專利名稱：非滅菌環(huán)境白腐真菌降解活性染料的抑制細菌生長培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于應用微生物領域，特別涉及在非滅菌環(huán)境應用白腐真菌降解活性染料時抑制細菌生長的液體培養(yǎng)基的研制。
背景技術：
含染料廢水是目前國內(nèi)外公認的難處理的工業(yè)廢水。近年來，許多研究表明在含染料廢水處理中白腐真菌(White rot fungi)是很有發(fā)展前景的微生物，其中研究和討論得最多的是黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。黃孢原毛平革菌因其具有非特異性、無需底物誘導的酶，對許多有機污染物和不同類型的人工合成染料(如偶氮，三苯甲烷，酞菁染料)具有廣譜的降解能力(Heinfling A，et al.Biodegradation of azo andphthalocyanine dyes by Trametes versicolor and Bjerkandera adusta.Appl MicrobiolBiotechnol，1997，48261-266.)。采用黃孢原毛平革菌對一些偶氮染料進行脫色已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了非常有意義的礦化(20％-48％)現(xiàn)象(Spadaro JT，et al.Degradation of azo dyes bythe lignin-degrading fungus Phanerochaete chrysosporium.Appl Environ Microbiol，1992，582397-2401.)。但是，雖然在滅菌環(huán)境中黃孢原毛平革菌對染料有較高的脫色效果，并且脫色效果不隨時間而降低，但是如果在非滅菌環(huán)境應用黃孢原毛平革菌，細菌污染卻很容易發(fā)生，一旦發(fā)生將引起脫色效率的急劇下降(Heinfling A，et al.Transformationof industrial dyes by manganese peroxidases from Bjerkandera adusta and Pleurotuseryngii in a manganese-independent reacxtion.Appl Environ Microbiol，1998，642788-2793.)。因此，如果在實際含染料廢水處理中應用白腐真菌，必須要解決的問題就是反應體系染菌。如果對實際工程中的反應器、培養(yǎng)液、載體以及廢水都進行滅菌處理并保證處理過程不染菌，顯然將大大增加處理工藝的運行成本，并且在實際工程中也是行不通的。因此，如何解決白腐真菌降解含染料廢水過程中的染菌問題是該工藝能否應用到實際工程中的瓶頸。不解決染菌問題，該工藝則很難在實際工程中使用，將會嚴重制約該項技術的發(fā)展。
通過檢索中外文獻，只發(fā)現(xiàn)兩篇研究應用白腐真菌降解染料時的抑菌技術，一個為采用聚乙烯醇包埋法來保護白腐真菌Trametes versicolor和細胞外產(chǎn)生的過氧化物酶免受細菌攻擊，從而達到對染料Poly R-478的連續(xù)生物氧化。但包埋法的問題是，由于白腐真菌不斷生長逐漸會掙破聚乙烯小球，使菌絲體暴露出來，影響抑菌效果(Leidig E，etal.Biotransformation of Poly R-478 by continuous cultures of PVAL-encapsulatedTrametes versicolor under non-sterile conditions.Bioprocess Eng，1999，215-12.)。另一篇為通過控制低pH值，氮限制培養(yǎng)基和天然載體研究應用白腐真菌Trametesversicolor在非滅菌環(huán)境降解活性染料的控制策略，但文中提到單單依靠控制低pH和限氮培養(yǎng)基很難獲得長期的抑菌效果(Judy A，et al.Competition strategies for thedecolorization of a textile-reactive dye with the white-rot fungi Trametesversicolor under non-sterile conditions.Biotechnilogy and Bioengineering，2003，82(6)736-744.)。