專利名稱：蛋氨酸酶在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化學(xué)治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋氨酸酶組合物，蛋氨酸酶的純化方法，把蛋氨酸酶結(jié)合到聚合物如PEG(聚乙二醇)的方法，在抗氨蛋酸和抗高半胱氨酸的化學(xué)治療中使用蛋氨酸酶的方法。更具體的說，本發(fā)明的方法包括蛋氨酸酶在癌癥治療，心血管病治療和腫瘤造影和診斷中的使用。本發(fā)明還涉及重組DNA技術(shù)。本發(fā)明特別提供了編碼蛋氨酸酶的表達模型。
背景技術(shù)：
以治療藥物為主的癌癥療法是指使用能夠選擇性抑制或殺滅癌細胞，但不對正常組織的功能造成超出可接受的范圍的損傷的藥物。常規(guī)療法的難點在于治療藥物對正常組織的毒性。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在各種細胞類型和所評論的腫瘤組織中許多腫瘤都對蛋氨酸有絕對的需求。其中所述的細胞和腫瘤組織包括結(jié)腸、乳腺、前列腺、卵巢、腎、喉黑色素瘤、肉瘤、肺、腦、胃和膀胱中的腫瘤以及白血病和淋巴瘤?，F(xiàn)已明確當(dāng)生長培養(yǎng)基中的蛋氨酸被高半胱氨酸取代時，腫瘤的無生長能力已被定義為對蛋氨酸的依賴性。例如，參見Chello等，Cancer Res.，331898-1904，1973；和Hoffman，Anticancer Res.，51-30，1985。
現(xiàn)已表明去除蛋氨酸(methionine depletion)能夠選擇性地使依賴蛋氨酸的腫瘤細胞同步進入該細胞周期中的S/G2晚期，Hoffman等，Proc.Natl.Ad.Acad.Sci.USA.777306-7310，1980。聯(lián)合使用去除蛋氨酸，接著與暴露于抗有絲分裂劑，即抗蛋氨酸的化學(xué)療法，已經(jīng)把腫瘤細胞從正常和腫瘤細胞的共培養(yǎng)物中選擇性地去除，結(jié)果導(dǎo)致正常細胞細胞的培養(yǎng)物強有力地增生。Stern等，J.Natl.Cancer Inst.，76629-639，1986。
但是，為了在體內(nèi)進行蛋氨酸依賴性化學(xué)療法，必需有一種從血清中有效去除循環(huán)的蛋氨酸的方法，目前還沒有人描述過這樣一種去除蛋氨酸的方法，即這種方法能夠降低體內(nèi)循環(huán)的蛋氨酸的含量使其足以在抗腫瘤治療中有效。
現(xiàn)已從各種細菌源純化出一種能夠降解蛋氨酸的酶即蛋氨酸酶，并且據(jù)報道這種酶能夠減緩體外腫瘤細胞增生的速度。Kreis等，Cancer Res.，331862-1865和1866-1869，1973；Tanaka等，F(xiàn)EBS Letters.66307-311 1976；Ito等，J.Biochem.，791263-1272，1976和Nakayama等，Agric.Biol.Chem.，482367-2369，1984。
Kreis等，在Cancer Rs.，331866-1869，1973中已經(jīng)描述了使用從產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌(Clostridium sporgenes)中分離出的很不純的蛋氨酸酶制劑，以1150單位/千克/天的量抑制移入小鼠模型中的癌肉瘤細胞的生長。盡管該酶明顯降低了原發(fā)腫瘤細胞的生長，但是從未報道過把腫瘤直徑的T/C率(處理與對照之比)降低到50％以下，并且也從未報道過對轉(zhuǎn)移瘤有任何作用。作者也指出沒有其他非特異性的干涉不能預(yù)測蛋氨酸酶的腫瘤特異性，而且作者也沒有評論不純制劑中內(nèi)毒素或其他組分對所觀察到的效果起的作用的可能性。所報道的唯一毒理研究是在治療期之后動物體重沒有減輕并且對毒性的一般肉眼檢查呈陰性。另外，作者報道了這種酶具有4小時的血清半衰期。這種酶制劑只有一半純度并且含有顯著量的內(nèi)毒素，這使得對該結(jié)果的解釋復(fù)雜化。
而且，Kreis不能把血清蛋氨酸的含量降低到對照組的8％以下，這可能歸因于芽胞桿菌(Clostridium)酶的高Km(大約90mM)。據(jù)報道蛋氨酸酶制劑不穩(wěn)定并且在對它的純化中只能獲得2％回收(產(chǎn)率)。
Kreis等，在Cancer Res.，331866-1869，1973中還報道了一種抗腫瘤的方法即使用不含蛋氨酸的食物作為去除蛋氨酸的方法。但是，作者報道該飲食方法不能象使用不純的蛋氨酸酶制劑一樣有效地減緩細胞的生長，并且會導(dǎo)致動物體重持續(xù)下降這種不希望出現(xiàn)的副作用。作者沒有報道聯(lián)合使用不含蛋氨酸的食物與蛋氨酸酶治療，并且沒有研究細胞的同步化。
本發(fā)明的在先的申請?zhí)岢隽擞行У哪[瘤化學(xué)療法，這些化學(xué)療法是指使用蛋氨酸酶有效降低蛋氨酸的含量從而提供一種無損傷的抗腫瘤的有益效果。本發(fā)明通過提供一種用于生產(chǎn)商業(yè)上可行數(shù)量的高純度重組蛋氨酸酶來改進這些申請?zhí)岢隽酥委熀驮\斷方法以及組合物。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸酶，不論是PEG化(PEGylated)的形式還是所生產(chǎn)和純化的高純度的不含內(nèi)毒素的重組形式，都能夠無損害地去除哺乳動物體內(nèi)的蛋氨酸含量，都能夠有效地用于選擇性抑制腫瘤的生長，并且還能夠選擇性地阻抑腫瘤細胞，使其與抗有絲分裂的化學(xué)療法同步化。
現(xiàn)在也發(fā)現(xiàn)當(dāng)協(xié)同使用好幾種不同的方法來基本有效地降低蛋氨酸的含量時，蛋氨酸去除法是最有效的。這些方法包括使用不含蛋氨酸的飲食的蛋氨酸饑餓法，使用能夠與蛋氨酸競爭蛋氨酸利用酶(methionine-utilizingenzyme)的抑制劑的蛋氨酸競爭性抑制法，利于由蛋氨酸去除法誘發(fā)的特定腫瘤選擇性細胞周期阻抑的化學(xué)治療劑以及這些方法的組合。
所以，本發(fā)明描述了一種抑制腫瘤細胞生長的方法，它包括把腫瘤細胞群與治療有效量的本文所定義的蛋氨酸酶接觸一段足以誘發(fā)細胞群中細胞的細胞周期停滯的時期，并形成靜止的腫瘤細胞。“接觸”一詞是指把本發(fā)明的治療組合物與靶腫瘤放得非常接近以至于能夠觀察到抑制腫瘤的作用，或者把本發(fā)明的治療組合物放在一種培養(yǎng)基如營養(yǎng)培養(yǎng)基或血液中，以至于能使培養(yǎng)基中的蛋氨酸含量降低到能夠抑制培養(yǎng)基中的腫瘤細胞生長的水平。“靜止的”腫瘤細胞是指生長受抑制的腫瘤細胞。這種方法能夠在體外或體內(nèi)使用。與腫瘤細胞的接觸不需要是直接的，它可以在體外或體內(nèi)與含有腫瘤細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸來實現(xiàn)。這種接觸也可以把循環(huán)血液與蛋氨酸酶接觸來完成。當(dāng)腫瘤是不能循環(huán)的固體腫瘤時這種循環(huán)血液可以含有腫瘤細胞或不含腫瘤細胞?！耙种颇[瘤細胞的生長”是指服用本發(fā)明化合物能夠減少腫瘤的生長，例如以體積來衡量，與未用該化合物治療的腫瘤相比，腫瘤的體積可降低10％到100％，更優(yōu)選為至少34％到79％，最優(yōu)選為降低到55％到68％。
