專利名稱：番茄靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的定位重組技術(shù)，是涉及番茄基因工程技術(shù)的改進(jìn)，尤其是番茄靶標(biāo)基因及其轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建制備方法，為使外源DNA能夠準(zhǔn)確地整合到番茄基因組中的特定位點而設(shè)計的一種高效的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，它是將改進(jìn)的DNA重組技術(shù)和基因工程技術(shù)，用于以番茄等茄科植物為主的品種培育方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化是現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化的標(biāo)志，2004年全世界的轉(zhuǎn)基因作物的播種面積已經(jīng)達(dá)到了8000萬公頃。全球轉(zhuǎn)基因種子產(chǎn)業(yè)的銷售利潤已經(jīng)達(dá)到380億美元，而且每年有以15％的速度增長。我們國家的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的面積已經(jīng)達(dá)到了300萬公頃。目前，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)作物品種改良和分子育種是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的商業(yè)特征，將外源基因?qū)胫参锘蚪M是基因工程育種技術(shù)的重要手段。傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)化方法大多是將目的基因和標(biāo)記基因構(gòu)建到Ti質(zhì)粒上，通過大量地轉(zhuǎn)化受體葉片或愈傷組織來獲得轉(zhuǎn)化體。傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)化方法沒有特定的轉(zhuǎn)化位點，目標(biāo)基因的插入位點沒有固定的位置，其隨機性強，轉(zhuǎn)化效率低，容易造成轉(zhuǎn)化基因的沉默、共抑制、位置效應(yīng)等問題，因此基因轉(zhuǎn)化技術(shù)本身缺乏穩(wěn)定性。而且進(jìn)行轉(zhuǎn)化所用的外植體多，所切割的葉片至少要有上百片，甚至上千片進(jìn)行侵染，而轉(zhuǎn)化率只有5％以下，篩選工作量比較大，最后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體只有不足10個，阻滯了轉(zhuǎn)基因品種產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。由于目標(biāo)基因的整合的隨機性，而且整合的位點多，并且沒有固定的位置，目標(biāo)基因容易在后代的遺傳重組中丟失。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的商業(yè)化發(fā)展和轉(zhuǎn)基因品種的產(chǎn)業(yè)化都要求建立有效的基因轉(zhuǎn)化和表達(dá)體系，以保證目標(biāo)基因要整合在染色體的特定位點上，使得目標(biāo)基因高效轉(zhuǎn)化和精確的定位表達(dá)。根據(jù)植物基因工程原理，定位表達(dá)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化要分成兩步進(jìn)行，第一步，建立靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化體系；第二步，在含有靶標(biāo)基因的小芽或者小葉片轉(zhuǎn)化體上進(jìn)行第二次基因轉(zhuǎn)化——目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化。然而，實現(xiàn)上述目的的關(guān)鍵就是在受體材料中通過靶標(biāo)基因載體的介導(dǎo)將靶標(biāo)基因引入到靶標(biāo)位點上，有了靶標(biāo)基因表達(dá)位點的受體，多個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化體才能夠在特異位點實現(xiàn)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，多個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化才能做到目標(biāo)明確、精確到位、高效轉(zhuǎn)化和定位表達(dá)。實現(xiàn)靶標(biāo)基因在受體植物基因組DNA中的整合，一般要有四個基本過程，一是構(gòu)建將含有LOX位點、Cre基因和抗性選擇標(biāo)記基因的靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體；二是將這個靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化到具有植物體轉(zhuǎn)化功能的根癌農(nóng)桿菌中，并在其中實現(xiàn)多拷貝復(fù)制；三是通過根癌農(nóng)桿菌侵染受體的切割葉片，經(jīng)Ti質(zhì)粒的介導(dǎo)進(jìn)行靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化；四是通過潮霉素和卡那霉素的篩選以及分子鑒定，確認(rèn)含有LOX位點、Cre基因、MAS結(jié)構(gòu)序列和標(biāo)記基因表達(dá)的植物轉(zhuǎn)化體。