專利名稱：一種檢測(cè)多藥耐藥基因多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及臨床個(gè)體基因型的測(cè)定方法，具體涉及一種檢測(cè)多藥耐藥基因多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
不同病人對(duì)同一藥物表現(xiàn)出不同的藥物療效和毒副作用的現(xiàn)象一直困擾著臨床醫(yī)療及制藥業(yè)。隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)與分子藥理學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到不同個(gè)體對(duì)同一藥物反應(yīng)的不同大多源于個(gè)體基因的差異，主要是由于藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、藥物作用靶點(diǎn)(如受體)等藥物相關(guān)基因的多態(tài)性造成。最常見(jiàn)的人類基因的多態(tài)性形式是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP在基因組中廣泛存在，據(jù)報(bào)道，平均每500bp就會(huì)產(chǎn)生1個(gè)SNP。SNP主要從以下兩個(gè)方面導(dǎo)致人類個(gè)體的多樣性(1)編碼區(qū)SNP(cSNP，即coding region SNP)cSNP可以改變基因的編碼，使得基因表達(dá)的蛋白質(zhì)中某些氨基酸發(fā)生變化，而影響其功能。這可以看作基因“質(zhì)”上的變化。(2)調(diào)節(jié)區(qū)SNP(rSNP，regulatory SNP)這些rSNP往往會(huì)影響基因的表達(dá)和調(diào)控，使基因的表達(dá)量產(chǎn)生變化。不同人群間的SNP等位頻率可以有相當(dāng)大的差異，某些SNP甚至呈現(xiàn)群體專一性。因此存在于這些酶、受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因上的任何能引起蛋白質(zhì)“質(zhì)”或“量”改變的SNPs都可能影響藥效的發(fā)揮。
P-糖蛋白(P-gp)是由多藥耐藥基因(multidrug resistance gene，MDR1)編碼的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。它是ATP依賴的跨膜外流泵，能從細(xì)胞內(nèi)向外泵藥物或其代謝物，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。這些藥物包括抗腫瘤藥物、地高辛、環(huán)孢素A(CsA)和HIV-1抑制劑等多種藥物。已知MDR1基因由28個(gè)外顯子組成，含有29個(gè)SNPs，其中，26外顯子C3435T的多態(tài)性與MDR1和P-gp的功能和表達(dá)密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，具有TT型的健康白種人群中，P-gp的表達(dá)比其他基因型(CC和CT型)低2倍，三種基因型的血藥濃度和藥物清除率存在差別。
目前檢測(cè)SNP的方法主要有變性梯度凝膠電泳(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、單鏈構(gòu)像多態(tài)性(SSCP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和直接測(cè)序法等。DGGE和SSCP均耗時(shí)長(zhǎng)、檢出率低、成本高；由于并不是所有的SNP都能找到相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，因此RFLP法應(yīng)用受到限制；直接測(cè)序法雖結(jié)果準(zhǔn)確，但耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)多藥耐藥基因多態(tài)性的方法。具體涉及一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定多藥耐藥基因C3435T多態(tài)性的方法。本方法可用以預(yù)測(cè)患者服用P-糖蛋白底物的藥物，如抗腫瘤藥物、地高辛、環(huán)孢素A(CsA)和HIV-1抑制劑等藥物后的血藥濃度及療效。
本發(fā)明方法通過(guò)下述步驟進(jìn)行，①樣品預(yù)處理抽取測(cè)試者全血，提取基因組DNA；②PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)針對(duì)多藥耐藥基因(Genbank accession noAC005068)第26外顯子C3435T位點(diǎn)的引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出序列1的包括C3435T位點(diǎn)的長(zhǎng)度為248bp的產(chǎn)物；③DHPLC檢測(cè)SNPs直接用變性高效液相色譜(denaturing high-performanceliquid chromatography，DHPLC)分析上述PCR產(chǎn)物，其中，DHPLC的變性溫度為58～65℃，流動(dòng)相起始為45％～50％的A液和50％～55％的B液組成的梯度溶液，其中A液含0.1mol的三乙胺醋酸鹽溶液(TEAA，Transgenomic)，B液含0.1mol三乙胺醋酸鹽溶液和20％～25％v/v的乙腈溶液(ACN)。結(jié)束梯度為35％～40％的A液和60％～65％的B液。以0.5ml/min～1.0ml/min的速度帶至DNA分離柱，洗脫液為100％的D液，其中含73％～77％v/v的ACN。
