專利名稱：：細(xì)胞因子il－24真核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子免疫學(xué)和腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，同時(shí)還涉及其表達(dá)的重組細(xì)胞因子IL-24在治療肝癌、小腸癌、黑色素瘤中的用途。
背景技術(shù)：
：白細(xì)胞介素24(Interleukin-24，IL-24)是2002年剛發(fā)現(xiàn)和確定的一種新的細(xì)胞因子(CaudellEG，MummJB，PoindexterN，EkmekciogluS，MhashilarAM，YangXH，RetterMW，HillP，ChadaS，GrimmEA.Theproteinproductofthetumorsuppressorgene，melanomadifferentiation-associatedgene7，exhibitsimmunostimulatoryactivityandisdesignatedIL-24.JImmunol.2002，168(12)6041-6；章曉聯(lián)，汪付兵，新型細(xì)胞因子IL-24及其前景，細(xì)胞及分子免疫學(xué)雜志2003，19(5)，S20-S22.)。IL-24屬于IL-10細(xì)胞因子家族(WolkK，KunzS，AsadullahK，SabatR.CuttingedgeimmunecellsassoucesandtargetsoftheIL-10familymembersJImmunol.2002，168(11)5397-402.)。人的IL-24原先被命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因-7(melanomadifferentiation-associatedgene-7，mda-7)(CaudellEG，MummJB，PoindexterN，EkmekciogluS，MhashilarAM，YangXH，RetterMW，HillP，ChadaS，GrimmEA.Theproteinproductofthetumorsuppressorgene，melanomadifferentiation-associatedgene7，exhibitsimmunostimulatoryactivityandisdesignatedIL-24.JImmunol.2002，168(12)6041-6.)。構(gòu)建的Mda-7腺病毒缺陷病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至多種腫瘤細(xì)胞，可抑制腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡(MhashilkarAM，SchrockRD，HindiM，LiaoJ，SiegerK，KouroumaF，Zou-YangXH，OnishiE，TakhO，etal.Melanomadifferentiationassociatedgene-7(mda-7)anovelanti-tumorgeneforcancergenetherapy.2001，7(4)271-82；SarkarD，SuZZ，LebedevaIV，SauaneM，GopalkrishnanRV，ValerieK，DentP，andFisherPB.mda-7(IL-24)mediatesselectiveapoptosisinhumanmelanomacellsbyinducingthecoordinatedoverexpressionoftheGADDfamilyofgenesbymeansofp38MAPK.ProcNatlAcadSciUSA.2002，99(15)10054-9)，如可導(dǎo)致和誘導(dǎo)黑色素瘤(HuangEY，MadireddiMT，GopalkrishnanRV，etal.Genomicstructure，chromosomallocalizationandexpressionprofileofanovelmelanomadifferentiationassociated(mda-7)genewithcancerspecificgrowthsuppressingandapoptosisinducingproperties.Oncogene2001，207051-63)，乳腺癌(SuZZ，MadireddiMT，LinJJ，YoungCS，KitadaS，ReedJC，GoldsteinNI，F(xiàn)isherPB.Thecancergrowthsuppressorgenemda-7selectivelyinducesapoptosisinhumanbreastcancercellsandinhibitstumorgrowthinnudemice.ProcNatlAcadSciUSA.1998，95(24)14400-5)，肺癌(SaekiT，MhashilkarA，SwansonX，Zou-YangXH，SiegerK，KawabeS，BranchCD，ZumsteinL，MeynRE，RothJA，ChadaSandRameshR.Inhibitionofhumanlungcancergrowthfollowingadenovirus-mediatedmda-7geneexpressioninvivo.Oncogene.2002，21(29)4558-66)和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(SaekiT，MhashilkarA，ChadaS，BranchC，RothJA，RameshR.Tumor-supressiveeffectsbyadenovirus-mediatedmda-7genetransferinnon-smallcelllungcancercellinvitro.GeneTher.2000，7(23)2051-7.)，宮頸癌細(xì)胞，神經(jīng)多形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，骨肉瘤，腸癌，鼻咽癌，前列腺癌和胰腺癌(SuZZ，MadireddiMT，LinJJ，YoungCS，KitadaS，ReedJC，GoldsteinNI，F(xiàn)isherPB.Thecancergrowthsuppressorgenemda-7selectivelyinducesapoptosisinhumanbreastcancercellsandinhibitstumorgrowthinnudemice.ProcNatlAcadSciUSA.1998，95(24)14400-5)等多達(dá)50種腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。但是IL-24對(duì)肝癌、小腸癌治療作用的研究還未見報(bào)道。由于mda是一種小分子量糖蛋白，其結(jié)構(gòu)的相似性，序列的同源性以及具有細(xì)胞因子樣特征，可以以自分泌和旁分泌方式發(fā)揮作用，因而最近Mda-7被HUGOGGeneNomenclatureCommittee同意命名為一種新的細(xì)胞因子，為IL-24，重組的IL-24可作為一種新的有希望的特異性的抗癌癥新藥，已成為國際上抗腫瘤領(lǐng)域中基因治療研究的熱點(diǎn)。1.IL-24的發(fā)現(xiàn)，基因和分子結(jié)構(gòu)人的IL-24，即mda-7，最先于1995年從人的黑色素瘤H0-1細(xì)胞中分離得到克隆。