專利名稱：預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種生物制品，特別是一種預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
流行性感冒病毒(influenza virus)是引起人類死亡的主要原因之一。它能引起急性呼吸道感染，嚴重危害人類的健康和生命。神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)是錨定于流感病毒脂質(zhì)雙層膜表面的一種主要糖蛋白，在病毒膜上以四聚體的形式存在。NA是流感病毒主要抗原之一，能夠誘導(dǎo)相應(yīng)的抗體產(chǎn)生。雖然NA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體沒有中和作用，不能阻止病毒進入機體，但是能夠干擾子代病毒的釋放以及病毒的傳播。
目前，人類預(yù)防流感唯一有效的方法是采用主動免疫方式，即接種流感滅活疫苗和包含有病毒表面糖蛋白的流感裂解疫苗。這些疫苗的主要有效成分是血凝素HA，由HA免疫產(chǎn)生的抗HA特異性抗體可中和病毒的感染力。但是，現(xiàn)有的流感疫苗存在著一大缺陷，那就是無論流感的滅活疫苗還是裂解疫苗，它們對預(yù)防同源毒株是非常有效的，而對于不同株的、乃至不同亞型的流感病毒不具保護力。這是由于病毒表面的HA要逃避宿主免疫壓力，經(jīng)常發(fā)生突變，從而使得本來有效的疫苗在流行季過后很快失效。事實上，WHO每年都要公布南北半球可能的流感流行毒株的型別及亞型，為制備流感滅活疫苗提供指導(dǎo)。這對于疫苗生產(chǎn)企業(yè)來說，無疑增加了流感疫苗的生產(chǎn)成本。如何才能研發(fā)出一種能預(yù)防所有的或大部分流感毒株感染的生物制品呢？核酸疫苗無疑為流感病毒的預(yù)防提供了一種良好的選擇。
核酸疫苗，又稱DNA疫苗，是近十幾年發(fā)展起來的一種新型疫苗。DNA疫苗是指利用基因重組技術(shù)直接將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA)與真核表達載體重組后，直接導(dǎo)入動物細胞內(nèi)，并通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。但是，流感病毒易突變，仍然無法克服DNA疫苗交叉保護能力較差的問題。如果找到NA基因抗流感病毒的關(guān)鍵序列，然后將各亞型流感病毒的截短片段構(gòu)建成多價DNA疫苗，就能實現(xiàn)良好的交叉保護作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶疫苗及其制備方法。該疫苗具有實用價值，它能夠有效地誘導(dǎo)宿主機體產(chǎn)生持久和全面的免疫應(yīng)答，同時引起細胞和體液免疫，以達到預(yù)防和治療流感疾病的目的。該疫苗制備方法簡單，便于生產(chǎn)、貯存和運輸，利于今后推向市場。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的預(yù)防流感病毒的截短的NA疫苗，其成分是截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，該基因編碼區(qū)全長1365核苷酸，編碼一個大小為454個氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保護序列。
本發(fā)明用截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因代替全長A/PR/8/34流感病毒NA基因，制備預(yù)防流感病毒的截短的NA疫苗。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下主要效果(1)確定了A/PR/8/34流感病毒NA基因的nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保護序列，從而為制備預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶疫苗(以下簡稱本疫苗)找到了有效的途徑。
(2)根據(jù)本疫苗的技術(shù)，我們預(yù)見可將截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因與其它亞型流感病毒株截短的NA基因構(gòu)建成預(yù)防流感病毒多價DNA疫苗。
(3)根據(jù)本疫苗的技術(shù)，我們可以預(yù)見將截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因表達成蛋白，制備預(yù)防流感病毒的蛋白疫苗。
(4)流感病毒NA DNA疫苗在不同遺傳背景的小鼠體內(nèi)都能提供較好的免疫保護。
