、復(fù)發(fā)或已轉(zhuǎn)移的頭頸癌患者預(yù)后往往很差，據(jù)報(bào)道平均生存期僅6個(gè)月左右，局部復(fù)發(fā)率≥50％，嚴(yán)重威脅人類的生命和健康?；熓悄壳疤岣呋颊呱媛屎蜕尜|(zhì)量的重要手段之一，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在化療藥物的作用下能夠發(fā)生凋亡，但在不同細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡發(fā)生所需的DNA損傷閾值并不相同，受到細(xì)胞遺傳背景的控制，表現(xiàn)出個(gè)體差異。順鉑(cisplatin)是迄今頭頸鱗癌化療方案中最常用藥物之一，44.04％以上的口腔鱗癌標(biāo)本對(duì)順鉑中度以上敏感，高于其它常用藥物如長(zhǎng)春新堿(VCR)，5-Fu，阿霉素(ADM)等。但由于腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，常常導(dǎo)致臨床化療的失敗。根據(jù)上海第二醫(yī)科大學(xué)第九人發(fā)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室的最近統(tǒng)計(jì)資料表明，口腔鱗癌患者對(duì)順鉑的敏感性不到50％，也就是說(shuō)至少有一半以上的患者無(wú)法接受順鉑化療或是不當(dāng)?shù)慕邮芰隧樸K的化療，因此對(duì)口腔鱗癌順鉑耐藥性的研究十分重要。
順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能涉及藥物對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制，細(xì)胞本身對(duì)DNA損傷的識(shí)別、修復(fù)和凋亡等眾多途徑的改變，和大量的基因產(chǎn)物的參與。
以往研究往往期望根據(jù)其中一個(gè)或幾個(gè)基因的變化來(lái)預(yù)測(cè)化療效果，常常導(dǎo)致結(jié)果間的互相矛盾。因?yàn)橐粋€(gè)基因表達(dá)的上調(diào)或者下調(diào)往往會(huì)影響上游和下游幾個(gè)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄的改變，激活不同的信號(hào)途徑，進(jìn)一步引起相關(guān)的更多基因的表達(dá)模式的改變，導(dǎo)致臨床觀察到的藥物作用的復(fù)雜性。由于生物體系的運(yùn)作與蛋白質(zhì)之間的相互作用密不可分，蛋白復(fù)合體幾乎參與了細(xì)胞內(nèi)所有生理過(guò)程，包括DNA復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄激活，蛋白質(zhì)的翻譯、修飾和定位，細(xì)胞周期調(diào)控、代謝等一系列重要的生物過(guò)程。因此，直接在蛋白質(zhì)水平研究順鉑耐藥發(fā)生的機(jī)制具有重要意義。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑耐藥性的產(chǎn)生事實(shí)上涉及到眾多機(jī)制的共同作用，而建立順鉑耐藥相關(guān)基因的表達(dá)文庫(kù)，從中篩選有效的順鉑耐藥性分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)是目前認(rèn)為最有希望的重要途徑之一。采用表達(dá)文庫(kù)的方法，已在一些類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)成功篩選到特異的診治分子，表明利用表達(dá)文庫(kù)的方法尋找腫瘤診治分子是可行的。和其它部位的腫瘤相比，口腔腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)行為具有一定的獨(dú)特性，目前口腔腫瘤，特別是耐藥性相關(guān)的研究進(jìn)行很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是公開(kāi)一種人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)，為深入研究口腔鱗癌順鉑耐藥發(fā)生的機(jī)制、尋找有效的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是公開(kāi)一種制備人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)的方法。
本發(fā)明從人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞中提取mRNA，合成cDNA的第一鏈和第二鏈，獲得cDNA多核苷酸產(chǎn)物，將cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化體，即得人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)。
本發(fā)明一方面提供了一種人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)，優(yōu)選地人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞是傳代細(xì)胞系，更優(yōu)選地是人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113/cisplatin細(xì)胞系。
本發(fā)明另一方面提供了制備人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)的方法，包括如下步驟a)提取人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞mRNA，b)合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物，c)cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。
可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)提取人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞mRNA，如先抽提細(xì)胞總RNA，然后用poly(T)層析純化mRNA。
