專利名稱：：獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的方法及其專用表達載體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的方法及其專用表達載體。
背景技術：
：籽粒硬度決定小麥的出粉率、淀粉顆粒的損傷程度和烘烤品質(zhì)，是小麥品質(zhì)改良的重要目標性狀，是衡量小麥品質(zhì)優(yōu)劣、貿(mào)易價格和最終用途的重要指標(Dubreil，L.S.Meliande，H.Chiron，J.P.，Compoint，L.，Quillien，G，，Branlard，D.andMarion，D.(1998)EffectofPuroindolinesonthebreadmakingpropertiesofwheatflour.CerealChem.75222-229)。控制硬度的主效基因pinA和pinB位于染色體5D短臂上，軟質(zhì)對硬質(zhì)為顯性。PINA和PINB統(tǒng)稱為富色氨酸蛋白(Puroindoline)共同作用形成脆弱蛋白(Friabilin)，從而影響籽粒質(zhì)地的形成。當pinA和pinB基因為野生型時，小麥籽粒為軟質(zhì)；當pinA不表達(PinA-D1a)或pinB(PinB-D1a)發(fā)生任何一種已報道的8種類型的突變，小麥籽粒則表現(xiàn)為硬質(zhì)。Friabilin蛋白作為硬度的生化標記，在軟質(zhì)麥水洗淀粉(water-washedstarch)表面含量較多，在硬質(zhì)麥水洗淀粉表面含量較少，在硬粒小麥水洗淀粉表面不存在。KonduruKrishnamurthy和MichealJ.Giroux(KonduruKrishnamurthy，MichealJ.Giroux.2001.Exprssionofwheatpuroindolinegenesintransgenicriceenhancegrainsofness.NatureBiotechnology.19162-166)將pinA和pinB轉(zhuǎn)入不含有此基因的水稻(OryzasativaL.)，轉(zhuǎn)基因水稻的籽粒質(zhì)地發(fā)生變化；Giroux等將野生型的pinB-D1a轉(zhuǎn)入攜帶pinB-D1b的硬質(zhì)小麥‘Hi-line’，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出軟質(zhì)，水洗淀粉中Friabilin含量增加明顯，籽粒硬度、破損淀粉顆粒數(shù)明顯減小。Hogg等將野生型的pinA-D1a和pinB-D1a分別和共同轉(zhuǎn)入硬質(zhì)小麥‘Hi-line，發(fā)現(xiàn)Friabilin的含量取決于野生型PINA和PINB的多少，而與Puroindoline總量無直接關系。目前，已報道的轉(zhuǎn)基因技術只限于將Puroindoline基因的野生序列轉(zhuǎn)入二倍體水稻和pinB-D1b小麥，獲得籽粒軟質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植株。通過控制Puroindoline的表達來改善提高谷物作物的籽粒硬度，目前尚未見報道。目前，我國生產(chǎn)上推廣種植的中優(yōu)9507(pinB-D1b)、京9428和內(nèi)鄉(xiāng)188等優(yōu)質(zhì)小麥品種，它們的蛋白質(zhì)含量和面筋強度均達到一級面包小麥水平，只是因為其硬度不夠，大大降低了其加工品質(zhì)和商業(yè)價值。通過常規(guī)育種方法很難在短時間內(nèi)獲得硬質(zhì)、高蛋白、強筋的優(yōu)質(zhì)面包小麥品種。花粉管通道法介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法已成功應用于不同植物的轉(zhuǎn)基因研究，并已經(jīng)在我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育中發(fā)揮了重要作用。和其他轉(zhuǎn)化方法相比，花粉管通道法在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中，不受受體基因型和愈傷分化能力的限制，且避免了組織培養(yǎng)過程中所存在的體細胞變異，以其快速、簡便、成本低廉，而逐步得到重視和應用。但轉(zhuǎn)化時間、轉(zhuǎn)化載體的DNA濃度及受體植株花粉發(fā)育狀態(tài)均直接影響其轉(zhuǎn)化成功率和效率，致使不少嘗試者望而卻步。因此，花粉管通道法介導的遺傳轉(zhuǎn)化還需要在應用實踐中進一步優(yōu)化和規(guī)范轉(zhuǎn)化程序，提高其可重復性和轉(zhuǎn)化效率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可用于獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的一對表達載體。本發(fā)明所提供的用于獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的一對表達載體，其中一個在多克隆位點插入有pinA，另一個在多克隆位點插入有pinB。為了提高pinA和pinB的表達效率，所述表達載體的啟動子均為Ubi啟動子；篩選標記基因均包括Bar基因。