mda-7在正常的黑色素細(xì)胞中以及黑色瘤早期階段均有表達(dá)，但在黑色素瘤晚期階段以及轉(zhuǎn)移灶中的黑色素瘤細(xì)胞中卻難以檢測(cè)到其表達(dá)。給予黑色素瘤細(xì)胞IFNβ+MEZ(一種PKC誘導(dǎo)劑)(JiangH，SuZ-Z，BoydJ，F(xiàn)isherPB.Geneexpressionchangesassociatedwithreversiblegrowthsuppressionandtheinductionofter分鐘aldifferentiationinhumanmelanomacells.MolCellDiffer1993，141-66)聯(lián)合治療，其結(jié)果抑制了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)和增強(qiáng)了mda-7表達(dá)。mda-7在組織和細(xì)胞中的表達(dá)有一定的局限性，Northernblotting分析表明mda-7在人的免疫系統(tǒng)正常組織和細(xì)胞(包括脾臟、胸腺、外周血細(xì)胞)及正常的黑色素細(xì)胞可以表達(dá)。通過對(duì)大量的正常細(xì)胞和癌細(xì)胞分析可知，mda-7不是組成性表達(dá)，而是誘導(dǎo)性表達(dá)(正常的黑色素細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞例外，為組成性表達(dá))，激活的NK細(xì)胞和T細(xì)胞、在LPS、PHA和IL-4刺激作用下的外周血細(xì)胞都有表達(dá)。大鼠的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞在LPS/IL-4和流感病毒A/DR/8作用下亦可表達(dá)mda-7。編碼IL-24/mda-7的基因座位于1q32+2，200kb大小，IL-10、IL-19、IL-20三個(gè)基因座亦位于這個(gè)區(qū)域(DumoutierL，LeemansC，LejeuneD，KotentkoSV，RenauldJC，CuttingedgeSTATactivationbyIL-19，IL-20andmda-7throughIL-20receptorcomplexesoftwotypes.JImmunol2001，1673545-9)。IL-19、IL-20、IL-24基因序列是一致的頭尾方向，而IL-10卻反向，朝向端粒。編碼IL-24/mda-7的基因結(jié)構(gòu)組成如下七個(gè)外顯子，六個(gè)內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)位于5`端的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，3`端富含AU，帶有polyA信號(hào)肽。這些外顯子和內(nèi)含子在進(jìn)化上有一定程度的保守性。IL-24/mda-7啟動(dòng)子區(qū)域從人胎盤基因文庫中已被分離并鑒定，有報(bào)道稱，AP-1、C/EBP轉(zhuǎn)錄因子有助于mda-7啟動(dòng)子激活并可顯著增強(qiáng)mda-7在黑色素瘤分化中的表達(dá)。IL-24/mda-7的mRNA約2kb，其表達(dá)的蛋白23.8KD，由206個(gè)氨基酸組成。通過Prosite數(shù)據(jù)庫對(duì)其多肽分析結(jié)果如下N-糖基化位點(diǎn)位于85、99、126，6個(gè)磷酸化位點(diǎn)分別在101、111、161、88、133和161，IL-10信號(hào)啟動(dòng)區(qū)在101，49個(gè)氨基酸的信號(hào)肽及其粘著位點(diǎn)在49、50。該信號(hào)肽在蛋白分泌及與相應(yīng)受體結(jié)合激活信號(hào)信道中起作用。2.IL-24的受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-24等IL-10細(xì)胞因子家族，它們的受體屬于II型細(xì)胞因子受體家族。該家族受體結(jié)構(gòu)可分為胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域。它們的胞外域同源性低，胞內(nèi)域、跨膜域無明顯同源性，但胞外域有保守氨基酸殘基存在。IL-24/mda-7的受體為異源二聚體，由R1/R2兩個(gè)亞單位組成，它們分別為IL-20R2/IL-20R1及IL-20R2/IL-22R1(SchaeferG，VenkataramanC，SchindlerU.CuttingedgeFISP(IL-4-inducedsecretedprotein)，anovelcytokine-likemoleculesecretedbyTh2cells.JImmunol2001，1665859-63)。IL-24/mda-7與IL-20、IL-19共用這兩個(gè)受體復(fù)合物。Northernblotting分析表明IL-22R2在正常的肝臟、腎臟、腸、胰腺組織中有較高表達(dá)，在腎上腺、肺、子宮組織中表達(dá)低下。幾個(gè)實(shí)體瘤組成性表達(dá)IL-22R1mRNA，包括結(jié)腸直腸腺癌SW480、肺癌A549、黑色素瘤G361、肝細(xì)胞癌HEPG2、腎癌Cuki-1和TK-10細(xì)胞系、HaCaT膠質(zhì)細(xì)胞系。RT-PCR分析可知IL-20R1在皮膚、睪丸、心臟、胎盤、唾液腺、前列腺中有較高表達(dá)，而在腦、肺、胃、胰腺、卵巢、子宮、甲狀腺、腎上腺中等量表達(dá)，在腎臟、肝臟、結(jié)腸、肌肉、小腸幾乎檢測(cè)不到。IL-20R2在皮膚、睪丸高表達(dá)，在卵巢中等量表達(dá)，在心臟、肺、肌肉、胎盤、腎上腺低表達(dá)，在小腸、唾液腺、外周血白細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到。編碼IL-20R1的基因座位于6號(hào)染色體，IL-20R2位于3號(hào)染色體，IL-22R1位于1號(hào)染色體。它們的基因結(jié)構(gòu)組成如下7個(gè)外顯子，6個(gè)內(nèi)含子，exon1編碼5’-UTR和信號(hào)肽，胞外域由exon2、3、4、5和部分exon6編碼，另外部分exon6編碼跨膜域和胞內(nèi)域起始部分，exon7編碼胞內(nèi)域其余部分和3’-UTR。這些外顯子和內(nèi)含子具有一定的保守性。IL-24/mda-7與R1/R2兩亞單位都結(jié)合后，激活Jack-stats信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。R1與Jakl作用，負(fù)責(zé)磷酸化胞內(nèi)域有關(guān)位點(diǎn)，招募各種信號(hào)分子；R2亞單位胞內(nèi)域較短，它與Tyk2作用。Stat3在Stat信號(hào)分子激活中占主導(dǎo)地位，stat1也可被IL-24/mda-7激活。3.IL-24作用特點(diǎn)及生物活性IL-24/mda-7與IL-10結(jié)構(gòu)相似、氨基酸同源，生物效應(yīng)卻有顯著區(qū)別。IL-10作為炎癥因子，在抗感染中有重要作用。