專利名稱：一種誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是利用PDX-1基因在胰腺生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要作用，構(gòu)建含該基因的病毒載體，用來感染干細(xì)胞；或構(gòu)建表達(dá)載體、純化PDX-1蛋白，添加于誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化，并將獲得的細(xì)胞植入糖尿病患者體內(nèi)用于糖尿病的治療。
背景技術(shù)：
近幾年，胰島細(xì)胞移植治療糖尿病取得了一些療效，但供者細(xì)胞來源不足、嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)等困難卻極大的限制了這種療法的應(yīng)用。干細(xì)胞作為一類具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞，已經(jīng)逐漸成為人們尋找胰島細(xì)胞的新資源，如骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)易于分離培養(yǎng)擴(kuò)增，遺傳背景穩(wěn)定，體內(nèi)植入反應(yīng)較弱，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種組織細(xì)胞，是修復(fù)骨、軟骨等組織或細(xì)胞損傷的首選種子細(xì)胞，也是基因治療的理想靶細(xì)胞。
對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕蛐揎?，使之成為能分泌胰島素的細(xì)胞，是治療I型糖尿病的策略之一，而引入PDX-1基因，即胰腺十二指腸同源框蛋白1，有可能獲得能分泌胰島素的細(xì)胞。PDX-1基因在胰腺生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演了很重要的角色，它不但可以調(diào)控胰島素的表達(dá)，還可以調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(Glut-2)、葡萄糖激酶(GK)等基因的表達(dá)。
由于干細(xì)胞是相對(duì)靜止的一群細(xì)胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低，選用病毒載體則可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。腺病毒載體不整合到染色體中，攜帶的外源基因表達(dá)水平高，表達(dá)時(shí)間短，是轉(zhuǎn)染PDX-1最合適的載體。因?yàn)镻DX-1是一個(gè)調(diào)控基因，它可以啟動(dòng)自身基因及下游基因的表達(dá)，瞬時(shí)表達(dá)就足以發(fā)揮功能。
利用PDX-1具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)載體、純化PDX-1蛋白，添加于誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，可以克服基因治療的不安全因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種獲得大量胰島樣細(xì)胞團(tuán)以用于糖尿病細(xì)胞治療的方法。采用以下技術(shù)方案1)構(gòu)建含PDX-1基因的原核表達(dá)載體表達(dá)、純化PDX-1蛋白。
2)構(gòu)建含PDX-1基因的病毒載體，以腺病毒載體為例用電穿孔法使穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV-PDX-1與病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝并擴(kuò)增腺病毒。
3)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化通過直接添加PDX-1蛋白，或轉(zhuǎn)染含PDX-1基因的病毒載體，可以誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞。
4)將獲得的胰島樣細(xì)胞以一定數(shù)量植入糖尿病患者體內(nèi)，腹腔或經(jīng)肝門脈移植，可以發(fā)揮降血糖作用。
本發(fā)明的內(nèi)容未公開發(fā)表，本領(lǐng)域的技術(shù)人員如不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)根本不能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的誘導(dǎo)分化方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、PDX-1蛋白的表達(dá)、純化設(shè)計(jì)含有NdeI、XhoI位點(diǎn)的PDX-1基因上、下游引物，PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)片段，電泳回收，連入pGEM-T easy載體(Promega公司產(chǎn)品)，測(cè)序正確后，NdeI、XhoI雙酶切目的片段及pET-24a(+)，回收、連接。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并純化該蛋白。
實(shí)施例2、pAdv-PDX-1腺病毒載體的構(gòu)建攜帶PDX-1基因的質(zhì)粒由美國(guó)Hui HongXiang博士饋贈(zèng)。PDX-1是通過smaI位點(diǎn)插入PBluscriptII KS載體中的。在smaI位點(diǎn)兩端選擇BamHI及XhoI酶切。BamHI、BglII是同尾酶，故選擇BglII及XhoI酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv。將酶切產(chǎn)物電泳回收，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂卡那霉素抗性平板篩選，取1μl菌液進(jìn)行PCR鑒定。提取PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液質(zhì)粒，行雙酶切鑒定。選擇BglII及XhoI位點(diǎn)進(jìn)行酶切鑒定，切出了400bp的小片段及9.7kb的大片段。
