專利名稱：一種檢測口蹄疫病毒的熒光定量pcr試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒，適用于對口蹄疫爆發(fā)疫情進(jìn)行實時監(jiān)控，可廣泛用于動物產(chǎn)品的進(jìn)出口及動物食品的安全檢測和有效方便地對病毒疫苗的效價進(jìn)行定量檢測和質(zhì)量監(jiān)控及可為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，還涉及在檢測口蹄疫爆發(fā)疫情和病毒疫苗中的用途。
背景技術(shù)：
口蹄疫病毒是一種小RNA病毒，主要引起偶蹄獸發(fā)生口蹄疫(FMD)。其發(fā)病特點是起病急、傳播快、發(fā)病率高、病畜生產(chǎn)性能迅速下降等，給畜牧業(yè)及其國際貿(mào)易帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，該病歷來都是國際社會最為關(guān)注的傳染病之一。FMD十分頑固，一旦發(fā)生，就很難消滅，有的國家甚至在宣布消滅FMD后，仍會再度爆發(fā)該病。口蹄疫的快速檢測是控制和消滅該病的前提，但口蹄疫的常規(guī)檢測方法有一些不足之處，檢測技術(shù)一般來說有血清學(xué)診斷技術(shù)、生物學(xué)試驗、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三類1.血清學(xué)診斷技術(shù)包括補(bǔ)體結(jié)合實驗、中和實驗、凝集實驗、免疫擴(kuò)散、沉淀實驗、免疫電泳技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫試驗和免疫電鏡技術(shù)等。在這些方法中得到普遍承認(rèn)、采用并且廣泛應(yīng)用的有補(bǔ)體結(jié)合實驗、間接血凝試驗、瓊脂擴(kuò)散實驗、中和實驗。但由于所有實驗均用到抗血清和抗原免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間長，材料多準(zhǔn)備周期長，檢測具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復(fù)性差。
2.生物學(xué)試驗包括動物實驗、雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品中存在抗補(bǔ)體活性，影響檢測效果。動物實驗成本高，周期長，浪費(fèi)生物資源和人力物力。
3.分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括核酸雜交、等電點聚焦電泳、寡核苷酸指紋圖譜分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、單克隆抗體技術(shù)等。核酸雜交、寡核苷酸指紋圖譜分析、等電點聚焦電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等檢測方法更適合于對病毒特性進(jìn)行更加深入的研究，由于整個系統(tǒng)操作復(fù)雜，過程繁多，成本高，不適宜同時進(jìn)行大批量檢測，因而受到很大限制。相比之下，普通RT-PCR方法特異性好，檢測靈敏度高，不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核酸片段。樣品可以是水泡皮，也可以直接用扁桃體、淋巴結(jié)、脊髓、肌肉和蹄冠、皮膚等組織，這是免疫學(xué)方法無法替代的。但這種傳統(tǒng)的定量方法測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA or RNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA or RNA拷貝數(shù)。因此，如何快速、準(zhǔn)確測定口蹄疫病毒是面臨的主要難題之一。
近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點在基因表達(dá)水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determinedby LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，16329-38)、病原體的定性(McGoldrick A，Lowings JP，Ibata G，et al.A Novel Approach to the Detection ofClassical Swine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods，1998，72125-135.；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCRassay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，831-10.)和定量檢測(Kathy F.J.Tang，Jun Wang，DonaldV.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR witha TaqMan assay[J].J.Virol.Methods，115(2004)109-114.；Michaela Schwaiger，Pascal Cassinotti.Development of a quantitative real-time RT-PCR assay withinternal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus(TBEV)RNA[J].J.Clin.Microbiol.，27(2003)136-145.；R.Frank Cooka，*，S.J.Cooka，et al，Development of a multiplex real-time reverse transcriptase-polymerase chain reactionfor equine infectious anemia virus(EIAN)[J].J.Virol.Methods，105(2002)171-179.；Birgit Liss*.Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling ofindividual cells[J].Nucleic Acids Res.，2002，Vol.30 No.17 e89.；Franck Housseaua，1imberly R.Lindseya，1，et al.Quantitative real-time RT-PCR as a method for monitoringT lymphocyte reactivity to full-length tyrosinase protein in vaccinated melanomapatients[J].J.Immunol.Methods 266(2002)87-103.