根據(jù)目前的研究，IL-24由于其選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在抗腫瘤方面有很好的應(yīng)用前景(MhashilkarAM，SchrockRD，HindiM，LiaoJ，SiegerK，KouroumaF，Zou-YangXH，OnishiE，TakhO，etal.Melanomadifferentiationassociatedgene-7(mda-7)anovelanti-tumorgeneforcancergenetherapy.2001，7(4)271-82)。IL-24作為細(xì)胞因子，它在免疫系統(tǒng)中的功能(CaudellEG，MummJB，PoindexterN，EkmekciogluS，MhashilarAM，YangXH，RetterMW，HillP，ChadaS，GrimmEA.Theproteinproductofthetumorsuppressorgene，melanomadifferentiation-associatedgene7，exhibitsimmunostimulatoryactivityandisdesignatedIL-24.JImmunol.2002，168(12)6041-6.)主要體現(xiàn)如下外周血白細(xì)胞在LPS等刺激作用下，分泌產(chǎn)生mda-7；mda-7亦可以誘導(dǎo)外周血細(xì)胞分泌產(chǎn)生高水平的IL-6、TNF-2、IFN-γ以及低水平的IL-1β、IL-1、GM-CSF。IL-10可以抑制mda-7誘導(dǎo)外周血白細(xì)胞產(chǎn)生上述細(xì)胞因子，mda-7與IL-10具有一定對(duì)抗作用。4.IL-24與抗腫瘤腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是分化不正常，“誘導(dǎo)分化”治療可以使腫瘤細(xì)胞失去或降低增殖能力和潛在致癌性。給予晚期黑色素瘤細(xì)胞聯(lián)合治療。(IFN-β+MEZ)，其結(jié)果抑制了癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其終末分化，促進(jìn)瘤細(xì)胞凋亡。通過消減交法，從黑色素瘤細(xì)胞中分離克隆出mda-7基因。以腺病毒為載體轉(zhuǎn)導(dǎo)其它腫瘤細(xì)胞，過量表達(dá)的mda-7的“不可逆的抑制生長(zhǎng)，誘導(dǎo)終末分化，促進(jìn)凋亡”的生物功能同樣得到體現(xiàn)。mda-7作為一個(gè)生長(zhǎng)抑制基因，選擇性抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，使其成為抗腫瘤基因治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，為數(shù)不少的研究報(bào)道認(rèn)為，mda-7將為基因抗癌帶來新希望。4.1IL-24抗腫瘤特點(diǎn)(1)劑量依賴性IL-24抑制瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與其劑量呈正比例相關(guān)性。(2)抗瘤譜廣過量表達(dá)的mda-7在較大范圍內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其分化，包括如下腫瘤細(xì)胞黑色素瘤、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、鼻咽癌、骨肉瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。(3)毒副作用小mda-7抗腫瘤的顯著特點(diǎn)是對(duì)親本的正常細(xì)胞不產(chǎn)生影響，這個(gè)機(jī)制目前還不大清楚，研究者觀察顯示mda-7僅有輕微的毒性，未給癌癥患者帶來很大不適。目前，Ad-mda-7已進(jìn)入臨床II期試驗(yàn)階段。(4)不依賴于P53或RbAd-mda-7轉(zhuǎn)染野生型P53、突變型P53、無P53的乳腺癌細(xì)胞均抑制瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡。Ad-mda-7轉(zhuǎn)染突變型Rb及無Rb的前列腺癌Du-145細(xì)胞，得到上述同樣結(jié)果。4.2可能存在抗瘤機(jī)制(1)PKR(double-strandedRNA-dependentproteinkinase)Ad-mda-7可以誘導(dǎo)和激活dsRNA依賴的PKR(PataerA，VorburgerSA，BarberGN，etal.Adenoviraltransferofthemelanomadifferentiation-associatedgene-7(mda-7)inducesapoptosisoflungcancercellsviaup-regulationofthedouble-strandedRNA-dependentproteinkinase(PKR).CancerRes2002，622239-4)，PKR激活后導(dǎo)致下游靶分子包括eIF-2α，Tyk2、stat1、stat3和p38MAPK磷酸化，PKR上調(diào)Ad-mda-7誘導(dǎo)凋亡。若用2氨基嘌呤(絲氨酸/酪氨酸激酶抑制劑)抑制PKR激活或eIF-2α磷酸化，則Ad-mda-7的誘導(dǎo)凋亡也被抑制。若缺失PKR，則抵制Ad-mda-7誘導(dǎo)凋亡。這些結(jié)果說明激活的PKR和它下游的靶分子是Ad-mda-7誘導(dǎo)凋亡不可缺少的組成部分。(2)GADD(growtharrestandDNAdamage，生長(zhǎng)阻斷和DNA損傷)家族GADDs是一組具有協(xié)同調(diào)控，結(jié)構(gòu)不相關(guān)的基因，包括GADD34、GADD45α、GADD45β、GADD45γ、GADD153。這一組應(yīng)激反應(yīng)分子，可以被如下因素激活紫外線照射、化學(xué)致癌劑、TNF-α、抗Fas-Ab等。GADDs可以誘導(dǎo)凋亡或抑制生長(zhǎng)，單獨(dú)效應(yīng)同樣存在，聯(lián)合表達(dá)協(xié)同抗增殖。目前研究證實(shí)Ad-mda-7轉(zhuǎn)染黑色素瘤不同細(xì)胞系(非正常永生的FM516細(xì)胞)，GADDs的mRNA和蛋白均被上調(diào)表達(dá)。同樣的現(xiàn)象在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌亦存在。當(dāng)用SB203580抑制了p38MAPK，GADDs基本水平表達(dá)不受影響，但明顯的抑制了mda-7誘導(dǎo)凋亡。這表明mda-7是由p38MAPK通路誘導(dǎo)和激活GADDs，從而介導(dǎo)凋亡。(3)凋亡通道多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括p38MAPK、PKR、Stat3等介導(dǎo)凋亡，但可能只有p38MAPK/PKR在mda-7介導(dǎo)凋亡中是必要的[4，13]，因?yàn)槿舴忾]了它們，則抑制凋亡發(fā)生。mda-7誘導(dǎo)凋亡是由p38MAPK通路介導(dǎo)，同時(shí)上調(diào)dsRNA依賴的PKR并磷酸化其下游靶分子，p38MAPK/PKR是Ad-mda-7最常用的誘導(dǎo)凋亡方式。