專利名稱：海洋真菌裂殖壺菌ouc88的工業(yè)應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋微生物應(yīng)用技術(shù)的改進，具體講是一種海洋真菌裂殖壺菌OUC88的工業(yè)應(yīng)用。其屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)對人類健康的重要作用已愈來愈受到人們的重視。其中，作為重要的ω-3PUFAs之一的二十二碳六烯(以下簡稱DHA)[docosahexaenoic acid(226，n-3)]因其在人體和動物體內(nèi)的重要生理功能而倍受人們的青睞。研究表明，DHA是人體某些組織中細胞膜的基本組分；對嬰兒視覺系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用；還具有降低膽固醇、抗凝血、預(yù)防癌癥等藥理作用；另外，DHA還是魚苗生長發(fā)育所需的一種必需脂肪酸，可以提高魚苗的成活率和降低其白化病。傳統(tǒng)上DHA從深海魚油中獲得，但從魚油中提取的PUFAs存在著產(chǎn)量不穩(wěn)、得率低、成本高及含有其它的ω-6PUFAs等問題，且隨著漁業(yè)資源的日益緊張，傳統(tǒng)的DHA資源已無法滿足日益增長的市場需求。因此，開發(fā)DHA的新生資源已成為新的研究熱點。
裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)為一種海洋真菌，其屬于真菌中的卵囊菌綱、水霉目、脆霉壺菌科、裂殖壺菌屬、limacinum種。該菌中DHA含量豐富，還含少量的DPA，而其它的不飽和脂肪酸含量卻很低。該菌使用安全，Hammond等人用其對白鼠、兔子進行了一系列的安全性檢測，沒有發(fā)現(xiàn)任何毒副作用(Hammond，2001)。因此，是一種優(yōu)良的DHA的潛生資源。目前，國際上對該菌的研究較少。T.Yokocki等在搖瓶中采用多種碳源和氮源對裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)SR21進行優(yōu)化培養(yǎng)，得到的DHA最高產(chǎn)量為4g/L。Kw Fan等人以葡萄糖和酵母提取物為碳、氮源培養(yǎng)裂殖壺菌mangrovei，DHA的產(chǎn)量僅為2.79g/L。以上培養(yǎng)中DHA的產(chǎn)量都不是很高，這除了與所選用的菌株有關(guān)外，與培養(yǎng)工藝也有直接的關(guān)系。因此，如何選育出更優(yōu)良的裂殖壺菌品系以及如何優(yōu)化該菌的培養(yǎng)工藝以近一步提高DHA的產(chǎn)量是一個值得研究的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在該菌的篩選培養(yǎng)中DHA產(chǎn)量低的問題，擬從原出發(fā)菌種出發(fā)，通過人工誘變，選育出DHA含量較高的裂殖壺菌新品種；并對影響裂殖壺菌生長的各因素及該菌的生長特點進行研究，在傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)上進一步改進，建立了一套制備工藝簡單、高DHA含量的裂殖壺菌的培養(yǎng)工藝，開發(fā)裂殖壺菌新品種的工業(yè)應(yīng)用。
本發(fā)明的任務(wù)是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，研制了一種海洋裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的工業(yè)應(yīng)用。該裂殖壺菌具有富產(chǎn)二十二碳六烯酸(以下簡稱DHA)的能力，其菌種保藏號CGMCC No.1240，保藏日期2004.10.27。
