專利名稱：用于檢測微流體的熒光檢測儀的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微流體(microfluidics)，更具體地，涉及能夠檢測微流體設備中的微流體反應的超小型熒光檢測儀。
背景技術：
微流體芯片(microfluid chip)是能夠通過使用覆蓋層(cover)覆蓋(covering)微通道結構而容納并操作痕量流體的芯片，所述微通道結構是通過諸如光蝕刻技術(photolithography)，熱模壓技術(hot embossing)，或模塑技術(plastic molding)等微處理技術產生的。所述微流體芯片可減少消耗的試劑量并縮短分析的時間。
具體地，當DNA變性，退火和延伸需要不同的溫度，就像在聚合酶鏈反應(PCR)中那樣時，這類反應通過重復溫度循環(huán)來進行。在這種情形下，小的反應體積和大的面積可迅速傳遞微室(micro chamber)中的溫度，并由此減少溫度循環(huán)所需的時間。
多種方法可實時檢測PCR；然而，目前優(yōu)選熒光檢測。已為熒光檢測發(fā)展出了各種方法，例如使用染料的方法和TaqMan(R)法。在使用染料的方法中，使用染料例如SYBR綠I(SYBR Green I)，它能與PCR中產生的雙鏈DNA結合而增強熒光。在TaqMan(R)法中，使用能夠結合在PCR所用兩種引物之間而不是一種引物的DNA序列作為探針，且熒光團和猝滅劑(quencher)連接在該探針的兩個末端。當利用DNA合成中使用的Taq聚合酶的外切核酸酶活性切割該探針時，結合在所述熒光團和猝滅劑之間的DNA被切下，且因此破壞了所述熒光團和猝滅劑之間的鍵。此時，分析發(fā)射出的熒光。
其間，1999年7月27日授權的美國專利5,928,907“System for Real TimeDetection of Nucleic Acid Amplification Products”(授予Applied Biosystems)公開了使用光纖(optical fiber)在管(tube)中檢測熒光的方法作為檢測熒光的方法之一。在該例中，一個檢測儀能檢測多根管。然而，必須使用昂貴的具有良好的凝聚性的光源例如激光，來收集激發(fā)光束(excitation beam)用于在光纖上激發(fā)熒光(exciting fluorescence)。此外，還需要精確的光學儀器，因此增加了設備的價格。
在2002年4月9日授權的美國專利6,369,893“Multi-Channel OpticalDetection System”(授予Cepheid)公開的方法中，激發(fā)區(qū)(excitation block)和檢測區(qū)是分開的。熒光激發(fā)通過激發(fā)區(qū)內的LED進行，熒光信號在檢測區(qū)中檢測，所述檢測區(qū)與激發(fā)區(qū)成90度角。因此，該設備對模塊化(modularization)有利。
然而，由于為了成90度角地進行激發(fā)和檢測，激發(fā)和檢測在菱形管(diamond-shaped tube)的側壁上進行，故所述管必須有足夠的壁厚度。因此，樣品管的容積必須是25μl或更大。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了超小型熒光檢測儀，它能實時檢測微室內流經的微流體的反應，所述微室具有預定的容積并位于微流體芯片上。
本發(fā)明一個方面提供了用于實時檢測微流體芯片中PCR擴增的熒光檢測儀，所述芯片具有預定體積的微室，該熒光檢測儀包括光源，第一光學系統(tǒng)(a first optical system)，第一檢測儀，和第二光學系統(tǒng)。其中，所述光源產生激發(fā)光束，所述第一光學系統(tǒng)能夠對所述微室發(fā)出具有預定的光點直徑(spot size)的激發(fā)光束，所述第二光學系統(tǒng)將源自微室中激發(fā)光束的熒光束反射到第一檢測儀。