其中，靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建是上述四個基本過程的第一步，是實現(xiàn)靶標(biāo)基因在受體番茄基因組DNA中整合的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，在實現(xiàn)靶標(biāo)基因在受體植物基因組DNA中整合的四個基本過程中，首先要建立一個能夠進(jìn)行目標(biāo)基因定點整合的靶標(biāo)受體或者受體系統(tǒng)，建立目標(biāo)明確的載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，即構(gòu)建番茄靶標(biāo)基因及番茄靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，研制了一種番茄靶標(biāo)基因，其含有LOX位點，Cre基因，MAS結(jié)構(gòu)序列和抗性選擇標(biāo)記基因，其特征在于該番茄靶標(biāo)基因載體的DNA連接片段總長度為14589bp，其中靶標(biāo)位點片段長度為2740bp，靶標(biāo)基因載體的T-DNA區(qū)長度為8266bp；該基因載體的T-DNA區(qū)核苷酸序列為附圖SEQ NO.1所示；該基因的圖譜結(jié)構(gòu)特征是，從T-DNA區(qū)的左邊界到右邊界依次是CaMV PolyA，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記基因，CaMV35S啟動子A，多克隆位點的MCS區(qū)，CaMV35S啟動子B，單一的LOX，Cre基因，MAS結(jié)構(gòu)序列，LacZ基因，CaMV35S啟動子C，Gus基因。
所述的番茄靶標(biāo)基因，從其T-DNA區(qū)的左邊界到右邊界，具有相關(guān)功能的基因分別是(1)用于潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄的CaMV35SPolyA尾(1-522bp)(2)用于抗生素篩選標(biāo)記的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(523-1616bp)；(3)用于調(diào)節(jié)潮霉素基因表達(dá)的CaMV35S啟動子A(1617-2399bp)；(4)用于多克隆位點的MCS區(qū)(2647-2697bp)；(5)用于調(diào)控Cre基因表達(dá)的CaMV35S啟動子B(3043-3603bp)；(6)用于目標(biāo)基因定位重組的單一的LOX位點(3604-3652bp)；(7)用于切割目標(biāo)基因的同向Lox位點的Cre基因(3653-4692bp)；(8)用于轉(zhuǎn)化的MAS結(jié)構(gòu)序列章魚堿合成酶基因的T-DNA結(jié)構(gòu)序列(4693-5388bp)；(9)用于克隆功能的半乳糖苷酶LacZ基因(5389-5656bp)；(10)用于調(diào)節(jié)Gus基因表達(dá)的CaMV35S啟動子C(5657-6199bp)；(11)用于定點表達(dá)的組織細(xì)胞學(xué)鑒定的Gus基因(6200-8224bp)。
一種上述番茄靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體，所述的轉(zhuǎn)化載體含有SEQ NO.1所示的核苷酸序列；當(dāng)將該轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105時，即完成了該轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建；完成了該轉(zhuǎn)化載體的受體菌轉(zhuǎn)化，即獲得該載體轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌株，其是含有靶標(biāo)基因雙元載體的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA1301D/1002D，其菌種保藏號CCTCC NOM 204094，菌種保藏日為2004年12月09日。
所述的含有靶標(biāo)基因雙元載體的具體結(jié)構(gòu)序列是從T-DNA區(qū)的左邊界到右邊界，順序依次為CaMV PolyA，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，CaMV35S啟動子A，多克隆位點的MCS區(qū)，CaMV35S啟動子B，單一的LOX，Cre基因，MAS結(jié)構(gòu)序列，LacZ基因，CaMV35S啟動子C，Gus基因。該具有靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)的雙元載體質(zhì)粒DNA的長度為14589bp。
所述番茄靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法的步驟有四步第一步是構(gòu)建靶標(biāo)位點片段；即用HindIII-NcoI酶切質(zhì)粒pLox1002D，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收以后，并獲得長度為1834bp的DNA片段；再用HindIII-NcoI酶切質(zhì)粒pUCE35/8012，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收以后，獲得長度為906bp的含有35S啟動子的DNA片段；將這兩段DNA片段用T4連接酶連接后，即獲得NcoI酶切位點連接的靶標(biāo)位點DNA片段；該靶標(biāo)位點DNA片段依序為35S啟動子、LOX位點、Cre基因和MAS結(jié)構(gòu)序列的連接DNA片段，該片段的長度為2740bp的DNA連接片段；第二步是構(gòu)建靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體；