蛋氨酸酶通過去除蛋氨酸被用作減緩或終止細胞分裂的一種抗腫瘤劑。使用蛋氨酸的競爭性抑制劑能夠增強這種作用。另外，把蛋氨酸酶與抗有絲分裂劑和其他細胞周期的特異性細胞毒素劑一起使用能夠通過誘發(fā)細胞周期同步化來增加抗有絲分裂劑或其他細胞周期的特異性細胞毒素劑的治療有效性。
蛋氨酸酶也能用于去除高半胱氨酸的化學(xué)療法中來降低心血管疾病的危險和治療心血管疾病。蛋氨酸酶也用于超高分辯率地探測和診斷腫瘤時，再充足供[11C]蛋氨酸之前去除血液和腫瘤中的[12C]蛋氨酸。
在一個技術(shù)方案中，首先使腫瘤細胞接受蛋氨酸饑餓步驟來首次降低蛋氨酸的含量?？刹皇芟拗频匾愿甙塍a氨酸伴隨蛋饑餓法來降低對正常細胞的毒性，從而增加治療的特異性。
本發(fā)明的其他相關(guān)方面的特征是使用本發(fā)明的蛋氨酸去除法來將腫瘤細胞阻抑在細胞周期中的S/G2晚期，接著進行同步開始細胞周期的處理并服用一種細胞周期的特異細胞毒素劑如抗有絲分裂劑來選擇性地并有效地殺滅腫瘤細胞。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知對細胞周期具體階段的細胞具有毒性的細胞周期特異性細胞毒素劑。這種方法包括下列步驟(a)使由上述蛋氨酸去除步驟產(chǎn)生的靜止的腫瘤細胞與可誘發(fā)細胞周期的用量的蛋氨酸接觸，以啟動形成靜止腫瘤細胞周期生長的細胞(cycling-cells)的細胞周期，和(b)使周期生長的細胞與一定量的細胞周期的特異性細胞毒素劑接觸。這種周期生長的細胞毒素劑用量要足以抑制有絲分裂細胞的有絲分裂，由此抑制腫瘤細胞的生長。
在一個技術(shù)方案中，這種方法包括下列步驟(a)使由上述蛋氨酸去除步驟產(chǎn)生的靜止腫瘤細胞與可誘發(fā)細胞周期用量的蛋氨酸接觸來啟動形成靜止腫瘤細胞的有絲細胞的有絲分裂，和(b)使有絲分裂細胞與一定量的抗有絲分裂劑接觸，這種抗有絲分裂劑用量要足以抑制有絲分裂細胞的有絲分裂，由此抑制腫瘤細胞的生長。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種診斷患者的腫瘤的方法，包括a)通過給患者服用蛋氨酸酶來去除患者體內(nèi)的12C蛋氨酸；b)通過給患者服用11C蛋氨酸來給患者體內(nèi)充分供應(yīng)蛋氨酸；和c)測定患者體內(nèi)腫瘤細胞中存在的11C蛋氨酸升高的水平。
本發(fā)明另一個特征是使用蛋氨酸酶以降低患者體內(nèi)的半胱氨酸水平來降低心血管疾病的危險性并治療心血管疾病。
本發(fā)明提供了通過給藥蛋氨酸酶以去除蛋氨酸來進行腫瘤診斷和造影的方法。
另一個特點是用于蛋氨酸去除治療法的治療組合物，它含有治療有效量的基本分離出的蛋氨酸酶，這種蛋氨酸酶具有的比活性為每毫克(mg)蛋白至少大約10到40個單位的蛋氨酸酶活性且每毫克蛋白少于大約1到100ng的內(nèi)毒素，在優(yōu)選的方案中，該治療組合物包括每毫克蛋白少于10ng的內(nèi)毒素，與一種藥學(xué)上合適的載體。
本發(fā)明的治療組合物還包括不含內(nèi)毒素的蛋氨酸酶，在一個技術(shù)方案中，蛋氨酸酶是使用一種新的有效的方法從在改良的發(fā)酵條件下生長的惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)中制得的。在這方面本發(fā)明還提供了一種分離改良的高效生產(chǎn)蛋氨酸酶的惡臭假單胞菌菌株的方法。在另一個方案中，蛋氨酸酶是由含有編碼蛋氨酸酶的表達模型的重組宿主產(chǎn)生的。
本發(fā)明的蛋氨酸酶組合物也可以通過將蛋氨酸酶偶聯(lián)到聚合物如聚乙二醇(PEG)而以一種化學(xué)修飾的形式提供。本發(fā)明使用的PEG修飾的蛋氨酸酶具有高效去除蛋氨酸的活性，延長的半衰期和低免疫原性。
本發(fā)明的蛋氨酸酶組合物也可以利用一種表達載體如本文所定義的高效表達載體所生產(chǎn)的重組蛋白的形態(tài)來提供。采用高效表達體系所生產(chǎn)的蛋氨酸酶能夠很容易地使用本文所描述的方法來純化以獲得不含內(nèi)毒素并且非常純的蛋氨酸酶組合物，該組合物具有大約10到40個單位/毫克蛋氨酸酶的比活度。
本發(fā)明還提供了含有能夠表達高得出奇的高含量蛋氨酸酶的核酸的載體?，F(xiàn)在已經(jīng)使用這種載體如那些使用T7 RNA聚合酶啟動子的載體，在適當(dāng)?shù)臏赜龡l件下生產(chǎn)大約1到4克蛋氨酸酶/升的蛋氨酸酶，其在粗制的組織勻漿液中比活度為大約2.6到5，可表示為大約總細胞蛋白的10％到20％。
本發(fā)明還提供了基因治療方法，即本文所述的使用能夠用來替代含有蛋氨酸酶組合物的克隆的蛋氨酸酶基因的方法?；颊唧w內(nèi)的細胞可以被改變來表達蛋氨酸酶為患者血清提供治療量的蛋氨酸酶。
本發(fā)明還涉及分離出的核苷酸分子，含有圖8中所提供的核苷酸序列和一個或多個能夠在蛋氨酸酶的C-或N-端編碼兩個或多個組氨酸殘基的核酸序列。
本發(fā)明還涉及使用一種表達模型的改良的基因療法。
本發(fā)明的其他特征、優(yōu)點和相關(guān)方案將以本文所包含的說明書為主進行闡述。
附圖簡述

圖1以6個圖形詳細說明在不含蛋氨酸、不含高半胱氨酸、或不含蛋氨酸和高半胱氨酸培養(yǎng)基中腫瘤細胞系的生長。
圖2詳細說明蛋氨酸酶在小鼠異種移植中降低人的肺腫瘤(H460)生長水平的有效性。也詳細說明了5-FU和長春新堿治療的結(jié)果。
圖3詳細說明蛋氨酸酶、5-FU和長春新堿對移植人肺腫瘤(H460)鼠的體重作用。
圖4、5和6示給三名患者服用蛋氨酸酶之后蛋氨酸酶和蛋氨酸的藥物動力學(xué)。以蛋氨酸酶活性百分比作為蛋氨酸酶起始制劑活性的相對百分比。以蛋氨酸的百分比作為服用蛋氨酸酶之前蛋氨酸的相對百分比。
圖7是對蛋氨酸酶-高半胱氨酸代謝循環(huán)的詳細說明。
圖8提供了從惡臭假單胞菌分離出來的編碼蛋氨酸酶DNA分子的蛋氨酸酶的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。
圖9圖解載體中典型的高表達的模型。
圖10簡要說明獲得高純度、不含內(nèi)毒素的蛋氨酸酶的純化步驟簡圖。
圖11概述使用本文所述的純化方法時重組蛋氨酸酶(rMETase)的典型純度和回收率。
圖12提供了采用本發(fā)明方法純化rMETase產(chǎn)物的例子。
圖13提供了不同劑型的rMETase的活性圖。
圖14提供了對PEG-rMETase的HPLC的分析數(shù)據(jù)。
圖15示不同PEG與rMETase的分子時PECT-rMETase的活性。
圖16提供了在小鼠體內(nèi)PEG-rMETase的藥物動力學(xué)。
圖17示rMETase對KB3-1細胞體外培養(yǎng)中的生長抑制作用。
圖18提供了rMETase抗裸鼠的KB3-1細胞的有效性。
圖19提供了以裸鼠體重示rMETase的毒性。