在所述表達載體中，在所述pinA或pinB的上游，還含有Ω序列和/或kozak序列；在所述pinA或pinB的下游含有poly(A)信號序列。為了能夠有效的表達PINA或PINB，所述kozak序列是指包括pinA或pinB起始密碼子在內(nèi)的‘CCATGC’；所述Ω序列在pinA或pinB基因上游，中間間隔2bp，該序列含有‘TTAAC’，能和80S核糖體結合，促進外源基因表達的90bp序列。其中，所述pinA可具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述pinB可具有序列表中序列2的核苷酸序列所述Ubi啟動子可具有序列表中序列3的核苷酸序列，所述Bar基因可具有序列表中序列4的核苷酸序列。序列表中的序列1和序列2均由449個堿基組成，序列3由2004個堿基組成，序列4由552個堿基組成。所述一對表達載體優(yōu)選為pUBPa和pUBPb。本發(fā)明的第二個目的是提供一種獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的方法。本發(fā)明所提供的獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的方法，是將上述一對表達載體導入小麥中，獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥。所述一對表達載體可通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化小麥。所述花粉管通道法轉(zhuǎn)化小麥的方法為在正在開花的麥穗上只留下當天剛開的穎花，剪去小穗1/3穎殼，2-3小時后剪去柱頭，在剛剪去柱頭的花柱上注入一對濃度均0.5-1μg/μL的表達載體各5-10μL。所述小麥優(yōu)為中優(yōu)9507。本發(fā)明通過外源pinA和pinB在受體植株中高效穩(wěn)定表達，與內(nèi)源基因形成共抑制，從而抑制受體植株中pinA和pinB的表達，提高受體植株的籽粒硬度，為進一步通過基因工程方法快速改良我國現(xiàn)有小麥優(yōu)良品種的籽粒硬度奠定基礎。本發(fā)明構建了在多克隆位點插入有pinA或pinB的植物表達載體，該植物表達載體采用了在單子葉植物中高效啟動外源基因表達的Ubi啟動子，并在目的基因的上游加上Kozak序列、Ω序列和poly(A)信號序列，提高外源基因的表達穩(wěn)定性與表達量。利用該表達載體將外源pinA和pinB導入小麥，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，PCR檢測和southern雜交證實了外源基因在受體小麥基因組中的整合。水洗淀粉表面蛋白的定量分析表明外源基因的導入影響了Friabilin表達。研究結果表明，有兩個株系中的外源pinA和pinB與內(nèi)源基因形成共抑制，受體植株中的Friabilin蛋白不表達，籽粒硬度大為提高。本發(fā)明為進一步明確pinA和pinB的功能，并通過基因工程方法快速改良我國現(xiàn)有單子葉植物(特別是小麥)品種的籽粒硬度奠定了基礎。圖1為pUBPa的構建過程示意2為pG4APa的酶切鑒定圖譜圖3為pUBPa的的酶切鑒定圖譜圖4為pUBPb的構建過程示意5為pG4APb的酶切鑒定圖譜圖6為pUBPb的的酶切鑒定圖譜圖7為轉(zhuǎn)基因植株的Barsta抗性篩選照片圖8為部分Barsta抗性植株的PCR檢測電泳圖譜圖9為不同轉(zhuǎn)基因植株的基因組southern雜交分析圖譜圖10為不同轉(zhuǎn)基因株系單籽粒水洗淀粉表明friabilin蛋白的SDS-PAGE分析圖譜具體實施方式轉(zhuǎn)基因受體優(yōu)質(zhì)面包小麥品種中優(yōu)9507(pinB-D1b)，特點為蛋白質(zhì)含量高、強筋，但作為面包品種，硬度偏低。實施例1、pUBPa及pUBPb的構建質(zhì)粒載體pGEMPa和pGEMPb分別含有野生型基因pinA和突變型pinB-D1b基因，其構建方法如下利用我國小麥品種京411基因組DNA做模板，比較已報道的谷物作物中硬度主效基因PinA和PinB的氨基酸序列，根據(jù)保守區(qū)域，設計了兩對簡并引物，同時為了方便于克隆，在引物兩端分別添加了酶切位點。擴增PinA的引物pinA上游引物(加BamHI位點)為5’-CGGGATCCAACATGAAG/TGCCCTCT/ATCCTCATAG，pinA下游引物(加EcoRI位點)為5’-CGGAATTCCATCA/GCCAGTAATA/TGCCAATAGTGC；擴增PinB的引物pinB上游引物(加KpnI位點)為5’-GGGGTACCCAT/AGAAGACCTTAT/GTCCTCCTAGC，pinB下游引物(加EcoRI位點)為5’-CGGAATTCCAT/ACACCAGTAATAGCC/GACTAGG(以上引物由上海博亞生物技術有限公司合成)。按照常規(guī)方法進行PCR擴增PinA和PinB，擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的條帶，pinA基因的特異性片段經(jīng)EcoRI和BamHI酶切，pinB基因的特異性片段經(jīng)EcoRI和KpnI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶解在超純水或TEbuffer中備用。