所述海洋裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的誘變方法，其菌株是以裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)SR21其菌種保存號為IFO 32693的菌株為出發(fā)菌種，通過化學(xué)誘變和物理誘變相結(jié)合而得到的新菌種。新菌種的誘變步驟如下(1)挑取裂殖壺菌SR21單菌落于液體培養(yǎng)基中，在18--30℃條件下，100--250rpm振蕩培養(yǎng)1--3天后；(2)于無菌條件下加入0.05--0.1mol/mL的甲基磺酸乙酯(EMS)，并使其終濃度為0.05--0.1mol/L，不斷搖動處理10--50分鐘；(3)離心(2)步培養(yǎng)液并洗滌菌體后，將離心洗滌菌液使菌液的OD650達0.3---0.8后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，使該離心洗滌菌液成為厚度為1--5mm的薄層菌液；(4)再將(3)步的薄層菌液在10--30W的紫外燈下30--40cm的距離處，經(jīng)紫外光線(UV)照射誘變10--60秒；(5)將誘變的薄層菌液離心后，制成液體培養(yǎng)基的菌細胞懸浮液，再涂布于固體培養(yǎng)基平板，并于暗處18--30℃條件下，培養(yǎng)1--3天，培養(yǎng)長出單菌落；(6)計算不同時間條件下的菌株誘變致死率，確定致死率在80％--90％的誘變時間40秒的菌株，挑取其單菌落，重新對該菌進行誘變，誘變條件同上述(2)，(3)，(4)和(5)；將重新進行誘變的菌株培養(yǎng)后，再挑取長出的單菌落，再分別接入含10--50ml液體培養(yǎng)基的三角搖瓶中，培養(yǎng)條件在18--30℃條件下，100--250rpm振蕩培養(yǎng)2--5天；(7)以細胞干重為指標，進行第一輪篩選篩選出10-20菌株的細胞干重高的單菌落；(8)然后以DHA產(chǎn)量為指標，進行第二輪篩選，按常規(guī)的BF3-甲醇法直接進行甲酯化，然后通過氣相色譜法測定菌體中DHA的百分含量，確定DHA產(chǎn)量高的菌株，最后篩選出3株DHA的產(chǎn)量高達8g/L的裂殖壺菌菌株，分別命名為OUC7、OUC23、OUC88。
所述的菌株OUC88菌株的優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件是以1--10％的接種量接入預(yù)培養(yǎng)的種子液；在該菌的培養(yǎng)初期，采用碳、氮源濃度均在60--30g/L的培養(yǎng)基；在培養(yǎng)的中后期，即第3-4天開始補加碳源，提高碳氮比C/N≮2；在18---30℃條件下，在空氣浴振蕩器上振蕩轉(zhuǎn)速為100---250rpm，振蕩培養(yǎng)3---7天；離心收集菌體，冷凍干燥后，測菌體細胞干重和測定菌體中DHA的含量。
所述的培養(yǎng)基是以葡萄糖或甘油或果糖為碳源，以酵母提取物或蛋白胨為氮源，加入到天然海水和蒸餾水的混合液中，其中海水占培養(yǎng)基的20％--80％；其中碳源濃度為10--80g/L，氮源濃度為6--40g/L，配制培養(yǎng)基的pH值在4--8。
所述海洋裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88，其菌體細胞，以其含有45--80％的總脂，其中不飽和脂肪酸以DHA為主的含量達23--44％，還含有7--11％的DPA，谷氨酸和天冬氨酸較高含量，含有0.4--1％的?；撬?，另含有ω-3多不飽和脂肪酸(EPA)≤1％的性能作為食品，飲料，乳制品及其嬰兒奶粉的添加劑以及飼料和飼料添加劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點在于從原出發(fā)菌種出發(fā)，通過二次人工誘變，二輪篩選育出DHA含量較高的裂殖壺菌新品種。本發(fā)明的菌株OUC88的菌體用常規(guī)方法對該菌中的總脂、蛋白含量、氨基酸組成及灰分進行了分析發(fā)現(xiàn)其細胞中有45-80％的總脂，其中不飽和脂肪酸以DHA為主，DHA在總脂中的含量達23-44％，另外還含有約7-11％的DPA。而另一種ω-3多不飽和脂肪酸EPA在該菌中含量很低，不到1％，這對于開發(fā)裂殖壺菌作為在制造食品、乳制品及其嬰兒奶的粉添加劑的衛(wèi)生食品應(yīng)用很有利。