圖20提供了rMETase對移植了KB3-1細胞的裸鼠血液細胞的毒性。
圖21提供了rMETase對BALB/C小鼠的毒性。
圖22提供了rMETase對BALB/C小鼠的毒性。
圖23提供了對人患者中蛋氨酸酶的毒性評價。
圖24提供了對人患者中蛋氨酸酶的藥物動力學(xué)評價。
圖25提供了證實rMETase對裸鼠體內(nèi)的H460和HT29的生長抑制的數(shù)據(jù)。
圖26提供了體外正常細胞和人癌細胞對rMETase的敏感性的對比。
這些附圖不必要按比例繪制，本發(fā)明的某些特征可以在比例上放大并且為了清楚和簡要以草圖的形式表示。
發(fā)明內(nèi)容A.定義
“氨基酸殘基”是指在多肽肽鏈上化學(xué)消化(水解)多肽所形成的氨基酸。本文所述的氨基酸殘基尤其是指“L”光學(xué)異構(gòu)體形式。但是，只要多肽保留了所需的功能特性，“D”光學(xué)異構(gòu)體上的殘基能被任何L-氨基酸殘基取代。NH2-是指存在于多肽氨基端的游離氨基。COOH是指存在于多肽羰基端的游離羰基。本文保留了標(biāo)準(zhǔn)的多肽命名法(在J.Biol.Chem.，243，3552-59，1969所描述的，并被37C.F.R.1.822(b)(2))采納，這里引用為參考文件。
應(yīng)當(dāng)注意本文使用通式所表示的所有氨基酸殘基序列的氨基端向羧基端的一般方向都是從左向右的取向。另外，把詞組“氨基酸殘基”較寬地定義為包括氨基酸表中所列的氨基酸以及改良的和不常用的氨基酸，如列于本文引用為參考文件的37CER 1.822(b)(4)中的那些氨基酸。而且，應(yīng)當(dāng)注意在氨基酸殘基序列起始端或末端的短線表示對另一個單個的或多個的氨基酸殘基序列的肽鍵或者對氨基端基團如NH2的或乙?；螋然嘶鶊F如COOH的共價鍵。
“重組DNA(rDNA)分子”指的是通過操作性連接兩個DNA片段所形成的DNA分子。所以，重組DNA分子是含有在自然中通常發(fā)現(xiàn)不在一起的至少兩個核苷酸序列的雜交的DNA分子。沒有相同生物起源的即進化上不同的rDNA被稱作為“異源的”rDNA。
“載體”指的是在細胞中能夠自主復(fù)制的rDNA分子和為了使所附著的區(qū)段發(fā)生復(fù)制，能夠可操作地連接DNA區(qū)段如基因或多核苷酸的rDNA分子。本文把能夠?qū)虮磉_編碼一個或多個多肽的基因的載體稱作“表達載體”。特別重要的載體能夠容易地表達本發(fā)明的蛋氨酸酶蛋白。
B.使用蛋氨酸酶作為抗腫瘤劑的方法1.蛋氨酸的去除本文以各種方式使用蛋氨酸酶作為抗腫瘤劑來從腫瘤細胞、腫瘤組織或患有癌癥的哺乳動物的循環(huán)系統(tǒng)中基本上去除蛋氨酸或者在如本文下面所詳細描述的認(rèn)為需要去除蛋氨酸的情況下，去除蛋氨酸。
盡管已有的方法能夠把體內(nèi)的蛋氨酸含量降低到不低于35μm左右，但是目前還沒有一種能夠安全、簡便并迅速把蛋氨酸含量降低到幾乎低于10μm左右的方法。基本上是指使用蛋氨酸的常規(guī)測定方法至少可測得蛋氨酸含量低于10μm，優(yōu)選少于1μm，更優(yōu)選少于0.1μm，最好是測定不出蛋氨酸的含量。使用一些方法能夠在水溶液，包括體液如血液、血漿和血清中測定出蛋氨酸。一個舉例說明的方法是使用蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)物的反相FPLC法。
在體內(nèi)，哺乳動物的循環(huán)中，在組織培養(yǎng)物或其他生物培養(yǎng)基需要去除蛋氨酸的體外條件下，以及在體外操作生物體液、細胞或組織并接著放回哺乳動物患者的體內(nèi)的離體方法中都能夠進行去除。
從循環(huán)、培養(yǎng)基、生物體液或細胞中進行蛋氨酸的去除是為了減少進入要治療物的蛋氨酸的量，因此它包括在去除蛋氨酸的條件下把要去除的物質(zhì)與去除蛋氨酸量的本發(fā)明蛋氨酸酶接觸，來降解被接觸物質(zhì)中的蛋氨酸。
因為腫瘤細胞依賴于它們營養(yǎng)培養(yǎng)基中的蛋氨酸，所以可以去除這些細胞的營養(yǎng)源，而不必去除這些細胞本身。因此，在體內(nèi)應(yīng)用本發(fā)明，使蛋氨酸酶與腫瘤細胞群的營養(yǎng)介質(zhì)接觸。在這種方案中，介質(zhì)可以是血液、淋巴液、腦脊液等需要去除蛋氨酸的體液。
去除蛋氨酸的量能夠根據(jù)使用的不同而在很寬范圍內(nèi)變化，并且一般取決于物質(zhì)中存在的蛋氨酸的量、所需的去除速度和該物質(zhì)對于暴露于蛋氨酸酶的耐受性。使用本領(lǐng)域所熟知的各種化學(xué)和生化方法能夠很容易地監(jiān)控物質(zhì)中的蛋氨酸的含量和從該物質(zhì)中去除蛋氨酸的速度。本文還描述了去除蛋氨酸量的例子，其中在每毫升被處理物質(zhì)中，蛋氨酸酶的范圍是0.001到100單位(U)，優(yōu)選大約為0.01到10U，更優(yōu)選為大約0.1到5U蛋氨酸酶的范圍內(nèi)變化。
去除蛋氨酸的條件是與蛋氨酸酶的生物活性相適應(yīng)的緩沖液和溫度條件，并且包括與該酶相適應(yīng)的緩和的溫度、鹽和pH條件。盡管優(yōu)選生理條件，但條件的例子包括4-40攝氏度(℃)左右、相對于0.05到0.2M NaCl的離子強度和5到9左右的pH。
在一個優(yōu)選的方案中，本發(fā)明設(shè)想了使用蛋氨酸酶作為抗腫瘤劑的方法，所以它包括把腫瘤細胞群與治療有效量的蛋氨酸酶接觸一段足以誘發(fā)群體中的細胞的細胞周期停滯的時期，并形成靜止的腫瘤細胞。
如本文所述，由于各種原因，包括但不限于，選擇性地減緩腫瘤的生長、通過把停滯期的細胞保持一段延長的時期以產(chǎn)生細胞死亡的方法殺滅腫瘤細胞和在接著的化學(xué)治療之前為細胞周期同步化制備腫瘤細胞群等，都需要使腫瘤細胞處于細胞周期停滯期。
通過與蛋氨酸酶接觸誘發(fā)細胞周期停滯所需的時間取決于好幾種因素，如與該細胞或含有該細胞的培養(yǎng)基所接觸的蛋氨酸酶的量，蛋氨酸的量，酶的比活度，溫度和其他影響反應(yīng)速度的反應(yīng)條件以及由實施者很容易控制的參數(shù)等。典型的時期是10分鐘到30天左右，優(yōu)選1小時到20天左右，更優(yōu)選1到10天左右。
細胞周期的停滯是這樣一種狀態(tài)，其中細胞既不分裂也不通過全部周期過程進行循環(huán)，各個階段分別稱作G0、G1、G2和S期。正如通過相對于正常靜息細胞DNA的累積所證實，據(jù)認(rèn)為一旦去除蛋氨酸，細胞周期會停止在S/G2晚期停止。通過各種組織學(xué)方法進行測定，能夠鑒定細胞周期停滯的方法，并且可以以細胞培養(yǎng)物進行評價，如實施例中所述該方法包括測定細胞群的DNA含量。
本治療方法可用于的腫瘤包括任何惡性細胞型如在固體腫瘤或血液腫瘤中發(fā)現(xiàn)的惡性細胞。固體腫瘤的例子包括但不限于下列器官的腫瘤胰臟、結(jié)腸、盲腸、胃、腦、頭、頸、卵巢、腎、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房。血液腫瘤的例子包括骨髓腫瘤、T或B細胞惡性腫瘤、白血病、淋巴瘤、胚細胞瘤、骨髓瘤等。
