專利名稱：α－葡萄糖苷酶固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種α-葡萄糖苷酶固定化的工藝方法，屬有機(jī)化學(xué)酶化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道，日本、歐美和中國(guó)都很關(guān)注低聚異麥芽糖的工業(yè)化生產(chǎn)和相關(guān)研究工作，作為低聚異麥芽糖工業(yè)化生產(chǎn)關(guān)鍵酶制劑α-葡萄糖苷酶，倍受國(guó)內(nèi)外食品工業(yè)界的重視。而由于α-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性和可控性欠佳，以及價(jià)格昂貴等問(wèn)題，在一定程度上制約了低聚異麥芽糖的發(fā)展和應(yīng)用。而酶工程的主要內(nèi)容就是把游離酶固定化，稱為固定化酶。采用固定化酶技術(shù)，不但能降低成本，還能提高酶的耐酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、耐有機(jī)溶劑性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性等，而且能增強(qiáng)工程可控性，因此與游離酶相比，具有明顯優(yōu)勢(shì)。
在固定化酶領(lǐng)域中，關(guān)鍵技術(shù)是交聯(lián)試劑與載體的選擇及其最佳匹配。目前普遍用于固定具有胺基功能載體的交聯(lián)試劑是戊二醛。但該交聯(lián)試劑存在一些如下問(wèn)題在交聯(lián)反應(yīng)中醛基與胺基所形成的C＝N席夫鍵易于水解，特別是在較高溫度時(shí)水解更嚴(yán)重，在固定化過(guò)程中，酶活性損失較大；在貯存中由于自動(dòng)聚合而形成很多不同物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定；另外戊二醛也是一種有毒物質(zhì)，對(duì)操作者身體不利。國(guó)外報(bào)道有一種新型的交聯(lián)試劑-三羥甲基磷，可用于具有胺基功能的載體，交連反應(yīng)在室溫下自動(dòng)進(jìn)行。據(jù)報(bào)道，用該三羥甲基磷交聯(lián)試劑固定化的酶有尿素酶、醇脫氫酶等，但未見(jiàn)用該試劑固定α-葡萄糖苷酶的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種α-葡萄糖苷酶的固定化的工藝方法。
本發(fā)明的一種α-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以殼聚糖為載體，用三羥甲基磷交聯(lián)固定α-葡萄糖苷酶，該方法具有以下工藝步驟a.殼聚糖的預(yù)處理先制備高脫乙酰度殼聚糖，取一定量的殼聚糖，加入一定濃度的NaOH溶液，在130℃下攪拌反應(yīng)時(shí)間5小時(shí)，然后水洗至中性，在105℃下干燥，經(jīng)粉粹，過(guò)120目的篩，得到經(jīng)預(yù)處理的殼聚糖，其脫乙酰度為93％；
b.三羥甲基磷的制備取等摩爾量的四羥甲基氯化磷和KOH，分別溶于水中，在室溫和劇烈攪拌下把KOH水溶液滴加到四羥甲基氯化磷水溶液中，滴加完畢則反應(yīng)結(jié)束，得三羥甲基磷；c.交聯(lián)固定α-葡萄糖苷酶將前述經(jīng)預(yù)處理過(guò)的殼聚糖迅速加入至上述的含有三羥甲基磷的反應(yīng)液中，在室溫下反應(yīng)8分鐘，然后過(guò)濾，并水洗殘留的四羥甲基氯化磷，然后再用pH6.0，含有1mM的巰基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行洗滌，最后加入濃度為0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶1ul；在5℃下進(jìn)行固定化，時(shí)間為2小時(shí)；待固定化完畢，用PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗出未交聯(lián)的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考馬斯亮藍(lán)G-250法的監(jiān)測(cè)下，進(jìn)一步用1M的NaCl水溶液洗盡未交聯(lián)的酶，接著再依次用水、PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，最后在4℃下保存存在于緩沖液中的固定化的α-葡萄糖苷酶。
固定α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)式如下所示 三羥甲基磷(THP)能與胺基物質(zhì)發(fā)生Mannich反應(yīng)，所以能與具有胺基功能的載體殼聚糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，交聯(lián)反應(yīng)在室溫下自動(dòng)進(jìn)行，所形成的P-CH2-N鍵非常穩(wěn)定，不水解，可長(zhǎng)期保存。