選用PmeI酶切1μg穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv-PDX-1，70％乙醇沉淀質(zhì)粒，加5μlH2O。線性化的穿梭質(zhì)粒與100ng超螺旋質(zhì)粒pAdEasy-1電穿孔共轉(zhuǎn)化至BJ5183感受態(tài)菌中，菌液涂卡那霉素抗性平板篩選。選擇20個(gè)小克隆，分別接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液，37℃搖菌過夜。提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒均大于40kb，經(jīng)0.7％瓊脂糖電泳可初步鑒定。根據(jù)電泳結(jié)果，選取質(zhì)粒作PacI限制性酶切鑒定。重組質(zhì)?？杀幻盖谐?.5kb的小片段及38.6kb的大片段。
取鑒定好的重組病毒質(zhì)粒5μg行PacI限制性酶切。用Lipofectine 2000(Invitrogen公司產(chǎn)品)包裹線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12h后去掉轉(zhuǎn)染液，加含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7～10天，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，收集細(xì)胞，-70℃和37℃反復(fù)凍融三次，離心取上清。用病毒上清再次感染293細(xì)胞，收集上清。用TCID50法測(cè)定病毒滴度(參考AdEasy Vector Systerm操作方法)，滴度為6.3×107PFU/mL。
實(shí)施例3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增無(wú)菌條件下，擠出肋骨中的骨髓，肋骨可以由非血液系統(tǒng)疾病胸外科手術(shù)后獲得；或由非血液系統(tǒng)疾病或正常人髂后上棘抽取骨髓，約5ml。向骨髓液中加入含10％胎牛血清的α-MEM(Gibico公司產(chǎn)品)充分混合，1500r/min離心5min，棄上清，再加入5ml完全培養(yǎng)液混勻后輕輕疊加到密度為1.073的Percoll分離液上，1500r/min離心20min，取白細(xì)胞膜層以上的部分，加入完全培養(yǎng)液洗兩遍。按1×106/ml密度接種于完全培養(yǎng)基中，置37℃，5％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后更換培養(yǎng)液，以后每4d換液一次。細(xì)胞達(dá)80％融合后用25％胰酶消化，按1∶3傳代繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。
實(shí)施例4、PDX-1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化直接添加PDX-1蛋白于培養(yǎng)液中；或選擇病毒感染MSCs合適的MOI(MOI＝150)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算所需病毒量感染MSCs，孵育2h后，補(bǔ)加含有10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1周，誘導(dǎo)分化。
實(shí)施例5、胰島樣細(xì)胞團(tuán)的鑒定利用RT-PCR鑒定巢蛋白(nestin)，神經(jīng)生成素3(ngn3)，PDX-1，GK、Glu2、胰島素，胰高血糖素基因的表達(dá)。利用primer 3軟件設(shè)計(jì)基因引物，序列如下

結(jié)果表明轉(zhuǎn)染PDX-1基因的細(xì)胞(1周)弱表達(dá)nestin、ngn3、Glut2基因，高表達(dá)PDX-1，GK、胰島素，胰高血糖素基因。
利用免疫組化鑒定胰島素、胰高血糖素抗原的表達(dá)。結(jié)果顯示誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素蛋白。
利用放射免疫分析法檢測(cè)胰島素水平。挑取轉(zhuǎn)染PDX-1基因1周的細(xì)胞團(tuán)，置24孔板中，分3孔，每孔約90～100個(gè)細(xì)胞團(tuán)，直徑約150μm。各孔加入1mL含5.6mmol/L葡萄糖的KRBB緩沖液，置37℃孵箱中孵育1h。棄掉舊緩沖液，以含5.6mmol/L葡萄糖、16.7mmol/L葡萄糖的KRBB緩沖液依次孵育1h，收集上清。收集各孔的細(xì)胞團(tuán)，加入酸乙醇溶液，4℃過夜，用細(xì)胞超聲破碎儀破細(xì)胞，上清保存于-20℃。用放射免疫分析法檢測(cè)各上清中的胰島素含量。用BCA(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量。結(jié)果誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞團(tuán)在5.6mmol/L葡萄糖濃度下胞內(nèi)胰島素含量為(54.45±9.14)ng/mg蛋白；而在16.7mmol/L葡萄糖濃度下胞內(nèi)胰島素含量為(130.14±12.24)ng/mg蛋白。具有一定的糖反應(yīng)性。