第一光學系統(tǒng)包括第一濾光鏡(filter)，第一透鏡(lens)，第一反光鏡(mirror)，以及物鏡(objective len)。其中，第一濾光鏡傳送激發(fā)光束的短波長成分；第一透鏡位于光源和第一濾光鏡之間并聚集(collect)激發(fā)光束；第一反光鏡傳送第一濾光鏡傳來的激發(fā)光束中具有預定波長的成分并反射來自微室的熒光束；物鏡使第一反光鏡傳來的激發(fā)光束具有預定的光點直徑。
激發(fā)光束可通過第一透鏡聚集，以便在物鏡前方產生聚焦點(focal point，F)。
第二光學系統(tǒng)包括第二反光鏡，第二濾光鏡，和第二透鏡。其中，第二反光鏡將第一反光鏡反射的熒光束反射到第一檢測儀；第二濾光鏡傳送該熒光束的長波長成分；第二透鏡將第二濾光鏡傳來的熒光束收集到第一檢測儀。
第一反光鏡具有第一側面(first side)和第二側面(second side)。第一側面可具有涂層，它傳送激發(fā)光束并反射其上形成的熒光束；第二側面可以透過激發(fā)光束和熒光束。
第一反光鏡可具有第一側面和第二側面。第一側面可具有涂層，它傳送其上形成的激發(fā)光束；第二側面可具有涂層，它傳送激發(fā)光束并反射其上形成的熒光束。
第二反光鏡可反射具有第一波長的熒光束部分，并傳送具有第二波長的熒光束部分。
可將SYBR綠I作為染料加入微室中，用于在聚合酶鏈反應(PCR)中產生熒光。
可將SYBR綠I加入微室中，實時監(jiān)控編碼乙型肝炎病毒的DNA的PCR擴增。
可將至少兩種染料加入微室中，使得熒光束具有至少兩種波長。


通過詳細敘述示例性實施方案，并參考以下附圖，本發(fā)明的上述和其他特征和優(yōu)點將更明顯圖1是微流體芯片的透視圖，該芯片在根據本發(fā)明實施方案檢測微流體的熒光檢測儀中使用。
圖2是根據本發(fā)明一個實施方案檢測微流體的熒光檢測儀的示意圖。
圖3是根據本發(fā)明另一實施方案檢測微流體的熒光檢測儀的示意圖。
圖4A顯示了實時監(jiān)控DNA擴增的設備在不同時間的反應溫度圖(profile)。
圖4B顯示了根據本發(fā)明實施方案使用熒光檢測儀在DNA擴增中實時檢測的熒光信號。
圖5顯示了根據本發(fā)明實施方案用熒光檢測儀測量的熒光的降低，這是由于微流體芯片中溫度升高導致DNA解鏈(melt)而造成的。
發(fā)明詳述微流體芯片，以及根據本發(fā)明實施方案使用該微流體芯片檢測微流體反應的熒光檢測儀，都參考附圖進行更詳細描述。
根據圖1，微流體芯片100包括上層(upper substrate)110和下層(lowersubstrate)112，其中所述上層具有加樣孔(sample supply hole)106和出樣孔(sample discharge hole)108。微加熱器(micro heater)102與下層112相連，以便控制反應溫度。微室(micro chamber)105和微通道(micro channel)103將加樣孔106和出樣孔108連通，所述微室105和微通道103都是利用光蝕刻技術(photolithography)，熱模壓技術(hot embossing)，或模塑技術(plasticmolding)在上層110或下層112中形成的。
上層110和下層112通過陽極聯(lián)結(anodic bonding)，熱聯(lián)結(thermalbonding)，或者通過粘合劑聯(lián)結(bonding by means of an adhesive)來相連，以便儲存流體。微流體芯片100可利用微加熱器102控制反應溫度，所述加熱器在硅(silicone)表面有成型的金屬(patterned metal)，微加熱器102與下層112連接。下層112可由硅，金屬，或具有高熱傳導性的塑料組成，以便更易于傳導溫度。上層110可由透明材料(例如透明塑料)組成，以便更易于檢測熒光。