④根據(jù)洗脫峰形判斷基因的多態(tài)性。
本發(fā)明方法采用變性高效液相色譜技術(shù)，檢測(cè)了40余例健康志愿者C3435T的單核苷酸多態(tài)性，并與DNA測(cè)序法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示完全相符。本發(fā)明方法的敏感度和特異性可達(dá)96％～100％，明顯高于常用的變性梯度凝膠電泳(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、單鏈構(gòu)像多態(tài)性(SSCP)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)等變異檢測(cè)技術(shù)。上述DGGE和SSCP均耗時(shí)長(zhǎng)、檢出率低、成本高；由于并不是所有的SNP都能找到相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，因此RFLP法應(yīng)用受到限制；與直接測(cè)序法比較，本發(fā)明方法靈敏度和精確度高，檢測(cè)更快速，成本更低，可用以預(yù)測(cè)病人服藥后血藥濃度與基因型的關(guān)系。具有下述優(yōu)點(diǎn)1.高通量檢測(cè)適合于大規(guī)模SNPs的篩查，2.自動(dòng)化程度高能減輕勞動(dòng)強(qiáng)度，提高檢測(cè)效率，3.靈敏度和特異性均較高與直接測(cè)序相當(dāng)，檢測(cè)未知的SNPs的準(zhǔn)確率可達(dá)95％以上，4.快速且成本較低每份標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)10分鐘，平均費(fèi)用約為40元人民幣，5.將數(shù)份DNA樣品混合后組成樣品池，如其中存在雜合突變可立即檢測(cè)到，使成本進(jìn)一步降低，6.檢測(cè)結(jié)果直觀易判斷。


圖1是本發(fā)明方法DHPLC檢測(cè)結(jié)果峰形圖，其中，(A)為CC型；(B)為C/T型；(C)為TT型；(D)為可用待測(cè)標(biāo)本與control等體積混合后，同樣條件進(jìn)行DHPLC檢測(cè)，如待測(cè)樣本峰形不變，仍為單一峰形，則為CC型(純合型)，如顯示雜合峰形，則為TT型(純合突變型)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1抽取測(cè)試者全血0.5ml，采用UltraPureTM基因組DNA快速提取試劑盒(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)，完成DNA的提取。然后設(shè)計(jì)序列2和序列3的針對(duì)多藥耐藥基因第26外顯子C3435T位點(diǎn)的引物，正向(Forward)5’-TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3’；反向(Reverse)5’-ACATTAGGCAGTGACTCGATGAAGGCA-3’，在總體積25μl的PCR反應(yīng)體系中，各成份的終濃度為DNA模板25ng，Taq酶1u，1倍濃度緩沖液內(nèi)含MgCl22.0mmol/L，Tris-HCl 10mmol/L和KCl 50mmol/L，dNTP 0.2mol/L，primers各0.3μmol/L。PCR反應(yīng)條件為94℃先預(yù)變性1min，然后94℃變性30s，在54～60℃中復(fù)性30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5min，擴(kuò)增出包含C3435T位點(diǎn)的長(zhǎng)度為248bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物無(wú)需純化，直接用變性高效液相色譜分析。所述DHPLC分析在自動(dòng)化儀器(Transgenomic WAVETMDNA片段分析系統(tǒng))中進(jìn)行。樣品在95℃下變性3min后，緩慢退火至室溫，自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)吸取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。
