專利名稱：利用等位基因特異性pcr檢測(cè)與雞生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋性狀相關(guān)基因的分子標(biāo)記方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及利用雞Ghrelin基因的ASP多態(tài)性與雞的生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀相關(guān)聯(lián)性能進(jìn)行檢測(cè)的方法，本發(fā)明還涉及到與雞的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀相關(guān)聯(lián)的DNA序列以及應(yīng)用該關(guān)聯(lián)基因制備的檢測(cè)診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
在當(dāng)前的家禽生產(chǎn)中，生長(zhǎng)、產(chǎn)蛋和肉質(zhì)是三個(gè)最重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。其中生長(zhǎng)指標(biāo)是處于第一位的。之所以這樣說(shuō)是因?yàn)榧仪萆L(zhǎng)的好壞直接決定和影響其繁殖(產(chǎn)蛋)性能和肉質(zhì)品質(zhì)。所以，家禽的生長(zhǎng)發(fā)育一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的目標(biāo)之一。但常規(guī)的表型、生理生化研究已經(jīng)不能滿足生產(chǎn)發(fā)展的需要。隨著分子生物學(xué)的興起，人們從分子水平上揭示基因和家禽生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)蛋性狀之間的關(guān)系已經(jīng)成為了可能。而且，這些研究已經(jīng)取得了豐碩的成果。基因或分子標(biāo)記的研究已經(jīng)并將繼續(xù)扮演著重要的角色。
對(duì)家禽的研究始于對(duì)其性狀標(biāo)記的研究。大致可分為三大類形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生理生化標(biāo)記和分子標(biāo)記。
形態(tài)學(xué)標(biāo)記包括顏色、大小、形狀等。生理生化標(biāo)記包括生理常數(shù)和血液生化指標(biāo)等。分子標(biāo)記包括染色體標(biāo)記和DNA指紋標(biāo)記。分子標(biāo)記是近年來(lái)興起的重要標(biāo)記。它更直接、簡(jiǎn)便、快捷的反映了家禽的生活狀態(tài)。尤其是DNA分子標(biāo)記在當(dāng)今家禽育種工作中是應(yīng)用范圍最廣的標(biāo)記類型。
分子標(biāo)記大致可分為三大類第一類是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、DNA指紋技術(shù)(DNA Fingerprinting)、原位雜交(in situ hybridization)等；第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(Random amplification polymorphism DNA，RAPD)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記(Simplesequence repeat，SSR)或簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(Simple sequence length polymorphism，SSLP)，也稱微衛(wèi)星(Microsatellite)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(Amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)、序列示蹤位點(diǎn)(Sequence tagged sites，STS)、序列特征化擴(kuò)增區(qū)域(Sequence charactered amplified region，SCAR)等；第三類是一些新型的分子標(biāo)記，如單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)、表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressedsequences tags，EST)等。
2004年3月初，雞的基因組序列草圖誕生，它把人們推向了一個(gè)嶄新的時(shí)代。但它卻畢竟是一張草圖。其序列缺口—“GAP”的填充和潛在SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)及其功能基因的鑒定給人們帶來(lái)了新一輪的任務(wù)和挑戰(zhàn)。世界各國(guó)的專家學(xué)者都在積極地開(kāi)展相關(guān)的研究工作。對(duì)影響雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀指標(biāo)的“本質(zhì)”—分子或基因的研究，無(wú)疑是最直接、最準(zhǔn)確、最快速、最有意義的選擇。其中的熱點(diǎn)之一是SNP的研究，專門的人類SNP數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)展現(xiàn)在國(guó)際NCBI網(wǎng)站上。這些SNP標(biāo)記為開(kāi)展MAS(標(biāo)記輔助選擇)、早期育種，提高選種準(zhǔn)確性和選育效率以及加速遺傳進(jìn)展提供了可靠的依據(jù)。對(duì)于雞而言，特別是對(duì)可能影響著具有諸多優(yōu)良特點(diǎn)的中國(guó)地方雞種的相關(guān)基因潛在SNP的研究成了國(guó)內(nèi)近兩年來(lái)首當(dāng)其沖的研究熱點(diǎn)之一。而SNP的檢測(cè)方法也層出不窮。最常用的有RFLP和SSCP(Single strand conformation polymorphisms，單鏈構(gòu)象多態(tài))等。但是，RFLP方法需要價(jià)格相對(duì)較為昂貴的限制性內(nèi)切酶和嚴(yán)格的酶切條件；SSCP方法不要內(nèi)切酶，可它的使用步驟繁瑣而復(fù)雜，耗費(fèi)大量的時(shí)間。所以，ASP(Allele Specific PCR，等位基因特異性PCR)方法應(yīng)運(yùn)而生，它綜合了RFLP和SSCP的優(yōu)點(diǎn)。
等位基因特異性PCR(Allele Specific PCR，ASP)產(chǎn)生于九十年初，它有著簡(jiǎn)便、節(jié)時(shí)、高效等特點(diǎn)，不需酶切，不需要繁瑣的步驟，僅僅兩次PCR就可直接判型。但其引物難以設(shè)計(jì)、引物特異性低的特點(diǎn)也尤為突出，這是它不能得到廣泛應(yīng)用的主要原因之一。所以，一種引物設(shè)計(jì)自動(dòng)化，特異化，實(shí)用化的改良ASP方法呼之欲出。
