專利名稱：全長fro的制作方法
所屬領域本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術領域或植物基因工程領域，尤其是一種全長FRO2基因的克隆和構建。
背景技術：
果樹具有多年生、童期長、自交不親和、雜合程度高、多無性繁殖等特點，使采用基因轉(zhuǎn)移技術獲得轉(zhuǎn)基因植物新品種逐漸成為果樹育種的重要手段。最早是1988年以核桃體系為外植體，通過農(nóng)桿菌介導，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。而后又在許多果樹上進行了研究，如在核桃上又相繼導入了ICP基因和CHS基因，獼猴桃上已轉(zhuǎn)入水稻的homebox基因，Sagi等在香蕉中轉(zhuǎn)入控制開花的基因，Gervera等在柑橘中轉(zhuǎn)入了耐鹽基因HAL2，并已得到再生植株，Bell等在梨中轉(zhuǎn)入了rolC基因。
1996年Eide等人從擬南芥中克隆到第一個高等植物的Fe2+轉(zhuǎn)移蛋白基因-IRT1(Iron Regulated Transporter)。IRT1在酵母中的表達能使因缺乏鐵吸收能力的酵母雙突變體fet3fed4的受缺鐵限制的生長恢復。但至今還未見到有人將此基因?qū)敫叩戎参镏仓甑膱蟮馈?br> 雙子葉植物吸收研究的另一重大進展是1999年，Robinson等人首次從擬南芥中分離到了Fe3+-螯合物還原酶的基因-FRO2(Ferric-Chelate Reductase)基因。FRO2基因是等位基因，在缺鐵脅迫的擬南芥根部表達，屬于一個跨膜轉(zhuǎn)運電子的b-型細胞色素大家族。在缺鐵脅迫下，F(xiàn)e3+-螯合物還原酶的合成增加，使該酶活性增強。FRO2基因的導入使缺失FRO2基因的突變體的黃化癥狀消失，F(xiàn)RO2比Fre1和FRO1有更強的活性。Mori小組1999年將從酵母菌中分離的Fe3+還原酶基因-Fre1基因，構建成為Refrel基因后導入煙草，轉(zhuǎn)基因植株表達了全長的mRNA，而且在正常供鐵的條件下檢測到了組成型的Fe3+-還原酶活性。Samuelson等人從酵母上獲得了Fe3+-螯合物還原酶的基因--Fre2，轉(zhuǎn)入煙草后獲得高表達的轉(zhuǎn)基因植株，與對照相比、轉(zhuǎn)基因株對鐵的吸收力提高了4倍。因此，F(xiàn)RO2基因?qū)τ诠麡涞霓D(zhuǎn)化十分重要，快速、高效、方便地培養(yǎng)FRO2基因是一個十分重要的課題。
目前所使用的基因克隆技術是RT-PCR擴增基因。該方法存在許多缺點1.當組織中所擴增的基因的mRNA含量較低時，很難擴增出全長的FRO2基因；2.當基因較大時，擴增全長的FRO2基因非常困難，需要高質(zhì)量的RNA和cDNA和非?？量痰腜CR反應條件，因此難以實現(xiàn)；3.PCR反應條件的優(yōu)化很復雜，無一個定式，通常要花大量的財力和時間；4.在基因構建時，采用何種方法和策略是構建成功的關鍵，目前還沒有一個十分科學有效的方法；5.現(xiàn)有基因的克隆和構建十分繁復，效率低下，時間漫長，不利于現(xiàn)場推廣以及以后的產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種全長FRO2基因的克隆和構建的科學方法，該方法可以高效、方便、快速地克隆和構建全長FRO2基因。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的全長FRO2基因的克隆和構建，其克隆的步驟為(1)擬南芥植株中RNA的提??；(2)通過該RNA的反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成；(3)對合成的cDNA的PCR擴增；(4)全長FRO2-PCR擴增基因的分離和純化；(5)全長FRO2-PCR擴增基因的克隆；(6)全長FRO2-PCR擴增基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌；(7)全長FRO2基因克隆的篩選；(8)全長FRO2克隆基因的酶切鑒定；(9)全長FRO2基因序列的確認；其構建的步驟為(1)帶特異性粘性末端的全長FRO2基因的大量富積；(2)帶有特異性粘性末端的質(zhì)粒pCB302-3的大量富積；(3)FRO2/pCB302-3質(zhì)粒的構建；其特征在于在對合成的cDNA的PCR擴增步驟時，根據(jù)擬南芥的抗缺鐵基因的基因序列以及PRIMER3軟件設計引物，該引物包括全長的基因兩端帶有酶切位點的兩個引物以及根據(jù)基因內(nèi)部保守序列設計的兩對巢式引物，共三對引物；這三對引物建立如下PCR反應H2O25微升 引物10.2-0.5微升cDNA1-3微升引物20.2-0.5微升