因為研究表明，過量的EPA不利于嬰幼兒的發(fā)育。菌體中蛋白含量為8-12％左右，其中，谷氨酸和天冬氨酸含量較高。分析還發(fā)現(xiàn)，該菌中含有約0.4--1％的牛磺酸，首次報道于國內(nèi)外文獻中。本發(fā)明的裂殖壺菌具有較高的研究價值。本發(fā)明的裂殖壺菌其干重生物量由原來的12--22g/L提高到14--25g/L，菌體中DHA的百分含量則由原來的13-26％提高到現(xiàn)在的18-35％。這樣得到的DHA的產(chǎn)量不低于3.6g/L，最高可達8g/L，超過了目前文獻中所報道的4g/L的最高產(chǎn)量，達到了預(yù)期的細胞生物量和DHA含量均增加的效果。Fan KW等人對裂殖壺菌mangrovei的研究，分別以葡萄糖和酵母提取物為碳源和氮源按常規(guī)方法進行培養(yǎng)，得到的DHA的最高產(chǎn)量為.2.78g/L(Fan KW et al，2001)；T.Nakahara等人以葡萄糖為碳源、以玉米漿和(NH4)2SO4為氮源對裂殖壺菌sp.strain SR21分別在搖瓶和反應(yīng)器中進行常規(guī)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該微生物在反應(yīng)器中的生長情況優(yōu)于搖瓶，在反應(yīng)器中的最高產(chǎn)量為21g/L的細胞干重和4.7g/L的DHA(T.Nakahara et al，1996)；1997年，T.Yaguchi等人在反應(yīng)器中按常規(guī)方法對裂殖壺菌sp.strain SR21進行培養(yǎng)，以葡萄糖為碳源、以玉米漿和(NH4)2SO4為氮源，在振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為300rpm條件下，提高葡萄糖的濃度到12％，得到了48.1g/L的細胞干重和13.3g/L的DHA產(chǎn)量(T.Yaguchi，1997)；而T.Yolochi等人在1998年仍以1997年T.Yaguchi等人研究的裂殖壺菌sp.strainSR21為研究對象，(此時該菌已被定名為裂殖壺菌limacinum SR21)，分別采用多種碳源、氮源包括1997年T.Yaguchi采用過的葡萄糖(碳源)和玉米漿、(NH4)2SO4(二者為氮源)在搖瓶中按常規(guī)方法進行優(yōu)化培養(yǎng)，得到的最好結(jié)果只有4g/L的DHA產(chǎn)量(T.Yolochi，1998)。而本發(fā)明通過對裂殖壺菌limacinum SR21進行人工誘變，篩選出高DHA含量的突變菌株OUC88，同樣也在搖瓶中對菌株OUC88進行培養(yǎng)，再通過后期補加碳源這一操作，使細胞干重高達25g/L，DHA產(chǎn)量達8.27g/L；且整個培養(yǎng)工藝簡單，不需增加額外的設(shè)備和人工，僅通過較低的附加投入，提高了生物的利用率，降低了發(fā)酵成本，提高了經(jīng)濟效益。本發(fā)明的整個培養(yǎng)工藝操作簡單，不增加額外的設(shè)備和人工，僅通過較低的附加投入，提高了生物利用率，獲得了較高產(chǎn)量的目的產(chǎn)物，降低了發(fā)酵成本。
附圖及其具體實施方式
本發(fā)明的實施例結(jié)合附圖進一步說明如下

圖1為不同時期本發(fā)明的期裂殖壺菌OUC88生長狀況圖。
圖2為不同時期本發(fā)明的期裂殖壺菌OUC88DHA積累狀況圖。
參見圖1，圖2本發(fā)明研制的一種海洋真菌裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88及其工業(yè)應(yīng)用。該菌種具有富產(chǎn)二十二碳六烯酸的能力，其菌種保藏號CGMCCNo.1240，保藏日期2004.10.27。