1999年，Kojima等(Kojima M.，et al.Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptidefrom stomach.Nature.1999 Dec 9；402(6762)656-660.)首先在小鼠和人胃內(nèi)分泌細(xì)胞及下丘腦弓狀核中發(fā)現(xiàn)了Ghrelin基因(有人簡(jiǎn)寫為GHR)編碼蛋白—生長(zhǎng)素(也有人成為“饑餓激素”)，它是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHS)的內(nèi)源性配體。哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)素主要合成于胃，能特異性刺激垂體前葉釋放生長(zhǎng)激素(GH)，影響胃腸道和心血管功能及能量代謝，增加食欲進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)。2002年，Hiroyuki Kaiya等(Kaiya，H.，S.，et al.Chicken ghrelinPurffication，cDNA cloning，and biological activity.Endocrinology.2002.1433454-3463.)分離純化及克隆了雞Ghelin基因，并首次公布了其包括完全編碼區(qū)(Complete CDS)的mRNA序列。隨后，聶慶華等(2003)和Tanaka等(2004)(WebsiteNCBI，nucleotide sequences.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝nucleotide&cmd＝search&term＝chicken+ghrelin.)先后公布了其包括完全編碼區(qū)的DNA序列。雞Ghelin基因包括5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，其mRNA序列長(zhǎng)843bp，編碼26個(gè)氨基酸，而不同于人和鼠的28個(gè)氨基酸。Kaiya等(Kaiya，H.，S.，et al.Chicken ghrelinPurification，cDNA cloning，and biologicalactivity.Endocrinology.2002.1433454-3463.)研究表明，雞Ghrelin基因mRNA也主要是在胃中表達(dá)，但卻是在前胃而非后胃。同時(shí)，在腦部、肺部和腸部也有較低水平表達(dá)。但其功能不同于哺乳動(dòng)物的是，它不僅能增加血漿中GH水平，而且還能增加血漿中腎上腺素水平。FuruseM等(Furuse，M.，et al.Intracerebroventricular injection of ghrelin and growth hormone releasingfactor inhibits food intake in neonatal chicks.Neurosci Lett.2001.301123-126.)認(rèn)為不同劑量的外源Ghrelin注射可以在短期內(nèi)不同程度地抑制雛雞的采食。后來(lái)其他一些人更進(jìn)一步證實(shí)了相類似的觀點(diǎn)。無(wú)論Ghrelin基因?qū)﹄u的激素水平、生理狀態(tài)及生長(zhǎng)發(fā)育如何影響，上述研究大都從生理生化角度著手，很少有從遺傳選擇進(jìn)化方面考慮的。
目前，國(guó)內(nèi)外以可能影響雞(特別是中國(guó)地方雞種)的生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀的Ghrelin基因作為候選基因，利用ASP分子標(biāo)記方法對(duì)雞的特性進(jìn)行研究和應(yīng)用還處于空白?；诖?，申請(qǐng)人探索出了一種適用于普通實(shí)驗(yàn)室的多態(tài)檢測(cè)方法—改良的ASP方法，對(duì)雞Ghrelin基因的ASP多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)及其與性狀的關(guān)聯(lián)分析，確實(shí)找到了一個(gè)顯著性(P＜0.05)影響中國(guó)地方雞種生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀的Ghrelin基因的分子標(biāo)記，發(fā)明了一種快速、高效、精確的檢測(cè)診斷試劑盒，并且已經(jīng)應(yīng)用于當(dāng)前的家禽生產(chǎn)當(dāng)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)存在的缺陷，通過(guò)使用改良的ASP(Allele Specific PCR，等位基因特異性PCR)技術(shù)來(lái)代替RFLP(Restriction fragment length polymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài))，SSCP(Single strand conformation polymorphisms，單鏈構(gòu)象多態(tài))和最初的ASP技術(shù)等的SNP檢測(cè)方法，以雞Ghrelin基因?yàn)樯L(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀的侯選基因進(jìn)行多態(tài)性研究，并開(kāi)展基因——性狀關(guān)聯(lián)分析。以期找到與雞生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的基因或標(biāo)記。具體而言，在體外利用ASP方法檢測(cè)Ghrelin基因中ASP等位基因的是否存在；擴(kuò)增、克隆雞Ghrelin基因第一外顯子和內(nèi)含子及部分第二外顯子的特定片段(如序列表SEQ ID NO1所示)，根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無(wú)直接判定個(gè)體基因型，尋找改良的ASP多態(tài)性及其與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀的相關(guān)。為雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的遺傳標(biāo)記。同時(shí)本發(fā)明的目的還在于構(gòu)建一種改良的在體外檢測(cè)診斷與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀相關(guān)的Ghrelin基因ASP標(biāo)記方法，其中包括應(yīng)用于上述檢測(cè)和診斷雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀的試劑盒。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)這是一種與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀相關(guān)的Ghrelin基因ASP標(biāo)記方法，其特征在于首先從雞中提取基因組DNA，例如從雞的全血或組織中提取DNA，通過(guò)測(cè)序和ASP和凝膠電泳進(jìn)行ASP等位基因的檢測(cè)，優(yōu)選的是通過(guò)ASP和凝膠電泳，在體外檢測(cè)Ghrelin基因中ASP等位因的存在。其步驟包括(1)在體外檢測(cè)Ghrelin基因中ASP等位基因是否存在；(2)通過(guò)測(cè)序和ASP及凝膠電泳進(jìn)行ASP等位基因的檢測(cè)；從雞的全血或組織中提取基因組DNA；(4)直接對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)多態(tài)性；(5)進(jìn)行基因型與雞生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析。