10XBuffer0.5微升巢CH10.2-0.5微升dNTP 0.2-0.8微升巢CH20.2-0.5微升Taq酶0.1-0.3微升巢CH30.2-0.5微升Mg+ 1-5微升巢CH40.2-0.5微升上述反應的反應條件1X 95℃ 3-6分鐘28-40X 95℃ 20-30秒45-70℃2-4分鐘72-76℃1-3分鐘1X 72℃ 10分鐘1X 4℃∞而且，引物1、引物2為兩端帶有酶切位點的一對引物，巢CH1、巢CH2、巢CH3、巢CH4為兩對巢式引物。
而且，用兩對巢式引物進行第一輪PCR反應，再以純化后的第一輪反應的產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR反應。
而且，PCR擴增反應中一對引物、兩對巢式引物同時進行，以快速得到全長的FRO2-PCR擴增基因。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是1.在國內(nèi)首次高效、方便、快速地克隆和構建影響植株鐵素吸收和代謝的關鍵性限速酶基因Fe3+-螯合物還原酶基因-FRO2基因，克隆和構建FRO2基因的方法科學合理。
2.提出了高質(zhì)量的總RNA的提取方法和高質(zhì)量的cDNA的合成以及兩輪多重巢式PCR技術和PCR反應條件的優(yōu)化技術。
4.在國際首次將影響植株鐵素吸收和代謝的關鍵性限速酶基因Fe3+-螯合物還原酶基因--FRO2導入蘋果，并首次建立了蘋果的高效農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化體系。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明實施例做進一步詳述本發(fā)明所述的FRO2基因的克隆和構建包括兩大步驟，其一為克隆，其二為構建，其詳細的步驟如下
一、FRO2基因的克隆1.RNA的提取(1)將擬南芥的植株根系取樣、清洗并在液氮下磨成粉末形成基因樣品；(2)將該基因樣品放入預熱的BUFFER中，采用苯酚氯仿提取2次，取上清液，加LiCl，孵化過夜；(3)用乙醇清洗沉淀三次，然后真空干燥；(4)溶解該沉淀于去離子水中，加NaAce和乙醇沉淀過夜；(5)離心去上清液，溶解該沉淀于去離子水中，形成RNA溶液。
這種RNA的提取方式可以保證所提取的RNA的高質(zhì)量的和高濃度，是合成高質(zhì)量的cDNA的前提。
2.cDNA的合成(1)將RNA溶液和引物OligoDT放入離心管中，在70℃下反應5分鐘，然后冰上冷卻；(2)加dNTP、RT酶、BUFFER和水，在42℃下反應60分鐘，冰上冷卻；(3)在85℃反應5分鐘，合成高質(zhì)量和高濃度的cDNA。
3.進行PCR擴增根據(jù)擬南芥的抗缺鐵基因的基因序列以及PRIMER3軟件設計引物，該引物包括全長的基因兩端帶有酶切位點的引物(引物1、引物2)以及根據(jù)基因內(nèi)部保守序列設計的兩對巢式引物(巢CH1、巢CH2、巢CH3、巢CH4)共三對引物。
這三對引物建立如下PCR反應H2O25微升 引物10.2-0.5微升cDNA1-3微升引物20.2-0.5微升10XBuffer 0.5微升巢CH10.2-0.5微升dNTP0.2-0.8微升巢CH20.2-0.5微升Taq酶 0.1-0.3微升巢CH30.2-0.5微升Mg+ 1-5微升巢CH40.2-0.5微升上述反應的反應條件1X95℃3-6分鐘28-40X95℃20-30秒45-70℃ 2-4分鐘72-76℃ 1-3分鐘