所述的裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88菌株是以裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)SR21菌種，其菌種保存號為IFO 32693的菌株為出發(fā)菌種，通過人工誘變而得到的新菌種；其誘變步驟如下實施例1裂殖壺菌的誘變選育挑取裂殖壺菌SR21單菌落，于含50ml液體培養(yǎng)基(葡萄糖30g/l、酵母提取物10g/l、50％的天然海水)的三角搖瓶中，于25℃條件下，180rpm振蕩培養(yǎng)2天后，于無菌條件下加入0.05mol/mL的甲基磺酸乙酯(EMS)，使其終濃度為0.08mol/L，不斷搖動處理30分鐘，無菌條件下離心上步培養(yǎng)液并洗滌菌體，即用無菌水洗滌5次后，將離心洗滌菌液使菌液的OD650達0.3---0.8后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，使該離心洗滌菌液成為厚度為1--5mm的薄層菌液；再于20W的紫外燈下30cm的距離處誘變0(對照)、10、20、30、40、50、60秒，再將菌體離心后懸浮于1ml液體培養(yǎng)基，然后涂布固體平板，于25℃條件下暗處培養(yǎng)2天，長出單菌落，計算不同條件下的致死率(見表1)。
表1不同誘變時間下裂殖壺菌SR21的致死率

根據(jù)表1確定致死率在80％--90％的誘變時間40秒的菌株，挑取單菌落，重新對該菌進行誘變，誘變時間為40秒，其它誘變條件同上。隨機挑取誘變后長出的單菌落，分別于含50ml液體培養(yǎng)基的三角搖瓶中在25℃條件下180rpm振蕩培養(yǎng)5天，離心收集菌體，-50℃冷凍干燥后，測其干重。以干重為指標進行第一次篩選，篩選出8株單菌落。
然后以DHA產(chǎn)量為指標，進行第二輪篩選。即，對篩選出的8株菌株進行第二次篩選分別取適量干燥菌體，按常規(guī)的BF3-甲醇法直接進行甲酯化，脂肪酸甲酯用正己烷抽提后進行氣相色譜分析，通過和DHA標準品的保留時間相對照，對菌體中的DHA進行定性分析；采用面積內(nèi)標法，通過十九酸標準品和DHA標準品峰面積的積分關(guān)系以及甲酯化過程中加入的內(nèi)標物十九酸和菌體中DHA的峰面積的積分關(guān)系確定樣品中DHA的濃度，然后根據(jù)抽提脂肪酸所用的正己烷的體積及甲酯化所用的菌體樣品的質(zhì)量，計算出菌體中DHA的百分含量，從而計算出裂殖壺菌中DHA的產(chǎn)量。最后篩選出3株DHA產(chǎn)量較高的裂殖壺菌株系(見表1-2)，分別命名為OUC7、OUC23、OUC88。其中以菌株OUC88的DHA含量最高。
表1-2裂殖壺菌誘變株與原出發(fā)菌株DHA產(chǎn)量的比較

具體實施例2碳、氮源濃度及碳氮比對裂殖壺菌OUC88生物量及DHA含量的影響在250ml的三角搖瓶中，分別加50ml天然海水(取自青島海域)和50ml蒸餾水，按表1所示的濃度添加碳源(葡萄糖)和氮源(酵母提取物)，調(diào)PH值為6.0，高壓滅菌后，接入5ml預(yù)培養(yǎng)的OUC88菌種種子液，在空氣浴振蕩器上25℃下振蕩培養(yǎng)5天，振蕩轉(zhuǎn)速為180rpm。離心收集菌體，-50℃條件下冷凍干燥至恒重，測其干重；取部分菌體，按常規(guī)的BF3-甲醇法甲酯化，同實施例1中所述，通過氣相色譜法測定菌體中DHA的百分含量。結(jié)果見表2。
表2不同培養(yǎng)基配比對裂殖壺菌OUC88生物量及DHA含量的影響


從表2中可以看出，細胞干重隨著碳源濃度的增加而增加，當葡萄糖濃度為60--70g/L時，細胞干重達21-24g/L；當碳源濃度再增加時，細胞干重則呈下降趨勢，當葡萄糖濃度為90g/L時，細胞干重只有8g/L左右。氮源濃度與細胞干重也有類似關(guān)系。當酵母提取物濃度在10--30g/L范圍時，細胞干重隨其濃度的增加而增加。細胞干重與DHA含量無線形關(guān)系，而碳源和氮源的比率則影響著DHA的積累，一定范圍內(nèi)C/N比的提高利于DHA的積累。
實施例3不同時期內(nèi)裂殖壺菌OUC88生長狀況和DHA積累狀況的測定在150ml的三角搖瓶中，分別加入25ml天然海水(取自青島海域)和25ml蒸餾水，然后添加濃度為60g/L的葡萄糖和30g/L的酵母提取物，調(diào)PH值為6.0，同時做7個平行樣，高壓滅菌后，接入1ml預(yù)培養(yǎng)的種子液，在空氣浴振蕩器上25℃下振蕩培養(yǎng)，振蕩轉(zhuǎn)速為180rpm，每隔22小時取出一瓶樣品進行分析，以期觀察裂殖壺菌的生長及DHA的積累狀況。菌體經(jīng)離心收集、冷凍干燥后測其干重；其內(nèi)DHA的含量按實施例1中所述的方法進行測定。結(jié)果見圖1。
