專利名稱：適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用重組DNA技術(shù)表達(dá)植物甜蛋白Monellin及其制備方法，特別是用釀酒酵母表達(dá)植物甜蛋白的方法。
背景技術(shù)：
甜蛋白Monellin是存在于非洲植物Dioscoreophyllum cumminsii中的一種甜蛋白，1972年首次由美國賓州化學(xué)味覺中心分離純化。Monellin的甜度是同種重量蔗糖的3000-4000倍，1μg的量就可使人感到甜味。近年來對這種甜蛋白進(jìn)行了大量研究，其一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列已經(jīng)測定，三級結(jié)構(gòu)也已十分清楚(范長勝.甜蛋白的開發(fā)與應(yīng)用研究.食品與發(fā)酵工業(yè).2001，27(12)50～54，崔洪志，李敏，郭三堆.植物甜蛋白的研究進(jìn)展.生物技術(shù)通報.1997，(2)10～13，F(xiàn)aus，I.Characterization ofmonellin，a protein that tastes sweet.Appl microbial Biotechnol.2000，53145～147)。天然的Monellin由二條肽鏈靠非共價鍵，主要是氫鍵相連(其中A鏈44個氨基酸，B鏈50個氨基酸)，分子量為10700道爾頓。X-射線晶體衍射分析表明，該蛋白的分子結(jié)構(gòu)相對緊密，分子內(nèi)沒有大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。空間結(jié)構(gòu)由一個β折疊片及位于β折疊片內(nèi)的α螺旋構(gòu)成，分子借助于兩條鏈之間的氫鍵和疏水鍵使其結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定。
多年來用于增加食物、飼料或其它消費(fèi)產(chǎn)品甜度的物質(zhì)多是低分子量的甜味物質(zhì)，稱之為傳統(tǒng)甜味劑，其中蔗糖是應(yīng)用最廣泛的一種。然而，蔗糖作為甜味劑有許多不足之處，如易被細(xì)菌所利用，特別是幼兒食用過多易產(chǎn)生齲齒；蔗糖代謝后產(chǎn)生大量的熱量，食用過多會導(dǎo)致肥胖，不符合當(dāng)今的消費(fèi)觀念；食用蔗糖后還會誘發(fā)體內(nèi)胰島素的需要量增加，對于糖尿病人尤其不利。隨著生活水平的提高，人們對健康、天然食品的要求越來越高，對傳統(tǒng)甜味物質(zhì)的替代品研究也是人們一直感興趣的課題。甜蛋白Monellin是理想的新型甜味劑，與化學(xué)合成的甜味劑相比，其口味純正、純天然，無毒性。Monellin甜度高，熱量低，可提高食品的風(fēng)味，又不易被細(xì)菌所利用，適于糖尿病、心血管病等患者食用，且能預(yù)防兒童齲齒，因此其在食品及醫(yī)藥等行業(yè)有很高的應(yīng)用價值。在美國、歐洲和日本等國家主要用在食品加工、飲料、口香糖、蜜餞、糖果、乳制品、保健品、寵物飼料中作為添加劑或藥品輔料。但由于其自然資源少、產(chǎn)地偏僻、產(chǎn)量低，無法滿足市場需求，使甜蛋白難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的商品化生產(chǎn)。
對甜蛋白的研究和商業(yè)開發(fā)是30年前才開始的。日本采用固相合成蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行生產(chǎn)，成本很高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化水平。從20世紀(jì)80年代開始，進(jìn)行了基因工程表達(dá)Monellin的研究，人們開始嘗試通過甜蛋白基因的克隆及表達(dá)，獲得這種蛋白質(zhì)。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)甜蛋白不僅可提高甜蛋白的產(chǎn)量，還可降低成本、擴(kuò)大其在工業(yè)上應(yīng)用的范圍。天然的Monellin由兩條鏈組成，使分子結(jié)構(gòu)易在熱和酸的環(huán)境下變性，失去自然風(fēng)味。同時，雙鏈結(jié)構(gòu)造成了基因工程改造蛋白的困難，在原核生物和植物中不易表達(dá)出具有正確結(jié)構(gòu)的Monellin。1989年Kim等根據(jù)Monellin甜蛋白氨基酸序列，將編碼A、B兩條肽鏈的核苷酸連接在一起，在E.coil中成功地表達(dá)出了具有生物活性的單鏈Monellin(Kim，S.H.，Kang，C.H.，Kim，R.et al.Redesigning asweet proteinincreased stability and renaturability.Protein Engineering.1989，2(8)571～579)。單鏈Monellin甜度與天然Monellin相近，熱穩(wěn)定性和復(fù)性能力有所提高，但Monellin的表達(dá)效率很低。以后于學(xué)紅等在畢赤酵母中表達(dá)Monellin，表達(dá)量為每升發(fā)酵液為18g甜蛋白(于學(xué)紅，袁漢英，高卜渝等甜蛋白Monellin在巴斯德畢赤氏酵母中的胞內(nèi)表達(dá)，復(fù)旦學(xué)報，2002，41650-654)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明解決了基因工程表達(dá)Monellin效率不理想的問題。采用釀酒酵母偏愛密碼子，用PCR方法合成Monellin基因，并在釀酒酵母中高效表達(dá)植物甜蛋白Monellin。且選用工藝簡單、成本低的提取純化方法，為工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