改良的ASP是基于這樣的原理根據(jù)各等位基因核苷酸堿基序列差異性，設(shè)計(jì)出一系列3′末端覆蓋SNP位點(diǎn)的特異性引物。因Taq DNA聚合酶沒(méi)有3′→5′核酸內(nèi)切酶活性，引物3′末端最后一個(gè)或3個(gè)堿基是否與模板配對(duì)決定著能否擴(kuò)增出產(chǎn)物。根據(jù)特異產(chǎn)物存在與否即可直接對(duì)基因進(jìn)行分型。其特點(diǎn)有(1)引物設(shè)計(jì)自動(dòng)化(在網(wǎng)站http://ausubellab.mgh.harvard.edu/自動(dòng)生成)。(2)高度特異性，針對(duì)各等位基因順序設(shè)計(jì)的引物，從PCR第一個(gè)循環(huán)開(kāi)始就是特異性擴(kuò)增，提高退火溫度又加強(qiáng)了這種特異性。(3)只需兩次常規(guī)PCR和瓊脂糖電泳即可簡(jiǎn)便而迅速的判定結(jié)果。(4)不論有無(wú)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)均可檢測(cè)，避免了象RFLP使用價(jià)格較昂貴的限制性內(nèi)切酶和SSCP過(guò)程的繁瑣性和結(jié)果難以判定等的缺點(diǎn)。(5)高度分辨率。需要指出的一點(diǎn)是用ASP法由于涉及多對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)成本高，而且曲于特異引物的有限性，有些罕見(jiàn)的位點(diǎn)特異性難以用此方法檢出。但它的無(wú)需限制性內(nèi)切酶(RFLP)、無(wú)需PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)、無(wú)需復(fù)雜的染膠步驟和高通量、快速等優(yōu)越特點(diǎn)，改變了原來(lái)的缺點(diǎn)，受到常規(guī)遺傳實(shí)驗(yàn)室的熱烈歡迎。
以上所述的檢測(cè)方法主要包括對(duì)基因組DNA進(jìn)行ASP擴(kuò)增并檢測(cè)多態(tài)性，經(jīng)擴(kuò)增的DNA片段含有Ghrelin基因第一外顯子、內(nèi)含子和部分第二外顯子的序列，其長(zhǎng)度為369bp。在擴(kuò)增獲得的Ghrelin基因序列中存在5個(gè)堿基突變位點(diǎn)，其中第71位堿基處有一個(gè)堿基突變T→C，導(dǎo)致ASP多態(tài)性；其它位點(diǎn)沒(méi)有ASP多態(tài)性(詳細(xì)情況見(jiàn)序列表SEQ ID NO1所示)。
這種與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀相關(guān)的Ghrelin基因ASP標(biāo)記，關(guān)鍵含有如SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示的引物。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)大量的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)證實(shí)應(yīng)用上述方法可以應(yīng)用于與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳檢測(cè)，其中，由ASP等位基因所產(chǎn)生的基因型CT型與七周齡體重和脛圍，十六周齡體重和脛圍呈現(xiàn)顯著性(P＜0.05)負(fù)相關(guān)，然而它與12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重呈現(xiàn)出顯著性(P＜0.05)正相關(guān)，基因型CC和TT結(jié)果相反。
利用上述制備方法，申請(qǐng)人已經(jīng)制成了用于檢測(cè)與雞生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的Ghrelin基因ASP診斷試劑盒，該試劑盒組成如下序列表SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示的引物，每種引物濃度為10μmol/L；1U Taq DNA聚合酶(Takara公司生產(chǎn)或者從商業(yè)上獲得)；10m mol/L dNTP(從商業(yè)上獲得)；10×buffer with 25m mol/L Mg2+(Takara公司生產(chǎn)或者從商業(yè)上獲得)。
以上所述的Ghrelin基因部分原序列(GenBank登陸號(hào)分別為AY303688)和三對(duì)引物對(duì)的DNA序列如序列表SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案是1、雞Ghrelin基因第一外顯子和內(nèi)含子及其部分第二外顯子特定片段的擴(kuò)增和克隆(1)雞基因組DNA的提取分別從12個(gè)中國(guó)地方雞種和一個(gè)外來(lái)商業(yè)品種共695只個(gè)體的翅靜脈無(wú)菌采血，每只雞采血約1ml，用10ml 10mmol/L EDTA(pH8.0)裂解液(含有10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)和2％SDS)混合血樣，采用常規(guī)的類似豬或羊的苯酚—氯仿—異戊醇的方法對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取(Chen，S.L.，et al.RAPD variation and genetic distance among Tibetan，Inner Mongolia andLiaoning cashmere goats，Asian-Australia.J.Anim.Sci.2001.141520-1522.)。每只雞提取一份DNA樣品，共獲得695個(gè)DNA樣品用于基因型檢測(cè)。供試雞群的具體情況參見(jiàn)下表1。
表1.13個(gè)雞種的詳細(xì)信息個(gè)體數(shù)量Number 品種 簡(jiǎn)寫 類型來(lái)源地公 母Total1 絲毛烏骨雞 WG藥用和觀賞型江西省泰和縣 18 23412 北京油雞YJ肉蛋兼用型 北京市124253 鹿苑雞 LY肉蛋兼用型 江蘇省張家港市15 24394 茶花雞 CH小型肉蛋兼用型 云南省西雙版納地區(qū)024245 蕭山雞 XS肉蛋兼用型 浙江省杭州市 120216 固始雞 GS蛋肉兼用型 河南省固始縣 19 26457 中國(guó)斗雞DJ觀賞型 內(nèi)蒙古和新疆自治區(qū)15 20358 大骨雞 DG蛋肉兼用型 遼寧省莊河市 036369 狼山雞 LS肉蛋兼用型 江蘇省如東縣 3242710白耳雞 BE蛋用型 江西省上饒市 14 193311仙居雞 XJ小型蛋用型 浙江省仙居縣 20 214112藏雞ZJ肉蛋兼用型 西藏林芝地區(qū) 64 168 23213隱性白*RW國(guó)外引進(jìn)以色列Kabir公司 40 5696*為國(guó)外血統(tǒng)的雞種，未標(biāo)注*號(hào)的雞種為中國(guó)地方血統(tǒng)雞種。