；Desire N，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load by aTaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，391303-1310.；MartellM，Gomez J，Esteban JI，et al.High-Throughput Real-Time ReverseTranscription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37327-332.；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detectionand Quantification of CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fiuorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95111-119.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量主要方法，國內(nèi)目前也已有關(guān)于丙肝、乙肝、支原體、愛滋病、結(jié)核定量檢測的試劑盒上市。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒適用于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀，靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測范圍廣，穩(wěn)定性好。
本發(fā)明的另一個目的是在于提供一種熒光定量PCR試劑盒在對口蹄疫爆發(fā)疫情進(jìn)行實時監(jiān)控、病毒疫苗的效價進(jìn)行定量和對動物產(chǎn)品的進(jìn)出口及動物食品安全檢測中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明要用以下技術(shù)措施a)RNA抽提液，b)逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動Taq DNA聚合酶，c)RNA酶抑制劑，d)引物和熒光探針(TaqMan)，e)標(biāo)準(zhǔn)陽性RNA模板，f)一步法RT-PCR熒光定量反應(yīng)液及其優(yōu)化試劑牛血清白蛋白，其特征是采用一步法擴(kuò)增(One-Step RT-PCR)，即在cDNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開管蓋一步完成，在處理大量樣品省時且易于操作，有助于減少加樣誤差和交叉污染，另外用已知濃度的體外轉(zhuǎn)錄RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，使定量結(jié)果更準(zhǔn)確、直接，而用DNA為標(biāo)準(zhǔn)品時，則要考慮逆轉(zhuǎn)錄效率問題，而影響定量的準(zhǔn)確性。RT-PCR反應(yīng)液含有反轉(zhuǎn)錄和熱啟動Taq DNA聚合酶反應(yīng)液，RNA酶抑制劑及牛血清白蛋白，熒光定量反應(yīng)液含有引物和熒光探針，引物序列分別為正義引物(FP)5’-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3’(SEQ ID NO1)，反義引物(RT)5’-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3’(SEQ ID NO2)，擴(kuò)增子大小為121bp。熒光探針序列為5′FAM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3′(SEQ ID NO3)，探針的5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)，靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。標(biāo)準(zhǔn)陽性RNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(購自promega公司)載體體外轉(zhuǎn)錄制備，轉(zhuǎn)錄RNA于紫外分光光度計測A260定量并10倍梯度稀釋。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，采用一步法擴(kuò)增(One-Step RT-PCR)，即在cDNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開管蓋反應(yīng)一步完成，在處理大量樣品省時且易于操作，有助于減少加樣誤差和交叉污染。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，熒光定量反應(yīng)液由正義引物(FP)，反義引物(RT)，熒光探針(TaqMan)，2×buffer溶液，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動Taq DNA聚合酶，RNA酶抑制劑，牛血清白蛋白，無RNA酶的滅菌雙蒸組成；在本發(fā)明的一個具體方案中，熒光定量反應(yīng)液由2×buffer溶液25μl，25μmol/L正義(FP)、反義(RT)引物各2μl，25μmol/L熒光探針0.5μl，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動Taq DNA聚合酶1μl，RNA酶抑制劑1μl，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，無RNA酶的滅菌雙蒸水7.5μl組成。其中熒光探針為(SEQ ID NO3)所示的核苷酸序列，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，標(biāo)準(zhǔn)陽性RNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(購自promega公司)載體體外轉(zhuǎn)錄制備，轉(zhuǎn)錄RNA于紫外分光光度計測A260定量并10倍梯度稀釋。實驗所用的標(biāo)準(zhǔn)品制備過程為PCR產(chǎn)物電泳后切下含有目的片段的凝膠，用Omega公司的凝膠純化試劑盒純化，與pGEM-T載體(購自promega公司)4℃過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑取白斑PCR鑒定陽性后送博亞生物工程有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果將篩選的陽性克隆菌接種到含氨卞的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，用SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，經(jīng)Omega公司的凝膠純化試劑盒純化后，Nco I酶切后，并利用SP6啟動子(根據(jù)測序結(jié)果)體外轉(zhuǎn)錄制備RNA模板，乙醇沉淀純化后于紫外分光光度計測A260定量，并稀釋至梯度109-101拷貝/10μL，-70℃保存，轉(zhuǎn)錄所用一切物品均需無RNA酶處理。