以上兩種抑菌技術均是采用Trametes versicolor菌種，目前國內(nèi)外尚沒有一種有效抑制細菌生長的黃孢原毛平革菌的生長液體培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了在自然環(huán)境下活性染料降解過程中有效抑制細菌生長的液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明提供的非滅菌環(huán)境白腐真菌降解活性染料的抑制細菌生長培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基利用黃孢原毛平革菌在氮限制和碳限制條件下能夠分泌降解染料等難降解有機污染物過氧化物酶的特點，通過同時控制培養(yǎng)基中(1)碳源和氮源的濃度；(2)pH值；(3)微量元素，使在該液體培養(yǎng)基下生長的黃孢原毛平革菌降解活性染料時染菌幾率大大降低，從而達到非滅菌環(huán)境對染料的脫色效果近似等于滅菌環(huán)境。
白腐真菌采用黃孢原毛平革菌，所述抑制細菌生長的液體培養(yǎng)基為氮限制液體培養(yǎng)基(C/N＝56/2.2～56/8.7mM)，其主要成分包括葡萄糖(碳源，占67.8％～76.1％)、酒石酸銨(氮源，占1.5％～5.4％)、磷酸二氫鉀(占7.6％～13.6％)，其余為微量元素和藜蘆醇(占4.9％～23.1％)等。具體配方如表1所示。
表1培養(yǎng)基配方成分 濃度 成分濃度2.0mg/L～3.5葡萄糖10g/LFeSO4.7H2Omg/L酒石酸銨 0.2g/L～0.8g/L CoCl27mg/L藜蘆醇1.5mMZnSO4.7H2O7mg/L醋酸-醋酸鈉緩沖20mM CuSO47mg/L液KH2PO41.0g/L～2.0g/L A1K(SO4)2.12H2O 0.7mg/LMgSO40.71g/L H3BO30.7mg/LCaCl20.1g/L Na2MoO4.2H2O 0.7mg/LMnSO435mg/L Nitrilotriacetate0.105g/L維生素B1(鹽酸硫NaCl 70mg/L1.0g/L胺)加入醋酸-醋酸鈉緩沖液后，此液體培養(yǎng)基的pH值在4.4～4.5左右，是白腐真菌的最佳生長和產(chǎn)酶pH環(huán)境，同時該pH值環(huán)境本身也不利于大部分細菌生長。但，該液體培養(yǎng)基并不適用在非滅菌環(huán)境培養(yǎng)白腐真菌孢子，它僅適于在滅菌環(huán)境培養(yǎng)白腐真菌后在非滅菌環(huán)境對活性染料進行降解。
采用本發(fā)明液體培養(yǎng)基在非滅菌環(huán)境對活性染料進行降解，獲得了穩(wěn)定、高效的脫色效果，其脫色率與滅菌環(huán)境得到的結果基本一致。并且在脫色結束時也未發(fā)現(xiàn)有大量細菌感染。因此，本發(fā)明使用方便，為實際工程應用白腐真菌處理含染料廢水提供了可能，并在實際中降低了因滅菌條件帶來的運行成本。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明實施例一將配制好未加維生素Bl的液體培養(yǎng)基分裝在6個250ml錐形瓶中，每瓶含有100ml液體培養(yǎng)基(此培養(yǎng)基C/N＝56/8.7mM，即酒石酸銨濃度為0.8g/L；另，磷酸二氫鉀濃度為2.0g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O為3.5mg/L)。將含有液體培養(yǎng)基的錐形瓶放入滅菌鍋中在113℃下滅菌30min。滅菌結束后，用注射器和針頭式過濾器(帶膜滅菌)向100ml液體培養(yǎng)基過濾加入1ml 100mg/L維生素B1溶液，保持液體培養(yǎng)基中維生素B1的終濃度為1mg/L。然后，將生長在37℃PDA平板(200g/L土豆汁、20g/L葡萄糖和20g/L瓊脂)上的黃孢原毛平革菌BKM-F-1767孢子等量無菌接入液體培養(yǎng)基中，接種量為1×105個孢子/ml。然后將錐形瓶放入溫度為37℃的恒溫搖床中，轉(zhuǎn)速設為160rpm/min，在空氣條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)5d后，分別在滅菌環(huán)境和非滅菌環(huán)境下向含有白腐真菌和液體培養(yǎng)基的錐形瓶中加入未經(jīng)滅菌處理的活性艷紅K-2BP溶液(1000mg/L)2ml，保持錐形瓶內(nèi)溶液中活性艷紅K-2BP的濃度為20mg/L。24h后，非滅菌環(huán)境投加活性艷紅K-2BP的3個錐形瓶內(nèi)活性艷紅K-2BP的脫色率均在80％以上，3d后脫色率升到88％；與滅菌環(huán)境投加活性艷紅K-2BP相比，二者脫色率基本相同。并對3d后非滅菌環(huán)境投加活性艷紅K-2BP的培養(yǎng)液鏡檢，只發(fā)現(xiàn)有少量酵母菌，并未發(fā)現(xiàn)有細菌。