研究表明用編碼A/PR/8/34流感病毒HA或NA的真核表達載體免疫小鼠，能有效抵抗同源病毒株攻擊。將HA、NA和NP三種DNA疫苗分別免疫BALB/c(H-2d)、B10(H-2b)和C3H(H-2k)三種不同遺傳背景的小鼠，比較各自的免疫應(yīng)答水平。研究結(jié)果顯示NADNA疫苗在所有三種小鼠中均表現(xiàn)出很高的保護水平，而HA DNA疫苗只在BALB/c小鼠中有效，NP DNA疫苗則全無效果，只引發(fā)低滴度的抗體反應(yīng)。由此說明，NA能夠作為一個有效的預(yù)防流感的抗原成分。
(5)流感病毒NA基因相對HA不易突變，具有較好的同亞型交叉保護能力。
眾所周知，流感病毒的NA基因較HA基因更為保守。在過去的100多年里，NA基因中只有N1和N2感染過人類，而流感病毒的HA中有H1、H2、H3、H5和H9共5個亞型感染過人類。即便是在同一亞型內(nèi)的毒株，HA也比NA更易發(fā)生自發(fā)點突變。研究顯示，流感病毒H1N1亞型的兩個變異株A/India/80和A/Chile/83在1980～1983的三年間，其NA抗原決定簇的蛋白序列僅有8％的改變，而兩者的HA決定簇序列卻發(fā)生了高達93％的大改變。
由于NA有著較好的穩(wěn)定性，其誘導(dǎo)交叉保護應(yīng)答的能力就成為了關(guān)注的熱點。本發(fā)明人曾從A/Guizhou/54/89(H3N2)、A/Aichi/2/68(H3N2)和A/PR/8/34(H1N1)3個流感毒株中分別制備獲得了3條NA基因，并以此構(gòu)建了3種NA DNA疫苗。對BALB/c小鼠分別免疫這3種重組真核表達載體，加強免疫后用致死量的A/Guizhou/54/89攻擊。結(jié)果顯示，免疫A/Guizhou NA真核表達載體的小鼠能完全抵抗同源毒株的攻擊，免疫A/Aichi NA真核表達載體的小鼠對同亞型變異株(A/Guizhou)的攻擊也有很高的存活率，而接種PR8 NA真核表達載體的小鼠則無法抵抗不同亞型病毒株(A/Guizhou)的攻擊。NA對于同亞型毒株的交叉保護效果得到了很好的驗證。
基于上述效果，本發(fā)明為開發(fā)出預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶疫苗提供了一條有希望的途徑。


圖1是A/PR/8/34流感病毒NA基因5′端、3′端缺失示意圖。
圖2是真核表達載體pCAGGSP7結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實例及附圖對本發(fā)明作進一步說明。
本疫苗是預(yù)防流感病毒的截短的NA疫苗，其成分是截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因。A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列，該基因編碼區(qū)全長1365個核苷酸，編碼一個大小為454個氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，該基因中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保護序列。
本疫苗包括(1)預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶核酸疫苗，即預(yù)防流感病毒的截短的NA DNA疫苗。(2)預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶蛋白疫苗。
一.預(yù)防流感病毒的截短的NA DNA疫苗用截短后的A/PR/8/34流感病毒NA基因代替全長A/PR/8/34流感病毒NA基因制得。
二.預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶蛋白疫苗根據(jù)預(yù)防流感病毒的截短的NA DNA疫苗的技術(shù)，我們可以預(yù)見將截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因表達成蛋白，以制備預(yù)防流感病毒的蛋白疫苗。
三.預(yù)防流感病毒多價DNA疫苗根據(jù)預(yù)防流感病毒的截短的NA DNA疫苗的技術(shù)，我們可以預(yù)見將截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因與其它亞型流感病毒株截短的NA基因構(gòu)建成預(yù)防流感病毒多價DNA疫苗。
四.截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因1.本專利A型流感病毒NA基因即截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，其最短保護序列的分析是通過如下步驟實現(xiàn)的PCR的方法分別從5’端或3’端對A/PR/8/34流感病毒NA基因(全長1365bp)進行了部分缺失，構(gòu)建了一系列部分缺失真核表達載體，將這些真核表達載體免疫小鼠，用致死量A/PR/8/34流感病毒攻擊，并且觀察小鼠的存活率、血清中抗NA抗體的效價和肺部病毒量。