在本發(fā)明提供檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒中，有一條一端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)另一端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5’端報告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被3’端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切活性對探針進(jìn)行切割釋放出報告基團(tuán)，這樣破壞了兩基團(tuán)之間的FRET，報告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測儀內(nèi)的熒光計檢測，模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系，所以熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對FMDV的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準(zhǔn)確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。
在本發(fā)明提供檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒中，針對口蹄疫病毒的基因組的靶片段特殊性，將反應(yīng)體系(引物和探針濃度、Mg2+濃度、擴(kuò)增程序等)的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)和定量檢測系統(tǒng)(包括LigthCycler系統(tǒng)，Roche；ABI Prism系統(tǒng)，PE Applied Bioasystems；)相結(jié)合，將其用于各種來源的口蹄疫病毒樣品的定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實驗，以及與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行比較，建立了定量檢測FMDV的方法，并研制出口蹄疫病毒的定量檢測試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應(yīng)體系中檢出10個以下的病毒基因拷貝數(shù)，檢測范圍可以達(dá)到九個數(shù)量級，是其它任何方法無法比擬的。
在本發(fā)明的另外一個方面，還提供了使用本發(fā)明的試劑盒對口蹄疫病毒進(jìn)行檢測的方法，該方法包括下列步驟A)用e)標(biāo)準(zhǔn)陽性RNA模板由插入目的片段的pGEM-T(購自promega公司)載體體外轉(zhuǎn)錄制備，并用紫外分光光度計定量；B)用a)RNA抽提液從待測標(biāo)本和陰陽性標(biāo)準(zhǔn)品中提取RNA，然后加C)f)一步法RT-PCR熒光定量反應(yīng)液及其優(yōu)化試劑，c)RNA酶抑制劑和b)逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動Taq DNA聚合酶，d)引物和TaqMan探針D)將C)步中已加入了標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的熒光定量反應(yīng)液PCR反應(yīng)體系上機(jī)，用熒光定量檢測儀進(jìn)行PCR檢測；E)通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。
在本發(fā)明中提供的檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒可對各種來源的口蹄疫病毒樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，從而可對口蹄疫爆發(fā)疫情進(jìn)行實時監(jiān)控，可廣泛用于動物產(chǎn)品的進(jìn)出口及動物食品的安全檢測和有效方便地對病毒疫苗的效價進(jìn)行定量檢測和質(zhì)量監(jiān)控及可為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果1.與傳統(tǒng)定量方法相比，此實時熒光定量PCR具有高靈敏性，高特異性和高準(zhǔn)確性的特點，直接對PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始RNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上RNA定量。
2.與兩步法相比，本實驗采用的一步法擴(kuò)增(One-Step RT-PCR)在處理大量樣品時易于操作，在cDNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開管蓋，因而有助于減少交叉污染和加樣誤差，方便進(jìn)行高通量的樣品檢測。
3.用已知濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品可作為逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的雙重對照，這樣建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線使定量結(jié)果更準(zhǔn)確、直接，而用DNA為標(biāo)準(zhǔn)品時，則要考慮逆轉(zhuǎn)錄效率問題，而影響定量的準(zhǔn)確性。
4.檢測范圍廣，在109-101c/r濃度范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系(R＝0.9999)，檢測范圍可以達(dá)到九個數(shù)量級，已達(dá)到國際先進(jìn)水平，其靈敏度可檢測10copies以下，是其它任何方法無法比擬的。