大多數(shù)氨基酸由一個以上的密碼子所編碼，即存在密碼子的簡并性。而密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)的tRNA含量呈正相關(guān)，特別是對于表達(dá)量高的蛋白質(zhì)。本發(fā)明采用酵母偏愛的密碼子，完成了單鏈Monellin甜蛋白基因序列的設(shè)計及全序列人工合成，并構(gòu)建重組表達(dá)載體，導(dǎo)入酵母宿主中。由于設(shè)計序列均采用酵母偏愛密碼子，故該基因在酵母中，尤其在釀酒酵母中可獲得相對高的表達(dá)量，產(chǎn)量可達(dá)24g/L發(fā)酵液，適用于用發(fā)酵方法大批量生產(chǎn)Monellin甜蛋白。
為了合成能夠在釀酒酵母中高效表達(dá)甜蛋白的Monellin基因，本發(fā)明合成了F1、F2、R1、R2四條單鏈DNA片段以及PCR引物P1、P2寡核苷酸片段，按圖1所示用PCR方法合成Monellin基因。先經(jīng)過兩組PCR反應(yīng)，分別合成兩個DNA片段。然后以這兩個DNA片段為模板，以P1、P2為引物，再次經(jīng)PCR反應(yīng)合成出全長為294bp的Monellin甜蛋白基因。
可供選擇使用的在釀酒酵母中表達(dá)的質(zhì)粒載體有很多。這些載體都帶有完整的閱讀框架，即含有一個啟動子和一個終止子，或另外帶有其它的表達(dá)調(diào)控元件。在啟動子和終止子之間有一段多克隆位點(diǎn)，這些多克隆位點(diǎn)分別包含有若干單一酶切位點(diǎn)，選用限制酶將載體切成線狀，并用DNA連接酶將Monellin蛋白基因連接到所選載體上，從而構(gòu)建成一個在啟動子和終止子之間含有目的基因的重組載體。
本發(fā)明所述的與重組甜蛋白基因連接的酵母表達(dá)載體一般具有以下特征一是要具有在酵母中表達(dá)能力較強(qiáng)的啟動子，且具有良好的調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)；二是要具有一個有較強(qiáng)復(fù)制能力的復(fù)制子。它可以使該質(zhì)粒進(jìn)入宿主后，能隨著宿主菌的分裂而復(fù)制，從而不會丟失，并在宿主菌中保持高的拷貝數(shù)；三是具有選擇標(biāo)記，可通過施加選擇壓力，使雜菌和未轉(zhuǎn)入外源基因的空宿主菌的生長受抑制，保證發(fā)酵過程中菌體的選擇性擴(kuò)增，以提高蛋白的得率。
本發(fā)明使用酵母表達(dá)載體pYES(購自invitrogen公司)，插入本發(fā)明人工合成的Monellin甜蛋白DNA編碼序列以后得到重組表達(dá)載體，它除了攜帶有所說的甜蛋白DNA編碼序列外，還帶有T7啟動子、GAL1啟動子、CYC1終止轉(zhuǎn)錄信號、URA3基因、f1復(fù)制基因、pUC復(fù)制基因、酵母2μm復(fù)制序列、氨芐青霉素抗性基因，以及為外源蛋白高效表達(dá)所需的各種調(diào)控元件。
本發(fā)明設(shè)計了含有酵母偏愛密碼子的294bp植物甜蛋白基因，其DNA序列如下ATGGGCGAAT GGGAAATCAT CGACATCGGT CCGTTCACCC AGAACCTGGG TAAGTTCGCTGTTGACGAAG AAAACAAAAT CGGCCAGTAC GGTCGTCTGA CCTTCAACAA GGTTATCCGTCCGTGCATGA AAAAGACCAT CTACGAAGAA AACGGTTTCC GTGAAATCAA GGGTTACGAATACCAGCTGT ACGTTTACGC TTCCGACAAG CTGTTCCGTG CTGATATCTC CGAAGATTACAAGACTAGAG GTAGAAAGTT GCTGAGATTC AACGGTCCAG TTCCACCACC ATAA需要說明的是所述的甜蛋白DNA序列由酵母偏愛密碼子組成，其中所述酵母是釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母等；其中所述酵母優(yōu)選的是釀酒酵母；還包括DNA序列的酵母重組表達(dá)載體；重組載體除包括編碼甜蛋白的DNA序列外還包括在酵母中表達(dá)甜蛋白所需的調(diào)控元件；還包括重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組體細(xì)胞，即釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母重組體細(xì)胞；其重組體細(xì)胞優(yōu)選的是重組體釀酒酵母細(xì)胞。
適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白的制備方法，包括以下步驟·基于甜蛋白的氨基酸序列，合成由酵母偏愛密碼子組成的甜蛋白的DNA序列；·將上述的DNA序列與適當(dāng)?shù)妮d體相連，得到攜帶甜蛋白DNA序列的重組表達(dá)載體；·將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)慕湍杆拗髦校玫街亟M體細(xì)胞；·在適于表達(dá)所需甜蛋白的條件下，將重組體細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵。每升發(fā)酵液可生產(chǎn)甜蛋白達(dá)24g。
·分離并純化甜蛋白。具體步驟為先將發(fā)酵液進(jìn)行50～70℃pH4～5處理，分離其它蛋白質(zhì)，再過柱純化。
其中所述的甜蛋白DNA序列由酵母偏愛密碼子組成；所述的重組載體適于在釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母中表達(dá)；尤其適于在釀酒酵母中表達(dá)；所述的重組體細(xì)胞是重組體釀酒酵母細(xì)胞。
可使用任何已知的轉(zhuǎn)化方法，如氯化鈣法、電轉(zhuǎn)化法等將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)甜蛋白的表達(dá)?？晒┻x擇的宿主細(xì)胞包括釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母等在細(xì)胞內(nèi)不含有能降解Monellin甜蛋白的外源蛋白酶的酵母宿主細(xì)胞。本發(fā)明所提供的重組表達(dá)載體pYESM特別適合在釀酒酵母中表達(dá)，所以本發(fā)明優(yōu)先使用釀酒酵母作為宿主細(xì)胞。本發(fā)明人用電轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，獲得了重組體菌株。