在一個方案中，通過靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)注射給藥患者有效量的一種含有本發(fā)明的蛋氨酸酶的生理上可耐受的組合物來完成體內(nèi)的接觸，由此去除存在于患者體內(nèi)循環(huán)的腫瘤細胞的蛋氨酸源。也能通過把蛋氨酸酶向含有腫瘤細胞的組織給藥來完成蛋氨酸酶的接觸。
蛋氨酸酶的治療有效量是達到所需作用即去除腫瘤組織或患者循環(huán)中的蛋氨酸而計算好的預(yù)測量，因此使腫瘤細胞停止分裂。
所以，服用本發(fā)明蛋氨酸酶的劑量范圍是足以產(chǎn)生所需的作用即減少腫瘤細胞分裂和細胞周期的癥候的劑量范圍。該劑量不能大到引起不利的副作用，如粘滯性過高癥狀，肺水腫，充血性心力衰竭等。通過劑量將隨著患者的年齡、身體狀況、性別和疾病程度的不同而變化，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠決定的。
如果有并發(fā)癥醫(yī)生可以調(diào)整該劑量。
本發(fā)明蛋氨酸酶的治療有效量一般是這樣一種劑量，即服用一種生理上可耐受的組合物時足以使血管內(nèi)(血漿)或局部的蛋氨酸酶濃度達到每毫升大約0.001到100單位(U)，優(yōu)選在0.1U以上，更優(yōu)選每毫升在1U蛋氨酸酶以上。普通的劑量是以體重為準(zhǔn)服用，并且在大約5-1000U/kg/天，優(yōu)選大約5-100U/kg/天，更優(yōu)選大約10-50U/kg/天，最優(yōu)選大約20-40U/kg/天的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選的方法中，所用的蛋氨酸酶基本上不含內(nèi)毒素，正如本文進一步討論的。特別優(yōu)選的是使用重組體所產(chǎn)生的基本上不含內(nèi)毒素的蛋氨酸酶。
該蛋氨酸酶能夠通過注射或逐漸輸注一段時間經(jīng)腸道外給藥。蛋氨酸酶也能通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)口腔、肌肉內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、經(jīng)皮、皮膚給藥，能夠通過蠕動方式運送，或者直接注射到含有腫瘤細胞的組織或通過與內(nèi)含有潛在的生物傳感器或蛋氨酸的導(dǎo)管相連的泵來給藥。
含有蛋氨酸酶的治療組合物通常靜脈內(nèi)給藥，如注射單位劑量。術(shù)語“單位劑量”當(dāng)用于本發(fā)明治療組合物的說明書中時是指適于受治療者的單一劑量的物理上分立的單位，每個單位含有能產(chǎn)生所需治療作用的預(yù)測量的活性物質(zhì)與所需稀釋劑即載體或賦形劑(vehicle)。
該組合物是以與劑型一致的方式和一種治療有效量給藥的。所給的量取決于所治療的對象，該對象系統(tǒng)對使用活性組分的能力和所需治療有效的程度。需要給藥的活性成分的精確量取決于醫(yī)師的判斷并且都是每個個體都是獨特的。但是，本文公開了系統(tǒng)使用的適當(dāng)劑量范圍，它取決于給藥的途徑。也仔細考慮了適當(dāng)?shù)淖畛踅o藥和加強劑量注射的方法，這種方法的特征是最初給藥接著在一或多個小時的間隔又進行注射或給藥重復(fù)的劑量。本文描述了多次給藥的例子，它特別優(yōu)選持續(xù)維持血清或組織蛋氨酸酶的高含量并相反持續(xù)維持血清或組織蛋氨酸的低含量。另一方面，也仔細考慮了足以把體內(nèi)的血液中的濃度維持到體內(nèi)治療的特殊范圍的連續(xù)靜脈注射。
II.蛋氨酸的去除法在實現(xiàn)本發(fā)明的方法中，通過能夠把含有蛋氨酸的物質(zhì)與上文描述的蛋氨酸酶接觸的去除蛋氨酸的同時還可伴有一種或多種附加的蛋氨酸去除步驟。而且，本發(fā)明考慮了要去除蛋氨酸的各種治療步驟，本文會進一步描述。
a.蛋氨酸饑餓法例如，可以使用蛋氨酸饑餓步驟來首次降低周圍的蛋氨酸含量，其中該饑餓步驟包括把腫瘤細胞與不含蛋氨酸的營養(yǎng)物接觸一段時間即蛋氨酸饑餓期，這個步驟可以在與蛋氨酸酶接觸步驟之前或過程中進行。蛋氨酸饑餓步驟可以包括在體外使用缺乏蛋氨酸的培養(yǎng)基即低含量或沒有蛋氨酸的培養(yǎng)基，或者體內(nèi)使用不含蛋氨酸的飲食。不含蛋氨酸的培養(yǎng)基在組織培養(yǎng)領(lǐng)域中是熟知的。該培養(yǎng)基的一個例子是含有非必需氨基酸的Eagle的基本培養(yǎng)基(缺少蛋氨酸和氯化膽堿)，如可從GIBCO得到。缺少蛋氨酸的氨基酸飲食也能夠在以商業(yè)途徑得到，包括從Teklad，Inc.得到的TD 92077飲食。
蛋氨酸饑餓步驟的時間可以根據(jù)具體應(yīng)用的不同而大范圍地變化，它是足以使細胞培養(yǎng)物，組織或血管的蛋氨酸濃度下降到較低水平并終止該水平進一步下降的時間。典型的時間可以從大約6小時到2個月，優(yōu)選大約1天到2周。
因為蛋氨酸是一種必需的氨基酸，應(yīng)當(dāng)清楚在許多本發(fā)明方法的使用中都在某種程度上對正常細胞具有毒性。但是，如本文所描述的，正常細胞和腫瘤細胞能夠不同地代謝蛋氨酸的前體高半胱氨酸，這樣高半胱氨酸能夠補充正常細胞中蛋氨酸的缺乏，同時又不挽救腫瘤細胞對蛋氨酸的依賴性。
所以，在一個相關(guān)的方案中，本發(fā)明考慮了一種使用缺乏蛋氨酸的營養(yǎng)物(培養(yǎng)基或飲食)的方法，它可以添加正常細胞所用的蛋氨酸的前體如高半胱氨酸或其類似物，來提供必需的營養(yǎng)補充。以大約5到200μM優(yōu)選大約10到100μM的濃度向營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入高半胱氨酸。
用于該方案的優(yōu)選蛋氨酸的前體包括L-高半胱氨酸-硫內(nèi)酯，高半胱氨酸和4-甲基硫-2-氧丁酸。
所以，在一個方案中，本發(fā)明包括用蛋氨酸缺乏的飲食喂養(yǎng)哺乳動物一段時間的步驟來去除血管內(nèi)蛋氨酸。這種飲食可以任選包括蛋氨酸前體作為蛋氨酸的補充物。另一方面，這種蛋氨酸前體也可以通過注射或其他熟知的途徑來服用。作為飲食補充物的高半胱氨酸優(yōu)選的每日劑量是每天每千克體重大約5到約1000mg高半胱氨酸。
高半胱氨酸的給藥途徑一般和加入蛋氨酸酶的途徑一樣，它取決于運送該補充物到達的靶組織。
b.蛋氨酸酯的競爭性抑制劑按照實施例中所述的觀察，我們進一步發(fā)現(xiàn)使用蛋氨酸酶的競爭性抑制劑可用來協(xié)同性增強本文所述的蛋氨酸去除法的作用。所以本發(fā)明考慮到使用蛋氨酸饑餓步驟還包括把腫瘤細胞與一定量的蛋氨酸的競爭性抑制劑接觸一段足以能用蛋氨酸利用酶抑制蛋氨酸代謝的時間。用于指導(dǎo)競爭性抑制劑的蛋氨酸酶包括S-腺苷蛋氨酸脫羧酶，蛋氨酸t(yī)-RNA合成酶和蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶。
抑制蛋氨酸酶所需的時間優(yōu)選在蛋氨酸饑餓期本身。