2.具體制備方法包括以下步驟(1)從10日齡雞胚中增殖得到A/PR/8/34病毒，從中提取RNA，RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到單鏈cDNA。
(2)根據(jù)A/PR/8/34流感病毒NA基因全長核苷酸序列，在其兩個末端設(shè)計PCR引物，正向引物含有XhoI酶切位點，反向引物含有SmaI酶切位點，以cDNA為模板，對目的片段進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物用XhoI酶與SmaI酶酶切，酶切片段克隆入真核表達載體pCAGGSP7(見圖1)中，構(gòu)建成重組真核表達載體pCAGGSP7/NA。
正向引物為5’gcgctcgagggggtttaaaatgaatcca-3’。
反向引物為5’aagcccgggtttgaacagactacttgtc-3’。
(3)對所得pCAGGSP7/NA進行末端測序，確定是長度為1365個核苷酸的A/PR/8/34流感病毒NA基因，(4)用PCR的方法以pCAGGSP7/NA為模板，構(gòu)建一系列真核表達載體(引物見表1)，其中包含了從5’端或者3’端連續(xù)缺失的A/PR/8/34流感病毒NA基因，即得到截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，例如A/PR/8/34流感病毒NA基因從5′端缺失21～114個核苷酸(見圖1)；A/PR/8/34流感病毒NA基因從3′端缺失42～99個核苷酸(見圖1)。圖1中黑色橢圓點為起始密碼子，黑色方塊為終止密碼子。
表1中NA-5′-d-21表示在NA序列5′端缺失21個核苷酸，真核表達載體編碼的是全長NA基因的片段nt22-nt1365，表中NA基因其它5’端缺失構(gòu)建的真核表達載體以此類推；NA-3′-d-42表示在NA序列3′端缺失42個核苷酸，真核表達載體編碼的是全長NA基因的片段nt1-nt1320，表中NA基因其它3’端缺失構(gòu)建的真核表達載體以此類推。
(5)用QIAGEN純化試劑盒純化，用紫外分光光度法測定真核表達載體的濃度和純度，DNA的濃度和純度通過OD260、OD280確定，選取OD260/OD280比值在1.8～2.0的真核表達載體。測序驗證所獲得的截短的NA基因。經(jīng)測序確認無誤后免疫小鼠，以鑒定本疫苗效果。
擴增5’端缺失片段時，在目的片段5’端設(shè)置起始密碼子ATG。擴增5’端缺失片段方法是以起始密碼子ATG為起點，從A/PR/8/34流感病毒NA基因的5′端缺失21～114個核苷酸共7個連續(xù)位點，1個缺失為3個核苷酸的倍數(shù)。5’端的7個連續(xù)位點所對應(yīng)的截短的片段是nt22～nt1365、nt52～nt1365、nt55～nt1365、nt58～nt1365、nt61～nt1365、nt64～nt1365和nt115～nt1365。
擴增3’端缺失片段時，在目的片段5’端設(shè)置終止密碼子TAG。擴增3’端缺失片段方法是以終止密碼子TAG為起點，從A/PR/8/34流感病毒NA基因3’端缺失42～99個核苷酸共8個連續(xù)位點，1個缺失為3個核苷酸的倍數(shù)。3’端的8個連續(xù)缺失位點所對應(yīng)的截短的片段是nt1～1320、nt1～1308、nt1～1302、nt1～1299、nt1～1296、nt1～1293、nt1～1275和nt1～1263。
NA基因即A/PR/8/34流感病毒NA基因，以下同。
3.真核表達載體pCAGGSP7來源由Niwa et al(Niwa H et al.Gene 1991，108103-200.)構(gòu)建(見圖2)。其方法是將多克隆位點KpnI、XhoI、ClaI、EcoRI、SmaI、NotI和SacI插入pCAGGS的EcoRI位點得到pCAGGSP7。真核表達載體pCAGGS含雞的β-肌動蛋白啟動子成分，SV40的復(fù)制起始部位(Ori)，氨芐青霉素抗性基因，CMV瞬時增強子，牛生長激素基因(BGH)多聚A。
五.實驗材料和方法1.免疫和病毒攻擊每10只4～6周齡的雌性BALB/C小鼠為一組，表達全長NA基因的表達載體和表達截短NA基因的真核表達載體以每只每次劑量30μg/30μl TE免疫小鼠。采用股四頭肌肌肉注射法，并在接種位點兩側(cè)5mm加入正反各3次的電擊(100V電壓，電擊時間為50ms)。初次免疫后第3周再以相同劑量的真核表達載體加強免疫一次。以未免疫的小鼠作為陰性對照組，以免疫全長NA基因的小鼠作為陽性對照組。第二次免疫后第7天，用致死量(40×LD50)的A/PR/8/34(H1N1)病毒懸液通過滴鼻法攻擊小鼠。這種感染能夠引起病毒在小鼠肺部快速、廣泛的復(fù)制，使未免疫小鼠6～8天內(nèi)死亡。病毒攻擊后3～21天內(nèi)定期觀測小鼠的體重變化和死亡(見表2)。