5.適用于各種型號的熒光定量擴(kuò)增儀，一次實驗中三個重復(fù)樣品相應(yīng)的變異系數(shù)(CV)小于2％，說明其極高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
6.適用于O、A、C、Asia-1型口蹄疫病毒的快速定量檢測。
7.該實時熒光定量PCR利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線，是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實驗指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實驗指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。
實施例1 口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒組成與配制及其反應(yīng)條件A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(10次反應(yīng))RNA提取液A(4ml/管) RNA提取液B(800μl/管)一步法擴(kuò)增反應(yīng)液(315μl/管)反轉(zhuǎn)錄和熱啟動Taq DNA聚合酶(10μl/管)強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品(100倍稀 PCR反應(yīng)管(無菌、無RNA酶和DNA酶)釋定值準(zhǔn)品20μl/管，共四管)DEPC H2O(2ml/管)
陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50μl/管) 臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50μl/管)RNA酶抑制劑(400U/管)RNA提取液A為Invitrogen公司產(chǎn)品，b)逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動Taq DNA聚合酶(2U/μl)、c)一步法擴(kuò)增(RT-PCR)反應(yīng)液均購自Invitrogen公司，RNA酶抑制劑(40U/μl)購自Takara公司。
B).一步法熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是50μl)2×buffer 25μl，正義引物FP(SEQ ID NO1)和反義引物RT(SEQ ID NO2)各2μl(25μmol/L)，熒光探針0.5μl(25μmol/L)，RNA酶抑制劑(40U/μl)，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動Taq DNA聚合酶1μl，抽提的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品均為10μl，無RNAse的滅菌雙蒸水7.5μl組成。其中熒光探針為(SEQ ID NO3)所示的核苷酸序列，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)cDNA synthesis50℃(水浴)30minPCR 95℃ 5min 在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行熒光檢測。對FMDV的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，Threshold Cycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。
D).熒光定量PCR試劑盒檢測口蹄疫病毒的靈敏度、檢測范圍及穩(wěn)定性的用途取轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)品RNA109-101c/10μl濃度范圍，每個濃度三個重復(fù)，加RNA裂解液400μl充分混勻，室溫靜置10分鐘，加80μl氯仿，室溫靜置3分鐘，于4℃12000g/min離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管，加200μl異丙醇，室溫沉淀10分鐘，4℃ 12000g/min離心10分鐘，輕輕倒出上清，加1ml 75％乙醇充分吹散，于4℃ 7500g/min離心5分鐘，棄上清，RNA沉淀在室溫下自然干燥，加無RNA酶水10μl 60℃ 10min溶解。
E).取D)步所提RNA 10μl，然后加一步法熒光定量反應(yīng)液2×buffer 25μl，正義引物FP(SEQ ID NO1)和反義引物RT(SEQ ID NO2)各2μl(25μmol/L)，熒光探針0.5μl(25μmol/L)，RNA酶抑制劑(40U/μl)，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動Taq DNA聚合酶1μl。
分別加入對應(yīng)編號的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環(huán)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃30s，60℃90s，擴(kuò)增40個循環(huán)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行，檢測波長為518nm。
循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶分析軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為


以上結(jié)果表明該試劑盒檢測范圍廣，在109-101c/r濃度范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R＝0.9999其檢測范圍可以達(dá)到九個數(shù)量級，其靈敏度可檢測10copies以下，且穩(wěn)定性好，一次實驗中三個重復(fù)樣品相應(yīng)的變異系數(shù)(CV)小于2％，說明其極高的重復(fù)性，適用于各種型號的熒光定量擴(kuò)增儀，是其它任何方法無法比擬的。