從圖1中可以看出，裂殖壺菌細胞增殖和DHA積累不同步。在培養(yǎng)的前3天，細胞數(shù)量呈倍數(shù)增長，到第4天，細胞數(shù)目已基本不再增加，開始進入穩(wěn)定生長期；而DHA的百分含量在前3天穩(wěn)定在一個較低水平，3天后DHA開始大量積累，5天左右趨于穩(wěn)定。因此，可把裂殖壺菌的生長過程分為兩個階段前期為細胞增殖階段，后期為DHA積累階段。
實施例4PH值對裂殖壺菌OUC88生物量及DHA含量的影響在250ml的三角搖瓶中，分別加入50ml天然海水(取自青島海域)和50ml蒸餾水，然后添加濃度為60g/L的葡萄糖和30g/L的酵母提取物，分別調(diào)PH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以找出最適合該菌生長及DHA積累的PH值。高壓滅菌后，接入5ml預(yù)培養(yǎng)的OUC88種子液，在空氣浴振蕩器上25℃下振蕩培養(yǎng)5天，振蕩轉(zhuǎn)速為180rpm。菌體經(jīng)離心收集、冷凍干燥后測其干重；其內(nèi)DHA的百分含量按實施例1中所述的方法進行測定。結(jié)果見表3。
表3 pH值對裂殖壺菌OUC88生物量及DHA含量的影響


從表3可以看出該菌能適應(yīng)較寬范圍的pH環(huán)境，但接近中性的pH值利于細胞的生長和DHA的積累。
實施例5培養(yǎng)溫度對裂殖壺菌OUC88生物量及DHA含量的影響如實施例3中所述配制培養(yǎng)基，調(diào)PH值為7.0，高壓滅菌后，接入5ml預(yù)培養(yǎng)的OUC88種子液，在空氣浴振蕩器上分別在20℃、23℃、25℃、28℃、30℃下振蕩培養(yǎng)5天，振蕩轉(zhuǎn)速為180rpm。菌體經(jīng)離心收集、冷凍干燥后測其干重；其內(nèi)DHA的百分含量按實施例1中所述的方法進行測定。結(jié)果見表4。
表4 培養(yǎng)溫度對裂殖壺菌生物量及DHA含量的影響

從表4可以看出，20--25℃范圍內(nèi)的溫度較適合裂殖壺菌的生長，生物量可達22g/L，當溫度超過28℃時，該菌生長速率急劇下降，到30℃時，該菌的生長幾乎停止。而相對的低溫利于DHA的積累，在20--23℃時，DHA的百分含量較高。
實施例6振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對裂殖壺菌OUC88生物量及DHA含量的影響如實施例3中所述配制培養(yǎng)基，調(diào)PH值為7.0，高壓滅菌后，接入5ml預(yù)培養(yǎng)的OUC88種子液，在空氣浴振蕩器上23℃下振蕩培養(yǎng)5天，振蕩轉(zhuǎn)速分別為150rpm、180rpm、200rpm、220rpm 4個水平，以測定振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對裂殖壺菌生物量及DHA含量的影響，結(jié)果見表5。
表5振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對裂殖壺菌OUC88生物量及DHA含量的影響

從表5可以看出，細胞干重及DHA的含量均隨振蕩轉(zhuǎn)速的提高而增加，這是因為轉(zhuǎn)速的提高增加了培養(yǎng)基內(nèi)部的溶氧，利于好氧的裂殖壺菌的生長，同時也促進了該菌的代謝，利于DHA的積累。
實施例7后期補加葡萄糖對裂殖壺菌ouc88生物量及DHA含量的影響在250ml的三角搖瓶中，分別加入50ml天然海水(取自青島海域)和50ml蒸餾水，然后添加濃度為60g/L的葡萄糖和30g/L的酵母提取物，分別調(diào)PH值為7.0，高壓滅菌后，接入5ml預(yù)培養(yǎng)的種子液，在空氣浴振蕩器上23℃下振蕩培養(yǎng)，振蕩轉(zhuǎn)速為200rpm。培養(yǎng)3天后，在無菌條件下，分別補加如表5所示的不同濃度的經(jīng)過高壓滅菌的葡萄糖溶液，然后繼續(xù)培養(yǎng)2天。菌體經(jīng)離心收集、冷凍干燥后測其干重；其內(nèi)DHA的百分含量按實施例1中所述的方法進行測定。結(jié)果見表6。