表2是NA基因5’端和3’端缺失真核表達載體時，免疫小鼠抵抗致死量病毒感染的能力。表2中(1)病毒攻擊后第3天采集小鼠心血同時，取器官和肺，用2mlPBS(0.1％BSA)洗兩次；用MDCK細胞測肺洗液中病毒的TCID50。(2)每組小鼠的TCID50表示為平均值+SD、.*p＜0.05。(3)NA-5’-d-21表示從5’端缺失21個核苷酸，NA-3’-d-42表示從3’端缺失42個核苷酸，依此類推。
2.樣本采集病毒攻擊后第3天，將每組15只實驗小鼠分為兩部分其中5只處死用來采集心血測抗體及取肺測肺部病毒量。另外10只用來觀測小鼠的體重變化和死亡情況，以判斷真核表達載體的保護效果。攻擊后用于采血的小鼠用氯仿麻醉，平放在實驗桌上，從劍狀軟骨下方微偏左處以15～20°角插入注射器針頭，緩慢地抽取心血直至血流停止。將收集到的血液置于室溫1小時左右，使血液凝固并析出血清，然后以5000rpm離心10min，吸出血清，-20℃冰箱保存。收集的血清用來檢測真核表達載體誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體量。采完血的小鼠，從小鼠的劍突至頦部腹向切開，取出氣管和肺，注入2ml PBS(含0.1％BSA)漂洗3次，并將漂洗液離心去細胞碎片用于測病毒滴度。
3.抗體測定抗NA抗體測定采用抗體對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制分析(NI assay)的方法采用2’-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetyl neuraminic acid(簡稱4-MU)作為底物，按照Potier和Deroo等的方法進行。在熒光酶標儀(GENios，TECAN)上檢測4-MU分解后的產(chǎn)物在激發(fā)光波長為365nm和吸收光波長為460nm的條件下的熒光強度。NI效價以抑制酶活性的最高血清稀釋度來反映。A/PR/8/34流感病毒NA5’端缺失和3’端缺失真核表達載體免疫小鼠所誘導(dǎo)的抗體效價見表3。
表3說明(1)病毒攻擊后第3天采集小鼠心血，采用NI assay測定抗體效價。(2)每組小鼠的平均值±SD。(3)“+”表示能夠提供保護，“-”表示不能提供保護。
4.病毒滴度測定將氣管和肺洗液作系列10倍稀釋，用每個稀釋度感染培養(yǎng)于24孔板中的MDCK細胞，并將感染細胞置于CO2培養(yǎng)箱中。37℃培養(yǎng)48小時后，觀察細胞病變。以引起細胞病變的最低稀釋度計算出每個樣本的病毒滴度(以TCID50表示)，每個實驗組病毒滴度是用每組所有5只小鼠樣本的病毒滴度的平均值±SD來表示。
5.統(tǒng)計學(xué)分析用Student’s test對實驗組間的數(shù)據(jù)進行評定；P＜0.05定為顯著。小鼠存活率結(jié)果是否有意義用Fisher’s exact test比較實驗組和對照組來確定。
6.實驗結(jié)果NA基因5′端缺失57個核苷酸仍然具有保護效果；缺失60個核苷酸不具有保護效果。NA基因從3′端缺失63個核苷酸仍然具有保護效果；缺失66個核苷酸不具有保護效果。
(1)A/PR/8/34流感病毒截短的NA基因真核表達載體的構(gòu)建用PCR的方法從模板中擴增得到HA基因部分缺失片段，引物見表1。使用限制性內(nèi)切酶Xho I和Sma I雙酶切HA基因部分缺失片段，定向插入到同樣用Xho I和Sma I雙酶切過的pCAGGSP7表達載體中。所有構(gòu)建的NA基因部分缺失真核表達載體經(jīng)377DNA測序儀測序證實沒有發(fā)生點突變和閱讀框改變。構(gòu)建的NA基因缺失真核表達載體如圖1所示(只表示出各真核表達載體所編碼的NA基因部分缺失片段，載體部分略去)。
(2)NA基因5’端缺失的真核表達載體所提供的抗流感保護力我們構(gòu)建了一系列從NA基因5’端連續(xù)缺失的真核表達載體，見圖1。用這些真核表達載體免疫BALB/c小鼠，間隔3周后以相同的劑量加強免疫一次，二次免疫后第7天以40×LD50攻擊小鼠。病毒攻擊后第3天取肺洗液測肺部病毒量。小鼠存活率一直觀察到病毒攻擊后第3周，以確定不同真核表達載體的保護效果。結(jié)果見表2。真核表達載體pCAGGSP7/NA-5’-d-21、pCAGGSP7/NA-5’-d-51、pCAGGSP7/NA-5’-d-54、pCAGGSP7/NA-5’-d-57免疫小鼠能完全保護小鼠抵抗病毒的攻擊，小鼠肺部病毒量比陰性對照組的小鼠(即未免疫真核表達載體的小鼠)要低，但是高于陽性對照組(即免疫全長NA基因的小鼠)。而真核表達載體pCAGGSP7/NA-5’-d-60、pCAGGSP7/NA-5’-d-63、pCAGGSP7/NA-5’-d-114免疫小鼠不能保護小鼠抵抗病毒的攻擊，小鼠肺部病毒量與陰性對照相近。隨著從5’端缺失的核苷酸數(shù)增多，NA清除病毒的能力降低。由此可見從NA的5’端缺失57個核苷酸還不影響NA基因抗流感病毒的攻擊，但是缺失60個核苷酸時，NA基因的保護作用就失去了。