可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，以oligod(T)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。優(yōu)選地，在合成cDNA第一鏈時(shí)引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列?？梢杂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的PCR技術(shù)擴(kuò)增cDNA多核苷酸產(chǎn)物，優(yōu)選地，采用LD-PCR方法合成并擴(kuò)增cDNA多核苷酸產(chǎn)物，更優(yōu)選地LD-PCR引物為SEQ ID No.3序列和SEQ ID No.4序列。
有多種方法可以將cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。優(yōu)選地采用將載體和cDNA多核苷酸產(chǎn)物共同轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞使它們?cè)诎麅?nèi)同原重組，從而cDNA多核苷酸插入載體。更優(yōu)選地cDNA文庫(kù)插入融合蛋白結(jié)構(gòu)域元件下，從而可以與文庫(kù)蛋白形成融合蛋白。
制備人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)的方法，還包括轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞步驟，有多種方法可以使cDNA文庫(kù)和/或載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，優(yōu)選地采用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法。
根據(jù)需要，受體細(xì)胞可以是細(xì)菌或酵母，優(yōu)選地受體細(xì)胞是酵母。
制備人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA的方法，合成的cDNA多核苷酸產(chǎn)物可以經(jīng)過(guò)純化，提取200bp-5kp的組分插入載體，優(yōu)選地提取500bp-3kp的組分插入載體。
以下結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的有意技術(shù)效果。
人類細(xì)胞基因數(shù)目大約有30000-40000個(gè)左右，其表達(dá)型文庫(kù)理論上講需要約5-10×106個(gè)重組子。本發(fā)明所構(gòu)建的文庫(kù)容量為4×107，基本達(dá)到了要求。該人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)建立后，即可以應(yīng)用誘餌蛋白來(lái)篩選分離目的基因，而一旦發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的分子，就可以很方便地對(duì)其進(jìn)一步分析研究。在選擇合適的靶點(diǎn)蛋白來(lái)篩選該口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)，尋找順鉑耐藥相關(guān)的基因時(shí)，如果能夠同時(shí)比較其在親代細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)中相互作用的蛋白，將會(huì)對(duì)闡明該靶點(diǎn)蛋白在順鉑介導(dǎo)的信號(hào)途徑中的具體作用具有重要意義。
自1989年Fields和Song首次提出采用酵母雙雜交體系來(lái)研究蛋白質(zhì)間的相互作用以來(lái)，酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺(tái)，得到了廣泛的應(yīng)用，成功的檢測(cè)到許多具有相互作用的蛋白質(zhì)，甚至，研究者們還利用這種技術(shù)成功的操縱了一些蛋白質(zhì)之間的相互作用，這種方法也稱為功能篩選。本發(fā)明所建立的人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)，將編碼DNA-AD(DNA激活域)的基因與人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞的cDNA文庫(kù)基因構(gòu)建在同一表達(dá)載體上，在受體細(xì)胞中表達(dá)兩者的融合蛋白AD-Library。當(dāng)其遇到特定的攜帶有BD結(jié)構(gòu)域(DNA結(jié)合域)的蛋白，而兩者之間具有相互作用時(shí)，BD和AD在空間上互相接近，從而形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄因子，激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，從而得以鑒定在人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞內(nèi)與該特定蛋白具有相互作用的一些重要蛋白，并且同時(shí)獲得其基因序列、克隆和蛋白質(zhì)。因此，采用酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞的表達(dá)文庫(kù)，對(duì)從分子水平上研究口腔鱗癌順鉑耐藥發(fā)生的機(jī)理，尋找有價(jià)值的分子標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。
本發(fā)明采用PCR技術(shù)尤其采用LD-PCR技術(shù)進(jìn)行人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA的合成擴(kuò)增，可以保證一些稀有cDNA片斷被擴(kuò)增，因而擴(kuò)增片斷具有很高的代表性，這有利于文庫(kù)的篩選和鑒定。如實(shí)施例二所述，隨機(jī)挑選的cDNA文庫(kù)的7個(gè)克隆鑒定結(jié)果，插入片斷大小范圍約為500bp-3kb，且多集中在1kb左右，如圖4。插入片斷的測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)(Genebank)進(jìn)行比對(duì)分析，分別與gi13435962，gi22760187，gi27526476，gi31873609，gi12862475，gi5531804，gi34782763基因序列99％-100％一致。實(shí)施例三對(duì)其在酵母AH109內(nèi)翻譯蛋白質(zhì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，這7個(gè)序列均能在AH109內(nèi)表達(dá)出蛋白產(chǎn)物，且具有HA的融合標(biāo)簽，如圖5所示。
