專利名稱：昆蟲卵可視化自吸式外源基因?qū)敕椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種昆蟲卵可視化自吸式外源基因?qū)敕椒ā?br> 背景技術(shù)：
通過生物技術(shù)將克隆的外源基因人為地整合到昆蟲基因組內(nèi)、并穩(wěn)定地遺傳和表達，這樣的昆蟲叫做轉(zhuǎn)基因昆蟲。轉(zhuǎn)基因昆蟲能夠形成一個具有相應(yīng)外源基因的新的品種，其利用價值在于(1)開展基礎(chǔ)理論研究；(2)生產(chǎn)外源蛋白；(3)開展經(jīng)濟昆蟲的分子育種；(4)開展害蟲的生物防治。
在開展轉(zhuǎn)基因昆蟲研究時，一般是在卵期，利用顯微注射方法導(dǎo)入克隆的外源基因。這一導(dǎo)入方法，需要價值昂貴的精密儀器設(shè)備和技術(shù)高超的實驗操作人員。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲卵(任何昆蟲卵)可視化自吸式外源基因?qū)敕椒?，利用價值較低的儀器設(shè)備，使一般的技術(shù)操作人員能夠從事轉(zhuǎn)基因昆蟲研究工作。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是(1)產(chǎn)卵后10小時以內(nèi)的昆蟲卵用1％-8％甲醛浸5-120分鐘、或用60-80％酒精噴灑卵面，進行消毒處理；(2)外源基因溶解在溶解液中，外源基因的濃度范圍為0.1ng/μl～100mg/μl；(3)昆蟲卵干燥后，借助放大倍數(shù)范圍為1-100倍的實體顯微鏡，在卵表面涂抹含有外源基因的溶液，涂抹溶液量為1nl-10μl；(4)利用金屬針穿刺涂有外源基因溶液的昆蟲卵表面，依靠金屬針進出昆蟲卵時造成的液體回流，使昆蟲卵自動吸入外源基因，金屬針進出昆蟲卵的次數(shù)為1-5次；(5)昆蟲卵金屬針穿刺后，用石蠟封閉穿刺口或不封閉穿刺口。
所述的外源基因狀態(tài)為直鏈基因、環(huán)狀基因、或整合在質(zhì)粒中的基因。
所述的溶解液為超純水、磷酸緩沖液、或Tris-HCl緩沖液。
所述的金屬針的針尖直徑小于0.5mm。
本發(fā)明具有的有益的效果是借助實體顯微鏡觀察，在昆蟲卵表面涂抹含有外源基因溶液，在涂抹部位用金屬針穿刺昆蟲卵數(shù)次，依靠金屬針進出昆蟲卵時造成的液體回流，使昆蟲卵自動吸入外源基因，并進一步整合到昆蟲基因組內(nèi)，作成能夠穩(wěn)定地遺傳和表達的轉(zhuǎn)基因昆蟲。是利用價值較低的儀器設(shè)備，使一般的技術(shù)操作人員能夠從事轉(zhuǎn)基因昆蟲研究工作。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1以Nistari家蠶品種產(chǎn)卵后8小時以內(nèi)的蠶卵為實驗材料，用4％甲醛浸蠶卵20分鐘，進行卵面消毒。采用整合在piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中的GFP(綠色熒關(guān)蛋白)外源基因，具體是用pPIGA3GFP質(zhì)粒和其輔助質(zhì)粒pHA3PIG系統(tǒng)，導(dǎo)入GFP(綠色熒關(guān)蛋白)外源基因。實體顯微鏡放大倍數(shù)采用32倍，用超純水溶解含有外源基因GFP的DNA質(zhì)粒及其輔助質(zhì)粒，調(diào)整DNA濃度為500ng/μl，蠶卵表面涂抹的含有外源基因的質(zhì)粒溶液量為50nl，外源基因涂抹的部位為蠶卵腹側(cè)面。穿刺蠶卵的金屬針的針尖直徑小于0.1mm。穿刺蠶卵的次數(shù)為3次，穿刺后用石蠟封閉穿刺口。實驗共穿刺1000粒蠶卵，蠶卵期表達GFP基因的個體達456粒。