將IL-24/MDA-7基因克隆到復(fù)制缺陷型腺病毒中構(gòu)建表達(dá)載體Ad-mda7，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，但腺病毒作為載體存在生物安全性的問題。并且IL-24對(duì)肝癌、小腸癌治療作用的研究也未見報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，方法簡(jiǎn)便，操作方便。本發(fā)明構(gòu)建了IL-24基因的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-IL-24，GFP蛋白在各種真核細(xì)胞中都可被用作定位研究各種蛋白質(zhì)的標(biāo)記物。pEGFP-C1-IL-24的構(gòu)建，為研究IL-24在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位、功能提供了直觀便捷的工具。本發(fā)明還涉及pEGFP-C1-IL-24表達(dá)的重組細(xì)胞因子IL-24在治療肝癌中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及pEGFP-C1-IL-24表達(dá)的重組細(xì)胞因子IL-24在治療小腸癌中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及pEGFP-C1-IL-24表達(dá)的重組細(xì)胞因子IL-24在治療黑色素瘤中的應(yīng)用。IL-24對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性的生長(zhǎng)和凋亡誘導(dǎo)作用，同時(shí)可刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。I1-24是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)細(xì)胞因子類的抑癌基因。本發(fā)明的重組新型細(xì)胞因子IL-24對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制和調(diào)亡作用，可作為有潛力的治療肝癌、小腸癌、黑色素瘤等腫瘤的新型抗癌生物藥物。本發(fā)明為臨床惡性腫瘤基因治療的開展提供了較為可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與簡(jiǎn)便的治療方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施1目的基因的擴(kuò)增與純化引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)人IL-24GeneBank序列(NM006850)設(shè)計(jì)引物，上游引物5’GCAGATCTAATTTTCAACAGAGGCTG-3’，含有BglII酶切位點(diǎn)；下游引物5’CGGTCGACTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3’，含有SalI酶切位點(diǎn)。引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。以插入人IL-24完整編碼區(qū)基因的質(zhì)粒TRAPIL-24為模板，采用上述引物從人IL-24N端編碼的第2個(gè)氨基酸開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的反應(yīng)條件為；95℃預(yù)變性2分鐘，以95℃變性36鈔，56℃退火36鈔，72℃延伸1分鐘24鈔，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，再以72℃延伸5分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12g/L瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下后，用Omega公司GelExtractionKitDNA試劑盒回收純化，操作步驟如下(1)從瓊脂糖凝膠中將DNA條帶切下，搗碎裝入Ep管中。加入1～2倍體積的BindingBuffer，55℃下溫育7分鐘使膠溶解。(2)將Ep管中已溶解的膠溶液加入DNAMinicolumn中，每次加入750μl，10,000g離心1分鐘。(3)向DNAMinicolumn中加入700μlSPWBuffer，10,000g離心1分鐘，離心完后將DNAMinicolumn再次10,000g離心1分鐘拋干。(4)將DNAMinicolumn套入Ep管中，加入10～20μl滅菌水，靜置5分鐘，10,000g離心1分鐘，Ep管底溶液即為回收DNA。2重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24構(gòu)建與鑒定將純化的PCR產(chǎn)物和載體pEGFP-C1用BglII和SalI雙酶切后，分別用Omega公司GelExtractionKitDNA試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，在T4DNA連接酶作用下定向連接IL-24片段至pEGFP-C1，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，在LB(Kan+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取陽性克隆，培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，采用BglII和SalI雙位點(diǎn)單、雙酶切鑒定。選取陽性克隆，送交上海華諾公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與人IL-24GeneBank序列(NM006850)完全一致。3重組質(zhì)粒在HIC細(xì)胞中的表達(dá)提取重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24及空載pEGFP-C1采用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。HIC細(xì)胞用含100ml/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃50ml/LCO2條件下培養(yǎng)。采用滅菌的蓋玻片鋪在12孔板底部，接種HIC細(xì)胞。待HIC細(xì)胞生長(zhǎng)至90％鋪滿培養(yǎng)板底部進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別用pEGFP-C1-IL-24、pEGFP-C1轉(zhuǎn)染HIC細(xì)胞，具體方法按照Lipofectamine2000試劑操作說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48小時(shí)后，取出蓋玻片，依次用PBS沖洗2次，40g/L多聚甲醛固定30分鐘及500ml/L甘油緩沖液封片后，用激光掃描共聚焦顯微鏡(Laserscanningconfocalmicroscope，LSCM，德國Leika公司)觀察陽性細(xì)胞并計(jì)算表達(dá)綠色熒光細(xì)胞的陽性率。