微室105，即微芯片100中用于檢測的中央部分，比加樣孔106和出樣孔108寬，使得所供樣品的檢測體積可達到最大。微芯片100中央區(qū)中形成的微室105的寬度是1mm或更寬。
圖2示意了根據本發(fā)明一個實施方案的熒光檢測儀。
根據圖2，熒光檢測儀200包括光源202，例如發(fā)光二極管(light emittingdiode)，第一透鏡204和第二透鏡236，第一濾光鏡206和第二濾光鏡234，第一反光鏡208和第二反光鏡232，物鏡210，微芯片220，和光電二極管(photodiode)240，所述光電二極管240具有作用區(qū)(active region)242。
光源202產生的光被第一透鏡204聚集，在物鏡210前方產生聚焦點(F)。第一濾光鏡206位于第一透鏡204和該聚焦點(F)之間，以便去除光源202產生的光中的長波長成分，這種成份干擾熒光。第一濾光鏡206被稱為透激發(fā)光束濾光鏡(excitation beam pass filter)，它由透短波長光的濾光鏡組成，也稱帶通(bandpass)濾光鏡。
透過第一濾光鏡206的光中，只有具有預定波長成分的光通過位于第一濾光鏡206和物鏡210之間的第一反光鏡208被傳送到物鏡210。具有其它波長成分的光被反射到第二反光鏡232。因此，具有其它波長成分而非預定波長成分的激發(fā)光束并不入射到微流體芯片220上。第一反光鏡208由分色鏡(dichroic mirror)組成。
第一反光鏡208傳送的激發(fā)光束通過物鏡210以預定的光點直徑照射到微流體芯片220的微室225上。
微流體芯片220的微室225中聚合酶鏈反應(PCR)的熒光信號如下檢測。
實施例1為從編碼乙型肝炎病毒的靶DNA的起始濃度開始，實時監(jiān)測該靶DNA的PCR擴增，用于檢測熒光束的PCR主混合物(master mixture)的組成如下表1所示。
表1

根據表1制備PCR溶液，取1μl注射到圖1所示微流體芯片100的加樣孔106內，并通過微通道103引入微室105。
然后，將熒光檢測儀對準微流體芯片100的微室105，并根據圖4A所示的溫度圖加熱微加熱器102。根據以下表2描述的PCR溫度條件，在各種熱循環(huán)下進行試驗。
表2

圖4B顯示了熒光信號，它是根據本發(fā)明的實施方案，在DNA擴增期間，使用所述熒光檢測儀實時監(jiān)測的。
在圖4B中，顯示了依賴于DNA質粒復制數的熒光束值，它是在熱循環(huán)期間在光電二極管中實時檢測到的。換言之，該圖顯示了相對于不同的PCR循環(huán)數的熒光束，它是在退火階段保持8秒后測連續(xù)5秒所得出的。
根據圖4B，PCR過程中DNA的量以幾何級數增加(geometricalprogression)，即當DNA數低于檢測限時，熒光束無法檢測到，它以直線形式射出，然后當DNA擴增到至少檢測限時，熒光束隨循環(huán)的增多而以幾何級數增加，由此檢測熒光。
一個具體循環(huán)(a particular cycle)后，反應速率開始下降，其中待反應的dNTP的濃度下降，且熒光束的增加率降低，從而顯示典型的S曲線。隨初始DNA質粒的復制數增加，開始以幾何級數增加的循環(huán)減少。
實施例2當使用SYBR綠I實時檢測PCR時，需要制作出造成DNA變性的解鏈曲線，以便確定PCR所擴增的DNA是否所需的位點。
圖5顯示了由于DNA隨微流體芯片中溫度升高而解鏈所造成的熒光降低，其使用所述熒光檢測儀來檢測。
圖5中明顯可見，當在溫度升高的同時實時檢測熒光時，擴增的DNA的雙鏈可以根據溫度解螺旋(untwist)并轉化成單鏈，由此降低熒光信號。對這種信號的分析提供了DNA的解鏈溫度，由此決定了擴增的DNA的雙鏈的長度。