(2)引物設(shè)計(jì)把自己克隆測(cè)序所得的中國(guó)地方雞種的Ghrelin基因大部分序列和GenBank收錄的雞的Ghrelin基因DNA或RNA序列(GenBank登陸號(hào)分別為AY303688，AB158617，NM_001001131，AY299454和AB075215)進(jìn)行在線Blast，根據(jù)堿基變異狀況，利用網(wǎng)站上(http://ausubellab.mgh.harvard.edu/)稱為SNAPER的引物設(shè)計(jì)程序，提交序列后自動(dòng)設(shè)計(jì)引物，并用Primer premier5.0(Microsoft Corp.)引物設(shè)計(jì)程序驗(yàn)證，基因Ghrelin基因原序列及其最終設(shè)計(jì)并篩選特異引物序列(即所述的引物對(duì))如下SEQ ID NO1TTTTGCCAGTTTTCCTCTGTAATTTCTCTCTGCTAACCTGTCTGGTCCAGTCATTACATCTCAGTTATAGAAGAAAACACAGTAAGTAATCTCTTTTGACAGGATATATTGCCTTTCTGCATGCAATAATTGTGCTTTCTTTCTATATTTGTTTGGAGAAACAATTGCACATCATTCTAATCAGGAGAACTATTTTCACTGGCTTGGGATTCAACCAAATACACAGATTAGAAAATATGTTTAATTTTTAACTTGTGTTTTCAGTTTGAAGCACTGCCTAACGAAGACAACCATGTTTCTCAGAGTTATTCTGCTAGGAATTCTCCTTCTCAGCATCCTTGGGACAGAAACTGCTCTGGCTGGCTCTAGSEQ ID NO2(Allele71-C)引物對(duì)5’-TTTTGCCAGTTTTCCTCTGTAATAC-3’ (正向引物)SEQ ID NO35’-CTAGAGCCAGCCAGAGCAGTTT-3’ (反向引物)SEQ ID NO4(Allele71-T)引物對(duì)5’-TTTTGCCAGTTTTCCTCTGTAAGTT-3’ (正向引物)SEQ ID NO75’-CTAGAGCCAGCCAGAGCAGTTT-3’ (反向引物)SEQ ID NO5(陽(yáng)性對(duì)照)引物對(duì) 5’-TGAAGCAACAAAGGTAAC-3′ (正向引物)SEQ ID NO65’-TTCTGTCCCAAGGATG-3′ (反向引物)(3)PCR反應(yīng)條件PCR儀為PTC-100TM(MJ Research，Inc)，反應(yīng)總體積為20μl，其中雞基因組DNA約50-60ng，2μl 10×buffer(MBI Fermentas)，0.3m mol/L dNTP，每種引物濃度為0.1μmol/L，1UTaq DNA聚合酶(MBI Fermentas)。PCR擴(kuò)增程序95℃預(yù)變性5min，然后95℃ 20s，59℃(兩對(duì)特異性引物)或者55℃(陽(yáng)性對(duì)照引物)20s，72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序A.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Promega)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。具體步驟在每300μl融化的凝膠中加入1ml清洗液(Resin液)，混勻20s，將Resin/DNA混合物裝入注射器，使?jié){液通過(guò)親和層析柱(Minicolumn柱)擠出。再在注射器中加入80％的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過(guò)Minicolumn擠出，取下Minicolumn裝入1.5ml Ependorff管中，10,000g離心2min以干燥Resin，將Minicolumn裝入另一個(gè)干凈的1.5ml離心管(Ependorff管)中，加入30～50μl滅菌水，靜置1min，10,000g離心20s，將DNA洗脫于Ependorff管中。
B.PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序連接反應(yīng)將純化過(guò)的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，連接反應(yīng)總體積是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl T載體，0.5μl純化PCR產(chǎn)物，0.5μl T4連接酶，最后加入1μl滅菌水置4℃水浴過(guò)夜。
感受態(tài)細(xì)胞的制備從37℃培養(yǎng)了16～20h的新鮮平板上挑取一個(gè)DH5α單菌落接種于2ml LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接1ml菌液于含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約4h，待OD600達(dá)到0.3～0.4時(shí)將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10～15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4℃ 4,000g離心10min以收集細(xì)胞，將離心管倒置以棄去培養(yǎng)液，用10ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復(fù)4℃ 4,000g離心10min一次，用4ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 轉(zhuǎn)化無(wú)菌狀態(tài)下取100～120μl感受態(tài)細(xì)胞于1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動(dòng)Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h后倒置培養(yǎng)。
質(zhì)粒的小量制備挑取平板上的單菌落，接種于2～3ml LB中，37℃ 300r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用1.5ml EP管12000r/min離心數(shù)秒收集菌體。每管加入100μl用冰預(yù)冷的溶液[50m mol/L葡萄糖，25mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris.HCl pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]，渦旋振蕩至菌體充分懸浮。加入新配制的溶液
200μl，快速顛倒混勻，冰浴5min，然后加入預(yù)冷的溶液[5mol/L乙酸鉀，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml]150μl，混勻后冰浴5min，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一EP管中，加入苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)500μl，渦旋振蕩，離心后小心吸取上層水相，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min離心5min，沉淀用70％乙醇洗滌2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
重組質(zhì)粒的酶切鑒定取3μl質(zhì)粒DNA與適量的雙蒸水混勻，使其總體積為15μl，加入2～3U限制性內(nèi)酶EcoRI及2μl相應(yīng)的10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置37℃水浴1～2小時(shí)，取2～3μl反應(yīng)液于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，酶切結(jié)果與預(yù)計(jì)完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定由北京華諾生物技術(shù)有限公司完成。