應(yīng)用本發(fā)明所獲得的重組體菌株可以進(jìn)行Monellin甜蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。在有選擇壓力的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組體細(xì)胞，然后收集裂解菌體，最后進(jìn)行純化得到Monellin甜蛋白晶體。本發(fā)明采用玻璃珠法破碎細(xì)胞，經(jīng)高溫處理后，再調(diào)節(jié)pH值至酸性，中和后過CM-Sephadex柱層析純化，真空冷凍干燥后即得到所需的甜蛋白。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明使用重組PCR技術(shù)，選用酵母偏愛密碼子，特別是釀酒酵母偏愛密碼子，人工合成了Monellin甜蛋白基因，并構(gòu)建了重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入酵母宿主中，使Monellin甜蛋白得以高效表達(dá)，且選用工藝簡單、成本低的提取純化方法，產(chǎn)量可達(dá)24g/L發(fā)酵液。為工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。選用釀酒酵母作為宿主，安全性好，更利于甜蛋白這種食用添加劑的大量生產(chǎn)，為甜蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供一條可行途徑。
下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。


圖1甜蛋白基因的PCR擴(kuò)增示意圖；圖2甜蛋白基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖3重組質(zhì)粒的酶切鑒定；圖4重組質(zhì)粒中Monellin基因的PCR檢測；圖5甜蛋白Monellin的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；圖6編碼甜蛋白的DNA序列。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1Monellin甜蛋白基因的合成人工合成編號為R1、R2、F1、F2的單鏈DNA片段及PCR引物P1、P2寡核苷酸片段(由上海生工合成)，然后按圖1所示合成甜蛋白基因。R1、R2、F1、F2人工合成的各片段序列如下R15’-TCGTAGATGGTCTTTTTCATGCACGGACGGATAACCTTGTTGAAGGTCAGACGACCGTACTGGCCGATTTTGTTTTCTTCGTCAACAGCGAACTTACC-3′R25’-TTATGGTGGTGGAACTGGACCGTTGAATCTCAGCAACTTTCTACCTCTAGTCTTGTAATCTTCGGAGATATCAGCGCA-3’F15′-ATGGGCGAATGGGAAATCATCGACATCGGTCCGTTCACCCAGAACCTGGGTAAGTTCGCTGTTGACG-3′F25’-ATGAAAAAGACCATCTACGAAGAAAACGGTTTCCGTGAAATCAAGGGTTACGAATACCAGCTGTACGTTTACGCTTCCGACAAGCTGTTCCGTGCTGACATCTCCGAAG-3′P15′-CGGGATCCATGGGCGAATGGGAAATCATCG-3′P25’-CGGAATTCTTATGGTGGTGGAACTG-3’按下述程序，用重組PCR技術(shù)擴(kuò)增甜蛋白基因。采用20μL擴(kuò)增體系先進(jìn)行兩次擴(kuò)增(1)雙蒸水7μL，10倍緩沖液2μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物F1(20mmol/L)4μL，引物R1(20mmol/L)4μL，Taq DNA聚合酶1μL。擴(kuò)增條件為95℃3分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，20個循環(huán)；最后一個循環(huán)為72℃5分鐘，得到產(chǎn)物W1。(2)雙蒸水7μL，10倍緩沖液2μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物F2(20mmol/L)4μL升，引物R2(20mmol/L)4μL，Taq DNA聚合酶1μL。擴(kuò)增條件同上，得到產(chǎn)物W2。再進(jìn)行PCR擴(kuò)增雙蒸水28μL，10倍緩沖液5μL，dNTP(2.5mmol/)2μL，5μL產(chǎn)物W1，5μL產(chǎn)物W2，Taq DNA聚合酶1μL。擴(kuò)增條件為95℃3分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒，48℃30秒，72℃30秒，20個循環(huán)；最后一個循環(huán)為72℃3分鐘。最后加入2μL上游引物P1，2μL下游引物P2，1μL Taq DNA聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為95℃3分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒，65℃30秒，72℃30秒，25個循環(huán)；最后一個循環(huán)為72℃5分鐘，之后取2μL PCR反應(yīng)液，用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，檢測294bp的PCR產(chǎn)物。
甜蛋白基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2，圖2中1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為PCR擴(kuò)增的Monellin基因。