4IL-24基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞體外增殖能力的測(cè)定IL-24基因轉(zhuǎn)染的HIC細(xì)胞體外增殖能力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)分為三組，包括HIC細(xì)胞組、空載pEGFP-C1轉(zhuǎn)染的HIC細(xì)胞組(HIC/pEGFP-C1)、pEGFP-C1-IL-24轉(zhuǎn)染的HIC細(xì)胞組(HIC/pEGFP-C1-IL-24)。IL-24基因轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞體外增殖能力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)分為三組，包括HepG2細(xì)胞組、空載pEGFP-C1轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞組(HepG2/pEGFP-C1)、pEGFP-C1-IL-24轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞組(HepG2/pEGFP-C1-IL-24)。將細(xì)胞以2×105/ml濃度懸于含100ml/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入200μl，置于37℃50ml/LCO2條件下培養(yǎng)2天后，用MTT檢測(cè)其增殖能力，結(jié)果用A值表示。5腫瘤細(xì)胞的凋亡與周期分析接種HIC于6孔培養(yǎng)板，待HIC細(xì)胞生長(zhǎng)至90％鋪滿培養(yǎng)板底時(shí)分別用pEGFP-C1-IL-24，pEGFP-C1轉(zhuǎn)染HIC細(xì)胞，并設(shè)置HIC細(xì)胞對(duì)照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后分別收集3組細(xì)胞，應(yīng)用美國BECKMANCOULTER公司的DNA-PrepReagenKit試劑及其流式細(xì)胞儀作細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期分析。6小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)將BALB/C小鼠隨機(jī)分為3組(每組6只)，分別于右側(cè)背部皮下注射1×106/100μl的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了空載pEGFP-C1的B16細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1-IL-24的B16細(xì)胞。觀察小鼠皮下腫瘤形成率及其大小(用腫瘤結(jié)節(jié)垂直方向的直徑平均值表示)。每2天用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次。7瘤體直接注射IL-24基因治療皮下荷瘤小鼠將B16細(xì)胞接種于BALB/C小鼠右側(cè)背部皮下，接種量為1×106/100μl。小鼠隨機(jī)分為三組，每組6只。接種10天后，分別在瘤體內(nèi)注射0.2ml脂質(zhì)體包裹的pEGFP-C1-IL-24(10μg)、pEGFP-C1(10μg)、PBS。觀察小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況，每2天測(cè)量一次腫瘤大小。發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明提供了一種能對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的新型細(xì)胞因子IL24的構(gòu)建和表達(dá)。并用IL-24基因在細(xì)胞及整體水平上抑制、預(yù)防和治療腫瘤的生長(zhǎng)。本發(fā)明構(gòu)建了IL-24基因的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-IL-24，GFP由238個(gè)氨基酸組成，在各種真核細(xì)胞中都可被用作定位研究各種蛋白質(zhì)的標(biāo)記物。pEGFP-C1-IL-24的構(gòu)建，為研究IL-24在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位、功能提供了直觀便捷的工具。腫瘤是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜疾病，單一因素的介入往往不能達(dá)到理想的抑瘤效果。因此尋找新的治療方案及將多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用是腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。目前臨床腫瘤治療主要采用三大常規(guī)療法，但在實(shí)施過程中，或由于切除的不徹底，或由于嚴(yán)重的毒副作用不能夠進(jìn)一步加大劑量而使殘存瘤細(xì)胞得以逃逸，從而使腫瘤的治療被復(fù)發(fā)所困擾。因此如何消除殘存腫瘤細(xì)胞是腫瘤治療中防止復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。IL-24基因治療可作為一種輔助治療方法，與手術(shù)切除、放療、化療聯(lián)合應(yīng)用，防止腫瘤復(fù)發(fā)。IL-24對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性的生長(zhǎng)和凋亡誘導(dǎo)作用，同時(shí)可刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。I1-24是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)細(xì)胞因子類的抑癌基因。本發(fā)明的重組新型細(xì)胞因子IL-24對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制和調(diào)亡作用，可作為有潛力的治療肝癌、小腸癌、黑色素瘤等腫瘤的新型抗癌生物藥物。本發(fā)明中，pEGFP-C1-IL-24經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HIC細(xì)胞后，經(jīng)LSCM檢測(cè)其表達(dá)率為28％。體外研究顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-IL-24的HIC細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照HIC細(xì)胞，且G2-M期細(xì)胞比例增高，細(xì)胞被阻滯在G2-M期。說明IL-24基因?qū)IC細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。