蛋氨酸的競爭性抑制劑與蛋氨酸競爭作蛋氨酸利用酶的底物，并通過直接競爭內(nèi)源蛋氨酸可能產(chǎn)生的正常代謝的作用，也就是說抑制蛋氨酸的代謝。在細胞需要蛋氨酸和蛋氨酸輔助代謝的地方，該競爭性抑制劑起著降低蛋氨酸代謝的作用，因而需要更高的蛋氨酸濃度以產(chǎn)生與不存在抑制劑時觀察到的效果相同的效果。
蛋氨酸的競爭性抑制劑可以是任何具有典型競爭性抑制劑功能的蛋氨酸衍生物。一般競爭性抑制劑包括蛋氨酸的烷基衍生物(即烷基硫堇)，其中甲硫氨酸(即蛋氨酸)的甲基可以被乙基取代(乙硫氨酸)，被丙基取代(丙硫氨酸)，被丁基取代(丁硫氨酸)，或者被戊基取代(戊硫氨酸)。
也考慮到把環(huán)亮氨酸和鹵代蛋氨酸用作可利用的蛋氨酸競爭性抑制劑。一般鹵代蛋氨酸選自于氟代蛋氨酸、氯代蛋氨酸、溴代蛋氨酸和碘代蛋氨酸。所以，所考慮到的蛋氨酸競爭性抑制劑選自于包括烷基硫堇、環(huán)亮氨酸和鹵代蛋氨酸在內(nèi)的一些物質(zhì)，其中所說的烷基硫堇不是甲硫氨酸。
對競爭性抑制蛋氨酸有效的蛋氨酸競爭性抑制劑的量是在蛋氨酸的有效濃度內(nèi)能夠產(chǎn)生降低的作用的量。這種量相對于存在的蛋氨酸來說一般是超過一摩爾，這正如實施例中所顯示的。抑制劑量的范圍一般是相對于存在有被競爭的蛋氨酸的培養(yǎng)基中蛋氨酸濃度，超過10到1000倍摩爾的，優(yōu)選超過至少20倍摩爾，更優(yōu)選超過至少50倍摩爾。如本文所示，在體內(nèi)使用抑制劑時，劑量一般是每千克動物體重大約5-30mg，優(yōu)選大約25mg/kg。
有效時所需的抑制劑的量可以取決于服用該抑制劑時存在的內(nèi)源蛋氨酸的量。通過在實施例中所顯示的劑量滴定結(jié)果可以證實蛋氨酸濃度和抑制劑的有效濃度之間的關(guān)系，并可以通過競爭性抑制劑的典型反應(yīng)速度理論進行限定。抑制劑的典型用量是從大約10μM到大約1mM。
而且，通過本文所描述的體外組織培養(yǎng)方法能夠預(yù)測抑制劑的有效用量，這種方法包括首先采用本文所描述的任何方法在去除蛋氨酸的特殊腫瘤組織中建立有效的條件，接著測定抑制劑的有效濃度。
使用各種指示劑包括實施例中所描述的指示劑能夠監(jiān)控使用蛋氨酸競爭性抑制劑抑制蛋氨酸的代謝。這些指示劑包括在喂過不含蛋氨酸飲食的小鼠中，測定組織培養(yǎng)物的DNA含量，作為細胞周期停止和增強抑制腫瘤組織生長的指示劑。其他指示劑對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說也是很清楚的。
C.使用多種蛋氨酸去除法-抗蛋氨酸化療法的協(xié)同作用在一個方案中，為了利用在使用兩種或多種不同的蛋氨酸去除法時發(fā)生的協(xié)同作用，本發(fā)明考慮到使用常稱作抗蛋氨酸化療法的多種蛋氨酸去除法。
本文所描述的蛋氨酸去除法包括(1)使用不含蛋氨酸的培養(yǎng)基(體外)或飲食(體內(nèi))的蛋氨酸饑餓法，(2)暴露給蛋氨酸酶以采用酶的方法去除內(nèi)源性蛋氨酸，(3)以蛋氨酸競爭性抑制劑來降低內(nèi)源蛋氨酸的有效濃度，特別是與上述(1)和(2)方法的結(jié)合，其中蛋氨酸的含量已經(jīng)降低，以及(4)使用蛋氨酸的前體和本文所描述的高半胱氨酸來增加其他三種蛋氨酸去除法中的任何一種對腫瘤細胞的選擇性。
所以，對蛋氨酸的去除來說，能夠使用上述所定義的方法的任何一種組合，包括(1)+(2)，(1)+(3)，(2)+(3)，(1)+(2)+(3)和這四種組合的任何一種加(4)來進行本文所描述的抗蛋氨酸的化學(xué)療法。
對最大限度地去除蛋氨酸和其代謝產(chǎn)物來說，特別優(yōu)選使用不含蛋氨酸但含有蛋氨酸前體并同時使用蛋氨酸的競爭性抑制劑和蛋氨酸酶。
III.增強抗有絲分裂劑的腫瘤治療作用在另一個方案中，本發(fā)明考慮到在方法中使用本文所述的蛋氨酸去除法來增加(增強)常規(guī)化療法的效力和選擇性，特別是癌癥治療所用的抗有絲分裂藥的選擇性。
把蛋氨酸去除步驟和常規(guī)的抗有絲分裂療法結(jié)合使用的主要目的是利用這樣一種情況即在有絲分裂之前蛋氨酸去除法能夠選擇性地并特異性地終止腫瘤細胞的增生，這樣一旦用再充分供應(yīng)蛋氨酸給細胞、組織、培養(yǎng)基或脈管系統(tǒng)，靜止的細胞能夠同步開始細胞周期，使得細胞群一致增生并且容易受到對細胞周期特異性化學(xué)療法的作用。為了使腫瘤細胞進入細胞停滯期，可以使用任何細胞周期的細胞毒素劑。這種藥劑對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是熟知的。在一個優(yōu)選的方案中，該細胞周期的細胞毒素劑是一種抗有絲分裂劑。
所以，在一個優(yōu)選的方案中，本發(fā)明考慮到一種抗腫瘤化療法，它包括用本文所述的蛋氨酸去除步驟形成靜止的腫瘤細胞，接著以另外的步驟(a)把靜止的腫瘤細胞與誘發(fā)細胞周期用量的蛋氨酸接觸來啟動靜止的腫瘤細胞的有絲分裂，形成有絲分裂細胞，和(b)把有絲分裂細胞與一定量的抗有絲分裂劑接觸，這種用量足以抑制有絲分裂細胞的有絲分裂，由此抑制腫瘤細胞的生長。
把具有啟動靜止細胞的細胞周期功能的蛋氨酸、蛋氨酸鹽及其功能等同物稱作細胞周期誘發(fā)劑，并能夠一起使用或另一方面在去除了蛋氨酸的腫瘤細胞群中作為啟動一個或多個靜止細胞中的細胞周期和有絲分裂的試劑。
細胞周期誘發(fā)劑的誘發(fā)細胞周期的量是能夠在去除了蛋氨酸的腫瘤細胞群中至少啟動一些(10％)，優(yōu)選大多數(shù)，更優(yōu)選至少90％的靜止細胞中的細胞周期的用量。使用組織學(xué)的或代謝的標(biāo)記物能夠很容易地測定細胞周期的啟動和程度。對蛋氨酸來說，誘發(fā)細胞周期的用量一般在大約1微摩爾(μM)到大約2.5毫摩爾(mM)的范圍，優(yōu)選大約10到250μM。當(dāng)充分供應(yīng)蛋氨酸時，同樣地能把S期的特異性藥物用于攻擊仍在S期的任何腫瘤細胞。
把細胞周期誘發(fā)劑與靜止的腫瘤細胞接觸(使用)的途徑能夠變化，但一般與本文所描述的服用蛋氨酸酶或競爭性抑制劑所用的途徑相同。
使靜止的腫瘤細胞和細胞周期誘發(fā)劑接觸的時間安排和時期可以根據(jù)腫瘤和其他考慮的不同而變化，這種考慮是能夠根據(jù)經(jīng)驗通過如本文所描述的組織培養(yǎng)方法來決定的。周期誘發(fā)劑能夠在抗有絲分裂劑之前或與抗有絲分離劑幾乎同時加入。當(dāng)已經(jīng)測定到具體抗有絲分離劑迅速起作用并且細胞周期的誘發(fā)是緩慢的時候，在抗有絲分裂劑之前加入誘發(fā)劑是有利的。這些參數(shù)取決于腫瘤的具體類型、組織的部位、抗有絲分裂劑的選擇等。而且，在使用治療方法在體內(nèi)給藥之前，通過各種方法能夠很容易地測定最優(yōu)化的變量如時間的選擇、劑量和藥物的選擇。優(yōu)選的最優(yōu)化方法是使用本文所描述的組織培養(yǎng)測定系統(tǒng)的例子。
接觸一種抗有絲分裂劑的時間安排的選擇取決于對靜止的腫瘤細胞的細胞周期的誘發(fā)。在周期的任何時候一般都能把抗有絲分裂劑與有絲分裂的細胞接觸，并馬上使細胞成為有絲分裂細胞。對有些腫瘤細胞群來說，在加入誘發(fā)劑之后這種情況可以迅速發(fā)生，使得可以向靜止的腫瘤細胞中同時或近乎同時加入誘發(fā)劑和抗有絲分裂劑。另一方面，在加入誘發(fā)劑大約1小時到30天后可以加入抗有絲分裂劑，但是優(yōu)選在誘發(fā)的一天或兩天之內(nèi)。