實(shí)施例2表達(dá)載體的制備在含氨芐青霉素(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基中接種攜帶質(zhì)粒pYES的大腸桿菌DH5α菌株(本實(shí)驗室保存)，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將1.5mL菌液轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30秒收集菌體，棄上清，空干殘液。將沉淀重懸于100μL預(yù)冷的溶液I(50mmol蔗糖，25mmol Tris，10mmol EDTA，pH8.0)，混合均勻。加入200uL新配的溶液II(0.2mol NaOH，1％SDS)，蓋緊管口，輕輕搖勻，放置冰上1-2分鐘至液體清亮。加入150μL預(yù)冷的溶液III(3mol乙酸鉀，pH4.8)，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解液中混合均勻，冰浴3-5分鐘。12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一管中，加等體積用Tris飽和的酚-氯仿-異戊醇混合液(三者的體積比為25∶24∶1)，混合均勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，再將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。加入2-2.5倍體積的無水乙醇，混勻，冰浴(或-20℃)放置30分鐘。12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集質(zhì)粒DNA沉淀。用70％乙醇洗滌沉淀2-3次，棄去殘液，空氣中干燥10-20分鐘，用20μL滅菌的雙蒸水溶解沉淀。
在微量離心管中加入5μL按上述方法制備的質(zhì)粒DNA，2μL 10倍濃度酶切緩沖液，0.5μL EcoRI，0.5μL BamHI，加入雙蒸水至總體積為20μL，于37℃保溫3-4小時，然后于65℃保溫20分鐘，使限制酶失活。取2μL樣品用瓊脂糖凝膠電泳檢測，超螺旋的pYES載體被切成線性的DNA分子。
上述酶切片段采用DNA純化試劑盒(promega公司)進(jìn)行純化。具體方法是用前充分混合Wizard DNA純化樹脂，如有結(jié)晶或沉淀出現(xiàn)，可將樹脂放入37℃保溫10分鐘，用前冷卻到25-30℃。每個樣品使用一個Wizard柱。取出3mL注射器的活塞，將注射器管體部分連接到Wizard柱的外接口上。取1mL Wizard DNA純化樹脂加到1.5mL離心管中。再加入樣品(50μL)，輕柔地顛倒幾次混勻。將結(jié)合有DNA的純化樹脂加入到注射器管中，插入活塞，緩慢地推動活塞，將樹脂與DNA的混合物壓入Wizard柱。將注射器從Wizard柱上取下，取出活塞，重新將注射器管體部分連接到Wizard柱的外接口上，向注射器管內(nèi)加入2mL異丙醇，插入活塞，輕柔推動活塞使溶液流經(jīng)Wizard柱。取下注射器，將Wizard柱放入1.5mL離心管中，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘，干燥樹脂。將Wizard柱移入新的1.5mL離心管中，向柱中加入50μL預(yù)先加熱到65-70℃的去離子水或TE緩沖液，靜置1分鐘。17000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20秒洗脫DNA片段。丟棄Wizard柱，純化好的DNA保存在4℃或-20℃條件下。所獲得的線性純化pYES即可用作連接monellin甜蛋白基因的載體。
實(shí)施例3Monellin甜蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建先將人工合成的Monellin基因的PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行割膠純化。具體操作如下用TAE緩沖液或TBE緩沖液制作1％的瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。在紫外燈下切下含有目的DNA條帶的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體，切碎膠塊。稱量膠塊重量，計算膠塊體積(按照1mg相當(dāng)于1μL計算)。向膠塊中加入膠塊融化液DR-I緩沖液，DR-I緩沖液的加入量為膠塊體積的3倍。均勻混合后75℃加熱融化膠塊，同時間斷振蕩，使膠塊充分融化(約6分鐘)。向膠塊融化液中加入DR-I緩沖液量的1/2體積的DR-II緩沖液，均勻混合。分離小于400bp的DNA片段時，在此溶液中加入終濃度為20％的異丙醇。將試劑盒中的Spin Column安置與CollectionTube上。將溶液轉(zhuǎn)移至SpinColumn中，3600轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄濾液。將500μL的RNase A加入Spin Column中，3600轉(zhuǎn)/分鐘，離心30秒，棄濾液。將700μL的RNase B加入Spin Column中，3600轉(zhuǎn)/分鐘，離心30秒，棄濾液。重復(fù)上一步驟，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘。將Spin Column安置于新的1.5mL離心管上，在SpinColumn膜的中央加入25μL水或洗脫液，室溫靜置1分鐘。12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘洗脫DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果。
取26μL純化的PCR產(chǎn)物，加入5μL 10倍濃度的酶切緩沖液，2μL EcoRI，2μLBamHI，加入雙蒸水至50μL總體積，于37℃保溫3小時，然后于65℃保溫20分鐘，使限制性內(nèi)切酶失活。用實(shí)施例2所述的方法對酶切片段進(jìn)行純化。在1.5mL管中加入3μL純化的DNA，1μL線形pYES載體，1μL連接緩沖液，1μL T4 DNA連接酶，加水至總體積為10μL，16℃連接過夜。所得到的連接混合物用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