1X72℃10分鐘1X4℃ ∞說明用兩對巢式引物進行第一輪PCR反應；再以純化后的第一輪反應的產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR反應；再根據(jù)反應產(chǎn)物片段的長短改進反應條件。其中最主要的是cDNA模板濃度，即要求cDNA的濃度合適和質(zhì)量要高；然后調(diào)整鎂離子濃度和退火溫度和時間。通常退火溫度較引物設計的退火溫度的TM值高5度；產(chǎn)物較短時主要延長退火時間和增加鎂離子濃度。如無產(chǎn)物時，可以增加cDNA模板濃度；如高背景產(chǎn)物較多，而無特異性帶時，主要提高退火溫度和時間，降低模板濃度。
以上的PCR擴增反應可用引物(一對)、巢式引物(二對)同時進行，可有效提高反應的效率，并可以快速得到含有全長的FRO2基因的PCR產(chǎn)物。
4.FRO2-PCR擴增基因的分離和純化用0.7％瓊脂糖進行凝膠電泳，以分離擴增出特異性FRO2基因的PCR產(chǎn)物。用解剖刀切下基因的特異性片段，用純化柱回收和純化特異性條帶。
5.FRO2-PCR擴增基因的克隆采用PGEM-T試劑盒進行克隆。
將下列試劑加入離心管中試劑名稱 標準反應 陽性對照 背景對照2XBUFFER 5微升5微升 5微升載體 1微升1微升 1微升PCR產(chǎn)物 1-3微升 / /對照DNA /2微升 /T4連接酶 1微升1微升 1微升H2O 加至10微升 加至10微升 加至10微升將上述試劑充分混合，反應過夜，得FRO2/pGEM-T質(zhì)粒。
6.FRO2/PGEM-T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌用CaCl2法制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞分別加感受態(tài)細胞于FRO2/pGEM-T質(zhì)粒和水及Pblue質(zhì)粒中，冰上反應；42度熱擊45秒，冰上冷卻；轉(zhuǎn)入SOC培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37度下培養(yǎng)1小時；放培養(yǎng)物于抗性平板中培養(yǎng)和篩選，37度過夜培養(yǎng)。
7.克隆基因的篩選挑取白色單克隆，分別進行抗性平板的培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。
8.克隆基因的酶切鑒定電泳分析質(zhì)粒的大小選擇大的質(zhì)粒進行酶切鑒定，用NCO1和PST1酶切該質(zhì)粒，跑電泳，檢查帶的長度。對符合條件的基因進行下一步驟。
9.基因序列的確認。
通過酶切分析篩選出4個克隆進行測序分析。并將該基因序列與基因銀行的已知物種-擬南芥抗缺鐵基因的序列進行比較，分析其保守區(qū)，對選擇保守區(qū)一致的一個克隆基因—即全長FRO2/tEM-T基因用于構建。
以上是對擬南芥抗缺鐵基因進行了克隆，并最終選擇出了進行下一步構建的一個克隆。
二、進行所克隆的全長FRO2基因的構建。
構建包括如下步驟1.帶特異性粘性末端的全長FRO2基因的大量富積(1)將FRO2/tEM-T質(zhì)粒在培養(yǎng)液內(nèi)大量繁殖。
(2)大量提取法提取FRO2/tEM-T質(zhì)粒。
(3)用SstI和BamHI酶切FRO2/tEM-T質(zhì)粒，反應體積需要擴大到100微升，切取和純化出1-5微升的質(zhì)粒。
反應用雙酶切方式如下2號10X BUFFER 10微升SstI酶 1微升BamHI酶1微升FRO2/tEM-T質(zhì)粒5微升10X BSA10微升H2O 加至100微升該反應于37℃下培養(yǎng)過夜，得到帶有粘性末端的全長FRO2基因。
說明帶有不同酶切位點的粘端克隆是效率最高的克隆，由于在引物設計時設計了2對保護堿基，才保證了粘端連接和克隆、構建的正常進行。
(4)FRO2基因的分離和純化。
采用0.7％瓊脂糖進行凝膠電泳，分離出帶有粘性末端的全長FRO2基因。用解剖刀切下該特異性片段，用純化柱回收和純化該特異性條帶。
(5)含有全長FRO2基因的濃縮。
將所分離和純化的全長FRO2基因用NaAC和乙醇沉淀過夜，離心、去上清液，真空干燥沉淀、加水備用。
2.帶有特異性粘性末端的質(zhì)粒pCB302-3的大量富積(1)大量培養(yǎng)pCB302-3質(zhì)粒。
(2)大量提取pCB302-3質(zhì)粒。
(3)用SstI和BamHI酶切pCB302-3質(zhì)粒，方法同F(xiàn)RO2/tEM-T質(zhì)粒。
(4)電泳分離和純化帶有特異性粘性末端的pCB302-3質(zhì)粒，方法同F(xiàn)RO2基因的分離和純化。