然后與pGEM-3Z-f(+)(PromegaBiotech，Wis.)相應的酶切大片斷于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選白斑重組子進行酶切鑒定和序列分析，獲得pGEMPa和pGEMPb。pG4AB(毛立群，郭三堆.1996.Ω序列和3’poly(A)序列長度與基因表達效率的關系.植物學報，1998，40(7)1-3)為表達載體提供Ω序列、kozak序列和poly(A)序列。pAHC25(ChristensenAH，QuailPH.1996.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch，5213-218)提供表達載體所需的Ubiqutin啟動子(2.0kb)、Nos強終止子及由Ubiqutin啟動子調(diào)控的Bar盒子(3.0kb)。PCR引物pTpina1(上游)5’>aactgcaggaaggccctcttcctcatag<3(含PstI酶切位點)pTpina2(下游)5’>ccgctcgagcatcaccagtaatagccaa<3’(含XhoI酶切位點)pTpinb1(上游)5’>aactgcaggaagaccttattcctcctagc<3’(含PstI酶切位點)pTpinb2(下游)5’>ccgctcgagcatcaccagtaatagcca<3’(含XhoI酶切位點)。1、pUBPa的構建pUBPa的構建過程如圖1所示，具體方法如下以pGEMPa為模板，在引物pTpina1和pTpina2的引導下，PCR擴增pinA。其中，擴增體系10μl10×PCR緩沖液(含15mMMg2+)，8μldNTP(每種2.5mM)，pTpina1(20μM)，pTpina2(20μM)，2μlpGEMPaDNA(0.2-1.0μg)，TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl，加H2O定容至100μl。反應程序95℃前變性5min，94℃變性1min，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃后延伸10min。PCR擴增結束后，將PCR擴增體系于0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，采用“六一”廠DYC-P31AI型電泳槽；80V，80min，EB染色10min，觀察，結果得到約0.5kb片段，回收此片段，再經(jīng)XhoI和PstI雙酶切回收，與經(jīng)XhoI和PstI雙酶切pG4AB得到的約4.0kb片段連接，將連接產(chǎn)物通過CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，得到陽性克隆，提質(zhì)粒，將質(zhì)粒用XhoI和PstI雙酶切，XhoI單酶切，PstI單酶切進行酶切鑒定，結果如圖2所示，表明pG4APa經(jīng)XhoI和PstI雙酶切后得到0.5kb和4.0kb的兩個片段；pG4APa經(jīng)XhoI單酶切得到4.5kb片段；pG4APa經(jīng)PstI單酶切得到4.5kb片段；說明重組質(zhì)粒pG4APa的結構正確。圖2中，1.PCRMarker；2.pG4APa經(jīng)XhoI和PstI雙酶切；3.pG4APa經(jīng)XhoI單酶切；4.pG4APa經(jīng)PstI單酶切；5.1kbDNALadderMarker。pAHC25經(jīng)BsmHI和SacI完全雙酶切，得到5.5kb、2.3kb、1.9kbs三個片段(圖3)，回收2.3kb、5.5kb兩個片段，分別含有Bar盒子、Ubi啟動子，與用BamHI完全酶切再用SacI部分酶切pG4APa質(zhì)粒DNA后回收得到含有Ω序列、poly(A)序列、pinA基因的約0.75kb外源片段進行三片段連接，先是0.75kb與2.3kb連接12h，再加入5.5kb片段連接反應，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，得到陽性克隆，提質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pUBPa，其圖譜及酶切鑒定結果如圖3所示，表明pUBPa經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切得到5.5kb、2.2kb、0.45kb和0.3kb的四個片段；pAHC25對照經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切出現(xiàn)約5.5kb、2.3kb、1.9kb三個片段。說明pUBPa的結構正確。圖3中，1.pAHC25經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切；2，3.pUBPa經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切；4.1kbDNALadderMarker。2、pUBPb的構建pUBPb的構建過程如圖4所示，具體方法如下以pGEMPb為模板，在引物pTpinb1和pTpinb2的引導下，PCR擴增pinB。其中，擴增體系10μl10×PCR緩沖液(含15mMMg2+)，8μldNTP(每種2.5mM)，pTpinb1(20μM)，pTpinb2(20μM)，2μlpGEMPbDNA(0.2-1.0μg)，TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl，加H2O定容至100μl。