FCM的檢測(cè)結(jié)果還顯示IL-24基因的轉(zhuǎn)入可誘導(dǎo)HIC細(xì)胞的調(diào)亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中接種轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-IL-24的B16細(xì)胞的小鼠與接種對(duì)照B16細(xì)胞的小鼠相比，前者的致瘤率明顯低于后者，腫瘤皮下結(jié)節(jié)生長(zhǎng)速度明顯慢于后者，說明B16細(xì)胞轉(zhuǎn)入IL-24基因可以減低腫瘤在活體內(nèi)的侵襲能力，降低其生長(zhǎng)速度。瘤體內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的IL-24基因后，可將IL-24基因在腫瘤部位直接轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞內(nèi)并有效表達(dá)，從而抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，注射一次已顯示出較有效的治療效果。本發(fā)明為臨床惡性腫瘤基因治療的開展提供了較為可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與簡(jiǎn)便的治療方法。圖1.人IL-24真核細(xì)胞重組表達(dá)載體的構(gòu)建圖2.人IL-24真核細(xì)胞重組表達(dá)載體的鑒定將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24分別用BglII、SalI進(jìn)行單酶切及雙酶切，pEGFP-C1大小4.7Kb，擴(kuò)增產(chǎn)物IL-24大小為0.6Kb，線狀重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24大小為5.3Kb，說明重組質(zhì)粒大小正確。pEGFP-C1-IL-24經(jīng)BglII、SalI雙酶切后，分成4.7Kb和0.6Kb兩個(gè)片段，與預(yù)期值相符，表明目的基因已正確插入pEGFP-C1載體中.。陽性克隆測(cè)序結(jié)果與GeneBank序列完全一致。Note1DNAmarker；2IL-24PCRproduct；3pEGFP-C1/BglII；4pEGFP-C1-IL-24/BglII+SalI；5pEGFP-C1-IL-24/BglII；6pEGFP-C1-IL-24/SalI圖3.重組質(zhì)粒在HIC細(xì)胞中的表達(dá)鑒定。提取重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24轉(zhuǎn)染HIC細(xì)胞，應(yīng)用LSCM觀察，在HIC細(xì)胞中，可見特異性EGFP。計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，表達(dá)率分別為28％。具體方法按照Lipofectamine2000試劑操作說明進(jìn)行。圖左邊為用激光掃描共聚焦顯微鏡(Laserscanningconfocalmicroscope，LSCM，德國Leika公司)觀察發(fā)綠色熒光的陽性細(xì)胞。右邊為無激光掃描時(shí)對(duì)照?qǐng)D片。圖4.重組IL-24對(duì)人小腸癌細(xì)胞HIC的增殖抑制作用圖4顯示HIC細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-24基因后，腫瘤細(xì)胞的體外增殖與對(duì)照HIC相比受到明顯抑制(P＜0.05)圖5.重組IL-24對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2.的增殖抑制作用圖5顯示HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-24基因后，腫瘤細(xì)胞的體外增殖與對(duì)照HepG2相比受到明顯抑制(P＜0.05)圖6.IL-24對(duì)HIC細(xì)胞周期分布的影響流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-IL-24的HIC細(xì)胞與對(duì)照HIC細(xì)胞相比，G2-M期細(xì)胞比例增高，細(xì)胞被阻滯在G2-M期。轉(zhuǎn)染IL-24基因的HIC細(xì)胞調(diào)亡細(xì)胞百分率為7.4％。注AHIC；BHIC/pEGFP-C1；CHIC/pEGFP-C1-IL-24圖7.接種腫瘤細(xì)胞后荷瘤B16小鼠皮下腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)曲線本發(fā)明觀察了小鼠接種1×106腫瘤細(xì)胞后皮下腫瘤結(jié)節(jié)的出現(xiàn)時(shí)間、大小變化。從圖7可以看出，接種轉(zhuǎn)染IL-24基因的HIC小鼠皮下結(jié)節(jié)生長(zhǎng)速度明顯慢于接種HIC小鼠，表明IL-24基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)能力顯著降低。圖8.基因治療后腫瘤生長(zhǎng)曲線BALB/C小鼠背部皮下接種B16細(xì)胞后6～8d均長(zhǎng)出腫瘤。瘤體內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的IL-24基因后，荷瘤小鼠的生長(zhǎng)明顯受抑制，因此瘤體內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的IL-24基因?qū)υ缙诤闪鲂∈蟮纳L(zhǎng)具有較明顯的抑制作用。具體實(shí)施例方式1.人IL-24真核細(xì)胞重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法1.1目的基因的擴(kuò)增與純化引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)人IL-24GeneBank序列(NM006850)設(shè)計(jì)引物，上游引物5’GCAGATCTAATTTTCAACAGAGGCTG-3’，含有BglII酶切位點(diǎn)；下游引物5’CGGTCGACTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3’，含有SalI酶切位點(diǎn)。引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。以插入人IL-24完整編碼區(qū)基因的質(zhì)粒TRAPIL-24為模板，采用上述引物從人IL-24N端編碼的第2個(gè)氨基酸開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的反應(yīng)條件為；95℃預(yù)變性2分鐘，以95℃變性36s，56℃退火36s，72℃延伸1分鐘24s，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，再以72℃延伸5分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12g/L瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下后，用DNA回收試劑盒回收純化。