表6后期補加葡萄糖對裂殖壺菌OUC88生物量及DHA含量的影響

由實施例1和實施例2的結(jié)果分析認為，裂殖壺菌的培養(yǎng)過程可分為兩個階段前2--3天為細胞增殖階段，較高濃度的碳源和氮源利于細胞數(shù)目的增加；后期為DHA的積累階段，需要較高的C/N比，此時向培養(yǎng)基中補加一定的碳源，提高培養(yǎng)基中碳源和氮源的比率，將利于DHA的積累。試驗證明，通過后期補加葡萄糖，細胞干重略有增加，由原來的21g/L提高到25g/L；而DHA含量則明顯增加，由原來的24％左右提高到34％左右。這樣得到的結(jié)果是細胞干重最高達25g/L，DHA產(chǎn)量最高達8.27g/L。
實施例8裂殖壺菌OUC88的理化性狀分析按實施例6中所述配制培養(yǎng)基，高壓滅菌后，接入5mlOUC88種子液，振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同實施例6。培養(yǎng)4天后，離心收集菌體，冷凍干燥。
取部分干燥菌體，按常規(guī)的氯仿/甲醇法提取總脂細胞破碎后，加入氯仿/甲醇混合液(2∶1∶V/V)，混勻，抽體液用Folch試劑洗滌，蒸發(fā)溶劑，即得較純的總脂，稱其重量，通過與所用的菌體重量相比，計算出總脂在細胞干重中的百分比。再取部分總脂，按常規(guī)的BF3-甲醇法，同實施例1中所述進行甲酯化，用甲酯化的脂肪酸通過氣相色譜—質(zhì)譜分析確定其總脂中各脂肪酸的成分，通過與相應(yīng)的標準品對照，測定總脂中各組分的含量，結(jié)果見表7。
表7裂殖壺菌OUC88主要脂肪酸含量

分析發(fā)現(xiàn)，總脂中不飽和脂肪酸以DHA為主，DHA在總脂中的含量達48.53％，另外，還含有約8％的DPA。而另一種ω-3PUFAEPA在該菌中的含量很低，不到1％。椐研究證明，過量的EPA不利于嬰幼兒的發(fā)育。本發(fā)明裂殖壺菌OUC88的菌體對于開發(fā)裂殖壺菌作為面包食品添加劑或乳制品的煉乳、奶片、尤其是嬰兒奶粉的添加劑，很有營養(yǎng)價值和促進身體發(fā)育。
分別取部分干燥菌體，按常規(guī)的方法，分別對其蛋白含量、氨基酸組成及灰分進行測定，結(jié)果見表8-1，8-2。另外還發(fā)現(xiàn)，該菌中還含有一種藥用成分?；撬幔@在國內(nèi)外文獻中是首次報道，這進一步提高了該菌的開發(fā)應(yīng)用價值。
表8-1裂殖壺菌OUC88理化性狀分析

表8-2裂殖壺菌OUC88中氨基酸組分分析

綜上，本發(fā)明的菌株OUC88的菌體細胞，以其具有含有45--80％的總脂，其中不飽和脂肪酸以DHA為主的含量達23--44％，還含有7--11％的DPA，谷氨酸和天冬氨酸含量也較高，含有0.4--1％的?；撬?，另含ω-3多不飽和脂肪酸(EPA)≤1％的性能，作為在制造食品、乳制品及其嬰兒奶粉的添加劑中的衛(wèi)生食品應(yīng)用。
實施例9用裂殖壺菌OUC88菌粉作為餌料營養(yǎng)強化輪蟲DHA的實驗；將輪蟲培養(yǎng)于2m3玻璃鋼水槽中，每個玻璃鋼水槽中的水體為1m3，水溫為25℃，綠球藻濃度為850萬個細胞/ml，充分通氣。實驗分為A、B、C、D四個組，A組為對照組，只添加綠球藻，B、C、D組為實驗組，分別加入濃度為20mg/L、50mg/L、80mg/L的裂殖壺菌，其他條件各組均一致。于3、6、9、12、18小時在解剖鏡下觀察檢測輪蟲，用300目篩絹收集每次觀察的輪蟲樣品，-50℃條件下冷凍干燥。取部分冷凍干燥的輪蟲，按常規(guī)的BF3-甲醇法甲酯化，同實施例1中所述，氣相色譜法測定輪蟲DHA的含量。
表9 實驗各組輪蟲體內(nèi)DHA的積累測定結(jié)果

注FA表示總脂肪酸 ％表示百分含量 DHA(mg/g)表示每克干輪蟲粉中含有DHA的毫克數(shù)。