上述的變性溫度為58～65℃，流動(dòng)相起始為45％～50％的A液和50％～55％的B液組成的梯度溶液。所述A液含0.1mol的三乙胺醋酸鹽溶液，B液含0.1mol的三乙胺醋酸鹽溶液和20％～25％v/v的乙腈溶液，結(jié)束梯度為35％～40％的A液和60％～65％的B液。以0.5ml/min～1.0ml/min的速度帶至DNA分離柱，洗脫液為100％的D液，含73％～77％v/v ACN。
雜合型(CT型)顯示兩個(gè)峰，純合的CC型和TT型均為單一峰，為了區(qū)分這兩種基因型，用待測(cè)標(biāo)本與control(對(duì)測(cè)序驗(yàn)證基因型為純合CC型的模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR的產(chǎn)物作為control)等體積混合后在95℃下變性3min～7min，然后緩慢退火至室溫。退火處理后的PCR產(chǎn)物進(jìn)樣，同樣方法進(jìn)行DHPLC檢測(cè)。如待測(cè)樣本峰形不變，仍為單一峰形，則為CC型(純合型)；如顯示雜合峰形，則為TT型(純合突變型)。
實(shí)施例2抽取測(cè)試者全血0.5ml，采用UltraPureTM基因組DNA快速提取試劑盒，完成DNA的提取。然后設(shè)計(jì)針對(duì)多藥耐藥基因第26外顯子C3435T位點(diǎn)的引物，F(xiàn)orward5’-TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3’；Reverse5’-ACATTAGGCAGTGACTCGATGAAGGCA-3’，在總體積50μl的PCR反應(yīng)體系中，各成份的終濃度為DNA模板約50ng、Taq酶約2u、緩沖液(MgCl22.0mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、KCl 50mmol/L)為1倍濃度，dNTP 0.2mol/L，primers各0.7μmol/L。PCR反應(yīng)條件為94℃先預(yù)變性1min，然后94℃變性1min，在54～60℃中復(fù)性1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5min，擴(kuò)增出包含C3435T位點(diǎn)的長(zhǎng)度為248bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物無(wú)需純化，在自動(dòng)化儀器(Transgenomic WAVETMDNA片段分析系統(tǒng))中直接用變性高效液相色譜分析。每個(gè)樣品在95℃下變性7min后，退火至室溫，自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)吸取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。
上述的變性溫度為58～65℃，流動(dòng)相起始為45％～50％的A液和50％～55％的B液組成的梯度溶液。所述A液含0.1mol的三乙胺醋酸鹽溶液，B液含0.1mol TEAA和20％～25％v/v的乙腈溶液，結(jié)束梯度為35％～40％的A液和60％～65％的B液。以0.5ml/min～1.0ml/min的速度帶至DNA分離柱，洗脫液為100％的D液，含73％～77％v/v ACN。
用待測(cè)標(biāo)本與control(對(duì)測(cè)序驗(yàn)證基因型為純合CC型的模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR的產(chǎn)物作為control)等體積混合后在95℃下變性3min～7min后，退火至室溫。退火處理后的PCR產(chǎn)物進(jìn)樣，同樣方法進(jìn)行DHPLC檢測(cè)。區(qū)分雜合型峰與純合型峰這兩種基因型，如待測(cè)樣本峰形不變，仍為單一峰形，則為CC型(純合型)；如顯示雜合峰形，則為TT型(純合突變型)。
本發(fā)明方法所采用儀器為PCR擴(kuò)增儀(GeneAmpPCR System 9700，USA)；WAVE DNA FRAGMENT ANALYSIS SYSTEM2100型(TRANSGENOMIC)；PCR擴(kuò)增儀(Biometra，Germany)；紫外凝膠成像系統(tǒng)(UV/WHITE ANALYSIS RS-200，上海復(fù)日科技有限公司)；DYY-III-8B電泳儀(北京六一儀器廠)；臺(tái)式離心機(jī)(市購(gòu))。
多藥耐藥基因序列1.txtSEQUENCE LISTING<110>復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院<120>一種檢測(cè)多藥耐藥基因多態(tài)性的方法<130>Fudan-041011<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>248<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>exon<222>(1)..