1.2重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24構(gòu)建與鑒定(見圖1、圖2所示)將純化的PCR產(chǎn)物和載體pEGFP-C1用BglII和SalI雙酶切后，分別回收酶切產(chǎn)物，在T4DNA連接酶作用下定向連接IL-24片段至pEGFP-C1，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，在LB(Kan+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取陽性克隆，培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24分別用BglII、SalI進(jìn)行單酶切及雙酶切，pEGFP-C1大小4.7Kb，擴(kuò)增產(chǎn)物IL-24大小為0.6Kb，線狀重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24大小為5.3Kb，說明重組質(zhì)粒大小正確。pEGFP-C1-IL-24經(jīng)BglII、SalI雙酶切后，分成4.7Kb和0.6Kb兩個(gè)片段，與預(yù)期值相符，表明目的基因已正確插入pEGFP-C1載體中.。選取陽性克隆，送交上海華諾公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與人IL-24GeneBank序列(NM006850)完全一致，翻譯為蛋白質(zhì)其相應(yīng)氨基酸序列(GeneBankNM006850)為NFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL2.抗腫瘤細(xì)胞增殖應(yīng)用2.1重組質(zhì)粒在HIC細(xì)胞中的表達(dá)(見圖3所示)提取重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24及空載pEGFP-C1采用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。HIC細(xì)胞用含100ml/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃50ml/LCO2條件下培養(yǎng)。采用滅菌的蓋玻片鋪在12孔板底部，接種HIC細(xì)胞。待HIC細(xì)胞生長(zhǎng)至90％鋪滿培養(yǎng)板底部進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別用pEGFP-C1-IL-24、pEGFP-C1轉(zhuǎn)染HIC細(xì)胞，具體方法按照Lipofectamine2000試劑操作說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48小時(shí)后，取出蓋玻片，依次用PBS沖洗2次，40g/L多聚甲醛固定30分鐘及500ml/L甘油緩沖液封片后，用激光掃描共聚焦顯微鏡(Laserscanningconfocalmicroscope，LSCM，德國Leika公司)觀察陽性細(xì)胞并計(jì)算表達(dá)綠色熒光細(xì)胞的陽性率。在HIC細(xì)胞中，均可見特異性EGFP。計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，表達(dá)率分別為28％、30％。2.2IL-24基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞體外增殖能力的測(cè)定(見圖4、圖5所示)IL-24基因轉(zhuǎn)染的HIC細(xì)胞體外增殖能力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)分為三組，包括HIC細(xì)胞組、空載pEGFP-C1轉(zhuǎn)染的HIC細(xì)胞組(HIC/pEGFP-C1)、pEGFP-C1-IL-24轉(zhuǎn)染的HIC細(xì)胞組(HIC/pEGFP-C1-IL-24)。IL-24基因轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞體外增殖能力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)分為三組，包括HepG2細(xì)胞組、空載pEGFP-C1轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞組(HepG2/pEGFP-C1)、pEGFP-C1-IL-24轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞組(HepG2/pEGFP-C1-IL-24)。將細(xì)胞以2×105/ml濃度懸于含100ml/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入200μl，置于37℃50ml/LCO2條件下培養(yǎng)2天后，用MTT檢測(cè)其增殖能力，結(jié)果用A值表示。HIC、HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-24基因后，腫瘤細(xì)胞的體外增殖與對(duì)照細(xì)胞相比均受到明顯抑制(P＜0.05)。2.3.腫瘤細(xì)胞的凋亡與周期分析(見圖6所示)接種HIC于6孔培養(yǎng)板，待HIC細(xì)胞生長(zhǎng)至90％鋪滿培養(yǎng)板底時(shí)分別用pEGFP-C1-IL-24，pEGFP-C1轉(zhuǎn)染HIC細(xì)胞，并設(shè)置HIC細(xì)胞對(duì)照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后分別收集3組細(xì)胞，應(yīng)用美國BECKMANCOULTER公司的DNA-PrepReagenKit試劑及其流式細(xì)胞儀作細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期分析。流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-IL-24的HIC細(xì)胞與對(duì)照HIC細(xì)胞相比，其G2-M期細(xì)胞比例增高，細(xì)胞被阻滯在G2-M期。轉(zhuǎn)染IL-24基因的HIC細(xì)胞調(diào)亡細(xì)胞百分率為7.4％。2.4.小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)(見圖7所示)將BALB/C小鼠隨機(jī)分為3組(每組6只)，分別于右側(cè)背部皮下注射1×106/100μl的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了空載pEGFP-C1的B16細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1-IL-24的B16細(xì)胞。觀察小鼠皮下腫瘤形成率及其大小(用腫瘤結(jié)節(jié)垂直方向的直徑平均值表示)。每2天用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次。我們觀察了小鼠接種1×106腫瘤細(xì)胞后皮下腫瘤結(jié)節(jié)的出現(xiàn)時(shí)間、大小變化。