實(shí)施例6、體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)首先制作糖尿病大鼠模型。取成年Wistar大鼠，雌雄不限，體重約180-200g。按70mg/kg劑量給每只大鼠腹腔注射鏈脲霉素。鏈脲霉素粉劑用0.1M檸檬酸緩沖液(pH＝4.5)配制成液體使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。當(dāng)大鼠血糖升高(≥16.7mmol/L)且穩(wěn)定一周，表明糖尿病模型已經(jīng)建成。無(wú)菌條件下，向糖尿病大鼠腎包囊下或肝門脈小分支注入1000個(gè)胰島樣細(xì)胞團(tuán)。術(shù)后，定期觀測(cè)血糖情況。結(jié)果糖尿病大鼠在植入細(xì)胞后第二周時(shí)血糖平均下降5.6mmol/L。表明誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞團(tuán)具有降血糖作用。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方法及其應(yīng)用，其特征在于利用轉(zhuǎn)錄因子PDX-1誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化，獲得的胰島樣細(xì)胞可在糖尿病的治療中應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方案，其特征在于向誘導(dǎo)培養(yǎng)液中直接添加PDX-1轉(zhuǎn)錄因子，或向干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PDX-1基因，可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
3.按照權(quán)利要求2所述的方案，其特征在于選擇構(gòu)建含有PDX-1基因的原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化該蛋白，按100nmol/L～1μmol/L濃度直接添加到培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
4.按照權(quán)利要求2所述的方案，其特征在于選擇構(gòu)建含有PDX-1基因的病毒載體，包括腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，慢病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，通過這些載體介導(dǎo)PDX-1基因在干細(xì)胞中表達(dá)，誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
5.按照權(quán)利要求4所述的病毒載體，腺病毒載體是轉(zhuǎn)染PDX-1基因的首選病毒載體。
6.按照權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞，其特征在于被用來誘導(dǎo)的干細(xì)胞可以包括胚胎干細(xì)胞，胰腺干細(xì)胞，肝干細(xì)胞，造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞等。
7.按照權(quán)利要求1所述的方案，其特征在于選用無(wú)血清誘導(dǎo)培養(yǎng)液，并向其中添加胰高血糖素樣肽-1，尼克酰胺等營(yíng)養(yǎng)素或細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染PDX-1基因或轉(zhuǎn)導(dǎo)PDX-1蛋白的干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
8.按照權(quán)利要求7所述的方案，其特征在于添加的胰高血糖素樣肽-1≤20nmol/L，尼克酰胺≤20mmol/L。
9.按照權(quán)利要求1所述的方案，其特征在于獲得的胰島樣細(xì)胞團(tuán)能表達(dá)胰島相關(guān)基因及蛋白，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子、葡萄糖激酶、胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素等。
10.按照權(quán)利要求1所述的方案，其特征在于獲得的胰島樣細(xì)胞團(tuán)通過肝門脈或腹腔等方式植入糖尿病患者體內(nèi)，可以發(fā)揮一定的降血糖功能。
全文摘要
發(fā)明名稱為一種誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種獲得大量胰島樣細(xì)胞團(tuán)并在糖尿病細(xì)胞治療中應(yīng)用的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案1)獲得PDX－1基因；2)將PDX－1基因插入原核表達(dá)載體中，表達(dá)、純化出PDX－1蛋白；或構(gòu)建含有PDX－1基因的病毒載體。3)分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增干細(xì)胞；4)向培養(yǎng)液中直接添加PDX－1蛋白，或利用病毒載體介導(dǎo)PDX－1基因在干細(xì)胞中表達(dá)，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞；5)經(jīng)肝門脈或腹腔移植，將獲得的胰島樣細(xì)胞植入糖尿病患者體內(nèi)發(fā)揮作用。本發(fā)明簡(jiǎn)化了誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方案，為糖尿病細(xì)胞治療提供了新的胰島細(xì)胞來源，為糖尿病患者實(shí)現(xiàn)自體干細(xì)胞治療自身疾病奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1637137SQ20041007064
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月6日
發(fā)明者裴雪濤, 李艷華, 張銳, 王韞芳, 閆舫 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所