即先用HindIII酶切質(zhì)粒pCam1301D，獲得長度為11849bp的線性DNA片段，然后用去磷酸化酶對酶切位點去磷酸化，再用T4連接酶在18℃、1小時，連接第一步的274bp靶標(biāo)位點DNA片段，獲得總長度為14589bp的靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體；初步構(gòu)建的該轉(zhuǎn)化載體是將35S啟動子、LOX位點、Cre基因、MAS結(jié)構(gòu)序列與含有另一個35S啟動子及含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和Gus基因的標(biāo)記基因連接在一起，構(gòu)成具有靶標(biāo)基因的雙元載體pCam1301D/1002D；第三步是構(gòu)建靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的中間表達(dá)載體菌株；將第二步的總長度為14589bp的靶標(biāo)基因雙元載體質(zhì)粒DNA，在42℃、90秒轉(zhuǎn)染E.coli感受態(tài)DH5a，然后在含有X-gal、IPTG和Kan的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時，挑選白色克隆，在LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序驗證該雙元載體的正確性和方向性，最后獲得含有三個35S啟動子、LOX位點、Cre基因、MAS結(jié)構(gòu)序列及含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和Gus標(biāo)記基因的、具有靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)的中間表達(dá)載體菌株大腸桿菌EC1301D/1002D菌株；第四步是完成靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體的實質(zhì)構(gòu)建；將驗證正確的第三步的靶標(biāo)基因的中間表達(dá)載體菌株大腸桿菌EC1301D/1002D的質(zhì)粒DNA與根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞混合，在液氮中放置1分鐘后，37℃、3分鐘，再加入YEB液體培養(yǎng)基28℃、培養(yǎng)3小時，然后在含有潮霉素和卡那霉素的YEB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)36小時；之后再挑選克隆，并在YEB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切驗證該靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的正確性和方向性，完成靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化；獲得高轉(zhuǎn)化率的表達(dá)宿主細(xì)胞根癌農(nóng)桿菌菌株EHA1301D/1002D，其內(nèi)含有三個35S啟動子、LOX位點、Cre基因、LacZ基因、MAS結(jié)構(gòu)序列及含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和Gus標(biāo)記基因的雙元載體質(zhì)粒DNA。其菌種保藏號CCTCC NOM 204094，菌種保藏日為2004年12月09日。
本發(fā)明的有益效果在于實施番茄的基因工程育種具有三個特點一是可以在農(nóng)藝性狀良好的番茄品種中進(jìn)行目的基因的多次轉(zhuǎn)化，由于有了靶標(biāo)基因的表達(dá)和靶標(biāo)位點的整合，目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化就有了精確的整合位點，目標(biāo)載體中的目標(biāo)基因可以更換并進(jìn)行多次的更換，農(nóng)藝性狀的改良也可以多元化，可以同時進(jìn)行多個抗病基因或者抗不同種病害基因的轉(zhuǎn)化。二是外植體的轉(zhuǎn)化率高，其中，以靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行番茄品種葉片外植體的基因轉(zhuǎn)化，則靶標(biāo)基因的整合比例可以達(dá)到30％以上(表1)；也就是說，30％以上的番茄外植體葉片可以獲得含有靶標(biāo)基因表達(dá)的再生芽。以含有靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化體葉片為外植體(荷蘭紅果LOX和97-2LOX)進(jìn)行目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化，則目標(biāo)基因的整合比例可以達(dá)到70％以上(表3，(54+61)/40×2×2×100％)，也就是說，70％以上的外植體葉片可以獲得含有目標(biāo)基因表達(dá)的再生芽，在如此高的基因轉(zhuǎn)化率之下，少量的受體組織(少于20個葉片外植體)就可以完成目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化和篩選；三是目標(biāo)基因的整合位點在特定的LOX位點上，精確率達(dá)到95％以上(表3)，如果以改造后的目標(biāo)基因為載體進(jìn)行不含有靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化體葉片為外植體(荷蘭紅果和97-2，表3)，則目標(biāo)基因Chi5B的轉(zhuǎn)化率只有7.5％，略高于卡那霉素抗性基因為目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化率4.2％(表4)，目標(biāo)基因Chi5B和卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化率低于10.0％，表明傳統(tǒng)方法進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)化，基因的整合往往受到了受體基因細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的干預(yù)和抑制，并伴有基因的沉默、共抑制及其位置效應(yīng)的發(fā)生。因此，靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)行目標(biāo)基因的高效轉(zhuǎn)化和特異位點的精確整合，有效地避免外源基因的沉默、共抑制、位置效應(yīng)等問題，接近100％的精確整合率表明目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化具有整合位點的特異性。