按下述方法制備大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞。接E.coli DH5α斜面菌種接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物以1％接種量接種于另一裝有100mL LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時，使細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期(OD600＝0.6)。將三角瓶轉(zhuǎn)移到冰上放置20分鐘，3000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心15分鐘收集細(xì)胞。用10％甘油洗細(xì)胞3次，每次100mL，3000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心15分鐘，收集細(xì)胞。最后將細(xì)胞懸浮在300μL甘油中，按每份40μL分裝到預(yù)冷的離心管并迅速在液氮中冷凍，然后置-80℃保存。
使用時將感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，同時將電轉(zhuǎn)化杯也放在冰上冷卻。在一管中加入5μL上述連接混合物，一管加入3μL不含甜蛋白基因的載體質(zhì)粒，混勻后加入電轉(zhuǎn)化杯中，輕擊液體以確保細(xì)菌與DNA懸液位于電轉(zhuǎn)杯底部。打開電轉(zhuǎn)化儀，調(diào)整到Ec1檔，即專為大腸桿菌轉(zhuǎn)化設(shè)置的一檔。擦干電轉(zhuǎn)化杯外面的冷凝水和霧氣，放進(jìn)電轉(zhuǎn)化儀中，按上述設(shè)定的檔，啟動對細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，盡可能快地取出電轉(zhuǎn)杯，室溫下加入1mL SOC培養(yǎng)液。混勻后轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，于37℃培養(yǎng)1小時。按每個平板100μL涂布到含氨芐青霉素(100μg/mL)的LA平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜(16-20小時)。從平板上挑取單一菌落，接種子液體LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)12-18小時，然后小量提取質(zhì)粒DNA，用限制酶EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定。選擇能切下294bp片段的克隆，含有甜蛋白基因的重組質(zhì)粒命名為pYESM。
也可以用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌。大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)同電轉(zhuǎn)化法。培養(yǎng)好的菌液置0℃冰上冷卻10分鐘，取50mL培養(yǎng)液裝入預(yù)冷的離心管中，4℃離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘。倒出培養(yǎng)液，空干離心管。用30mL冰浴的MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸細(xì)胞沉淀。4℃離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，倒出上清液，空干離心管。用1mL冰浴的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮。按每管40μL分裝到1.5mL離心管中，-80℃保存。使用時將感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，加入5μL連接混合物，輕輕混勻，冰浴20分鐘。于42℃熱激90秒，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，放置2-3分鐘。加入SOC培養(yǎng)基1mL，37℃緩慢搖動45分鐘。按每個平板100L涂布到含氨芐青霉素(100g/mL)的LA平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜(16-20小時)。從平板上挑取單一菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-18小時，然后小量提取質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定。選擇能切下294bp片段的克隆，含有甜蛋白基因的重組質(zhì)粒命名為pYESM。
重組質(zhì)粒的酶切鑒定見圖3，在圖3中1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為重組質(zhì)粒的EcoRI+BamHI酶切，產(chǎn)生2個片段，5900bp片段為質(zhì)粒載體，294bp片段為Monellin基因。