上述工藝步驟中，磷酸鉀緩沖液中加入巰基乙醇是防止酶在溫度高和沖洗過(guò)程中失活，EDTA則是防止有重金屬毒害酶。
本發(fā)明以殼聚糖為載體，用三羥甲基磷交聯(lián)固定α-葡萄糖苷酶，克服了傳統(tǒng)使用的交聯(lián)劑戊二醛的不足，特別是在固定化過(guò)程中在較高溫度時(shí)，使酶活性損失減少，酶的復(fù)活回收率較高。另外，本發(fā)明方法固定的α-葡萄糖苷酶的耐酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、耐有機(jī)溶劑性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性與游離的酶和用戊二醛作交聯(lián)劑固定的該酶相比，均有較大提高。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)將本發(fā)明的具體實(shí)施例敘述于后。
實(shí)施例一本實(shí)施例的具體工藝步驟如下a.殼聚糖的預(yù)處理先制備高脫乙酰度殼聚糖，取20g殼聚糖，加入350mL濃度為40％NaOH，在130℃下攪拌反應(yīng)時(shí)間5小時(shí)，然后水洗至中性，在105℃干燥，經(jīng)粉粹，過(guò)120目的篩，得預(yù)處理的殼聚糖，其脫乙酰度為93％。
b.三羥甲基磷(THP)的制備取等摩爾量的四羥甲基氯化磷(THPC)和KOH，分別溶于90mL和10mL的水中，在室溫和劇烈攪拌下，把KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢則反應(yīng)結(jié)束。該反應(yīng)液中所得到的三羥甲基磷(THP)的濃度為2.5mg/ml。
c.交聯(lián)劑固定α-葡萄糖苷酶將前述經(jīng)處理過(guò)的殼聚糖70mg迅速加入于上述100ml含三羥甲基磷的反應(yīng)液中(濃度為2.5mg/ml，則相當(dāng)于250mg三羥甲基磷)，在室溫反應(yīng)8分鐘。然后進(jìn)行過(guò)濾，并用水洗殘留的三羥甲基磷(THP)，然后用pH6.0，含有1mM的巰基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸鉀緩沖液洗滌，，最后加入1ulα-葡萄糖苷酶(0.1U/mL)，在5℃下進(jìn)行固定化，固化時(shí)間為2小時(shí)；待固定化完畢，用PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗出未交聯(lián)的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考馬斯亮藍(lán)G-250法的監(jiān)測(cè)下，進(jìn)一步用1M的NaCl水溶液洗盡未交聯(lián)的酶，接著依次用水、PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗，最后在4℃下保存存在于該緩沖液中的α-葡萄糖苷酶。
本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)殼聚糖的預(yù)處理，其脫乙酰度的高低及殼聚糖的顆粒大小均直接影響著α-葡萄糖苷酶的固定化，本實(shí)施例中，脫乙酰度為93％，粒度過(guò)120目篩是比較適宜的，它能使交聯(lián)劑載體的酶增多。
本實(shí)施例中，所用的四羥甲基氯化磷(THPC)和KOH是等摩爾量，KOH不能過(guò)量，過(guò)量的OH-會(huì)催化加速生成沒(méi)有固定化能力的(HOCH2)3P＝O (THPO)和殼聚糖-CH2(HOCH2)2P＝O，不利于固定化過(guò)程。本實(shí)施例中采用四羥甲基氯化磷(THPC)來(lái)制取三羥甲基磷(THP)，其原因是THPC是一種工業(yè)化大生產(chǎn)的阻燃劑，價(jià)格便宜，易于購(gòu)得，可降低制造成本。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，本實(shí)施例中1μm游離α-葡萄糖苷酶(0.1u/ml)的OD(吸光度)為0.8，采用三羥甲基磷固定化的α-葡萄糖苷酶的OD為0.229，未被交聯(lián)固定的α-葡萄糖苷酶的OD為0.244，由計(jì)算而得固定化酶回收率為41.2％。