本發(fā)明構(gòu)建完成的靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體，其最重要的效果一是轉(zhuǎn)化效率的大大提高；二是轉(zhuǎn)化位點的精確整合。由于靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建完成，因此可以使得轉(zhuǎn)基因作物達(dá)到進(jìn)行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的積極效果。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)方法也可以推介到其它轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用中。
附圖及其具體實施方式
本發(fā)明的實施例結(jié)合附圖進(jìn)一步描述如下

圖1為番茄靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的組成示意圖。
圖2為轉(zhuǎn)基因番茄植物產(chǎn)品的定位重組技術(shù)路線流程示意圖。
參見圖1研制的一種番茄靶標(biāo)基因，其含有LOX位點，Cre基因，MAS結(jié)構(gòu)序列和抗性選擇標(biāo)記基因。該番茄靶標(biāo)基因載體的DNA連接片段總長度為14589bp，其中靶標(biāo)位點片段長度為2740bp，靶標(biāo)基因載體的T-DNA區(qū)長度為8266bp；該基因載體的T-DNA區(qū)核苷酸序列為圖1SEQ NO.1所示；該段DNA的圖譜結(jié)構(gòu)特征如圖2所示圖中有 表示CaMV35SPolyA(1-522bp)； 表示潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(523-1616bp)； 表示CaMV35S啟動子A(1617-2399bp)； 表示多克隆位點的MCS區(qū)(2647-2697bp)； 表示CaMV35S啟動子B(3043-3603bp)； 表示單一的LOX位點(3604-3652bp)； 表示Cre基因(3653-4692bp)； 表示MAS結(jié)構(gòu)域(4693-5388bp)； 表示半乳糖苷酶LacZ基因(5389-5656bp)； 表示CaMV35S啟動子C(5657-6199bp)； 表示Gus基因(6200-8224bp)； 表示T-DNA左右邊界。
所述的番茄靶標(biāo)基因，從其T-DNA區(qū)的左邊界到右邊界，具有相關(guān)功能的基因分別是(1)用于潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄的CaMV35SPolyA尾(1bp-522bp)(2)用于抗生素篩選標(biāo)記的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(523bp-1616bp)；(3)用于調(diào)節(jié)潮霉素基因表達(dá)的CaMV35S啟動子A(1617bp-2399bp)；(4)用于多克隆位點的MCS區(qū)(2647-2697bp)；(5)用于調(diào)控Cre基因表達(dá)的CaMV35S啟動子B(3043bp-3603bp)；(6)用于目標(biāo)基因定位重組的單一的LOX位點(3604bp-3652bp)；(7)用于切割目標(biāo)基因的同向Lox位點的Cre基因(3653bp-4692bp)；(8)用于轉(zhuǎn)化的MAS結(jié)構(gòu)序列章魚堿合成酶基因的T-DNA結(jié)構(gòu)序列(4693bp-5388bp)；(9)用于克隆功能的半乳糖苷酶LacZ基因(5389bp-5656bp)；(10)用于調(diào)節(jié)Gus基因表達(dá)的CaMV35S啟動子C(5657bp-6199bp)；(11)用于定點表達(dá)組織細(xì)胞學(xué)鑒定的Gus基因(6200bp-8224bp)。
一種上述番茄靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體，所述的轉(zhuǎn)化載體含有附圖SEQ NO.1所示的核苷酸序列；當(dāng)將該轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105時，即完成了該轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建；完成了該轉(zhuǎn)化載體的受體菌轉(zhuǎn)化，即獲得該載體轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌株，其是含有靶標(biāo)基因雙元載體的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA1301D/1002D，其菌種保藏號CCTCC NOM204094，菌種保藏日為2004年12月09日。
所述的含有靶標(biāo)基因雙元載體的具體結(jié)構(gòu)序列是從T-DNA區(qū)的左邊界到右邊界，順序依次為CaMV PolyA，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，CaMV35S啟動子A，多克隆位點的MCS區(qū)，CaMV35S啟動子B，單一的LOX，Cre基因，MAS結(jié)構(gòu)序列，LacZ基因，CaMV35S啟動子C，Gus基因。該具有靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)的雙元載體質(zhì)粒DNA的長度為14589bp。