以下結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。


圖1為人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113細(xì)胞總RNA1％瓊脂.糖電泳結(jié)果，A為rRNA電泳結(jié)果，分別為28SrRNA及18SrRNA條帶，其中，28SrRNA較18SrRNA明亮，說(shuō)明總RNA的完整性較好；B為純化后的mRNA電泳結(jié)果，為從加樣孔至28SrRNA至18SrRNA的彌散條帶，其中，28SrRNA及18SrRNA隱約可見(jiàn)。
圖2為人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113細(xì)胞cDNA的LD-PCR產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，可見(jiàn)500bp至3Kb之間的彌散條帶。上樣量為每泳道7μl PCR產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖3為pGADT7-Rec-Library示意圖，LD-PCR產(chǎn)物經(jīng)兩端的SMARTIII和CDSIII序列與線性化的pGADT7質(zhì)粒在酵母AH109內(nèi)同源重組，成為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
圖4為cDNA文庫(kù)插入片斷入鑒定結(jié)果，隨機(jī)挑選的7個(gè)克隆，抽取重組質(zhì)粒，對(duì)插入片斷行LD-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其插入片斷為從500bp-3Kb大小不等的片斷，多集中在1Kb左右。
圖5為cDNA文庫(kù)蛋白產(chǎn)物鑒定結(jié)果，隨機(jī)挑選7個(gè)克隆，提取AH109總蛋白，anti-HA行WesternBlot檢測(cè)結(jié)果，可見(jiàn)每個(gè)克隆中均有HA融合蛋白表達(dá)。
圖6為克隆6在基因庫(kù)中比對(duì)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一，人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建本實(shí)施例的步驟如下1.人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113細(xì)胞的培養(yǎng)人舌口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113/cisplatin傳代細(xì)胞系由上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物學(xué)室驗(yàn)室建系并保存。
人舌口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113/cisplatin傳代細(xì)胞系于含10％小牛血清的RMPI1640中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃、5％CO2，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)大約為3×107。
2.細(xì)胞總RNA提取按照Invitrogen公司的TrizolTM試劑總RNA提取操作指南，從細(xì)胞中提取總RNA。按照Qiagen公司Mini-Rneasy分離試劑盒說(shuō)明書進(jìn)一步純化RNA?？捎梅止夤舛扔?jì)測(cè)定總RNA的得率。紫外燈下鑒定RNA的質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)28S條帶清晰、亮度約為18S兩倍，沒(méi)有明顯的5S條帶，見(jiàn)附圖1A為人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113細(xì)胞總RNA1％瓊脂糖電泳結(jié)果，A為rRNA電泳結(jié)果，分別為28SrRNA及18SrRNA條帶，其中，28SrRNA較18SrRNA明亮，說(shuō)明總RNA的完整性較好。
3.純化mRNA按照Qiagen公司mRNA純化試劑盒操作指南從總RNA中純化mRNA，電泳檢測(cè)mRNA的質(zhì)量，附圖1B為純化后的mRNA電泳結(jié)果，為從加樣孔至28SrRNA至18SrRNA的彌散條帶，其中，28SrRNA及18SrRNA隱約可見(jiàn)。
4.cDNA雙鏈合成與純化按照clontech公司cDNA文庫(kù)構(gòu)建和篩選試劑盒(cDNAlibrary construction and screening kit)說(shuō)明書推薦的方法，用Oligo d(T)作為反轉(zhuǎn)錄引物，反應(yīng)體系中加入SMARTIII和CDSIII序列，利用模板轉(zhuǎn)換，在反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈的同時(shí)分別引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列。采用LD-PCR的方法，利用引入的SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列序列，設(shè)計(jì)SEQ ID No.3序列和SEQ ID No.4序列的引物，擴(kuò)增cDNA，循環(huán)數(shù)為24。如圖2為人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113細(xì)胞cDNA的LD-PCR產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，可見(jiàn)500bp至3Kb之間的彌散條帶。上樣量為每泳道7μl PCR產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。取7μl產(chǎn)物在1％瓊脂糖上電泳鑒定cDNA多核苷酸產(chǎn)物的質(zhì)量。電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片斷大小集中于500bp-3kb之間。隨后，產(chǎn)物采用CHROMA SPIN+TE-400柱子純化，去除200bp以下的產(chǎn)物及反應(yīng)體系中殘留的一些引物片段。