(3)NA基因3’端缺失的真核表達載體所提供的抗流感保護力將NA基因按照5’端連續(xù)缺失的方法從3’端作連續(xù)缺失，見圖1，構(gòu)建一系列截短真核表達載體，用以免疫小鼠，觀察其保護效果。結(jié)果見表3pCAGGSP7/NA-3’-d-42、pCAGGSP7/NA-3’-d-54、pCAGGSP7/NA-3’-d-60、pCAGGSP7/NA-3’-d-63免疫小鼠能完全保護小鼠抵抗病毒的攻擊，小鼠肺部病毒量比陰性對照鼠要低，但高于陽性對照鼠。而pCAGGSP7/NA-3’-d-66、pCAGGSP7/NA-3’-d-69、pCAGGSP7/NA-3’-d-87免疫小鼠不能保護小鼠抵抗病毒的攻擊，小鼠肺部病毒量與陰性對照相近。肺部病毒滴度隨著從3’端或5’端連續(xù)缺失的核苷酸數(shù)增多而增高但低于陰性對照。不具有保護作用的真核表達載體的肺部病毒量與陰性對照相近。結(jié)果表明NA基因從3’端連續(xù)缺失63個核苷酸時，NA基因還能抵抗流感病毒的攻擊，但連續(xù)缺失66個核苷酸時，NA基因的保護作用就失去了。
(4)NA基因5’端和3’端缺失真核表達載體所誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答血清來自于第2次免疫后第10天采集的小鼠心血，采用NI assay方法檢測抗NA抗體。表3顯示了所有NA基因缺失片段真核表達載體在小鼠體內(nèi)所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價。所有截短的NA基因誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價明顯低于全長NA基因。隨著NA基因從5’端或3’端缺失的核苷酸數(shù)目的增多，NA基因誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價下降。
六.附表表1 NA基因5’、3’端缺失所用引物

表2.表達NA基因截短片段真核表達載體免疫小鼠抵抗致死量病毒感染的能力

表3.表達NA基因截短片段真核表達載體免疫小鼠誘導(dǎo)的抗體效價

七.A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列ATGAATCCAAATCAGAAAATAATAACCATTGGATCAATCTGTATGGTAGTCGGACTAATTAGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGCACCTGGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAGTTCATCTCTTTGTCCCATCCGTGGGTGGGCTATATACAGCAAAGACAATAGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAGACGTTTTTGTCATAAGAGAGCCCTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACCTTTTTTCTGACCCAAGGTGCCTTACTGAATGACAAGCATTCAAATGGGACTGTTAAGGACAGAAGCCCTTATAGGGCCTTAATGAGCTGCCCTGTCGGTGAAGCTCCGTCCCCGTACAATTCAAGATTTGAATCGGTTGCTTGGTCAGCAAGTGCATGTCATGACGGCATGGGCTGGCTAACAATCGGAATTTCAGGTCCAGATAATGGAGCAGTGGCTGTATTAAAATACAACGGCATAATAACTGAAACCATAAAAAGTTGGAGGAAGAAAATATTGAGGACACAAGAGTCTGAATGTGCCTGTGTAAATGGTTCATGTTTTACTATAATGACTGATGGCCCGAGTGATGGGCTGGCCTCGTACAAAATTTTCAAGATCGAAAAGGGGAAGGTTACTAAATCAATAGAGTTGAATGCACCTAATTCTCACTATGAGGAATGTTCCTGTTACCCTGATACCGGCAAAGTGATGTGTGTGTGCAGAGACAATTGGCATGGTTCGAACCGGCCGTGGGTGTCTTTCGATCAAAACCTGGATTATCGAATAGGATACATCTGCAGTGGGGTTTTCGGTGACAACCCGCGTCCCAAAGATGGAACAGGCAGCTGTGGTCCAGTGTATGTTGATGGAGCAAACGGAGTAAAGGGATTTTCATATAGGTATGGTAATGGTGTTTGGATAGGAAGGACCAAAAGTCACAGTTCCAGACATGGGTTTGAGATGATTTGGGATCCTAATGGATGGACAGAGACTGATAGTAAGTTCTCTGTGAGGCAAGATGTTGTGGCAATGACTGATTGGTCAGGGTATAGCGGAAGTTTCGTTCAACATCCTGAGCTAACAGGGCTAGACTGTATAAGGCCGTGCTTCTGGGTTGAATTAATCAGGGGACGACCTAAAGAAAACACAATCTGGACTAGTGCGAGCAGCATTTCTTTTTGTGGCGTGAATAGTGATACTGTAGATTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTCACCATTGACAAGTAG
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征是預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶疫苗即預(yù)防流感病毒的截短的NA疫苗，該疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列如下ATGAATCCAAATCAGAAAATAATAACCATTGGATCAATCTGTATGGTAGTCGGACTAATTAGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATAATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGCACCTGGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAGTTCATCTCTTTGTCCCATCCGTGGGTGGGCTATATACAGCAAAGACAATAGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAGACGTTTTTGTCATAAGAGAGCCCTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACCTTTTTTCTGACCCAAGGTGCCTTACTGAATGACAAGCATTCAAATGGGACTGTTAAGGACAGAAGCCCTTATAGGGCCTTAATGAGCTGCCCTGTCGGTGAAGCTCCGTCCCCGTACAATTCAAGATTTGAATCGGTTGCTTGGTCAGCAAGTGCATGTCATGACGGCATGGGCTGGCTAACAATCGGAATTTCAGGTCCAGATAATGGAGCAGTGGCTGTATTAAAATACAACGGCATAATAACTGAAACCATAAAAAGTTGGAGGAAGAAAATATTGAGGACACAAGAGTCTGAATGTGCCTGTGTAAATGGTTCATGTTTTACTATAATGACTGATGGCCCGAGTGATGGGCTGGCCTCGTACAAAATTTTCAAGATCGAAAAGGGGAAGGTTACTAAATCAATAGAGTTGAATGCACCTAATTCTCACTATGAGGAATGTTCCTGTTACCCTGATACCGGCAAAGTGATGTGTGTGTGCAGAGACAATTGGCATGGTTCGAACCGGCCGTGGGTGTCTTTCGATCAAAACCTGGATTATCGAATAGGATACATCTGCAGTGGGGTTTTCGGTGACAACCCGCGTCCCAAAGATGGAACAGGCAGCTGTGGTCCAGTGTATGTTGATGGAGCAAACGGAGTAAAGGGATTTTCATATAGGTATGGTAATGGTGTTTGGATAGGAAGGACCAAAAGTCACAGTTCCAGACATGGGTTTGAGATGATTTGGGATCCTAATGGATGGACAGAGACTGATAGTAAGTTCTCTGTGAGGCAAGATGTTGTGGCAATGACTGATTGGTCAGGGTATAGCGGAAGTTTCGTTCAACATCCTGAGCTAACAGGGCTAGACTGTATAAGGCCGTGCTTCTGGGTTGAATTAATCAGGGGACGACCTAAAGAAAACACAATCTGGACTAGTGCGAGCAGCATTTCTTTTTGTGGCGTGAATAGTGATACTGTAGATTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTCACCATTGACAAGTAG上述A/PR/8/34流感病毒NA基因編碼區(qū)全長1365核苷酸，編碼一個大小為454個氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物；該基因中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保護序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防流感病毒神經(jīng)氨酸酶疫苗，其特征在于預(yù)防流感病毒的截短的NA疫苗是預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶核酸疫苗，即預(yù)防流感病毒的截短的NADNA疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防流感病毒神經(jīng)氨酸酶疫苗，其特征在于預(yù)防流感病毒的截短的NA疫苗是預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶蛋白疫苗。