實施例二改變液體培養(yǎng)基部分成分，進行非滅菌環(huán)境脫色活性艷紅K-2BP實驗。液體培養(yǎng)基中酒石酸銨濃度為0.2g/L，磷酸二氫鉀濃度為1.0g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O為2.0mg/L；其余成分含量同實施例一。具體培養(yǎng)黃孢原毛平革菌和脫色活性艷紅K-2BP過程同實施例一。結果顯示，在非滅菌環(huán)境仍然具有較好的脫色活性艷紅K-2BP的效果，加入活性艷紅K-2BP 2d后脫色率在82％以上；通過對液體培養(yǎng)基鏡檢，只發(fā)現(xiàn)少量酵母菌，并未發(fā)現(xiàn)有細菌。
實施例三仍然改變液體培養(yǎng)基部分成分，進行非滅菌環(huán)境脫色活性艷紅K-2BP實驗。液體培養(yǎng)基中酒石酸銨濃度為0.4g/L，磷酸二氫鉀濃度為1.5g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O為3.0mg/L；其余成分含量同實施例一。具體培養(yǎng)黃孢原毛平革菌和脫色活性艷紅K-2BP過程同實施例一。結果顯示，在非滅菌環(huán)境仍然具有較好的脫色活性艷紅K-2BP的效果，加入活性艷紅K-2BP 2d后脫色率在85％以上；液體培養(yǎng)基鏡檢結果，只發(fā)現(xiàn)少量酵母菌，并未發(fā)現(xiàn)有細菌。
權利要求
1.非滅菌環(huán)境白腐真菌降解活性染料的抑制細菌生長培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基利用黃孢原毛平革菌在氮限制和碳限制條件下能夠分泌降解染料等難降解有機污染物過氧化物酶的特點，通過同時控制培養(yǎng)基中碳源和氮源的濃度，pH值及微量元素，使在該液體培養(yǎng)基下生長的黃孢原毛平革菌降解活性染料時染菌幾率大大降低，從而達到非滅菌環(huán)境對染料的脫色效果近似等于滅菌環(huán)境，所述白腐真菌采用黃孢原毛平革菌，所述抑制細菌生長的液體培養(yǎng)基為氮限制液體培養(yǎng)基(C/N＝56/2.2～56/8.7mM)，其主要成分包括葡萄糖(碳源，占67.8％～76.1％)、酒石酸銨(氮源，占1.5％～5.4％)、磷酸二氫鉀(占7.6％～13.6％)，其余為微量元素和藜蘆醇(占4.9％～23.1％)。
2.按照權利要求1所述的非滅菌環(huán)境白腐真菌降解活性染料的抑制細菌生長培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中pH值為4.4～4.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及非滅菌環(huán)境白腐真菌降解活性染料的抑制細菌生長培養(yǎng)基，屬于應用微生物領域。該液體培養(yǎng)基是在現(xiàn)有培養(yǎng)白腐真菌液體培養(yǎng)基的基礎上，通過調(diào)整碳氮比(C/N＝56/8.7mM)和微量元素(Fe)，并利用白腐真菌本身在酸性環(huán)境(pH＝4.4)生長最優(yōu)的特點，開發(fā)出在白腐真菌降解活性染料時能有效抑制細菌生長的液體培養(yǎng)基。經(jīng)過對比試驗，本液體培養(yǎng)基培養(yǎng)出的白腐真菌在非滅菌環(huán)境下對活性艷紅K－2BP的脫色率與滅菌環(huán)境得到的結果基本相當。并且鏡檢液體培養(yǎng)基未發(fā)現(xiàn)有大量細菌。本發(fā)明使用方便，為實際工程應用白腐真菌處理含染料廢水提供了可能，并在實際中降低了因滅菌條件帶來的運行成本。
文檔編號C12N1/14GK1587379SQ20041007382
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月3日 優(yōu)先權日2004年9月3日
發(fā)明者文湘華, 高大文, 錢易 申請人:清華大學