本文所用的抗有絲分裂劑和其他細胞周期特異制劑能夠是針對細胞增生、有絲分離或細胞周期具有細胞毒性基礎(chǔ)的機理的任何試劑。所以，抗有絲分裂劑能夠包括各種化合物即抗代謝劑，或其他對分裂(有絲分裂的)細胞具有毒性的化合物中的任意一種。用于本發(fā)明方法中的抗有絲分裂劑的優(yōu)選臨床藥理學(xué)是對細胞有絲分離活性的抑制，對核酸合成、烷化劑、抗菌素、生物堿等抗腫瘤劑的抑制。就藥理領(lǐng)域來說是不斷提高的，應(yīng)當(dāng)清楚本發(fā)明是不限于目前已知的抗有絲分裂劑和其他細胞周期特異性制劑，而是包括使用已知的等同物、新發(fā)現(xiàn)或開發(fā)的化合物和其他具有必要活性的試劑。
烷化劑的例子包括環(huán)磷酰胺(CTX；癌得星)、苯丁酸氮芥(CHL；痛可寧)、順氯氨鉑(CisP；氯氨鉑)、二甲磺酸丁二醇二酯(馬利蘭)、左旋苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BCNU)、鏈脲菌素、三亞乙基密胺(TEM)、絲裂霉素C和其他烷化劑。
抗代謝產(chǎn)物的例子包括氨甲喋呤(MTX)、足葉乙甙(VP16；鬼臼乙叉甙)、6-巰嘌呤(6MP)、6-thiocquanine(6GT)、阿糖胞甙(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5FU)、氮烯唑氨(DTIC)和其他抗代謝劑。
抗菌素的例子包括放線線菌素D、阿霉素(DEX；亞德里亞霉素)、多諾霉素(柔紅霉素)、爭光霉素、光輝霉素和其他抗菌素。
生物堿的例子包括長春生物堿如長春新堿(VCR)、長春堿等。
其他抗腫瘤劑包括紫杉酚及其衍生物，抑制細胞生長劑糖皮質(zhì)激素如地塞米松(DEX；氟美松)和皮質(zhì)甾類如強的松，核苷酶抑制劑如羥基脲，氨基酸去除酶如天冬酰胺酶和其他形形色色的抗腫瘤劑。
上述抗有絲分裂劑(細胞毒性劑)的合成和制備都是人們所熟知的，在各種原始資料中都有描述，所以這里就不再重復(fù)。合成和制備上述試劑的原始資料例子包括“內(nèi)科醫(yī)生桌面參考”(Physicians Desk Reference)，Barnhart，eds.，Medical Econom ics Company，Inc.，Oradell，N.J.，1992；和“Merck索引”(Merck Index)，第11版，Merck&Co.，1989。
在化療方法中使用上述細胞毒素劑一般是癌癥治療領(lǐng)域的明顯特征，在這里使用它們，還涉及監(jiān)控耐受性和有效性以及控制給藥途徑和劑量。例如，該細胞毒素劑的實際劑量可以根據(jù)使用現(xiàn)有的組織培養(yǎng)方法所測定的所培養(yǎng)的患者的細胞反應(yīng)來變化。一般該劑量比缺乏同步的細胞周期所使用的量要降低，這正如本發(fā)明說明書中所示。
有效細胞毒素劑的典型劑量能夠在制造商所推薦的范圍內(nèi)，并且由體外反應(yīng)或動物模型反應(yīng)所表示的劑量可降低到至多大約一個量級的濃度或用量。所以，該實際的劑量將取決于醫(yī)師的判斷，患者的身體狀況和治療方法的有效性，這種有效性以最初培養(yǎng)的惡性細胞或組織培養(yǎng)的組織樣品的體外應(yīng)答性或在適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ椭兴^察到的反應(yīng)為準(zhǔn)。
IV.基因療法在另一個方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋氨酸酶的接觸法，本發(fā)明考慮到在組織或被治療組織周圍的淋巴細胞中使用rDNA來表達蛋氨酸酶。為得到這一結(jié)果，可以想到通過可控制的蛋氨酸酶表達基因的表達和由此，產(chǎn)生的蛋氨酸酶基因產(chǎn)物而用于接觸步驟提供蛋氨酸酶。
如前面所描述的，目前已知有大量的適當(dāng)表達載體可用來表達能夠使用的蛋氨酸酶。在一個方案中，蛋氨酸酶基因的表達是可控制的。所以，一個表達載體具有能夠可操作地連接到編碼蛋氨酸酶的第一條序列的第二條核苷酸序列，這也定義了調(diào)節(jié)蛋氨酸酶基因表達的手段。這種調(diào)節(jié)手段的一個例子是可誘導(dǎo)的啟動子，最優(yōu)選的啟動子是腫瘤特異性的。用一種腫瘤特異性的啟動子控制蛋氨酸酶基因表達的表達模型，這些表達模型對本文所述的基因療法是特別有用的。
一類可誘發(fā)的啟動子對可加入培養(yǎng)基中的組分有反應(yīng)，或很容易地滲透到含有基因的宿主細胞中來表達蛋氨酸酶基因。其它類的啟動子是如上所述的腫瘤特異性啟動子，例如癌胚抗原(CEA)啟動子。
所以，本發(fā)明也考慮到一種把蛋氨酸酶與腫瘤細胞群接觸的蛋氨酸的去除法，它包括下列步驟(i)在活體內(nèi)或活體外，把一種表達載體導(dǎo)入腫瘤細胞或?qū)虢櫮[瘤的淋巴細胞或其骨髓前體細胞來形成蛋氨酸酶基因轉(zhuǎn)染的細胞，其中該表達載體具有編碼蛋氨酸酶并能夠調(diào)節(jié)蛋氨酸酶的表達的核苷酸序列，并且具有能夠提供調(diào)節(jié)蛋氨酸酶表達的手段的核苷酸序列；(ii)把體內(nèi)的腫瘤細胞與蛋氨酸酶基因轉(zhuǎn)染的細胞接觸；和(iii)在轉(zhuǎn)染的細胞中表達編碼蛋氨酸酶的核苷酸序列，由此在該轉(zhuǎn)染的細胞中產(chǎn)生蛋氨酸酶并把所產(chǎn)生的蛋氨酸酶與腫瘤細胞接觸。對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說“導(dǎo)入”是指任何已知的以一種方式把表達載體插入靶細胞的方法，其中該靶細胞可以表達該表達載體中所攜帶的基因。這種插入能夠在體內(nèi)或活體外進行。通過例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或病毒感染的方法可以完成這種“導(dǎo)入”。
使用各種已知的轉(zhuǎn)染方法能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤細胞，無論是粘附細胞或是懸浮液內(nèi)或體內(nèi)的細胞的傳染。此后，把轉(zhuǎn)染的細胞(如果使用活體外的轉(zhuǎn)染方法)再導(dǎo)入宿主并使該轉(zhuǎn)染細胞定位在天然的、相關(guān)的、附近的要治療的組織，由此把轉(zhuǎn)染的細胞與要治療的腫瘤細胞接觸。使用各種手段能夠?qū)崿F(xiàn)把蛋氨酸酶導(dǎo)入轉(zhuǎn)染的細胞，但是一般需要有選擇性標(biāo)記存在。
在一個方案中，調(diào)節(jié)基因表達的工具是對能夠加入培養(yǎng)基中的試劑應(yīng)答的可誘發(fā)的啟動子。如金屬硫蛋白的啟動子。另一方面，可誘發(fā)的啟動子可以是腫瘤特異性啟動子。這種啟動子對腫瘤細胞的靶蛋氨酸酶的表達起作用。