(5)濃縮，方法同F(xiàn)RO2基因的濃縮。
3.FRO2/pCB302-3質(zhì)粒的構建。
(1)用帶有粘性末段的DNA產(chǎn)物克隆方法連接帶有特異性粘性末端的FRO2基因和pCB302-3質(zhì)粒。
(2)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞EcolI.大腸桿菌，方法同F(xiàn)RO2基因。
(3)在含有卡那霉素的抗性培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)和篩選。
(4)對抗性單克隆在含有30-100微升卡那霉素/毫升液體培養(yǎng)上進行分別的培養(yǎng)。
(5)分別提取質(zhì)粒和酶切鑒定。用少量提取法提取質(zhì)粒，用XhoII進行酶切鑒定。
(6)測序。對酶切正確的克隆質(zhì)粒進行測序鑒定。
(7)選擇序列正確的克隆提取質(zhì)粒。
(8)制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞。
(9)用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和在抗性培養(yǎng)基上篩選單克隆。
(10)酶切鑒定，選擇正確的FRO2/pCB302-3質(zhì)?？寺”４?。用于植物的轉(zhuǎn)化。
權利要求
1.一種全長FRO2基因的克隆和構建，其克隆的步驟為(1)擬南芥植株中RNA的提??；(2)通過該RNA的反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成；(3)對合成的cDNA的PCR擴增；(4)全長FRO2-PCR擴增基因的分離和純化；(5)全長FRO2-PCR擴增基因的克隆；(6)全長FRO2-PCR擴增基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌；(7)全長FRO2基因克隆的篩選；(8)全長FRO2克隆基因的酶切鑒定；(9)全長FRO2基因序列的確認；其構建的步驟為(1)帶特異性粘性末端的全長FRO2基因的大量富積；(2)帶有特異性粘性末端的質(zhì)粒pCB302-3的大量富積；(3)FRO2/pCB302-3質(zhì)粒的構建；其特征在于在對合成的cDNA的PCR擴增步驟時，根據(jù)擬南芥的抗缺鐵基因的基因序列以及PRIMER3軟件設計引物，該引物包括全長的基因兩端帶有酶切位點的兩個引物以及根據(jù)基因內(nèi)部保守序列設計的兩對巢式引物，共三對引物；這三對引物建立如下PCR反應H2O25微升 引物1 0.2-0.5微升cDNA1-3微升 引物2 0.2-0.5微升10XBuffer 0.5微升 巢CH1 0.2-0.5微升dNTP0.2-0.8微升 巢CH2 0.2-0.5微升Taq酶 0.1-0.3微升 巢CH3 0.2-0.5微升Mg+ 1-5微升 巢CH4 0.2-0.5微升上述反應的反應條件1X95℃ 3-6分鐘28-40X95℃ 20-30秒45-70℃ 2-4分鐘72-76℃ 1-3分鐘1X 72℃ 10分鐘1X 4℃ ∞
2.根據(jù)權利要求1所述的全長FRO2基因的克隆和構建，其特征在于引物1、引物2為兩端帶有酶切位點的一對引物，巢CH1、巢CH2、巢CH3、巢CH4為兩對巢式引物。
3.根據(jù)權利要求1所述的全長FRO2基因的克隆和構建，其特征在于用兩對巢式引物進行第一輪PCR反應，再以純化后的第一輪反應的產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR反應。
4.根據(jù)權利要求1所述的全長FRO2基因的克隆和構建，其特征在于PCR擴增反應中一對引物、兩對巢式引物同時進行，以快速得到全長的FRO2-PCR擴增基因。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領域的一種全長FRO
文檔編號C12N15/70GK1778924SQ20041007285
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權日2004年11月23日
發(fā)明者楊靜慧, 向成斌, 劉艷軍 申請人:天津農(nóng)學院