委托TaKaRa公司對目的基因進(jìn)行序列測定，所得結(jié)果與設(shè)計的Monellin基因序列完全相同。該基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列如下M G E W E I I D I G P F T Q N1 ATG GGC GAA TGG GAA ATC ATC GAC ATC GGT CCG TTC ACC CAG AACL G K F A V D E E N K I G Q Y46 CLG GGT AAG TFC GAT GVT GDC GEA GEA ANC AAA AIC GGC CAG TYCG R L T F N K V I R P C M K K91 GGT CGT CTG ACC TTC AAC AAG GTT ATC CGT CCG TGC ATG AAA AAGT I Y E E N G F R E I K G Y E136 ACC ATC TAC GAA GAA AAC GGT TTC CGT GAA ATC AAG GGT TAC GAAY Q L Y V Y A S D K L F R A D181 TAC CAG CTG TAC GTT TAC GCT TCC GAC AAG CTG TTC CGT GCT GACI S E D Y K T R G R K L L R F226 ATC TCC GAA GAC TAC AAG ACC CGT GGT CGT AAG CTG CTG CGT TTCN G P V P P P *271 AAC GGT CCG GTT CCG CCG CCG TAA實(shí)施例4表達(dá)載體pYESM轉(zhuǎn)化釀酒酵母在含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基中接種攜帶質(zhì)粒pYESM的大腸桿菌DH5α菌株，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按實(shí)施例2的方法提取質(zhì)粒。
釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如下。從活化好的斜面上挑取菌株，YPD平板上劃線分離(YPD培養(yǎng)基配方酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，固體培養(yǎng)基加1.2％瓊脂粉)，平板在28-30℃培養(yǎng)2天。接種單菌落到裝有50mL YPAD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28-30℃，250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)過夜。然后轉(zhuǎn)接到裝有200mL YPD液體培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，使OD600＝0.3，28-30℃，200-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)4小時；再測定培養(yǎng)液的OD600值，應(yīng)在0.6-1之間，如果小于0.6，繼續(xù)培養(yǎng)1小時，如果大于1，用滅菌的YPD培養(yǎng)基稀釋到OD600＝0.6，繼續(xù)培養(yǎng)1小時，使其處于對數(shù)生長期。3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞懸浮在40mL無菌的KD緩沖液中(50mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH＝7.5)，25mmol/L DTT，在使用前新配，過濾除菌)。細(xì)胞懸浮液于30℃溫育15分鐘。4℃，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心收集菌體，細(xì)胞重新懸浮在50mL冰冷的STM緩沖液(270mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris(pH7.6)，1mmol/L MgCl2，過濾除菌，4℃保存)中。3000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心，棄上清。用緩沖液重復(fù)洗兩次，最后細(xì)胞懸浮在1mL冰冷的STM緩沖液中。按每管100μL分裝，-80℃保存。
用重組質(zhì)粒pYESM轉(zhuǎn)化釀酒酵母。利用Bio-Rad Genepulser II電轉(zhuǎn)化儀和2mm電轉(zhuǎn)化杯，在電壓1500V，電容25μF，電阻200Ω條件下轉(zhuǎn)化釀酒酵母。轉(zhuǎn)化之前將電轉(zhuǎn)化杯置于冰上冷卻。將100μL感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入1-3μg pYESM，輕輕混勻，冰浴2分鐘。將細(xì)胞、DNA混合物轉(zhuǎn)入冰凍電轉(zhuǎn)化杯中，電轉(zhuǎn)化儀經(jīng)預(yù)熱后，設(shè)定參數(shù)，按照說明書進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。用不加pYESM的感受態(tài)細(xì)胞和只加pYESM不加感受態(tài)細(xì)胞的離心管作對照。電轉(zhuǎn)化后立即加入1mL室溫的YPD培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，28-30℃靜止培養(yǎng)1小時。室溫，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，收集菌體。棄上清液，細(xì)胞懸浮在100μL YPD培養(yǎng)基中。取50μL涂SC-U平板(0.67％酵母提取物，2％葡萄糖，含微量元素，不加尿嘧啶)，28-30℃培養(yǎng)3-4天，待菌落長出。
提取轉(zhuǎn)化子總DNA接種轉(zhuǎn)化子單菌落到裝有10mL YPD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃培養(yǎng)至OD600＝5-10。室溫，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集菌體。用10mL無菌水洗滌菌體，室溫，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集菌體。細(xì)胞懸浮在2mL的SCED緩沖液(1mmol/L山梨醇，10mmol/L檸檬酸鈉(pH7.5)，10mmol/L EDTA，10mmol/L DTT，pH7.5)。加入0.1-0.3mg的Zymolyase，37℃溫育50分鐘，使原生質(zhì)體形成率小于80％。加入2mL 1％SDS，輕輕混勻，冰浴5分鐘。加入1.5mL 5mol/L醋酸鉀(pH8.9)，混勻。