實施例2熒光定量PCR試劑盒檢測對不同型口蹄疫病毒的檢測及與傳統(tǒng)的病毒滴度定量測定方法蝕斑滴定進(jìn)行比較A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(10次反應(yīng))RNA提取液A(4ml/管) RNA提取液B(800μl/管)一步法擴(kuò)增反應(yīng)液(315μl/管)反轉(zhuǎn)錄和熱啟動Taq DNA聚合酶(10μl/管)強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品(100倍稀 PCR反應(yīng)管(無菌、無RNA酶和DNA酶)釋定值準(zhǔn)品20μl/管，共四管)DEPC H2O(2ml/管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50μl/管) 臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50μl/管)RNA酶抑制劑(400U/管)RNA提取液A為Invitrogen公司產(chǎn)品，b)逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動Taq DNA聚合酶(2U/μl)、c)一步法擴(kuò)增(RT-PCR)反應(yīng)液均購自Invitrogen公司，RNA酶抑制劑(40U/μl)購自Takara公司。
B).一步法熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是50μl)2×buffer 25μl，正義引物FP(SEQ ID NO1)和反義引物RT(SEQ ID NO2)各2μl(25μmol/L)，熒光探針0.5μl(25μmol/L)，RNA酶抑制劑(40U/μl)，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動Taq DNA聚合酶1μl，抽提的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品均為10μl，無RNAse的滅菌雙蒸水7.5μl組成。其中熒光探針為(SEQ ID NO3)所示的核苷酸序列，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)cDNA synthesis50℃(水浴)30minPCR 95℃ 5min 在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行熒光檢測。對FMDV的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，Threshold Cycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。
D.熒光定量PCR試劑盒檢測對不同型口蹄疫病毒的檢測及與傳統(tǒng)的病毒滴度定量測定方法蝕斑滴定進(jìn)行比較分別取O、A、C、Asia-1型口蹄疫病毒感染的動物組織病料，剪碎研磨后取少量加RNA裂解液400μl充分混勻，室溫靜置10分鐘，加80μl氯仿，室溫靜置3分鐘，于4℃ 12000g/min離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管，加200μl異丙醇，室溫沉淀10分鐘，4℃ 12000g/min離心10分鐘，輕輕倒出上清，加1ml 75％乙醇充分吹散，于4℃ 7500g/min離心5分鐘，棄上清，RNA沉淀在室溫下自然干燥，加無RNA酶水10ul 60℃10min溶解。
E.取D步所提RNA 10μl，然后加一步法熒光定量反應(yīng)液2×buffer 25μl，正義引物FP(SEQ ID NO1)和反義引物RT(SEQ ID NO2)各2μl(25μmol/L)，熒光探針0.5μl(25μmol/L)，RNA酶抑制劑(40U/μl)，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動Taq DNA聚合酶1μl。
分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環(huán)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃30s，60℃90s，擴(kuò)增40個循環(huán)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行，檢測波長為518nm。
循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶分析軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為O、A、C、Asia-1型口蹄疫病毒在定量擴(kuò)增儀上有明顯的熒光信號增加，并具有完美的動力學(xué)曲線，所以該熒光定量RT-PCR系統(tǒng)可成功用于O、A、C、Asia-1型口蹄疫病毒的檢測。
2.取O型口蹄疫病毒細(xì)胞毒原液100μl，10倍梯度稀釋，先用熒光定量PCR檢測試劑盒測定病毒粒子數(shù)，然后再用蝕斑滴定法檢測。編號分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。每個樣品三個重復(fù)，結(jié)果取其平均值如下表

UD病毒濃度太大無法測定病毒蝕斑滴定法鋪滿單層BHK-21消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，加入12孔板1ml/孔，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞形成90％單層，吸棄細(xì)胞上清，用1％雙抗、2％FBS的MEM洗一次，加入0.1ml病毒懸液，每個濃度3個重復(fù)，37℃溫育90min，每隔15min輕輕晃動一次以確保病毒均勻吸附，吸棄病毒懸液，用1％雙抗、2％FBS的MEM洗兩次，加入0.6-0.8ml/孔終濃度為0.4％溫度43-45℃的營養(yǎng)瓊脂糖(營養(yǎng)瓊脂糖配方2×MEM與去離子水配制并滅菌的PH7.2-7.4的0.8％瓊脂糖以等體積混合，于43-45℃水浴中保溫)，于超凈臺上20min冷卻凝固后，移入CO2培養(yǎng)箱，72hour后，加入含2％結(jié)晶紫的10％的甲醛溶液200μl，于通風(fēng)櫥中染色2hour，吸棄結(jié)晶紫，用自來水沖掉瓊脂糖，觀察蝕斑并計數(shù)。
從上述實驗對比可以說明，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，在檢測范圍內(nèi)有極高的線性相關(guān)性，(R＝0.9999)而蝕斑滴定法由于方法本身的限制，檢測范圍很窄，檢測靈敏度比熒光定量低兩個數(shù)量級，其結(jié)果受細(xì)胞狀態(tài)影響會導(dǎo)致測毒不準(zhǔn)。而且，熒光定量PCR檢測試劑盒對病毒的檢測定量僅需4個小時就能完成，而傳統(tǒng)的蝕斑滴定法約需1周左右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間。