從表9可知裂殖壺菌OUC88有顯著增加輪蟲體內(nèi)的DHA含量的作用。三個實驗組B、C、D在強化12小時后輪蟲體內(nèi)DHA/FA的含量分別為5.98％、10.21％和13.44％，每克干燥輪蟲粉中DHA的凈含量分別為4.42mg/g、7.85mg/g、8.14mg/g；而對照組A在整個實驗過程中均未檢測出輪蟲體內(nèi)的DHA含量。從實驗中還看出，在超過12小時后，輪蟲體內(nèi)的DHA含量顯著下降，因此，使輪蟲在體內(nèi)積累DHA的時間以不超過12小時為宜。
實施例10用裂殖壺菌OUC88強化過的輪蟲飼喂大菱鲆幼苗抗白化效果試驗；實驗分為A、B、C三組，每組大菱鲆幼苗200尾，培養(yǎng)于50L塑料桶中，水體20L，水源為過濾的自然海水，經(jīng)紫外線消毒。初孵仔魚培育溫度14℃.以后逐漸升溫至16℃。海水鹽度28‰，pH值8.6。光源為人工光源，水面200-2000lx。仔魚前期微充氣，仔魚后期加大充氣量。每天吸污一次，以清除池底污物。充分通氣。A組投喂未強化的輪蟲(只用小球藻喂養(yǎng)的輪蟲)，B組投喂用日本烏賊甘油強化的輪蟲，C組投喂用裂殖壺菌OUC88強化過的輪蟲，其他條件一致，每天觀察仔魚存活情況。、表10 大菱鲆抗白化實驗結(jié)果

實驗結(jié)束時，飼喂未強化輪蟲的大菱鲆的生長速率最低，發(fā)育過程中白化現(xiàn)象嚴重，白化率高達59.5％；在兩個飼喂強化輪蟲的大菱鲆組間，用裂殖壺菌OUC88強化輪蟲飼喂的大菱鲆生長速率高于用日本烏賊甘油強化輪蟲飼喂的大菱鲆，攝食活躍，皮膚的黑色素細胞生長狀態(tài)好，B組大菱鲆白化率為9.0％，C組大菱鲆白化率為6.5％，C組白化率要低于B組白化率。并且，當幼苗發(fā)生白化時，用裂殖壺菌OUC88強化輪蟲飼喂的大菱鲆的白化面積也遠遠小于用日本烏賊甘油強化輪蟲飼喂的大菱鲆的白化面積。說明用裂殖壺菌OUC88強化過的輪蟲飼喂大菱鲆幼苗的抗白化效果優(yōu)于傳統(tǒng)的用日本烏賊甘油強化輪蟲飼喂的大菱鲆的抗白化效果，且使用安全可靠。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種海洋裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的工業(yè)應(yīng)用，其特征在于其具有富產(chǎn)二十二碳六烯酸(簡稱DHA)的能力，其菌種保藏號CGMCC No.1240，保藏日期2004.10.27。
2.權(quán)利要求1所述海洋裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的誘變方法，其特征在于所述的該菌株是以裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)SR21其菌種保存號為IFO32693的菌株為出發(fā)菌種，用化學(xué)誘變和物理誘變相結(jié)合的方法得到的新菌種；其誘變步驟如下(1)挑取裂殖壺菌SR21單菌落于液體培養(yǎng)基中，在18——30℃條件下，100——250rpm振蕩培養(yǎng)1——3天后；(2)于無菌條件下加入0.05——0.1mol/mL的甲基磺酸乙酯(EMS)，并使其終濃度為0.05——0.1mol/L，不斷搖動處理10——50分鐘；(3)離心(2)步培養(yǎng)液并洗滌菌體后，將離心洗滌菌液使菌液的OD650達0.3——0.8后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，使該離心洗滌菌液成為厚度為1——5mm的薄層菌液；(4)再將(3)步的薄層菌液在10——30W的紫外燈下30——40cm的距離處，經(jīng)紫外光線(UV)照射誘變10——60秒；(5)將誘變的薄層菌液離心后，制成液體培養(yǎng)基的菌細胞懸浮液，再涂布于固體培養(yǎng)基平板，并于暗處18——30℃條件下，培養(yǎng)1——3天，培養(yǎng)長出單菌落；計算不同時間條件下的菌株誘變致死率，選擇菌株重新進行誘變，培養(yǎng)長出單菌落；(6)計算不同時間條件下的菌株誘變致死率，確定致死率在80％——90％的誘變時間40秒的菌株，挑取其單菌落，重新對該菌進行誘變，誘變條件同上述(2)，(3)，(4)和(5)；將重新進行誘變的菌株培養(yǎng