(5)DNA序列同源性檢索鑒定通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information.http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測(cè)序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的已知基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定所獲得的DNA序列。
2、ASP方法的建立陽(yáng)性對(duì)照引物和兩對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)拍照后直接可以判定基因型。判型方法如下1)如果一個(gè)個(gè)體陽(yáng)性引物和Allele71-C引物都有目的帶而Allele71-T引物沒(méi)有目的帶，則判型為CC純合基因型；2)如果一個(gè)個(gè)體陽(yáng)性引物和Allele71-T引物都有目的帶而Allele71-C引物沒(méi)有目的帶，則判型為TT純合基因型；3)如果一個(gè)個(gè)體陽(yáng)性引物，Allele71-C和Allele71-T引物都有目的帶，則判型為CT雜合基因型。4)如果陽(yáng)性引物或者兩對(duì)特異性引物都沒(méi)有目的帶，則判型為失敗，需要重新實(shí)驗(yàn)。
3、PCR試劑盒的制備(試劑盒組成、使用劑量及測(cè)定方法)試劑盒的組成(1)本發(fā)明的三對(duì)引物濃度為10μmol/L，(2)1U Taq DNA聚合酶(MBIFermentas)，(3)10m mol/L dNTP，(4)10×buffer with MgCl2(MBI Fermentas)。
使用劑量和測(cè)定方法(1)每20μl反應(yīng)體積分別需要本發(fā)明的陽(yáng)性引物和特異性引物(10μmol/L)各0.5μl，(2)1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)，(3)10m mol/L dNTP 0.2μl，(4)10×buffer with MgCl2(MBI Fermentas)2μl。加雙蒸水至19μl，再加1μl雞基因組DNA混合均勻后，即可據(jù)前述的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
4、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)處理和分析采用現(xiàn)成的商業(yè)化軟件SPSS11.5(從SPSS商業(yè)公司獲得)進(jìn)行。分析數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表3和表4及實(shí)施例4。
本發(fā)明的效果1、雞Ghrelin基因片段的擴(kuò)增、克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物(如圖2所示)。將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示特異性PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為369bp，而陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物長(zhǎng)度395bp。
將特異性片段DNA序列在GenBank中進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果表明(如圖2所示)，該片段每個(gè)引物序列與目的基因Ghrelin DNA(GenBank登陸號(hào)AY303688)完全一致(除了變異堿基之外)，該P(yáng)CR產(chǎn)物序列對(duì)應(yīng)于目的基因的第一外顯子(pos.1-127th)、第一內(nèi)含子(pos.127-311th)和第二外顯子的5′端的58個(gè)核苷酸序列(pos.312-369th)。且該片段369個(gè)核苷酸序列中在第25個(gè)堿基處(對(duì)應(yīng)于目的基因71為堿基處)有一個(gè)堿基發(fā)生突變，即71T→C，產(chǎn)生了ASP多態(tài)現(xiàn)象，其他變異堿基沒(méi)有產(chǎn)生了ASP多態(tài)現(xiàn)象。
2、ASP診斷方法建立陽(yáng)性對(duì)照引物和兩對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)拍照后直接可以判定基因型。判型方法如下1)如果一個(gè)個(gè)體陽(yáng)性引物和Allele71-C引物都有目的帶而Allele71-T引物沒(méi)有目的帶，則判型為CC純合基因型；2)如果一個(gè)個(gè)體陽(yáng)性引物和Allele71-T引物都有目的帶而Allele71-C引物沒(méi)有目的帶，則判型為TT純合基因型；3)如果一個(gè)個(gè)體陽(yáng)性引物，Allele71-C和Allele71-T引物都有目的帶，則判型為CT雜合基因型。4)如果陽(yáng)性引物或者兩對(duì)特異性引物都沒(méi)有目的帶，則判型為失敗，需要重新實(shí)驗(yàn)。根據(jù)這些判型原則，發(fā)現(xiàn)雞Ghrelin基因71位點(diǎn)含有兩個(gè)等位基因，即Allele71-T和Allele71-C，它們組成了三種基因型CC，CT，TT。片段大小為369bp，而陽(yáng)性對(duì)照的目的片段為395bp。
3、藏雞的基因頻率和基因型頻率分析表2.藏雞的基因頻率和基因型頻率分布基因型頻率 等位基因頻率品種 只數(shù)CC CT TT C T藏雞 2320.20 0.29 0.51 0.34 0.66從表2可見(jiàn)，在該西藏藏雞群體中，等位基因T的基因頻率幾乎為等位基因B的2倍，而在基因型頻率分布上，TT基因型占優(yōu)勢(shì)，CC基因型和CT基因型頻率處于劣勢(shì)。
4、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析所有雞種Ghrelin基因ASP多態(tài)性位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果表明，在695個(gè)個(gè)體中CC基因型有104個(gè)，CT基因型有137個(gè)個(gè)體，TT基因型有454個(gè)個(gè)體。所分析的性狀是七周齡體重和脛圍，十六周齡體重和脛圍，12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重。主效應(yīng)方差分析結(jié)果表明，基因型對(duì)5個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋性狀(七周齡體重和脛圍，十六周齡體重和脛圍，12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重)均有極顯著性(P＜0.01)影；多重比較結(jié)果表明基因型之間在這些性狀上也存在顯著性(P＜0.05)或極顯著性(P＜0.01)差異(表3)。具體而言，CT基因型在七周齡體重和脛圍，十六周齡體重和脛圍上極顯著(P＜0.01)的低于CC和TT基因型；CC基因型與TT基因型之間在這些性狀上也存在顯著性或極顯著性差異(除了七周齡體重在此兩種基因型之間沒(méi)有差異之外)。同時(shí)，從表4中可以看出，基因型CT與七周齡體重和脛圍，十六周齡體重和脛圍呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，然而它與12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重呈現(xiàn)正相關(guān)。這一點(diǎn)恰好反應(yīng)了雞體內(nèi)的能量代謝和支配狀況。也就是說(shuō)，對(duì)于產(chǎn)蛋雞而言，產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)量高的雞的體重和生長(zhǎng)速度就相對(duì)較小。而對(duì)于肉用型雞而言，就強(qiáng)調(diào)高的體重和生長(zhǎng)速度，而產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)量相對(duì)較低了。