實施例2以越南演金黃家蠶品種產(chǎn)卵后2小時以內(nèi)的蠶卵為實驗材料，用75％酒精噴灑蠶卵，進行卵面消毒。采用整合在piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中的DsRed_(紅色熒關(guān)蛋白)外源基因，具體是用pBac[3×P3-EGFP-P9DsRed-LITR]質(zhì)粒和其輔助質(zhì)粒pHA3PIG系統(tǒng)，導(dǎo)入DsRed_(紅色熒關(guān)蛋白)外源基因。實體顯微鏡放大倍數(shù)采用25倍，用磷酸緩沖液(pH7.6)溶解含有外源基因DsRed的DNA質(zhì)粒及其輔助質(zhì)粒，調(diào)整DNA濃度為200ng/μl，蠶卵表面涂抹的含有外源基因的質(zhì)粒溶液量為30nl，外源基因涂抹的部位為蠶卵背側(cè)面。穿刺蠶卵的金屬針的針尖直徑小于0.05mm。穿刺蠶卵的次數(shù)為1次，穿刺后用石蠟封閉穿刺口。實驗共穿刺1000粒蠶卵，650蠶卵發(fā)育到轉(zhuǎn)青期胚子，共獲得58個蠶蛾，其中雌蛾23個，雄蛾35個，雌雄交配后的下一代有2蛾，其中的一齡家蠶幼蟲表達DsRed基因。
實施例3以加秋家蠶品種產(chǎn)卵后4小時以內(nèi)的蠶卵為實驗材料，用2％甲醛浸蠶卵30分鐘，進行卵面消毒。采用直鏈基因，帶有A3啟動子的CAT基因為外源基因，實體顯微鏡放大倍數(shù)采用40倍，用磷酸緩沖液(pH7.6)溶解外源基因，調(diào)整DNA濃度為1mg/μl，蠶卵表面涂抹的含有外源基因的溶液量為100nl，外源基因涂抹于蠶卵表面。穿刺蠶卵的金屬針的針尖直徑小于0.01mm。穿刺蠶卵的次數(shù)為2次，穿刺后不用石蠟封閉穿刺口。實驗共穿刺5000粒蠶卵，有165蠶卵表達CAT基因。
權(quán)利要求
1.昆蟲卵可視化自吸式外源基因?qū)敕椒?，其特征在?1)產(chǎn)卵后10小時以內(nèi)的昆蟲卵用1％-8％甲醛浸5-120分鐘、或用60-80％酒精噴灑卵面，進行消毒處理；(2)外源基因溶解在溶解液中，外源基因的濃度范圍為0.1ng/μl～100mg/μl；(3)昆蟲卵干燥后，借助放大倍數(shù)范圍為1-100倍的實體顯微鏡，在卵表面涂抹含有外源基因的溶液，涂抹溶液量為1nl-10μl；(4)利用金屬針穿刺涂有外源基因溶液的昆蟲卵表面，依靠金屬針進出昆蟲卵時造成的液體回流，使昆蟲卵自動吸入外源基因，金屬針進出昆蟲卵的次數(shù)為1-5次；(5)昆蟲卵金屬針穿刺后，用石蠟封閉穿刺口或不封閉穿刺口。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲卵可視化自吸式外源基因?qū)敕椒ǎ涮卣髟谟谒龅耐庠椿驙顟B(tài)為直鏈基因、環(huán)狀基因、或整合在質(zhì)粒中的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲卵可視化自吸式外源基因?qū)敕椒ǎ涮卣髟谟谒龅娜芙庖簽槌兯?、磷酸緩沖液、或Tris-HCl緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲卵可視化自吸式外源基因?qū)敕椒?，其特征在于所述的金屬針的針尖直徑小?.5mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種昆蟲卵可視化自吸式外源基因?qū)敕椒?。是借助實體顯微鏡的觀察，在昆蟲卵表面涂抹含有外源基因溶液，在涂抹部位用金屬針穿刺昆蟲卵數(shù)次，依靠金屬針進出昆蟲卵時造成的液體回流，使昆蟲卵自動吸入外源基因，并進一步整合到昆蟲基因組內(nèi)，作成能夠穩(wěn)定遺傳和表達的轉(zhuǎn)基因昆蟲。本發(fā)明可以利用價值較低的儀器設(shè)備，使一般的技術(shù)操作人員能夠從事轉(zhuǎn)基因昆蟲研究工作。
文檔編號C12N15/85GK1644702SQ200410073439
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月13日
發(fā)明者鐘伯雄 申請人:浙江大學(xué)