(248)<400>1aca tta ggc agt gac tcg atg aag gca tgt atg ttg gcc tcc ttt gct48Thr Leu Gly Ser Asp Ser Met Lys Ala Cys Met Leu Ala Ser Phe Ala1 5 10 15gcc ctc aca atc tct tcc tgt gac acc acc cgg ctg ttg tct cca tag96Ala Leu Thr Ile Ser Ser Cys Asp Thr Thr Arg Leu Leu Ser Pro20 25 30gca atg ttc tca gca atg ctg cag tca aac agg atg ggc tcc tgg gac 144Ala Met Phe Ser Ala Met Leu Gln Ser Asn Arg Met Gly Ser Trp Asp35 40 45acg atg ccc agg tgt gct cgg agc cac tga aca ttc agt cgc ttt att 192Thr Met Pro Arg Cys Ala Arg Ser His Thr Phe Ser Arg Phe Ile50 55 60tct ttg cca tca agc agc tga aaa caa gag ttc aca gat caa ctt cag 240Ser Leu Pro Ser Ser Ser Lys Gln Glu Phe Thr Asp Gln Leu Gln65 70 75gac cag ca248Asp Gln<210>2<211>27<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(27)<220>
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多藥耐藥基因序列1.txt<220>
<221>exon<222>(1)..(27)<400>3aca tta ggc agt gac tcg atg aag gca 27Thr Leu Gly Ser Asp Ser Met Lys Ala1 權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)多藥耐藥基因多態(tài)性的方法，其特征是包括下述步驟，①樣品預(yù)處理抽取測(cè)試者全血，提取基因組DNA；②PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)多藥耐藥基因(Genbank accession noAC005068)第26外顯子C3435T位點(diǎn)的引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出包括C3435T位點(diǎn)的產(chǎn)物；③DHPLC檢測(cè)SNPs直接用變性高效液相色譜分析上述PCR產(chǎn)物，其中，變性溫度為58～65℃，流動(dòng)相起始為45％～50％的A液和50％～55％的B液組成的梯度溶液，A液含0.1mol的三乙胺醋酸鹽溶液，B液含0.1mol三乙胺醋酸鹽溶液和20％～25％v/v的乙腈溶液；結(jié)束梯度為35％～40％的A液和60％～65％的B液；以0.5ml/min～1.0ml/min的速度帶至DNA分離柱，洗脫液為100％的D液，其中含73％～77％v/v乙腈溶液。④根據(jù)洗脫峰形判斷基因的多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)多藥耐藥基因多態(tài)性的方法，其特征是所述的PCR擴(kuò)增出的包括C3435T位點(diǎn)的產(chǎn)物具有序列1的序列，長(zhǎng)度為248bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)多藥耐藥基因多態(tài)性的方法，其特征是所述的多藥耐藥基因第26外顯子C3435T位點(diǎn)的引物具有序列2和序列3的序列。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及臨床個(gè)體基因型的測(cè)定方法，具體涉及一種檢測(cè)多藥耐藥基因多態(tài)性的方法。本發(fā)明方法采用變性高效液相色譜技術(shù)，檢測(cè)多藥耐藥基因C3435T的單核苷酸多態(tài)性，敏感度和特異性可達(dá)96％～100％，明顯高于常用的變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳、單鏈構(gòu)像多態(tài)性和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性等變異檢測(cè)技術(shù)；檢測(cè)結(jié)果顯示與DNA測(cè)序法完全相符。與直接測(cè)序法比較，本發(fā)明方法靈敏度和精確度高，檢測(cè)更快速，成本更低?？捎靡灶A(yù)測(cè)病人服藥后血藥濃度與基因型的關(guān)系。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1673391SQ20041006706
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2004年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月11日
發(fā)明者鐘明康, 梁惠琪, 焦正 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院