要轉(zhuǎn)染的細胞能夠是腫瘤細胞樣品或正常免疫細胞如浸潤腫瘤的細胞，如浸潤腫瘤的淋巴細胞或骨髓的骨髓前體細胞如造血的干細胞或原始細胞。這些細胞能夠在體內(nèi)或體外。
實施例9描述了編碼蛋氨酸酶的核苷酸分子的分離。該實施例還描述了用于分批酵解生產(chǎn)蛋氨酸酶的表達載體的產(chǎn)生。熟練的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易地使用克隆的蛋氨酸酶基因，如在pAC-1中所提供的，來制成適用于上述基因療法的表達盒。
C.治療組合物在另一個方案中，本發(fā)明考慮到治療組合物，它含有治療有效量的基本上分離出的、優(yōu)選以重組體方法產(chǎn)生的蛋氨酸酶和藥物可接受的載體。
L-蛋氨酸酶(L-蛋氨酸-α-脫氨基-γ-巰基甲烷-裂合酶或蛋氨酸酶)是通過脫氨基作用和脫硫代甲基作用來降解蛋氨酸的一種酶。蛋氨酸酶的活性至少能夠通過測定在蛋氨酸裂解時所形成的α-丁酮酸鹽的量來測得。一個單位(U)的蛋氨酸酶定義為在標(biāo)準(zhǔn)測定條件下從蛋氨酸中每分鐘產(chǎn)生1毫摩爾α-丁酮酸鹽的酶的量，如Ito等，“生化雜志”(J.Biochem.)，791263-1272，1976；和Soda，“生化分析”(Analyt.Biochem.)，25228-235，1968中所描述的。
蛋氨酸酶可以由許多來源制備，包括直接由細菌培養(yǎng)基分離，或者由編碼蛋白酸酶蛋白的重組DNA分子表達，例如描述于例9和例12。
蛋氨酸酶的細菌源包括惡臭假單胞菌(Pseudomona Dutida)，卵狀假單胞菌(Pseudomonas ovalis)和氣單胞菌菌屬(Aeromonas)和任何其他蛋氨酸酶的潛在來源。惡臭假單孢菌菌株可以商業(yè)途徑從ATCC中得到，它的入藏號分別是ATCC 8209和ATCC 7955。其他細菌一般也能夠從學(xué)術(shù)研究團體得到?，F(xiàn)已描述了使用各種方法純化蛋氨酸酶。例如，參見Kreis等，“癌癥研究”(CancerRes.)，331862-1865，1973；Tanaka等，“歐洲生物化學(xué)學(xué)會聯(lián)合會通訊”(FEBSLetters)，66307-311，1976；Ito等，“生化雜志”(J.Biochem.)，791263-1272，1976；Nakayama等，“農(nóng)業(yè)生物化學(xué)”(Agric.Biol.Chem.)，482367-2369，1984和Soda，“生化分析”(Analyt.Biochem.)，25228-235，1968。但是，這些方法都沒有得到高純度的不含內(nèi)毒素的蛋氨酸酶。本發(fā)明提供了已經(jīng)用于純化蛋氨酸酶的兩種方法，這樣該蛋氨酸酶幾乎不含內(nèi)毒素。
一種優(yōu)選的蛋氨酸酶具有每毫克蛋白大約10到50個單位(U)的比活度。本文描述了純化蛋氨酸酶的典型制劑，該制劑具有大約10到大約50U/mg的比活度，在實施例12中，使用表達載體pAC-1所制備的蛋氨酸酶具有大約20.1U/mg的比活度。
一種優(yōu)選的蛋氨酸酶最好是大體上分離的。大體上分離是指該酶按重量計有至少50％的純度，優(yōu)選至少90％的純度，更優(yōu)選至少99％的純度或基本上是均勻的。當(dāng)在電泳介質(zhì)如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中分析時，優(yōu)選的蛋白基本是均勻的。在PAGE上的均勻是指只有單一的測定帶。
由于當(dāng)通過靜脈注射或腹腔內(nèi)給藥而與哺乳動物生理接觸時不希望有與內(nèi)毒素有關(guān)的副作用，所以，優(yōu)選的蛋氨酸酶是基本上不含內(nèi)毒素如細菌性脂多糖。這里的基本上不含是指每毫克(mg)蛋氨酸酶蛋白至少于大約10ng內(nèi)毒素，優(yōu)選少于1ng內(nèi)毒素/mg蛋氨酸酶，更優(yōu)選的少于0.1ng內(nèi)毒素/mg蛋氨酸酶。在治療領(lǐng)域內(nèi)內(nèi)毒素的測定是熟知的，使用各種方法能夠進行內(nèi)毒素的測定。在實施例中描述了優(yōu)選的方法。
優(yōu)選的蛋氨酸酶是熱穩(wěn)定的，這樣當(dāng)在如動物體內(nèi)升高溫度的條件下使用時能夠增加它的存儲期和有效性。熱穩(wěn)定是指該酶能夠在60℃下暴露10分鐘并保持其比活度達80％優(yōu)選保留90％的比活度，更優(yōu)選保留95％的比活度。
優(yōu)選的蛋氨酸酶具有至少5小時的血清半衰期，優(yōu)選6小時，更優(yōu)選至少7小時。
特別優(yōu)選的蛋氨酸酶是從惡臭假單胞菌制備的或使用從惡臭假單胞菌中分離出來的含有編碼蛋氨酸酶的DNA分子的表達載體制備的。惡臭假單胞菌蛋氨酸酶在變性條件下PAGE-SDS分析時具有大約43千道爾頓的表觀分子量。在實施例中描述了純化蛋氨酸酶的優(yōu)選方法。
所以，治療組合物含有一種生理上可耐受的載體和溶于或分散在其中的作為活性成分的大體上分離的蛋氨酸酶。在一個優(yōu)選的方案中，當(dāng)為治療目的給病人服用時，該治療組合物是非免疫原性的。
本發(fā)明的一個方案的特征是化學(xué)修飾的蛋氨酸酶，它包括結(jié)合到聚合物上的蛋氨酸酶。優(yōu)選該蛋氨酸酶是大體上分離的并幾乎不含內(nèi)毒素?！盎瘜W(xué)修飾”是指被改變形成與從自然中純化的蛋氨酸酶不同的任何形式的蛋氨酸酶。優(yōu)選的是通過把該蛋氨酸酶連接到聚合物如聚乙二醇上的方法來化學(xué)修飾蛋氨酸酶的。
如本文中所使用的，用來指組分、載體、稀釋劑和試劑的術(shù)語“藥學(xué)可接受的”、“生理可耐受的”和它們在語法上的變化都可以交換使用，并且它們都表示能把該物質(zhì)給藥哺乳動物或人類服用或在給哺乳動物或人類服用時不會產(chǎn)生不希望的生理作用如惡心、眩暈和胃不適等。
在本領(lǐng)域中對包括溶于或分散在其中的活性成分的藥物組合物的制備是非常清楚的。一般可以把這種組合物制成可注射的無菌的液體溶液如懸浮液、含水或不含水的溶液，或者在使用前也能夠配成液體的適用于溶液和懸浮液的固體形式。該制劑也可以是乳劑形式的。如本文所述的特別優(yōu)選的是磷脂和脂質(zhì)體組合物。另外，在油膏或分散性蓋片如繃帶上也可以含有治療量的蛋氨酸酶以提供該試劑的局部釋放。
該活性成分能夠與藥物可接受的并與活性成分可配伍的賦形劑混合，其用量應(yīng)適合于本文所述的治療方法。適當(dāng)?shù)馁x形劑例如有水、鹽水、葡萄糖、甘油等及其組合物。另外，如果需要，該組合物可以含有微量的能夠提高該活性成分的效果的輔助物質(zhì)如濕潤劑、乳化劑、pH緩沖劑等。
本發(fā)明的治療組合物能夠包括組分的藥物可接受的鹽。藥物可接受的鹽包括與如鹽酸或磷酸的無機酸或者象乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等有機酸形成的酸加成鹽(與多肽的游離氨基所形成的)。與游離羰基所形成的鹽也能由無機堿例如鈉、鉀、氨、鈣或鐵的氫氧化物和有機堿如異丙胺、三甲氨、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等衍生。