5.感受態(tài)細(xì)胞的制備宿主細(xì)胞為酵母AH109，從YPDA培養(yǎng)板上挑選新鮮的，直徑在2-4mm的AH109克隆，在新鮮配置的YPDA培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)，至OD600＝0.8左右，收集酵母細(xì)胞，用乙酸鋰法制備感受態(tài)細(xì)胞。
6.cDNA文庫(kù)構(gòu)建將純化后的cDNA多核苷酸產(chǎn)物和線性化的pGADT7-Rec同時(shí)轉(zhuǎn)入AH109的感受態(tài)細(xì)胞中，雙鏈cDNA和pGADT7-Rec在AH109內(nèi)經(jīng)SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列進(jìn)行同源重組，形成pGADT7-Rec-Library閉環(huán)結(jié)構(gòu)，如附圖3為pGADT7-Rec-Library示意圖，LD-PCR產(chǎn)物經(jīng)兩端的SMARTIII和CDSIII序列與線性化的pGADT7質(zhì)粒在酵母AH109內(nèi)同源重組，成為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在SD/-Leu培養(yǎng)板上倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，至克隆長(zhǎng)出，篩選含重組質(zhì)粒的AH109，最終AH109酵母的轉(zhuǎn)化效率為1×106轉(zhuǎn)化體/3μg pGADT7-Rec。在4℃預(yù)冷平板，加入預(yù)冷的凍存液，收集所有平板上的克隆，混勻，分裝成1ml，-80℃凍存。取100μl凍存文庫(kù)，分別稀釋100，1000，10000倍，取100μl涂板于SD/-Leu，30℃倒置培養(yǎng)至克隆長(zhǎng)出。計(jì)數(shù)長(zhǎng)出的克隆數(shù)(cfu)。文庫(kù)大小為4×107cfu/ml。
實(shí)施例二 文庫(kù)鑒定從SD/-Leu培養(yǎng)板上隨機(jī)挑選7個(gè)克隆，接種于10mlSD/-Leu培養(yǎng)液中，30℃震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，收集培養(yǎng)物，使用lyticase破壁，酚、氯仿抽提質(zhì)粒，采用Taqara公司的Ex-premix對(duì)插入片斷進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃，30秒；68℃，5分鐘；30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增用上游引物為SEQ ID No.5，下游引物為SEQ IDNo.6。產(chǎn)物6μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察插入片斷大小。同時(shí)測(cè)序，測(cè)序引物為SEQ ID No.5，測(cè)序結(jié)果在基因庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。如附圖4為cDNA文庫(kù)插入片斷之鑒定結(jié)果，隨機(jī)挑選的7個(gè)克隆，抽取重組質(zhì)粒，對(duì)插入片斷行LD-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其插入片斷為從500bp-3Kb大小不等的片斷，多集中在1Kb左右。測(cè)序結(jié)果分別與gi13435962，gi22760187，gi27526476，gi31873609，gi12862475，gi5531804，gi34782763基因序列99％-100％一致，附圖6為克隆6在基因庫(kù)中比對(duì)結(jié)果。顯示了6號(hào)克隆的文庫(kù)基因序列與基因庫(kù)的比對(duì)結(jié)果。
實(shí)施例三 蛋白產(chǎn)物鑒定常規(guī)Western Blotting，利用pGADT7-Rec提供的融合蛋白標(biāo)簽HA，采用Anti-HA多抗(Clonetech)，對(duì)AH109蛋白產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。2×SDS Loading Buffer酵母蛋白裂解產(chǎn)物，于10％SDS-PAGE上進(jìn)行分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，7.5％Blotto過(guò)夜封閉，anti-HA一抗孵育1小時(shí)，PBST洗膜3×5分鐘，HRP標(biāo)記的二抗孵育1小時(shí)，PBST洗膜3×5分鐘，ECL發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果表明，這7個(gè)序列均能在AH109內(nèi)表達(dá)出蛋白產(chǎn)物，且具有HA的融合標(biāo)簽，如附圖5為cDNA文庫(kù)蛋白產(chǎn)物鑒定結(jié)果，隨機(jī)挑選7個(gè)克隆，提取AH109總蛋白，anti-HA行WesternBlot檢測(cè)結(jié)果，可見(jiàn)每個(gè)克隆中均有HA融合蛋白表達(dá)。
序列表<110>上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院<120>一種人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)及制備方法<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>59<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>1attctagagg ccgaggcggc cgacatgttt tttttttttt tttttttttt tttttttvn 59<210>2<211>39<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物