從表一可以看出，轉(zhuǎn)染IL-24的B16細(xì)胞與B16細(xì)胞相比致瘤率明顯降低。從圖7可以看出，接種轉(zhuǎn)染IL-24基因的HIC小鼠皮下結(jié)節(jié)生長(zhǎng)速度明顯慢于接種HIC小鼠，表明IL-24基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)能力顯著降低。表1小鼠接種腫瘤細(xì)胞B16后皮下腫瘤結(jié)節(jié)陽性率GroupsMicewithdetectabletumor(％)OnlyB16100pEGFP-C183.3pEGFP-C1-IL-24502.5.瘤體直接注射IL-24基因治療皮下荷瘤小鼠(見圖8所示)將B16細(xì)胞接種于BALB/C小鼠右側(cè)背部皮下，接種量為1×106/100μl。小鼠隨機(jī)分為三組，每組6只。接種10天后，分別在瘤體內(nèi)注射0.2ml脂質(zhì)體包裹的pEGFP-C1-IL-24(10μg)、pEGFP-C1(10μg)、PBS。觀察小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況，每2天測(cè)量一次腫瘤大小。BALB/C小鼠背部皮下接種B16細(xì)胞后6～8d均長(zhǎng)出腫瘤。瘤體內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的IL-24基因后，與注射空載DNA相比，僅一次注射IL-24基因荷瘤小鼠的生長(zhǎng)就明顯受抑制(表2、圖8)，因此瘤體內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的IL-24基因?qū)υ缙诤闪鲂∈蟮纳L(zhǎng)具有較明顯的抑制作用。表2瘤體注射基因治療后腫瘤的大小Table2AveragediameteroftumorsizeafterinjectionofIL-24基因治療后腫瘤大小(X±s)mm組別2d4d8d12d16d20dPBS6.60±0.868.10±0.4411.20±0.6114.50±0.3217.20±0.6719.00±0.89pEGFP-C16.70±0.358.20±0.5811.40±2.1115.00±2.2917.60±2.4819.40±2.69pEGFP-C1-IL-246.20±0.616.30±0.525.60±0.586.10±1.357.20±2.028.20±2.16注pEGFP-C1-IL-24組與PBS組腫瘤大小比較，2d后無顯著性差異(P＞0.05)，4d、8d、12d、16d、20d后均有顯著性差異(P＜0.05)。權(quán)利要求1.一種細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，它包括下列步驟A、目的基因的擴(kuò)增與純化，根據(jù)人IL-24GeneBank序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5’GCAGATCTAATTTTCAACAGAGGCTG-3’，含有BglII酶切位點(diǎn)；下游引物5’CGGTCGACTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3’，含有SalI酶切位點(diǎn)，以插入人IL-24完整編碼區(qū)基因的質(zhì)粒TRAPIL-24為模板，采用上述引物從人IL-24N端編碼的第2個(gè)氨基酸開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2分鐘，以95℃變性36鈔，56℃退火36鈔，72℃延伸1分鐘24鈔，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，再以72℃延伸5分鐘，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12g/L瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下后，用試劑盒回收純化；B、重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24構(gòu)建與鑒定，將純化的PCR產(chǎn)物和載體pEGFP-C1用BglII和SalI雙酶切后，分別用試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，在T4DNA連接酶作用下定向連接IL-24片段至pEGFP-C1，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，在LB培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，采用BglII和SalI雙位點(diǎn)單、雙酶切鑒定，測(cè)序。2.包括權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體pEGFP-C1-IL-24。3.一種細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體pEGFP-C1-IL-24表達(dá)的重組細(xì)胞因子IL-24在治療肝癌中的應(yīng)用。4.一種細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體pEGFP-C1-IL-24表達(dá)的重組細(xì)胞因子IL-24在治療小腸癌中的應(yīng)用。5.一種細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體pEGFP-C1-IL-24表達(dá)的重組細(xì)胞因子IL-24在治療黑色素瘤中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種細(xì)胞因子IL－24真核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用，其步驟是首先是目的基因的擴(kuò)增與純化，設(shè)計(jì)上引物和下引物，以質(zhì)粒TRAPIL－24為模板，采用人IL－24N端編碼的第2個(gè)氨基酸開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的條帶切下后，用試劑盒回收純化；其次是重組質(zhì)粒pEGFP－C1－IL－24構(gòu)建與鑒定，將純化的PCR產(chǎn)物和載體pEGFP－C1用BglII和SalI雙酶切后，分別用試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，連接片段，篩選培養(yǎng)，克隆，鑒定，測(cè)序。本發(fā)明包括證實(shí)重組細(xì)胞因子IL－24在治療肝癌、小腸癌、黑色素瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，操作方便，能抑制、預(yù)防和治療腫瘤的生長(zhǎng)。文檔編號(hào)C12N15/79GK1618978SQ20041006081公開日2005年5月25日申請(qǐng)日期2004年9月9日優(yōu)先權(quán)日2004年9月9日發(fā)明者章曉聯(lián),瞿少剛,周翔,吳建國,陳明,李平飛申請(qǐng)人:武漢大學(xué)