4℃，5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集上清液。將上清液轉(zhuǎn)入另一支離心管，加入等體積無水乙醇，室溫放置15分鐘。4℃，5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，收集沉淀。沉淀懸浮在0.7mL的TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)。加入等體積苯酚-氯仿溶液(1∶1，v/v)，4℃，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，再加入等體積的氯仿-異戊醇溶液(24∶1，v/v)，4℃，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，加入1/2體積7.5mol/L的醋酸銨(pH7.5)，兩倍體積無水乙醇，干冰中放置10分鐘或-20℃放置60分鐘，4℃，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，用1mL 70％乙醇洗滌沉淀兩次。真空干燥沉淀。每支離心管中加入50μL TE緩沖液(pH7.5)溶解沉淀。以總DNA為模板，用實(shí)施例1設(shè)計的外端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃ 4分鐘；94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 30秒，25個循環(huán)；72℃ 5分鐘。瓊脂糖凝膠電泳檢測證明，Monellin基因已插入釀酒酵母的染色體上。
重組質(zhì)粒中Monellin基因的PCR檢測見圖4，在圖4中1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為294bp的Monellin基因。
實(shí)施例5釀酒酵母重組菌株中Monellin甜蛋白基因表達(dá)的鑒定先少量提取菌體蛋白，檢測是否有外源蛋白的表達(dá)。挑取上面獲得的攜帶重組表達(dá)載體pYESM的單菌落，接種于15mL含有2％葡萄糖的SC培養(yǎng)基中，同時分別接種同樣量的攜帶質(zhì)粒pYES的釀酒酵母和未攜帶任何質(zhì)粒的釀酒酵母作為對照。28-30℃培養(yǎng)過夜。然后按1％的接種量接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(其他配方同SC，但含半乳糖)，于30℃振蕩培養(yǎng)3個小時。
將上述方法培養(yǎng)的分別攜帶質(zhì)粒pYESM的釀酒酵母和未攜帶任何質(zhì)粒的釀酒酵母的細(xì)胞懸浮液分別轉(zhuǎn)入離心管中，4℃，5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，除去上清液，收集細(xì)胞。將細(xì)胞用破壁緩沖液(50mmol/L磷酸緩沖液，1mmol DTT，10％甘油，pH7.4)懸浮于離心管中，加入15g 0.25-0.5mm玻璃珠，振蕩20次(振蕩1分鐘，冰上冷卻1分鐘)，4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，上清液含有表達(dá)的甜蛋白蛋白。取10μL上清液，用15％的聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在誘導(dǎo)表達(dá)的條件下攜帶有pYES的釀酒酵母樣品中檢測到一條約11kD的蛋白帶，這表明在誘導(dǎo)表達(dá)的條件下外源Monellin甜蛋白基因得到了表達(dá)。
甜蛋白Monellin的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測見圖5，在圖5中1為未攜帶任何質(zhì)粒的釀酒酵母；2為攜帶pYES重組質(zhì)粒的釀酒酵母；3為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例6Monellin甜蛋白的提取和純化將攜帶質(zhì)粒pYESM的釀酒酵母接種于15mL含有2％葡萄糖的SC培養(yǎng)基中，28-30℃培養(yǎng)過夜。然后按1％的接種量接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)液在4℃下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，除去上清液，收集細(xì)胞。用20mL磷酸破壁緩沖液(50mmol/L磷酸緩沖液，1mmol/L DTT，10％甘油，pH7.4)重新懸浮于Beater的容器中，加入15g 0.25-0.5mm玻璃珠，振蕩20次(振蕩1分鐘，冰上冷卻1分鐘)，在4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，上清液含有表達(dá)的甜蛋白。將獲得的蛋白制備液在60℃熱處理10分鐘，用0.2mol乙酸鈉溶液(pH3.0)調(diào)pH到4.5，4℃放置1小時。12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集上清液。用0.2mol/L的磷酸鈉溶液(pH7.0)將其中和至pH6.0。用10mmol pH7.0的磷酸緩沖液在4℃透析過夜，然后用經(jīng)磷酸緩沖液平衡的CM-Sephadex柱進(jìn)一步層析純化，用50mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液(含0.1mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，用蛋白紫外監(jiān)測儀檢測并收集含甜蛋白的洗脫物。然后透析脫鹽，用15％的聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測表達(dá)產(chǎn)物。制備物經(jīng)真空冷凍干燥后得到甜蛋白Monellin結(jié)晶體。每升發(fā)酵液可得甜蛋白結(jié)晶體24g。用雙蒸水稀釋蛋白產(chǎn)物，用品嘗法檢測其甜度。結(jié)果表明，按上述方法所制備的甜蛋白Monellin的甜度約為同等重量蔗糖的3000倍以上。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>天津科技大學(xué)<120>適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白及其制備方法<130>041012<160>1