<400>2aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt atggccggg 39<210>3<211>39<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>3gtatcgatgc ccaccctcta gaggccgagg cggccgaca 39<210>4<211>33<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>4ttccacccaa gcagtggtat caacgcagag tgg 33
<210>5<211>33<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>5ctattcgatg atgaagatac cccaccaaac cca 33<210>6<211>27<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>6ttgcggggtt tttcagtatc tacgatt 2權(quán)利要求
1.一種人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA文庫(kù)，其特征在于該文庫(kù)是從人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113/cisplatin細(xì)胞系制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的cDNA文庫(kù)其特征在于該文庫(kù)基因片斷為500bp-3kb。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3之一所述的cDNA文庫(kù)的制備方法，其特征在于包括如下步驟a)提取人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞mRNA，b)合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物，c)cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的cDNA文庫(kù)的制備方法，其特征在于，在合成cDNA第一鏈時(shí)引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列，用PCR技術(shù)擴(kuò)增cDNA多核苷酸產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的cDNA文庫(kù)的制備方法，其特征在于用LD-PCR方法擴(kuò)增cDNA多核苷酸產(chǎn)物，引物為SEQ ID No.3序列和SEQ ID No.4序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的cDNA文庫(kù)的制備方法，其特征在于cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體融合蛋白結(jié)構(gòu)域元件下。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的cDNA文庫(kù)的制備方法，其特征在于通過(guò)將載體和cDNA多核苷酸產(chǎn)物共同轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞使在胞內(nèi)同源重組，從而cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的cDNA文庫(kù)的制備方法，其特征在于通過(guò)將載體和cDNA多核苷酸產(chǎn)物共同轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞使在胞內(nèi)同源重組，從而使cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體融合蛋白結(jié)構(gòu)域元件下。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3之一所述的cDNA文庫(kù)基因的載體或轉(zhuǎn)化體。
全文摘要
本發(fā)明涉及cDNA文庫(kù)領(lǐng)域，具體涉及一種人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)及制備方法。本發(fā)明人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)是從人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113/cisplatin細(xì)胞系制備的，其制備方法依序?yàn)樘崛∪丝谇击[癌順鉑耐藥細(xì)胞mRNA、合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物、cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。本發(fā)明公開(kāi)了一種人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)，為深入研究口腔鱗癌順鉑耐藥發(fā)生的機(jī)制、尋找有效的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)；公開(kāi)了一種制備人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫(kù)的有效方法；對(duì)從分子水平上研究口腔鱗癌順鉑耐藥發(fā)生的機(jī)理，尋找有價(jià)值的分子標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1648251SQ20041005393
公開(kāi)日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者張萍, 周曉健, 陳萬(wàn)濤, 徐骎, 李金忠, 邱蔚六 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院