)后，再挑取長出的單菌落，再分別接入含10——50ml液體培養(yǎng)基的三角搖瓶中，培養(yǎng)條件在18——30℃條件下，100——250rpm振蕩培養(yǎng)2——5天；(7)以菌體產(chǎn)量為指標，進行第一輪篩選篩選出10-20株菌體產(chǎn)量高的單菌落；(8)然后以DHA產(chǎn)量為指標，進行第二輪篩選，按常規(guī)的BF3-甲醇法直接進行甲酯化，然后通過氣相色譜法測定菌體中DHA的百分含量，確定DHA產(chǎn)量高的菌株，最后篩選出3株DHA的產(chǎn)量高達8g/L的裂殖壺菌菌株，分別命名為OUC7、OUC23、OUC88。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述海洋裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的工業(yè)應(yīng)用，其特征在于所述的菌株OUC88菌株的優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件是以1——10％的接種量接入預(yù)培養(yǎng)的種子液；在該菌的培養(yǎng)初期，采用碳、氮源濃度均在60——30g/L的培養(yǎng)基；在培養(yǎng)的中后期，即第3-4天開始補加碳源，提高碳氮比(C/N)在2——5∶1；在18---30℃條件下，在空氣浴振蕩器上振蕩轉(zhuǎn)速為100---250rpm，振蕩培養(yǎng)---7天；離心收集菌體，冷凍干燥后，測菌體細胞干重和測定菌體中DHA的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述海洋裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的工業(yè)應(yīng)用，其特征在于所述的培養(yǎng)基是以葡萄糖或甘油或果糖為碳源，以酵母提取物或蛋白胨為氮源，加入到天然海水和蒸餾水的混合液中，其中海水占培養(yǎng)基的20％——80％；其中碳源濃度為10——80g/L，氮源濃度為6——40g/L，配制培養(yǎng)基的pH值在4——8。
5.權(quán)利要求1所述海洋裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)OUC88，其特征在于所述的菌體細胞，以其含有45——80％的總脂，其中不飽和脂肪酸以DHA為主的含量達23——44％，還含有7——11％的DPA，谷氨酸和天冬氨酸含量也較高，含有0.4——1％的?；撬?，另含有ω-3多不飽和脂肪酸(EPA)≤1％的性能作為食品，乳制品及其嬰兒奶粉的添加劑以及飼料，和飼料添加劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是海洋裂殖壺菌OUC88的工業(yè)應(yīng)用。該裂殖壺菌具有富產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)的能力，其菌種保藏號CGMCC No.1240，保藏日期2004.10.27。該裂殖壺菌是以裂殖壺菌SR21的菌株為出發(fā)菌種，通過化學(xué)誘變和物理誘變相結(jié)合而得到的新菌種。該高DHA含量的突變菌株OUC88，通過優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，培養(yǎng)后期補加碳源，使細胞干重高達25g/L，DHA產(chǎn)量達8.27g/L。該菌體作為面包等食品或乳制品，尤其是嬰兒奶粉的添加劑，可以促進身體發(fā)育。整個菌體發(fā)酵工藝簡單，不需增加額外的設(shè)備和人工，提高了生物的利用率，獲得了較高產(chǎn)量的目的產(chǎn)物，降低了發(fā)酵成本。
文檔編號C12N1/14GK1648233SQ20041007542
公開日2005年8月3日 申請日期2004年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者張學(xué)成, 朱路英, 宋曉金, 況成宏 申請人:中國海洋大學(xué)