下表3描述了獲得解鏈曲線的實驗條件。
表3

再看圖2，由于光源202產生激發(fā)光束，微室225中的樣品發(fā)射出熒光束，且該熒光束入射到物鏡210上，然后由物鏡210聚集。聚集的熒光束被第一反光鏡208反射到第二反光鏡232，然后被第二反光鏡232反射到第二濾光鏡234。
第二濾光鏡234采用傳送長波長成分的濾光鏡，或帶通濾光鏡，作為熒光束傳送濾光鏡。
然后，第二透鏡236將第二濾光鏡234傳送的熒光束聚集到光電二極管240的作用區(qū)242，然后檢測電信號。
圖3是根據本發(fā)明另一實施方案的熒光檢測儀300的示意圖。
圖3所示的根據本發(fā)明另一實施方案的熒光檢測儀300包括，光源302；第一到第三透鏡304，336，338；第一到第三濾光鏡306，307，309；第一和第二反光鏡308，311；第一和第二光電二極管340，344；物鏡310；和微流體芯片320。
圖2顯示的熒光檢測儀200設計為檢測一道熒光束，而圖3顯示的熒光檢測儀300構建成同時檢測至少兩道熒光束。
盡管SYBR綠I染料根據本發(fā)明一個實施方案用于檢測編碼乙型肝炎病毒基因的DNA，當同時使用染料例如羧基熒光素(carboxyfluorescein)(FAM)和羧基四甲基羅丹明(carboxytetramethylrhodamine)(TAMRA)來檢測編碼其它基因的DNA時，可使用熒光檢測儀300。
具體地，第一反光鏡308將至少兩種染料產生的具有不同波長的所有熒光束反射到第二反光鏡311。
第二反光鏡311導致具有第一波長的熒光束途經第二濾光鏡307和第二透鏡336而入射到第一光電二極管340的作用區(qū)342。
與此同時，具有第二波長的熒光束由第二反光鏡311傳送到第三濾光鏡309。然后，第三濾光鏡309所傳送的具有第二波長的熒光束途經第三透鏡338而入射到第二光電二極管344的作用區(qū)346。如此一來，熒光檢測儀300可檢測至少兩道熒光束。
光源302采用具有約470nm的峰值波長的藍色發(fā)光二極管(LED)，傳送短波長光的分色鏡作為透短波長光濾光鏡，在第一濾光鏡306中用作透激發(fā)光束濾光鏡。
由于分色鏡不允許具有長波長的光以約0-1％的透射比(transmittance)透過(這樣也是不利的)，因此使用至少兩層分色鏡來降低背景信號。
此外，在照射光透過濾光鏡(radiation light pass filter)的情況下，可使用一或兩層傳送長波長光的分色鏡，或者可進一步使用分開傳送(separatelytransmiting)長波長光的有色玻璃濾光鏡，來降低由于檢測途經該濾光鏡到達光電二極管的激發(fā)光束所引起的背景信號的升高。
根據本發(fā)明一個實施方案的第一反光鏡具有第一和第二側面。第一側面具有涂層，該涂層傳送激發(fā)光束并反射在該涂層上形成的熒光束；第二側面可透過所述激發(fā)光束和熒光束。但也可在第一側面上涂覆傳送激發(fā)光束的涂層，并在第二側面上涂敷傳送激發(fā)光束和反射熒光束的涂層，以此來改造第一反光鏡。
如上述，根據本發(fā)明的實施方案，設計了一種熒光檢測儀，使得光源發(fā)射的光聚焦在第一反光鏡和物鏡之間。相應地，該物鏡傳送的激發(fā)光束形成較大的光點直徑，使得激發(fā)光束可照射微流體芯片的整個微室，從而在更大的面積內檢測熒光束。
因此，根據本發(fā)明的實施方案構建熒光檢測儀時，易于將激發(fā)光束和微室相對，且不再另外需要用于控制其它光學組件(optical parts)的儀器組件(instrumental part)，從而降低生產成本。
本發(fā)明參照示例性實施方案進行了具體顯示和描述，但本領域技術人員應理解，可以在不偏離以下權利要求限定的本發(fā)明的精神和范疇的前提下，在形式和細節(jié)上進行各種改變。