反應程序95℃前變性5min，94℃變性1min，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃后延伸10min。PCR擴增結束后，將PCR擴增體系于0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，采用“六一”廠DYC-P31AI型電泳槽；80V，80min，EB染色10min，觀察，結果得到約0.5kb片段，回收此片段，再經(jīng)XhoI和PstI雙酶切回收，與經(jīng)XhoI和PstI雙酶切pG4AB得到的約4.0kb片段連接，將連接產(chǎn)物通過CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，得到陽性克隆，提質(zhì)粒，將質(zhì)粒用XhoI和PstI雙酶切，XhoI單酶切，PstI單酶切進行酶切鑒定，結果如圖5所示，表明pG4APb經(jīng)XhoI和PstI雙酶切后得到0.5kb和4.0kb的兩個片段；pG4APb經(jīng)XhoI單酶切得到4.5kb片段；pG4APb經(jīng)PstI單酶切得到4.5kb片段；說明重組質(zhì)粒pG4APb的結構正確。圖5中，1.PCRMarker；2，3.pG4APb經(jīng)XhoI單酶切；4，5.pG4APb經(jīng)PstI單酶切；6，7.pG4APb經(jīng)XhoI和PstI雙酶切；5.1kbDNALadderMarker。pAHC25經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切，得到5.5kb、2.3kb、1.9kbs三個片段(圖6)，回收2.3kb、5.5kb兩個片段，分別含有Bar盒子、Ubi啟動子，與用BamHI和SacI完全雙酶切pG4APb質(zhì)粒DNA后回收得到含有Ω序列、poly(A)序列、pinA基因的約0.75kb外源片段進行三片段連接，先是0.75kb與2.3kb連接，過夜，再加入5.5kb片段連接反應，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，得到陽性克隆，提質(zhì)粒，獲得目的重組質(zhì)粒pUBPb，其酶切鑒定結果如圖6所示，表明pUBPb質(zhì)粒DNA經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切出現(xiàn)約5.5kb、2.2kb、0.75kb三條目的片段，pAHC25對照經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切出現(xiàn)約5.5kb、2.3kb、1.9kb三個片段；可能的克隆子經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶，進一步說明了0.75kb外源片段替換的是pAHC25中SacI(2775)酶切位點與BamHI(5048)酶切位點之間的片段而非gus的位置，可能在回收2.3kb片段時將一部分的1.9kb片段收到。圖6中，1.pAHC25經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切；2.pUBPb經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切；3.可能的克隆子經(jīng)BamHI和SacI完全雙酶切；4.1kbDNALadderMarker。實施例2、同時轉(zhuǎn)質(zhì)粒pUBPa和pUBPb獲得硬質(zhì)、強筋轉(zhuǎn)基因小麥1、小麥花粉管通道轉(zhuǎn)化參照《分子克隆》(SambrookJ，David.W.RussellMolecuarCloningAlaboratoryManual，3rded.科學出版社，2002，8.30-32)方法分別大量提取pUBPa、pUBPb質(zhì)粒DNA，PEG純化。經(jīng)純化后的質(zhì)粒DNA，溶于PH7.6的TE緩沖液中，終濃度為1μg/μL。小麥中優(yōu)9507揚花后開始選材掛牌，12天后至盛花期選擇正在開花的麥穗，去除未開過的穎花和已開過的穎花，每穗只留下當天剛開的穎花，剪去小穗1/3穎殼，2-3小時后剪去柱頭。用微量注射器在剛剪去柱頭的花柱上注入5μL含有1μg/μLpUBPa和5μL含有1μg/μLpUBPb重組質(zhì)粒的溶液，并用TE溶液作對照，套上雜交袋。植株正常成熟后收獲籽粒2300粒。2、轉(zhuǎn)化后代Basta篩選收獲的籽粒經(jīng)H2O2浸種、催芽后播于盆缽內(nèi)育苗，播種成苗率達90％以上。長至三葉期時，經(jīng)100mg/L抗性篩選劑Basta涂抹第三葉片的1/3面積，五天后進行抗性篩選。當對照(未轉(zhuǎn)pUBPa和pUBPb質(zhì)粒的植株)葉片出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象時，選擇葉片生長正常轉(zhuǎn)基因植株移栽溫室，一周后篩選得到89株Basta抗性植株(圖7)。圖7中，1非轉(zhuǎn)基因植株2轉(zhuǎn)基因植株。3、轉(zhuǎn)化后代PCR檢測抗性篩選后獲得的89株Basta抗性植株新鮮葉片50mg，按SDS堿法提取小麥基因組總DNA。