所述番茄靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法的步驟有四步第一步是構(gòu)建靶標(biāo)位點片段；即用HindIII-NcoI酶切質(zhì)粒pLox1002D，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收以后，并獲得長度為1834bp的DNA片段；再用HindIII-NcoI酶切質(zhì)粒pUCE35/8012，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收以后，獲得長度為906bp的含有35S啟動子的DNA片段；將這兩段DNA片段用T4連接酶連接后，即獲得NcoI酶切位點連接的靶標(biāo)位點DNA片段；該靶標(biāo)位點DNA片段依序為35S啟動子、LOX位點、Cre基因和MAS結(jié)構(gòu)的連接DNA片段，該片段的長度為2740bp的DNA連接片段；第二步是構(gòu)建靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體；即先用HindIII酶切質(zhì)粒pCam1301D，獲得長度為11849bp的線性DNA片段，然后用去磷酸化酶對酶切位點去磷酸化，再用T4連接酶在18℃、1小時，連接第一步的274bp靶標(biāo)位點DNA片段，獲得總長度為14589bp的靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體；初步構(gòu)建的該轉(zhuǎn)化載體是將35S啟動子、LOX位點、Cre基因、MAS結(jié)構(gòu)序列與含有另一個35S啟動子及含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和Gus基因的標(biāo)記基因連接在一起，構(gòu)成具有靶標(biāo)基因的雙元載體pCam1301D/1002D；第三步是構(gòu)建靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的中間表達(dá)載體菌株；將第二步的總長度為14589bp的靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒DNA，在42℃、90秒轉(zhuǎn)染E.coli感受態(tài)DH5a，然后在含有X-gal、IPTG和Kan的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時，挑選白色克隆，在LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序驗證該雙元載體的正確性和方向性，最后獲得含有三個35S啟動子、LOX位點、Cre基因、MAS結(jié)構(gòu)序列及含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和Gus標(biāo)記基因的、具有靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)的中間表達(dá)載體菌株大腸桿菌EC1301D/1002D菌株；第四步是完成靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體的實質(zhì)構(gòu)建；將驗證正確的第三步的靶標(biāo)基因的中間表達(dá)載體菌株大腸桿菌EC1301D/1002D的質(zhì)粒DNA與根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞混合，在液氮中放置1分鐘后，37℃、3分鐘，再加入YEB液體培養(yǎng)基28℃、培養(yǎng)3小時，然后在含有潮霉素和卡那霉素的YEB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)36小時；之后再挑選克隆，并在YEB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切驗證該靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的正確性和方向性，完成靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化；獲得高轉(zhuǎn)化率的表達(dá)宿主細(xì)胞根癌農(nóng)桿菌菌株EHA1301D/1002D，其內(nèi)含有三個35S啟動子、LOX位點、Cre基因、LacZ基因、MAS結(jié)構(gòu)序列及含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和Gus標(biāo)記基因的雙元載體質(zhì)粒DNA。其菌種保藏號CCTCC NOM 204094，菌種保藏日為2004年12月09日。
應(yīng)用靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體實施番茄靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化的具體實施例如圖3所示；含有靶標(biāo)基因片段(13)的靶標(biāo)載體(14)，經(jīng)過轉(zhuǎn)化成為含有靶標(biāo)載體(15)的農(nóng)桿菌EHA1301D/1002D(16)，在含有YEB培養(yǎng)基(18)的三角瓶(17)中過夜培養(yǎng)，將待接種的受體番茄的葉片(19)切成5mm2大小的碎片(20)，與YEB培養(yǎng)基(18)過夜的農(nóng)桿菌EHA1301D/1002D共培養(yǎng)10-30分鐘，將菌液用無菌水沖洗干凈，侵染后的葉片接種在含有MS+X分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(21)上，經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)以后，大約經(jīng)過30-40天的時間，在含有潮霉素的MS+X分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織形成和植株再生(22)。
具體實施過程如下1)外植體預(yù)培養(yǎng)將番茄品種“荷蘭紅果2003”“櫻紅1號”、“97-2”、“遼遠(yuǎn)多麗”無菌苗葉片切成5mm2大小接種在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2～3天。
2)含有靶標(biāo)基因載體的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)取100ul在甘油中保存的農(nóng)桿菌菌液EHA1301D/1002D，接種到5ml含有25mg/l潮霉素和50mg/l卡那霉素的的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃過夜培養(yǎng)。取1ml過夜培養(yǎng)的菌液接種到20ml含有同樣抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，至O.D.600＝0.6～0.8，5000r/m，4℃離心7min，收集菌體。用20ml MSA液重新懸浮培養(yǎng)菌，加入10ul乙酰丁香酮，28℃培養(yǎng)1～2h，此時O.D.600在0.3左右，即可用于侵染。
3)外植體轉(zhuǎn)化將葉片置于上述MSA液中侵染10min，侵染完畢后，MS+X培養(yǎng)液洗去葉片表面的殘余菌液，將葉片接種到分化培養(yǎng)基上28℃共培養(yǎng)1天。
然后用MS液洗凈葉片，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(MS+X)+250mg/lcarb上25～28℃誘導(dǎo)不定芽分化1-2周。待葉片邊緣微愈傷形成。
4)轉(zhuǎn)化體的篩選待葉片邊緣形成微愈傷后再轉(zhuǎn)接到含較低濃度(＜25mg/l)潮霉素的上述分化培養(yǎng)基(MS+X)中誘導(dǎo)不定芽發(fā)生。2-4周以后，適當(dāng)提高抗生素的篩選濃度40-80mg/l潮霉素，不定芽長到2～3cm，將其切下轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(MS)中。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化體植株再生。
5)轉(zhuǎn)化體的鑒定；5).1組織染色鑒定經(jīng)用X-Gluc染色24小時，轉(zhuǎn)化體的根、莖、葉全部為蘭色，在抗性植株的根中也看到了很強的蘭色反應(yīng)。非轉(zhuǎn)基因胚體和植株的根中未檢測到蘭色。
5).2分子鑒定運用RT-PCR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)化體的靶標(biāo)基因是否整合在受體番茄轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中，是否有Cre基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，以及轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞中是否含有T-DNA區(qū)段的DNA整合。
本發(fā)明實施例的有益效果見表1——4表1 不同番茄受體品種的靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化率


注①能夠在含有潮霉素的分化培養(yǎng)基上生長愈傷組織的外植體葉片數(shù)；②40天時，所有潮霉素抗性愈傷組織上形成的不定芽數(shù)；③被檢測含有轉(zhuǎn)化的T-DNA的再生植株株數(shù)(由不定芽發(fā)育而成)；④被檢測含有Gus基因的再生植株株數(shù)；⑤被檢測含有Cre基因的再生植株株數(shù)；⑥被檢測含有Cre基因的再生植株株數(shù)與轉(zhuǎn)化外植體葉片數(shù)的比×100％。
表2 不同番茄受體品種的卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化率

注①能夠在含有潮霉素的分化培養(yǎng)基上生長愈傷組織的外植體葉片數(shù)；②40天時，所有潮霉素抗性愈傷組織上形成的不定芽數(shù)；③被檢測含有轉(zhuǎn)化的T-DNA的再生植株株數(shù)(由不定芽發(fā)育而成)；④被檢測含有Gus基因的再生植株株數(shù)；⑤被檢測含有NptII基因的再生植株株數(shù)；⑥被檢測含有NptII基因的再生植株株數(shù)與外植體葉片數(shù)的比×100％。
表3 不同番茄靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化體的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化率

注①能夠在含有潮霉素的分化培養(yǎng)基上生長愈傷組織的外植體葉片數(shù)；②40天時，所有潮霉素抗性愈傷組織上形成的不定芽數(shù)；③被檢測含有轉(zhuǎn)化的T-DNA的再生植株株數(shù)(由不定芽發(fā)育而成)；④被檢測含有目標(biāo)基因Chi5B的再生植株株數(shù)；⑤被檢測含有靶標(biāo)位點LOX的再生植株株數(shù)；⑥被檢測含有LOX位點的再生植株株數(shù)與形成的不定芽數(shù)的比×100％；⑦含有靶標(biāo)基因的荷蘭紅果轉(zhuǎn)化體植株；
⑧含有靶標(biāo)基因的97-2轉(zhuǎn)化體植株。
表4 不同番茄品種目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化率