α-葡萄糖苷酶能水解底物PNPG產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚(PNP)，PNP在400nm處有最大紫外吸收，所以α-葡萄糖苷酶的活性可通過(guò)測(cè)定PNP在400nm處的吸光度OD值來(lái)測(cè)定。本實(shí)施例中采用UV-260型等外分光光度計(jì)在400nm處測(cè)定PNP吸光度OD值。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，三羥甲基磷交聯(lián)劑固定的α-葡萄糖苷酶具有較好的物理化學(xué)性能(1)有較強(qiáng)的耐酸堿能力，它在PH4.0條件下連續(xù)操作4小時(shí)，活性基本沒(méi)變化；在有底物PNPG的碳酸鈉溶液(0.1mol/L，PH＝10)中在37℃水浴下10分鐘，它的活性僅減少15％，而用戊二醛交聯(lián)固定的該酶其活性減少62％；游離的α-葡萄糖苷酶則馬上失活。
(2)耐有機(jī)溶劑能力強(qiáng)，它能在甲醇∶磷酸鉀(PH6.8)緩沖液＝1∶1中正常地水解底物PNPG，在甲醇∶磷酸鉀(PH6.8)緩沖液＝1∶2中水解底物PNPG的能力比正常情況下高58.5％。
(3)熱穩(wěn)定性劑儲(chǔ)存穩(wěn)定性高，固定化的α-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性劑儲(chǔ)存穩(wěn)定性要比游離α-葡萄糖苷酶高出很多，在160℃下的半衰期為17小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種α-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以殼聚糖為載體，用三羥甲基磷交聯(lián)固定α-葡萄糖苷酶，該方法具有以下工藝步驟a.殼聚糖的預(yù)處理先制備高脫乙酰度殼聚糖，取一定量的殼聚糖，加入一定濃度的NaOH溶液，在130℃下攪拌反應(yīng)時(shí)間5小時(shí)，然后水洗至中性，在105℃下干燥，經(jīng)粉粹，過(guò)120目的篩，得到經(jīng)預(yù)處理的殼聚糖，其脫乙酰度為93％；b.三羥甲基磷的制備取等摩爾量的四羥甲基氯化磷和KOH，分別溶于水中，在室溫和劇烈攪拌下把KOH水溶液滴加到四羥甲基氯化磷水溶液中，滴加完畢則反應(yīng)結(jié)束，得三羥甲基磷；c.交聯(lián)固定α-葡萄糖苷酶將前述經(jīng)預(yù)處理過(guò)的殼聚糖迅速加入至上述的含有三羥甲基磷的反應(yīng)液中，在室溫下反應(yīng)8分鐘，然后過(guò)濾，并水洗殘留的四羥甲基氯化磷，然后再用pH6.0，含有1mM的巰基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行洗滌，最后加入濃度為0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶1ul；在5℃下進(jìn)行固定化，時(shí)間為2小時(shí)；待固定化完畢，用PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗出未交聯(lián)的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考馬斯亮藍(lán)G-250法的監(jiān)測(cè)下，進(jìn)一步用1M的NaCl水溶液洗盡未交聯(lián)的酶，接著再依次用水、PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，最后在4℃下保存存在于緩沖液中的固定化的α-葡萄糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種α－葡萄糖苷酶固定化的工藝方法，屬有機(jī)化學(xué)酶化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的一種α－葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以殼聚糖為載體，用三羥甲基磷交聯(lián)固定α－葡萄糖苷酶，該方法具有以下工藝步驟(1)殼聚糖的預(yù)處理，使脫去乙?；@得高脫乙酰度的殼聚糖；(2)用四羥甲基氯化磷和KOH反應(yīng)制取三羥甲基磷；(3)交聯(lián)固定α－葡萄糖苷酶將前述經(jīng)預(yù)處理過(guò)的殼聚糖迅速加入至上述的含有三羥甲基磷的反應(yīng)液中，在室溫下反應(yīng)8分鐘，然后過(guò)濾，水洗、磷酸鉀緩沖液洗滌，最后加入濃度為0.1U/mL的α－葡萄糖苷酶1ul；在5℃下進(jìn)行固定化，時(shí)間為2小時(shí)；待固定化完畢，在依次用水、磷酸鉀緩沖液洗滌，最后在4℃下保存好固定化的α－葡萄糖苷酶。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1618959SQ200410067070
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2004年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月12日
發(fā)明者雍克嵐, 呂敬慈, 盧大勝, 陳旭, 馮偲慜, 顧慧娟 申請(qǐng)人:上海大學(xué)