<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>294<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(294)<400>1atgggcgaat gggaaatcat cgacatcggt ccgttcaccc agaacctggg taagttcgct 60gttgacgaag aaaacaaaat cggccagtac ggtcgtctga ccttcaacaa ggttatccgt120ccgtgcatga aaaagaccat ctacgaagaa aacggtttcc gtgaaatcaa gggttacgaa180taccagctgt acgtttacgc ttccgacaag ctgttccgtg ctgatatctc cgaagattac240aagactagag gtagaaagtt gctgagattc aacggtccag ttccaccacc ataa 29權(quán)利要求
1.適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白，其特征在于，編碼該甜蛋白的DNA序列如下ATGGGCGAAT GGGAAATCAT CGACATCGGT CCGTTCACCC AGAACCTGGG TAAGTTCGCTGTTGACGAAG AAAACAAAAT CGGCCAGTAC GGTCGTCTGA CCTTCAACAA GGTTATCCGTCCGTGCATGA AAAAGACCAT CTACGAAGAA AACGGTTTCC GTGAAATCAA GGGTTACGAATACCAGCTGT ACGTTTACGC TTCCGACAAG CTGTTCCGTG CTGATATCTC CGAAGATTACAAGACTAGAG GTAGAAAGTT GCTGAGATTC AACGGTCCAG TTCCACCACC ATAA
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白，其特征在于，所述的甜蛋白DNA序列由酵母偏愛密碼子組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白，其特征在于，其中所述酵母是釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白，其特征在于，其中所述酵母是釀酒酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白，其特征在于，還包括DNA序列的酵母重組表達(dá)載體；重組表達(dá)載體除包括編碼甜蛋白的DNA序列外，還包括在酵母中表達(dá)甜蛋白所需的調(diào)控元件。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白，其特征在于，還包括重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組體細(xì)胞，即釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母重組體細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白，其特征在于，其重組體細(xì)胞為重組體釀酒酵母細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟·基于甜蛋白的氨基酸序列，合成由酵母偏愛密碼子組成的甜蛋白的DNA序列；·將上述的DNA序列與載體相連，得到攜帶甜蛋白DNA序列的重組表達(dá)載體；·將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到酵母宿主中，得到重組體細(xì)胞；·將重組體細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵制備甜蛋白；·分離并純化甜蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白的制備方法，其特征在于，所述的甜蛋白DNA序列由酵母偏愛密碼子組成；所述的重組載體適于在釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母中表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白的制備方法，其特征在于，所述的載體特別適于在釀酒酵母中表達(dá)；所述的重組體細(xì)胞是重組體釀酒酵母細(xì)胞。
全文摘要
適于在酵母中表達(dá)的重組甜蛋白及其制備方法，屬于用重組DNA技術(shù)表達(dá)植物甜蛋白，特別是用釀酒酵母表達(dá)重組甜蛋白的方法。本發(fā)明解決了基因工程表達(dá)重組甜蛋白Monellin效率不理想的問題。其技術(shù)方案是采用酵母偏愛密碼子，用PCR方法合成甜蛋白基因，并在釀酒酵母中高效表達(dá)植物甜蛋白。包含該序列的重組表達(dá)載體以及攜帶該載體的重組體細(xì)胞。其中酵母可以是釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母等。選用釀酒酵母作為宿主，安全性好，更利于甜蛋白這種食用添加劑的大量生產(chǎn)，產(chǎn)量可達(dá)24g/L發(fā)酵液，為工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/29GK1603416SQ20041007232
公開日2005年4月6日 申請日期2004年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月14日
發(fā)明者路福平, 陳忠軍, 杜連祥, 戚薇, 王敏, 黎明, 蔡恒 申請人:天津科技大學(xué)