專利名稱：中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物序列及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于分子生物學(xué)方法檢測(cè)中藥材的技術(shù)領(lǐng)域的鑒定引物序列及其鑒定方法，特別是一種中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物序列及其鑒定方法。
背景技術(shù)：
中藥肉蓯蓉(Herba Cistanches)為列當(dāng)科植物肉蓯蓉(Cistanche deserticolaY.C.Ma)的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，是傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥?，F(xiàn)代研究證明肉蓯蓉具有調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、增強(qiáng)體力和抗疲勞、抗肝炎、抗腫瘤、通便作用以及鎮(zhèn)靜、抗衰老及促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等作用。肉蓯蓉生于干旱沙漠，為根寄生植物，寄主為梭梭(Haloxylon ammodena Bunge)、白梭梭(H.persicum Bunge)、檉柳、鹽爪爪、珍珠柴和白刺等。肉蓯蓉屬植物全世界約有20余種，主要分布于歐、亞洲溫暖的干燥地區(qū)，我國(guó)分布有4種，即肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉(C.salsa(C.A.Mey.)G.Beck)、管花肉蓯蓉(C.tubulosa(Schrenk.)R.Wight)、沙蓯蓉(C.sinensis G.Beck)，其中肉蓯蓉為《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的中藥肉蓯蓉的基源植物，因其藥材粗壯、密被鱗片、質(zhì)感柔潤(rùn)而備受歡迎。由于肉蓯蓉生長(zhǎng)繁殖的特殊性，加之療效顯著而被人為的濫挖以及大批砍伐其寄主梭梭，致使肉蓯蓉野生資源急驟減少，因此同屬其它植物也在各地區(qū)作肉蓯蓉入藥。市場(chǎng)上甚至有鎖陽(yáng)(Cynomorium songaricum Rupr.)混淆使用。
鑒于肉蓯蓉藥材資源緊缺以及市場(chǎng)上偽品較多等問(wèn)題，因此需要快速、準(zhǔn)確鑒別藥材真?zhèn)蔚姆椒?。然而傳統(tǒng)的形態(tài)及理化方法鑒定要求有一定的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于破碎后的藥材就更加難以準(zhǔn)確鑒別。基于DNA序列的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)則不存在這方面的問(wèn)題，同時(shí)具有用量少、效率高、準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)。對(duì)于肉蓯蓉的開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)有著重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物序列及其鑒定方法。使其能夠?qū)θ馍惾厮幉臏?zhǔn)確鑒別其真?zhèn)?，有益于控制藥材質(zhì)量，同樣適用于海關(guān)檢驗(yàn)等相關(guān)部門的使用。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明肉蓯蓉聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鑒定引物序列為引物15’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’，引物25’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。
本發(fā)明的中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定方法為1)藥材DNA的提取按常規(guī)方法進(jìn)行，用無(wú)離子水將受試樣品模板DNA濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5ng/μl。
2)鑒別性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系以50μl為參考，引物用無(wú)離子水調(diào)至10pmol/μl，各試劑的用量分別為10×TaqDNA聚合酶緩沖液 5μlMgCl2(25mM) 3μldNTP(10mM) 1μl引物1 1.5～2.0μl引物2 1.5～2.0μl供試樣品DNA模板40～60ngTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位無(wú)離子水 加到50μl混勻后，瞬時(shí)離心3)鑒定反應(yīng)條件反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，94℃預(yù)變性5分鐘，然后按照下列參數(shù)進(jìn)行40次循環(huán)反應(yīng)變性94℃ 50秒復(fù)性50～55℃ 1分鐘延伸72℃ 1分鐘循環(huán)結(jié)束后在72℃保持8分鐘，反應(yīng)結(jié)束后在4℃保存。
4)反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取出上述反應(yīng)混和液6～8μl，與2μl加樣緩沖液混合均勻，用2％瓊脂糖凝膠，電壓5v/cm，電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
所述的2％瓊脂糖凝膠是指含0.5％溴化乙錠，即EB。
5)若有陽(yáng)性擴(kuò)增，則供試樣品為正品肉蓯蓉；若為陰性，即無(wú)擴(kuò)增條帶，則供試樣品不為肉蓯蓉。
本發(fā)明解決了中藥材肉蓯蓉真?zhèn)蔚蔫b別問(wèn)題，在對(duì)肉蓯蓉的研究中設(shè)計(jì)了可以鑒別肉蓯蓉的一對(duì)高效特異性引物。該引物在給定的反應(yīng)條件下只特異性地鑒別肉蓯蓉，對(duì)于其他種類的肉蓯蓉藥材或偽品均不能擴(kuò)增出該基因片段。由于應(yīng)用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，因此可以快速方便地檢測(cè)樣品的真?zhèn)?，通常只需要極少量的樣品，用此引物還可以制造用于肉蓯蓉鑒別的試劑盒。本發(fā)明對(duì)于從事中藥生產(chǎn)、銷售的部門快速準(zhǔn)確地鑒定肉蓯蓉，控制藥材質(zhì)量是十分必要，對(duì)于各地藥檢部門打擊假冒偽劣藥材，凈化藥材市場(chǎng)將是十分有效的。肉蓯蓉植物為瀕危保護(hù)植物，其資源的保護(hù)尤為重要，本發(fā)明的方法同樣適用于海關(guān)檢驗(yàn)等相關(guān)部門的使用。


圖1是實(shí)施例的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果示意圖其中M為100bp分子量梯度，1為鹽生肉蓯蓉，2為沙蓯蓉，3為肉蓯蓉，4為管花肉蓯蓉，5為空白對(duì)照。