總之，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了雞Ghrelin基因序列(GenBank登陸號(hào)AY303688)71位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)。在次位置發(fā)生了C→T突變，產(chǎn)生了三種基因型，分別為CC，CT和TT；其中，CT基因型顯著地(P≤0.05)跟雞七周齡體重和脛圍，十六周齡體重和脛圍負(fù)相關(guān)，跟12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。換句話說(shuō)，基因型CT跟雞低的七周齡體重和脛圍，十六周齡體重和脛圍及高的12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重有顯著性關(guān)聯(lián)(P＜0.05＝。
表3.雞Ghrelin基因ASP基因型與部分生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀的關(guān)聯(lián)分析之多重比較結(jié)果位基因 十六周齡脛七周齡體重 七周齡脛圍十六周齡體重12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù) 12個(gè)月總蛋重點(diǎn)型 圍CC233.027±7.087aA5.392±0.076A863.450±20.371A7.828±0.098A108.125±13.398bB5345.079±709.231bB71CT211.759±7.973B4.989±0.085B593.220±22.947C7.211±0.110C161.229±9.176A7779.875±485.767ATT242.488±4.990aA5.295±0.053A812.362±14.360B7.672±0.069B141.125±3.612aB7012.345±191.228aB注同一列的不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01＝，同一列的不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05＝。
表4.基因型與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀之間的關(guān)系位點(diǎn) 基因型關(guān)系 性狀名71 CT負(fù)向相關(guān)七周齡體重CT負(fù)向相關(guān)七周齡脛圍CT負(fù)向相關(guān)十六周齡體重CT負(fù)向相關(guān)十六周齡脛圍CT向相關(guān) 12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù)CT正向相關(guān)12個(gè)月總蛋重序列表

序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明用于進(jìn)行ASP檢測(cè)雞生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋性狀的Ghrelin基因部分原序列；序列表SEQ ID NO2和SEQ ID NO3是本發(fā)明用于進(jìn)行ASP檢測(cè)雞生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋性狀Ghrelin基因多態(tài)性的Allele71-C特異性引物對(duì)序列；序列表SEQ ID NO4和SEQ ID NO7是本發(fā)明用于進(jìn)行ASP檢測(cè)雞生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋性狀Ghrelin基因多態(tài)性的Allele71-T特異性引物對(duì)序列。
序列表SEQ ID NO5和SEQ ID NO6是本發(fā)明用于進(jìn)行ASP檢測(cè)雞生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋性狀Ghrelin基因多態(tài)性的陽(yáng)性對(duì)照引物對(duì)序列。
序列表SEQ ID NO4是本發(fā)明利用ASP進(jìn)行雞生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋性狀檢測(cè)的Ghrelin基因部分DNA序列。
圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程2是用于進(jìn)行ASP檢測(cè)雞生長(zhǎng)發(fā)育Ghrelin基因多態(tài)性的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
圖3是該發(fā)明中PCR產(chǎn)物序列以及該序列中的5個(gè)新堿基突變(藍(lán)色加下劃線的為發(fā)生突變的堿基)。圖中黑色下畫(huà)線的片段為引物序列，*表示與DNA序列(GenBank登陸號(hào)AY303688)一致的Ghrelin基因的核苷酸，突變堿基用藍(lán)色加下劃線表示，第一個(gè)藍(lán)色加下劃線的堿基T為71位點(diǎn)的突變堿基。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1雞Ghrelin基因ASP多態(tài)性在4個(gè)中國(guó)地方雞品種中的分布檢測(cè)分析(1)SEQ ID NO；2(Allele71-C)引物對(duì)5’-TTTTGCCAGTTTTCCTCTGTAATAC-3’(正向引物)SEQ ID NO35’-CTAGAGCCAGCCAGAGCAGTTT-3’ (反向引物)SEQ ID NO4(Allele71-T)引物對(duì)5’-TTTTGCCAGTTTTCCTCTGTAAGTT-3’(正向引物)SEQ ID NO75’-CTAGAGCCAGCCAGAGCAGTTT-3’ (反向引物)SEQ ID NO5(陽(yáng)性對(duì)照)引物對(duì) 5’-TGAAGCAACAAAGGTAAC-3′ (正向引物)SEQ ID NO65’-TTCTGTCCCAAGGATG-3′ (反向引物)(2)PCR擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)總體積為20μl，其中雞基因組DNA約50-60ng，10×buffer withMgCl2(MBI Fermentas)，0.3mmol/L dNTP，每種ASP引物濃度為0.1μmol/L，1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)。PCR擴(kuò)增程序95□預(yù)變性5min，然后95□20s，59□(兩對(duì)特異性引物)或者55□(陽(yáng)性對(duì)照引物)20s，72□30s，35個(gè)循環(huán)，最后72□延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。