引物是用Ubi啟動子的部分序列及外源基因的全長而設計，PCR擴增產(chǎn)物全長約為700bp。PCR反應所用引物為上海生工公司合成。用于檢測外源pinA基因的上游引物序列為5’-GGCATATGCAGCATCTATTC-3’，下游引物為5’-CTACACCAGTAATAGCCAA-3’；用于檢測pinB基因的上游引物序列為5’-GGCATATGCAGCATCTATTC-3’，下游引物為5’-CATCACCAGTAATAGCCACTA-3’。結果得到52棵陽性株。其中部分Barsta抗性植株的PCR檢測結果如圖8所示，陽性植株的PCR擴增產(chǎn)物中均有700bp的條帶。圖8中，MPCRMarker；1-12，PCR陽性植株13陰性對照；箭頭示目的條帶。4、轉(zhuǎn)化后代的southernblot分析利用pinA基因的PCR擴增產(chǎn)物做雜交探針，采用Promega公司Primc-a-GeneLabelingSystem試劑盒進行探針標記，α-32P-dCTP購自北京亞輝生物公司。選擇PCR檢測呈陽性的植株，提取基因組DNA，取30ug進行HindIII酶切處理，1％的瓊脂糖電泳小時后，轉(zhuǎn)至Hybond+尼龍膜，按Xia等(LanqinXia，SanduiGuo.2001.IntegrationandinheritancestabilityofBttoxingeneinthebivalentinsect-resistanttransgeniccottonplants.ChineseScienceBulletin，46(16)1372-1375)方法進行Southern雜交。洗膜后，壓磷屏24h，掃屏10分鐘左右進行雜交信號檢測。結果如圖9所示，轉(zhuǎn)基因植株與陽性對照一樣，得到大小分別為5.5kb、3.5kb、1.2kb和450bp的雜交條帶，而非轉(zhuǎn)基因植株無這些條帶，證實外源基因已整合到受體植株的基因組中(圖9)。圖9中，1-4為不同轉(zhuǎn)基因株系；5，6為非轉(zhuǎn)基因植株；7為陽性對照(該陽性對照為pinA全長序列的PCR擴增產(chǎn)物)；8為1kbladder。5、轉(zhuǎn)化后代的Friabilin蛋白分析取轉(zhuǎn)基因植株種子，橫切，對不含胚的一半籽粒(含胚的半粒種子用于成苗)，采用Bettge等(A.D.Bettge，C.F.MorrisandG.A.Greenblatt.1995.Assessinggenotypicsoftnessinsinglewheatkernelsusingstarchgranule-associatedfriabilinasabiochemicalmarker.Euphytica，8665-72)的方法提取friabilin蛋白，然后進行SDS-PAGE分析此蛋白在不同轉(zhuǎn)基因植株中的表達情況，每個轉(zhuǎn)基因株系設三次重復。同時，以未轉(zhuǎn)基因材料和硬粒小麥為對照。結果如圖10所示，表明和對照相比，不同轉(zhuǎn)基因株系中，小麥籽粒水洗淀粉表面Friabilin蛋白含量不同(圖10)，其中有三個株系(轉(zhuǎn)基因植株3-9，轉(zhuǎn)基因植株3-10，轉(zhuǎn)基因植株6-14)表現(xiàn)為Friabilin蛋白含量增加，有兩個株系(轉(zhuǎn)基因植株6-9，轉(zhuǎn)基因植株9-33)中的外源pinA和pinB與內(nèi)源基因形成共抑制，受體植株中的Friabilin蛋白不表達，籽粒硬度大為提高。圖10中，1.硬粒小麥；2.轉(zhuǎn)基因植株6-9；3.轉(zhuǎn)基因植株3-9；4.轉(zhuǎn)基因植株3-10；5.轉(zhuǎn)基因植株9-33；6.非轉(zhuǎn)基因植株；7.轉(zhuǎn)基因植株6-14；箭頭示Friabilin蛋白條帶。水洗淀粉表面蛋白的定量分析表明外源基因的導入影響了Friabilin表達。這可能是由于不同轉(zhuǎn)基因株系中，外源puroindoline基因的整合拷貝數(shù)不同，外源基因的高拷貝和高表達引起外源基因和內(nèi)源基因共抑制，從而導致Friabilin蛋白不表達。序列表<160>4<210>1<211>449<212>DNA<213>小麥屬小麥(TriticumaestivumL.)<400>1atgaaggccctcttcctcataggactgcttgctctggtagcgagcaccgcctttgcgcaa60tatagcgaagttgttggcagttacgatgttgctggcgggggtggtgctcaacaatgccct120gtagagacaaagctaaattcatgcaggaattacctgctagatcgatgctcaacgatgaag180gatttcccggtcacctggcgttggtggaaatggtggaagggaggttgtcaagagctcctt240ggggagtgttgcagtcggctcggccaaatgccaccgcaatgccgctgcaacatcatccag300gggtcaatccaaggcgatctcggtggcatcttgggatttcagcgtgatcgggcaagcaaa360gtgatacaagaagccaagaacctgccgcccaggtgcaaccagggccatccctgcaacatc420cccggcactattggctattactggtgatg449<210>2<211>449<212>DNA<213>小麥屬小麥(TriticumaestivumL.)