權利要求
1.一種熒光檢測儀，用于實時檢測微流體芯片中進行的PCR擴增，所述微流體芯片具有體積預定的微室，所述熒光檢測儀包括光源，其產生發(fā)射光束；第一光學系統(tǒng)，其能夠將具有預定的光點直徑的激發(fā)光束照射到所述微室；第一檢測儀；和第二光學系統(tǒng)，其將熒光束反射到該第一檢測儀，所述熒光束來自所述微室中具有預定光點直徑的激發(fā)光束。
2.權利要求1的熒光檢測儀，其中所述第一光學系統(tǒng)包括第一濾光鏡，其傳送激發(fā)光束的短波長成分；第一透鏡，其位于光源和第一濾光鏡之間并聚集激發(fā)光束；第一反光鏡，其傳送第一透鏡傳送的激發(fā)光束的預定波長成分，并反射來自微室中的熒光束；和物鏡，其使得第一反光鏡傳送的激發(fā)光束具有預定的光點直徑。
3.權利要求2的熒光檢測儀，其中激發(fā)光束由第一透鏡收集，以便在物鏡前方產生聚集點(F)。
4.權利要求2的熒光檢測儀，其中第一反光鏡具有第一側面和第二側面，且第一側面具有涂層用于傳送激發(fā)光束并反射其上形成的熒光束；第二側面可透過所述激發(fā)光束和熒光束。
5.權利要求2的熒光檢測儀，其中第一反光鏡具有第一側面和第二側面，且第一側面具有涂層用于傳送其上形成的激發(fā)光束；第二側面具有涂層用于傳送激發(fā)光束并反射熒光束。
6.權利要求2的熒光檢測儀，其中第二光學系統(tǒng)包括第二反光鏡，其將第一反光鏡反射的熒光束反射到第一檢測儀；第二濾光鏡，其傳送該熒光束的長波長成分；第二透鏡，其將第二濾光鏡傳送的熒光束聚集到第一檢測儀。
7.權利要求6的熒光檢測儀，其中第二反光鏡反射具有第一波長的熒光束部分，并傳送具有第二波長的熒光束部分。
8.權利要求7的熒光檢測儀，進一步包括第二檢測儀；第三濾光鏡，其傳送具有第二波長的熒光束的長波長成分；和第三透鏡，其將第二反光鏡傳送的具有第二波長的熒光束聚集到第二檢測儀。
9.權利要求7的熒光檢測儀，其中將至少兩種染料加入所述微室中，使得產生具有至少兩種波長的熒光束。
10.權利要求9的熒光檢測儀，其中所述至少兩種染料選自SYBR綠I，FAM，和TAMRA。
11.權利要求1的熒光檢測儀，其中聚合酶鏈反應(PCR)在所述微室中進行，且加入了嵌入劑(intercalating agent)或TaqManTM作為染料，用于在PCR過程中產生熒光束。
12.權利要求11的熒光檢測儀，其中的嵌入劑是SYBR綠I。
13.權利要求12的熒光檢測儀，其中加入SYBR綠I來實時監(jiān)測編碼乙型肝炎病毒的DNA的PCR擴增。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種超小型熒光檢測儀，能夠實時檢測具有預定體積并位于一種微流體芯片上的微室中進行的反應。所述熒光檢測儀用于實時檢測微流體芯片中進行的PCR擴增，所述微流體芯片具有容積預定的微室；所述熒光檢測儀包括產生激發(fā)光束的光源，能夠將具有預定光點直徑的激發(fā)光束照到所述微室的第一光學系統(tǒng)，第一檢測儀，和第二光學系統(tǒng)，它將來自所述微室中具有預定光點直徑的激發(fā)光束的熒光束反射到所述第一檢測儀。相應地，所述熒光檢測儀設計為使光源發(fā)射的光線聚焦在所述第一反光鏡和物鏡之間。因此，物鏡傳送的激發(fā)光束形成的光點直徑較大，使得所述激發(fā)光束可照射在所述微流體芯片的整個微室上，由此在更大的面積內檢測熒光束。
文檔編號C12M1/34GK1637407SQ20041007865
公開日2005年7月13日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權日2003年12月30日
發(fā)明者金洙賢, 金珍泰 申請人:三星電子株式會社