記錄基因型，用凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)拍照。檢測(cè)結(jié)果如表4所示表5.ASP多態(tài)性在4個(gè)雞品種中的分布基因型頻率等位基因頻率品種只數(shù)CC CT TT C T烏骨雞 41 0.17 0.15 0.68 0.24 0.76北京油雞25 0.04 0.00 0.96 0.04 0.96鹿苑雞 39 0.13 0.18 0.69 0.22 0.78茶花雞 24 0.17 0.25 0.58 0.29 0.71根據(jù)表5的基因型和基因頻率的結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的4個(gè)雞品種中，都是T等位基因占優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例2ASP多態(tài)性在蕭山雞、固始雞、斗雞和大骨雞的分布的檢測(cè)分析。操作步驟應(yīng)用了如實(shí)施例1所述的步驟，其結(jié)果如表6所示表6.ASP多態(tài)性在4個(gè)雞品種中的分布基因型頻率 等位基因頻率品種 只數(shù)CC CT TT CT蕭山雞20 0.00 0.10 0.90 0.05 0.95固始雞27 0.00 0.00 1.00 0.00 1.00斗雞 28 0.06 0.06 0.89 0.09 0.91大骨雞29 0.06 0.03 0.92 0.07 0.93從表6可見(jiàn)，在4個(gè)中國(guó)地方雞種蕭山雞、固始雞、斗雞和大骨雞中，T等位基因占優(yōu)勢(shì)，為主導(dǎo)等位基因。
實(shí)施例3ASP檢測(cè)四個(gè)雞種的Ghrelin基因多態(tài)性的基因型頻率及等位基因頻率分布結(jié)果如表8所示。操作步驟應(yīng)用了如實(shí)施例1所述的步驟。
表7.ASP多態(tài)性在4個(gè)雞品種中的分布基因型頻率 等位基因頻率品種 只數(shù)CC CT TT CT狼山雞27 0.11 0.48 0.41 0.35 0.65白耳雞33 0.12 0.15 0.73 0.20 0.80仙居雞41 0.05 0.32 0.63 0.21 0.79隱性白96 0.29 0.16 0.55 0.37 0.63總體而言，在上述4個(gè)地方雞種的自然群體中，T等位基因占優(yōu)勢(shì)，幾乎為C等位基因頻率的2-4倍；而TT基因型除了狼山雞外在其它三個(gè)品種中占優(yōu)勢(shì)；狼山雞中，CT基因型占有一定優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例4申請(qǐng)人用建立起的ASP診斷方法，對(duì)一個(gè)來(lái)自青藏高原上的藏雞(232只)和一個(gè)外來(lái)商業(yè)品種隱性白(96只)的328份DNA樣品進(jìn)行Ghrelin基因的多態(tài)性檢測(cè)并和雞的七周齡體重和脛圍，十六周齡體重和脛圍性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；對(duì)上述表1中的絲毛烏骨雞，北京油雞，鹿苑雞，茶花雞，蕭山雞，固始雞，大骨雞，狼山雞，白耳雞，仙居雞10個(gè)品種的所有個(gè)體進(jìn)行Ghrelin基因的多態(tài)性檢測(cè)并和雞的12個(gè)月的產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。檢測(cè)方法采用了如實(shí)施例1所述的操作步驟。
檢測(cè)結(jié)果表明，在藏雞和隱性白328個(gè)個(gè)體中CC基因型有74個(gè)，CT基因型有82個(gè)，TT基因型有172個(gè)個(gè)體；在絲毛烏骨雞，北京油雞，鹿苑雞，茶花雞，蕭山雞，固始雞，大骨雞，狼山雞，白耳雞，仙居雞中CC基因型有28個(gè)，CT基因型有53個(gè)，TT基因型有251個(gè)個(gè)體。基因型與生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表8和表9。主效應(yīng)方差分析結(jié)果表明，基因型對(duì)藏雞和隱性白雞七周齡體重和脛圍，十六周齡體重和脛圍有極顯著性影響(P＜0.01)(表8)；多重比較結(jié)果表明，CT基因型在12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重上極顯著(P＜0.01)的高于CC和TT基因型；CC基因型與TT基因型之間在這兩個(gè)指標(biāo)上也存在顯著性差異(P＜0.05＝(表9)。
表8.藏雞和隱性白基因型的主效應(yīng)方差分析(部分表格)來(lái)源 因變量三類方差和 自由度 均方F值 顯著性修正模型7周齡體重(g) 795793.482(j)11 72344.86223.520 0.0007周齡脛圍(mm) 124.787(1) 11 11.344 32.269 0.00016周齡體重(g) 8165608.370(n) 11 742328.034 29.139 0.00016周齡脛圍(mm) 214.674(p) 11 19.516 33.163 0.000截距7周齡體重(g) 10484183.730 1 10484183.730 3408.5650.0007周齡脛圍(mm) 5454.120 1 5454.120 15514.157 0.00016周齡體重(g) 114276190.3061 114276190.3064485.7570.00016周齡脛圍(mm) 11447.9821 11447.98219453.275 0.000基因型7周齡體重(g)32858.392216429.1965.3410.0057周齡脛圍(mm)4.75022.3756.7550.00116周齡體重(g)2244709.40821122354.70444.0570.00016周齡脛圍(mm)11.05525.5289.3930.000誤差7周齡體重(g) 968888.138 315 3075.8357周齡脛圍(mm) 110.741 315 0.35216周齡體重(g) 8024732.563 315 25475.34116周齡脛圍(mm) 185.373 315 0.588總和7周齡體重(g) 16552633.978 3277周齡脛圍(mm) 8316.858 32716周齡體重(g) 185976862.21832716周齡脛圍(mm) 17511.148327修正總和7周齡體重(g) 1764681.620 3267周齡脛圍(mm) 235.528 32616周齡體重(g) 16190340.933 32616周齡脛圍(mm) 400.047 326
表9.Ghrelin基因ASP基因型與10個(gè)中國(guó)地方雞種部分產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀的關(guān)聯(lián)分析之多重比較結(jié)果位點(diǎn)基因型12個(gè)月產(chǎn)蛋數(shù)12個(gè)月總蛋重CC108.125±13.398bB5345.079±709.231bB71 CT161.229±9.176A7779.875±485.767ATT141.125±3.612aB7012.345±191.228aB注同一列的不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01＝，同一列的不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05＝。
序列表SEQUENCE LISTING<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>利用等位基因特異性PCR檢測(cè)與雞生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋性狀相關(guān)基因的方法及其應(yīng)用<130>