<400>2atgaagaccttattcctcctagctctccttgctcttgtagcgagcacaaccttcgcgcaa60tactcagaagttggcggctggtacaatgaagttggcggaggaggtggttctcaacaatgt120ccgcaggagcggccgaagctaagctcttgcaaggattacgtgatggagcgatgtttcaca180atgaaggattttccagtcacctggcccacaaaatggtggaagagcggctgtgagcatgag240gttcgggagaagtgctgcaagcagctgagccagatagcaccacaatgtcgctgtgattct300atccggcgagtgatccaaggcaggctcggtggcttcttgggcatttggcgaggtgaggta360ttcaaacaacttcagagggcccagagcctcccctcaaagtgcaacatgggcgccgactgc420aagttccctagtggctattactggtgatg449<210>3<211>2004<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3aagcttgcatgcctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagc60attgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagt120gcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctata180gtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtcta240aaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgt300gttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagta360catccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctatt420ttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttattta480ataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaatacccttta540agaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgtt600aaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggcc660aagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccg720ctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagac780gtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggatt840cctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccct900ccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctc960ccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctcccccccccc1020ccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctact1080tctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtac1140acggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttg1200gggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttg1260tttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttg1320tttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttg1380ggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaatt1440ttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatgga1500aatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagaga1560tgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttct1620agatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtat1680gtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctagga1740taggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatc1800tattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataat1860tattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggattttttt1920agccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccc1980tgttgtttggtgttacttctgcag2004<210>4<211>552<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4atggctagcccagaacgacgcccggccgacatccgccgtgccaccgaggcggacatgccg60cggtctgcaccatcgtcaaccactacatccgagacaagcacggtcaacttccgtaccgag120ccgcagggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtctgcgggagcgctatccctg180gctcgtcgccgaggtggacggcgaggtcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggc240acgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcg300gacgggactgggctccacgctctacacccacctgctgaagtccctggaggcacagggctt360caagagcgtggtcgctgtcatcgggctgcccaacgacccgagcgtgcgcatgcacgaggc420gctcggatatgccccccgcggcatgctgcgggcggccggcttcaagcacgggaactggca480tgacgtgggtttctggcagctggacttcagcctgccggtaccgccccgtccggtcctgcc540cgtcaccgagat55權利要求1.用于獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的一對表達載體，其中一個在多克隆位點插入有pinA，另一個在多克隆位點插入有pinB。2.根據(jù)權利要求1所述的一對表達載體，其特征在于所述表達載體的啟動子均為Ubi啟動子；篩選標記基因均包括Bar基因。3.根據(jù)權利要求1或2所述的一對表達載體，其特征在于在所述表達載體中，在所述pinA或pinB的上游，還含有Ω序列和/或kozak序列；在所述pinA或pinB的下游含有poly(A)信號序列。4.根據(jù)權利要求3所述的一對表達載體，其特征在于所述Ω序列與所述pinA或pinB基因相距2bp；kozak的核苷酸序列為CCATGC。5.根據(jù)權利要求4所述的一對表達載體，其特征在于所述一對表達載體為pUBPa和pUBPb。6.獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的方法，是將權利要求1-5中任一項權利要求所述的一對表達載體導入小麥中，獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥。7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述一對表達載體通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化小麥。8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述花粉管通道法轉(zhuǎn)化小麥的方法為在正在開花的麥穗上只留下當天剛開的穎花，剪去小穗1/3穎殼，2-3小時后剪去柱頭，在剛剪去柱頭的花柱上注入一對濃度均0.5-1μg/μL的表達載體各5-10μL。9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述小麥為中優(yōu)9507。全文摘要本發(fā)明公開了獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥種子的方法及其專用表達載體。本發(fā)明的用于獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的一對表達載體，其中一個在多克隆位點插入有pinA，另一個在多克隆位點插入有pinB。獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥的方法，是將所述一對表達載體導入小麥中，獲得轉(zhuǎn)基因硬質(zhì)強筋小麥。本發(fā)明為進一步明確pinA和pinB的功能，并通過基因工程方法快速改良我國現(xiàn)有小麥品種的籽粒硬度奠定了基礎。文檔編號C12N15/29GK1749400SQ20041007813公開日2006年3月22日申請日期2004年9月17日優(yōu)先權日2004年9月17日發(fā)明者何中虎,夏蘭芹,陳新民申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物育種栽培研究所