該試劑盒的操作只需1人即可完成整個定量操作過程，一次可檢測32-384個(由定量檢測儀的型號決定)樣品，這樣極大地提高了效率也減少了人力資源的浪費(fèi)。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>一種檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用<130>一種檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>1gaacacattc tttacaccag gat 23<210>2<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>2catatctttg ccaatcaaca tcag 24<210>3<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>3acaacctacc gccgagccaa ttc 23
<210>4<211>121<212>RNA<213>人工合成<400>4gaacacauuc uuuacaccag gaugaugauu ggcagauuuu gugcucaaau gcacucaaac 60aacggaccgc gaauuggcuc ggcgguaggu uguaacccug auguugauug gcaaagauau120g12權(quán)利要求
1.一種檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有a)RNA抽提液，b)逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動Taq DNA聚合酶，c)RNA酶抑制劑，d)引物和TaqMan探針，e)標(biāo)準(zhǔn)陽性RNA模板，f)RT-PCR熒光定量反應(yīng)液，其特征是引物序列分別為正義引物5’-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3’，反義引物5’-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3’，擴(kuò)增子大小為121bp，熒光探針序列為5′FAM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3′，探針的5′端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽性RNA模板由已插入口蹄疫病毒3D區(qū)121bp片段的pGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄制備RNA，并于紫外分光光度計測A260定量并10倍梯度稀釋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征是一步法逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增熒光定量反應(yīng)液是由2×buffer，25μmol/L的正義引物和反向義引物，25μmol/L熒光探針，逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動Taq DNA聚合酶，RNA酶抑制劑，無RNA酶的滅菌雙蒸水及牛血清白蛋白組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征是標(biāo)準(zhǔn)陽性模板RNA核苷酸序列為gaacacauuc uuuacaccag gaugaugauu ggcagauuuu gugcucaaau gcacucaaac aacggaccgcgaauuggcuc ggcgguaggu uguaacccug auguugauug gcaaagauau g
4.一種用于實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒制備方法，它包括下列步驟A.標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)品處理向一高壓滅菌且無RNase處理的1.5ml Ep中加入400μLRNA提取液a 4℃保存，再加入40μL液體或20-40mg固體及陽性標(biāo)準(zhǔn)品吹打混勻，再加入RNA提取液b 80μL混勻，室溫靜置10min，4℃12000g離心10min，小心吸取上清轉(zhuǎn)移到另一管中，加入400μL異丙醇，室溫靜置5min，4℃12000g離心10min，沉淀加入500μL 75％的乙醇，震蕩混勻，4℃7500g離心5min，沉淀干燥5-10min后用DEPC水溶解，使用或-70℃保存；B.一步法RT-PCR擴(kuò)增及實時熒光檢測向PCR反應(yīng)管中依次加入一步法熒光定量反應(yīng)液31.5μl，牛血清白蛋白1μl，濃度為5mg/ml，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動TaqDNA聚合酶1μl，抽提標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品和無RNA酶的滅菌雙蒸水共17.5μl，混勻瞬時離心后放入熒光定量擴(kuò)增儀上運(yùn)行程序為50℃30min，95℃5min，94℃30s，60℃90s，共40個循環(huán)，在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行熒光檢測，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的基因拷貝數(shù)。
5.權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR試劑盒在定量檢測口蹄疫病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測口蹄疫病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒利用熒光探針(TaqMan)和正義引物、反義引物并直接以體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的雙重對照，使得定量結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。可高效方便地對病毒疫苗的效價進(jìn)行定量檢測和質(zhì)量監(jiān)控及對口蹄疫爆發(fā)疫情進(jìn)行實時監(jiān)控，同時可廣泛用于動物產(chǎn)品的進(jìn)出口及動物食品的安全檢測，也可為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。
文檔編號C12Q1/25GK1661088SQ20041006142
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者鄭從義, 顧潮江, 屈三甫 申請人:武漢大學(xué)