<141>2004-10-28<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>369<212>DNA<213>雞(Gallus gallus)<220>
<221>gene<222>(1)..(369)<223>
<400>1ttttgccagt tttcctctgt aatttctctc tgctaacctg tctggtccag tcattacatc60tcagttatag aagaaaacac agtaagtaat ctcttttgac aggatatatt gcctttctgc120atgcaataat tgtgctttct ttctatattt gtttggagaa acaattgcac atcattctaa180tcaggagaac tattttcact ggcttgggat tcaaccaaat acacagatta gaaaatatgt240ttaattttta acttgtgttt tcagtttgaa gcactgccta acgaagacaa ccatgtttct300cagagttatt ctgctaggaa ttctccttct cagcatcctt gggacagaaa ctgctctggc360tggctctag369<210>2<211>25
<212>DNA<213>雞(Gallus gallus)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(25)<223>
<400>2ttttgccagt tttcctctgt aatac 25<210>3<211>22<212>DNA<213>雞(Gallus gallus)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(22)<223>
<400>3ctagagccag ccagagcagt tt 22<210>4<211>25<212>DNA<213>雞(Gallus gallus)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(25)<223>
<400>4ttttgccagt tttcctctgt aagtt 25<210>5<211>18<212>DNA<213>雞(Gallus gallus)
<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(18)<223>
<400>5tgaagcaaca aaggtaac 18<210>6<211>16<212>DNA<213>雞(Gallus gallus)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(16)<223>
<400>6ttctgtccca aggatg16<210>7<211>22<212>DNA<213>雞(Gallus gallus)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(22)<223>
<400>7ctagagccag ccagagcagt tt 2權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的Ghrelin基因的分子標(biāo)記方法，其特征在于包括以下步驟(1)在體外檢測(cè)Ghrelin基因中等位基因特異性PCR(ASP)等位基因是否存在；(2)通過(guò)測(cè)序和ASP及凝膠電泳進(jìn)行ASP等位基因的檢測(cè)；(3)從雞的全血或組織中提取基因組DNA；(4)直接對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)多態(tài)性；(5)進(jìn)行基因型與雞生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于通過(guò)ASP和凝膠電泳方法檢測(cè)基因多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增出的DNA片段含有Ghrelin基因第一外顯子、內(nèi)含子和第二外顯子的部分序列，其長(zhǎng)度為369bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增獲得的Ghrelin基因序列中存在5個(gè)堿基突變位點(diǎn)，其中第71位堿基處有一個(gè)堿基突變T→C，導(dǎo)致ASP多態(tài)性，而其它4個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有ASP多態(tài)性。
5.一種與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的Ghrelin基因ASP標(biāo)記，含有如序列表SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQID NO7所示的引物序列。
6.用于權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于應(yīng)用于與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳檢測(cè)。
7.試劑盒，其中包括權(quán)利要求5的引物序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用改良ASP(等位基因特異性PCR)技術(shù)檢測(cè)雞Ghrelin基因的多態(tài)性及其評(píng)價(jià)雞的生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋性狀的方法及其檢測(cè)診斷試劑盒。主要步驟包括從雞血液或組織中提取基因組DNA、設(shè)計(jì)引物、獲得Ghrelin基因部分序列，進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序、改良ASP多態(tài)性檢測(cè)、改良ASP多態(tài)性與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析，這些結(jié)果證實(shí)了Ghrelin等位基因的存在與雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋性狀之間有顯著關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還公開(kāi)了用于擴(kuò)增Ghrelin基因片段特定序列的三對(duì)引物序列，以及該基因片段的堿基突變位點(diǎn)和ASP多態(tài)性在雞生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重)性狀上的檢測(cè)、評(píng)價(jià)和應(yīng)用，本發(fā)明為雞的標(biāo)記輔助選擇和家禽育種提供了一種新的分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1635147SQ20041006101
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月28日
發(fā)明者劉榜, 李長(zhǎng)春, 李奎, 余梅, 樊斌, 李進(jìn), 莫德林, 徐日福, 熊統(tǒng)安, 朱猛進(jìn), 強(qiáng)巴央宗, 陳國(guó)宏, 王克華, 紀(jì)素玲, 關(guān)迅 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)