具體實(shí)施方法首先用植物DNA提取試劑盒(QIAGEN，Germany)從不同肉蓯蓉植物中提取總DNA，用ISSR-PCR方法擴(kuò)增并比較擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)不同種植物的特異性片段進(jìn)行純化、克隆，并測(cè)序，根據(jù)測(cè)序后DNA序列再設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行不同植物樣品的PCR擴(kuò)增，直至根據(jù)克隆、測(cè)序所獲得的引物能夠針對(duì)某種植物或藥材只能擴(kuò)增出單一條帶。針對(duì)肉從藥材以及偽、混品出現(xiàn)的情況，分別設(shè)計(jì)一對(duì)鑒別性PCR引物引物15’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’，引物25’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。
用全自動(dòng)DNA合成儀按上述DNA序列進(jìn)行合成，即可得到鑒定引物的白色粉末結(jié)晶。以上均為本發(fā)明的基礎(chǔ)工作，本發(fā)明的使用者只需按實(shí)施例實(shí)施即可藥材DNA的提取按常規(guī)方法進(jìn)行，用無(wú)離子水將受試樣品模板DNA濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5ng/μl。
鑒別性聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)體系以50μl為參考，引物用無(wú)離子水調(diào)至10pmol/μl，各物品的用量分別為10×TaqDNA聚合酶緩沖液 5μlMgCl2(25mM) 3μldNTP(10mM) 1μl引物117μl引物216μl供試樣品DNA 2.0～3.0μlTaq DNA聚合酶1.0單位無(wú)離子水 加到50μl混勻后，瞬時(shí)離心。
聚合酶鏈反應(yīng)條件反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，94℃預(yù)變性5分鐘，然后按照下列參數(shù)進(jìn)行40次循環(huán)反應(yīng)變性94℃ 50秒復(fù)性50～55℃ 1分鐘延伸72℃ 1分鐘循環(huán)結(jié)束后在72℃保持8分鐘，反應(yīng)結(jié)束后在4℃保存。
反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取出上述反應(yīng)混和液6～8μl，與2μl加樣緩沖液混合均勻，用2％瓊脂糖凝膠(含0.5％溴化乙錠，即EB)，電壓5v/cm，電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，如圖1所示。
權(quán)利要求
1.一種中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物序列，其特征在于，肉蓯蓉聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鑒定引物序列為引物15’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’，引物25’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。
2.一種中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定方法，其特征是，具體方法為1)藥材DNA的提取按常規(guī)方法進(jìn)行，用無(wú)離子水將受試樣品模板DNA濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5ng/μl；2)鑒別性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系以50μl為參考，引物用無(wú)離子水調(diào)至10pmol/μl；3)鑒定反應(yīng)條件反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，94℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行40次循環(huán)反應(yīng)；4)反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取出上述反應(yīng)混和液6～8μl，與2μl加樣緩沖液混合均勻，用2％瓊脂糖凝膠，電壓5v/cm，電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；5)若有陽(yáng)性擴(kuò)增，則供試樣品為正品肉蓯蓉；若為陰性，即無(wú)擴(kuò)增條帶，則供試樣品不為肉蓯蓉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定方法，其特征是，所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)各試劑的用量分別為10×TaqDNA聚合酶緩沖液5μl，MgCl2(25mM)3μl，dNTP(10mM)1μl，引物1 1.5～2.0μl，引物2 1.5～2.0μl，供試樣品DNA模板2.0～3.0μl，Taq DNA聚合酶1.0～2.0單位，無(wú)離子水加到50μl，混勻后，瞬時(shí)離心。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定方法，其特征是，所述的循環(huán)反應(yīng)按照下列參數(shù)進(jìn)行變性94℃50秒，復(fù)性50～55℃1分鐘，延伸72℃1分鐘，循環(huán)結(jié)束后在72℃保持8分鐘，反應(yīng)結(jié)束后在4℃保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定方法，其特征是，所述的2％瓊脂糖凝膠是指含0.5％溴化乙錠。
全文摘要
一種中藥肉蓯蓉聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物序列及其鑒定方法，鑒定引物序列為引物15’－AGA GAG AGA GAG AGA GTC－3’，引物25’－AAC TCG TGACAA CCA CAC－3’。具體方法為藥材DNA的提取按常規(guī)方法進(jìn)行，用無(wú)離子水將受試樣品模板DNA濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5ng/μl；鑒別性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系以50μl為參考，引物用無(wú)離子水調(diào)至10pmol/μl；鑒定反應(yīng)條件在基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，94℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行40次循環(huán)反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取出上述反應(yīng)混和液6～8μl，與2μl加樣緩沖液混合均勻，用2％瓊脂糖凝膠，電壓5v/cm，電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；若陽(yáng)性，則為正品；若為陰性，則不為正品。本發(fā)明能夠?qū)θ馍惾厮幉哪軌驕?zhǔn)確鑒別其真?zhèn)?，有益于控制藥材質(zhì)量，同樣適用于海關(guān)檢驗(yàn)等相關(guān)部門的使用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1635148SQ20041006678
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者李曉波, 屠鵬飛, 金鑫, 王敬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)