注①能夠在含有潮霉素的分化培養(yǎng)基上生長愈傷組織的外植體葉片數(shù)；②40天時，所有潮霉素抗性愈傷組織上形成的不定芽數(shù)；③被檢測含有轉(zhuǎn)化的T-DNA的再生植株株數(shù)(由不定芽發(fā)育而成)；④被檢測含有Chi5B基因的再生植株株數(shù)；⑤被檢測含有Lox位點整合的再生植株株數(shù)；⑥被檢測含有Chi5B的再生植株株數(shù)與外植體葉片數(shù)的比×100％；⑦不含有靶標(biāo)基因的荷蘭紅果品種；⑧不含有靶標(biāo)基因的97-2品種。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對于上述實施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表SEQ NO.1<110>姜國勇<120>番茄靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的制備方法<140>專利申請?zhí)?amp;lt;141>2004-12-09<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>8266<212>DNA<213>根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)<220>
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1.一種番茄靶標(biāo)基因，其含有LOX位點，Cre基因，MAS結(jié)構(gòu)序列和抗性選擇標(biāo)記基因，其特征在于該番茄靶標(biāo)基因載體的DNA連接片段總長度為14589bp，其中靶標(biāo)位點片段長度為2740bp，靶標(biāo)基因載體的T-DNA區(qū)長度為8266bp；該基因載體的T-DNA區(qū)核苷酸序列為附圖SEQ NO.1所示；該基因的圖譜結(jié)構(gòu)特征是，從T-DNA區(qū)的左邊界到右邊界依次是CaMV PolyA，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記基因，CaMV35S啟動子A，多克隆位點的MCS區(qū)，CaMV35S啟動子B，單一的LOX，Cre基因，MAS結(jié)構(gòu)序列，LacZ基因，CaMV35S啟動子C，Gus基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述番茄靶標(biāo)基因，其特征在于所述的番茄靶標(biāo)基因，從其T-DNA區(qū)的左邊界到右邊界，具有相關(guān)功能的基因分別是(1)用于潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄的CaMV35SPolyA尾；(2)用于抗生素篩選標(biāo)記的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；(3)用于調(diào)節(jié)潮霉素基因表達(dá)的CaMV35S啟動子A；(4)用于多克隆位點的MCS區(qū)；(5)用于調(diào)控Cre基因表達(dá)的CaMV35S啟動子B；(6)用于目標(biāo)基因定位重組的單一的LOX位點；(7)用于切割目標(biāo)基因的同向Lox位點的Cre基因；(8)用于轉(zhuǎn)化的MAS結(jié)構(gòu)序列章魚堿合成酶基因的T-DNA結(jié)構(gòu)序列；(9)用于克隆功能的半乳糖苷酶LacZ基因；(10)用于調(diào)節(jié)Gus基因表達(dá)的CaMV35S啟動子C；(11)用于定點表達(dá)組織細(xì)胞學(xué)鑒定的Gus基因。
3.一種權(quán)利要求1所述番茄靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化載體，其含有附圖SEQ NO.1所示的核苷酸序列；當(dāng)將該轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105時，即完成了該轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建；完成了該轉(zhuǎn)化載體的受體菌轉(zhuǎn)化，即獲得該載體轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌株，其是含有靶標(biāo)基因雙元載體的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA1301D/1002D，其菌種保藏號CCTCC NOM 204094，菌種保藏日為2004年12月09日。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述番茄靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化載體，其特征在于所述的含有靶標(biāo)基因雙元載體的具體結(jié)構(gòu)序列是從T-DNA區(qū)的左邊界到右邊界，順序依次為CaMV PolyA，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，CaMV35S啟動子A，多克隆位點的MCS區(qū)，CaMV35S啟動子B，單一的LOX，Cre基因，MAS結(jié)構(gòu)序列，LacZ基因，CaMV35S啟動子C，Gus基因。該具有靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)的雙元載體質(zhì)粒DNA的長度為14589bp。