4.一種預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因代替全長A/PR/8/34流感病毒NA基因，制備預(yù)防流感病毒的截短的NA疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于所述的截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，由以下步驟獲得(1)從10日齡雞胚中增殖得到A/PR/8/34病毒，從中提取RNA，RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到單鏈cDNA，(2)根據(jù)A/PR/8/34流感病毒NA基因全長核苷酸序列，在其兩個末端設(shè)計PCR引物，正向引物含有XhoI酶切位點，反向引物含有SmaI酶切位點，以cDNA為模板，對目的片段進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物用XhoI酶與SmaI酶酶切，酶切片段克隆入真核表達載體pCAGGSP7中，構(gòu)建成重組真核表達載體pCAGGSP7/NA，(3)對所得pCAGGSP7/NA進行末端測序，確定是長度為1365個核苷酸的A/PR/8/34流感病毒NA基因，(4)用PCR的方法以pCAGGSP7/NA為模板，構(gòu)建一系列真核表達載體，其中包含了從5’端或者3’端連續(xù)缺失的A/PR/8/34流感病毒NA基因，即得到截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，其由下述步驟驗證，(5)用QIAGEN純化試劑盒純化，用紫外分光光度法測定真核表達載體的濃度和純度，DNA的濃度和純度通過OD260、OD280確定，選取OD260/OD280比值在1.8～2.0的真核表達載體，測序驗證。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于在擴增5’端缺失片段時，在目的片段5’端設(shè)置起始密碼子ATG；在擴增3’端缺失片段時，在目的片段的3’端設(shè)置終止密碼子TAG。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于在擴增5’端缺失片段時，以起始密碼子ATG為起點，從A/PR/8/34流感病毒NA基因的5′端缺失21～114個核苷酸共7個連續(xù)位點，1個缺失為3個核苷酸的倍數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于5’端的7個連續(xù)位點所對應(yīng)的截短的片段是nt22～nt1365、nt52～nt1365、nt55～nt1365、nt58～nt1365、nt61～nt1365、nt64～nt1365和nt115～nt1365。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于在擴增3’端缺失片段時，以終止密碼子TAG為起點，從A/PR/8/34流感病毒NA基因3’端缺失42～99個核苷酸共8個連續(xù)位點，1個缺失為3個核苷酸的倍數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于3’端的8個連續(xù)缺失位點所對應(yīng)的截短的片段是nt1～1320、nt1～1308、nt1～1302、nt1～1299、nt1～1296、nt1～1293、nt1～1275和nt1～1263。
全文摘要
本發(fā)明是一種預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶疫苗及其制備方法。本疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因。A/PR/8/34流感病毒NA基因編碼區(qū)全長1365核苷酸，編碼一個大小為454個氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保護序列。用截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因代替全長A/PR/8/34流感病毒NA基因，制備本疫苗。本發(fā)明確定了A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列，并且確定了其中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保護序列，從而為制備預(yù)防流感病毒的截短的神經(jīng)氨酸酶疫苗找到了有效的途徑。
文檔編號C12N15/14GK1660421SQ20041006131
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者陳則 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所