5.權(quán)利要求3所述番茄靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述的番茄靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法步驟有四步第一步是構(gòu)建靶標(biāo)位點片段；即用HindIII-NcoI酶切質(zhì)粒pLox1002D，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收以后，并獲得長度為1834bp的DNA片段；再用HindIII-NcoI酶切質(zhì)粒pUCE35/8012，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收以后，獲得長度為906bp的含有35S啟動子的DNA片段；將這兩段DNA片段用T4連接酶連接后，即獲得NcoI酶切位點連接的靶標(biāo)位點DNA片段；該靶標(biāo)位點DNA片段依序為35S啟動子、LOX位點、Cre基因和MAS結(jié)構(gòu)的連接DNA片段，該片段的長度為2740bp的DNA連接片段；第二步是構(gòu)建靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體；即先用HindIII酶切質(zhì)粒pCam1301D，獲得長度為11849bp的線性DNA片段，然后用去磷酸化酶對酶切位點去磷酸化，再用T4連接酶在18℃、1小時，連接第一步的274bp靶標(biāo)位點DNA片段，獲得總長度為14589bp的靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體；初步構(gòu)建的該轉(zhuǎn)化載體是將35S啟動子、LOX位點、Cre基因、MAS結(jié)構(gòu)序列與含有另一個35S啟動子及含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和Gus基因的標(biāo)記基因連接在一起，構(gòu)成具有靶標(biāo)基因的雙元載體pCam1301D/1002D；第三步是構(gòu)建靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的中間表達(dá)載體菌株；將第二步的總長度為14589bp的靶標(biāo)基因雙元載體質(zhì)粒DNA，在42℃、90秒轉(zhuǎn)染E.coli感受態(tài)DH5a，然后在含有X-gal、IPTG和Kan的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時，挑選白色克隆，在LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序驗證該雙元載體的正確性和方向性，最后獲得含有三個35S啟動子、LOX位點、Cre基因、MAS結(jié)構(gòu)序列及含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和Gus標(biāo)記基因的、具有靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)的中間表達(dá)載體菌株大腸桿菌EC1301D/1002D菌株；第四步是完成靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的實質(zhì)構(gòu)建；將驗證正確的第三步的靶標(biāo)基因的中間表達(dá)載體菌株大腸桿菌EC1301D/1002D的質(zhì)粒DNA與根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞混合，在液氮中放置1分鐘后，37℃、3分鐘，再加入YEB液體培養(yǎng)基28℃、培養(yǎng)3小時，然后在含有潮霉素和卡那霉素的YEB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)36小時；之后再挑選克隆，并在YEB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切驗證該靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體的正確性和方向性，完成靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化；獲得高轉(zhuǎn)化率的表達(dá)宿主細(xì)胞根癌農(nóng)桿菌菌株EHA1301D/1002D，其內(nèi)含有三個35S啟動子、LOX位點、Cre基因、LacZ基因、MAS結(jié)構(gòu)序列及含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和Gus標(biāo)記基因的雙元載體質(zhì)粒DNA；其菌種保藏號CCTCC NOM 204094，菌種保藏日為2004年12月09日。
全文摘要
本發(fā)明是一種番茄靶標(biāo)基因和轉(zhuǎn)化載體及其構(gòu)建方法，該靶標(biāo)基因片段總長14589pb，其中靶標(biāo)位點片段長2740pb，靶標(biāo)基因載體的T－DNA區(qū)長8266pb；該T－DNA區(qū)序列為圖SEQNO.1所示。該轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建第一步是構(gòu)建靶標(biāo)位點片段；第二步是構(gòu)建靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體；第三步是構(gòu)建該轉(zhuǎn)化載體的中間表達(dá)載體菌株；第四步是完成該轉(zhuǎn)化載體的實質(zhì)構(gòu)建。當(dāng)將該轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105時，即完成該轉(zhuǎn)化載體的受體菌轉(zhuǎn)化，該載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株是根癌農(nóng)桿菌菌株EHA1301D/1002D，保藏號CCTCCNOM204094，保藏日為2004/12/09。該靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化載體最重要的效果一是轉(zhuǎn)化效率大提高；二是轉(zhuǎn)化位點精確整合?？蓪崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物規(guī)模工廠化生產(chǎn)的效果。本基因轉(zhuǎn)化技術(shù)可推介到其它轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用中。
文檔編號C12N15/74GK1670214SQ20041007571
公開日2005年9月21日 申請日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者姜國勇 申請人:姜國勇