在本領(lǐng)域?qū)ι砜赡褪艿妮d體是熟知的。液體載體的例子有除活性成分和水外不含其他物質(zhì)的無菌水溶液，或含有緩沖液如生理pH值的磷酸鈉、生理鹽水或二者如磷酸鹽-緩沖的鹽水。此外含水載體還包括一種以上的緩沖鹽以及象鈉和鉀的氯化物、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇和其他溶質(zhì)。
如本文所述液體組合物也能夠包括與水相溶的液相和與水不溶的液相。這種附加的液相例子是甘油、植物油如棉籽油、有機酯如油酸乙酯和水包油的乳濁液，尤其是前面所述的脂質(zhì)體組合物。
該治療組合物含有有效量的蛋氨酸酶，一般有效量是每治療組合物總重至少0.1重量百分比的活性蛋白，并優(yōu)選至少大約25重量百分比。重量百分比是蛋氨酸酶與總組合物的重量比。所以，例如0.1重量百分比是每100克總組合物0.1克的蛋氨酸酶。
為了使蛋氨酸酶組合物能夠通過血管在體內(nèi)使用，我們考慮到配制一種控制釋放蛋氨酸酶的治療組合物的方案，并任選使蛋氨酸酶蛋白不受降解和會降低治療給藥的蛋氨酸酶的血清半衰期的其他現(xiàn)象的影響。
所以，在一個方案中，本發(fā)明考慮到包括運送載體的治療組合物，該運送載體包括聚合物、聚合物載體、顆粒狀物、乳狀液、團聚體、離子交換樹脂、脂質(zhì)體、腸包衣、介質(zhì)、生物膠粘劑、微膠囊、水凝膠等載體。包括脂質(zhì)體的藥物釋放載體的例子至少由Tarcha在“控制藥物釋放的聚合物”(“Polymers For Controlled Drug Delivery”)，CRC出版社，Boca Raton，1990中描述過。
本發(fā)明還提供了純化蛋氨酸酶的詳細方法，把該方法與其他已知的方法相比較，它能夠提供優(yōu)越的產(chǎn)率和純度。純化重組蛋氨酸酶，特別純化是使用含有編碼蛋氨酸酶的高效表達模塊的轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的蛋氨酸酶的優(yōu)選方法，包括下列步驟a)在緩沖水溶液中把含有蛋氨酸酶的轉(zhuǎn)化細胞的提取物于約40-60℃下加熱約1-10分鐘，優(yōu)選在50℃加熱1分鐘。
b)在一個GS-3轉(zhuǎn)子(Sorvall，Du Pont)中以大約10k到20k rpm轉(zhuǎn)速把加熱后的提取物離心分離大約15分鐘到1小時，優(yōu)選在4℃大約13k rpm離心分離30分鐘；c)使用10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.3)，使用大約50k到100k孔徑的過濾器超濾上清液，優(yōu)選為Millipore Pre/ScaleTFF PLHK 100K 2.5ft2的過濾器芯子；d)在低離子強度(大約10-50mM)KCl并在10-20mM磷酸鉀緩沖液大約pH7.0-7.6的條件下進行DEAE離子交換柱層析，并收集用40-200mM的KCl梯度溶液洗脫的含有蛋氨酸酶的級分，優(yōu)選使用DEAE-SepharoseFF柱；e)在中等離子強度(大約50-100mM)KCl并在10-20mM磷酸鉀緩沖液大約pH8.0-8.6的條件下進行第二次DEAE離子交換色譜層析，并收集用100-200mM的KCl洗脫的和用磷酸鹽緩沖液(pH8.3)洗脫的含有蛋氨酸酶的級分，優(yōu)選使用DEAE-瓊脂糖FF柱；和f)把在步驟(e)中收集的級分與能夠吸附內(nèi)毒素的柱層析介質(zhì)接觸，并收集洗脫液，由此從該洗脫液中除去內(nèi)毒素形成不含內(nèi)毒素的蛋氨酸酶，該蛋氨酸酶具有每毫克蛋白至少20個單位的蛋氨酸酶活性和每毫克蛋白1-100ng內(nèi)毒素，優(yōu)選使用ActicleanEtox柱。
該細胞提取物最好是從已被改變的能夠表達高含量的重組蛋氨酸酶(大約5-75％總細胞蛋白)的宿主細胞制得的。另一方面，也能把天然表達蛋氨酸酶的有機物用作起始物。對細菌細胞提取物來說，制備提取物一般是首先收獲并再洗滌細菌細胞培養(yǎng)物來形成細胞糊/丸，并取決于是否通過離心分離方法還是空心纖維管過濾方法收獲，這些方法一般是大家所熟知的。
然后，使用常規(guī)工具把細胞碎裂。優(yōu)選使用勻漿器如空化型勻漿器(例如Microfluidics Corp.Model#HC 8000碎裂細胞。
把所得到的懸浮液加熱以沉淀選擇的蛋白和其他不溶物。加熱條件一般是大約45-60℃下1-10分鐘。優(yōu)選50℃1分鐘的加熱步驟。
把加熱后的提取物離心分離除去碎片，并過濾上清液再用于上述兩個步驟中的DEAE離子交換柱層析介質(zhì)。在實施例中描述了優(yōu)選的吸收和洗脫條件。在這些步驟中可以使用各種DEAE離子交換柱層析介質(zhì)的任何一種，并對介質(zhì)的選擇不作限定。商業(yè)來源包括Pharmacia Fine Chemicals，BioRad和Sigma。
之后，除去內(nèi)毒素生產(chǎn)具有如前面所述的可接受含量的內(nèi)毒素的蛋白。以熟知的各種工具中的任何一種都能夠進行內(nèi)毒素的去除步驟，該去除步驟一般包括把溶液中的蛋白與能夠吸附內(nèi)毒素的一種柱層析介質(zhì)接觸，得到含有不含內(nèi)毒素蛋白的柱層析介質(zhì)洗脫物。用于除去內(nèi)毒素的優(yōu)選商業(yè)試劑是ActicleanEtox。
D.化學(xué)改良的蛋氨酸酶為了延長蛋氨酸酶的半衰期并降低它的免疫原性或抗原性，可以把蛋氨酸酶與一種聚合物結(jié)合。
在過分敏感的個體中存在變態(tài)反應(yīng)的可能性。另一方面，抗蛋氨酸酶的抗體可以縮短蛋氨酸酶的半衰期。
現(xiàn)已嘗試了各種途徑來解決多肽和蛋白的抗原性問題。把聚合物如聚乙二醇偶聯(lián)到蛋白上是降低蛋白抗原性的途徑之一。本發(fā)明涉及使用一種新型有效的方法生產(chǎn)的蛋氨酸酶的化學(xué)修飾，它包括把在保持酶活性的條件下把純化蛋氨酸酶與聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)。本發(fā)明的PEG-蛋氨酸酶具有延長的半衰期并沒有表觀免疫原性。
新的與聚乙二醇結(jié)合的蛋氨酸酶(“PEG-蛋氨酸酶”或“PEG化的蛋氨酸酶”)具有高的蛋氨酸去除活性、延長的半衰期和低免疫原性。因此PEG-蛋氨酸酶提供了一種保持穩(wěn)定性，延長血清半衰期，降低免疫原性和降低毒性的抑制腫瘤生長的新工具。
本發(fā)明穩(wěn)定的、蛋氨酸去除有效的、具有長半衰期且是非免疫原性的PEG-蛋氨酸酶可以用作安全有效的多劑量抗腫瘤劑。PEG-蛋氨酸酶可以在-70℃、4℃和室溫下保存在10mM磷酸鈉(pH7.2)中的0.12M氯化鈉的液體制劑中，而不喪失活性。
重要的是，本發(fā)明PEG-蛋氨酸酶是非免疫原性的，這使得它特別適于治療對蛋氨酸酶敏感且需要重復(fù)給藥的癌癥患者。本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員懂得，和用蛋氨酸酶一樣，PEG-蛋氨酸酶可以以多種劑型提供。
純化的沒有內(nèi)毒素的蛋氨酸酶的優(yōu)選制劑是以在0.06M和0.2M之間的濃度溶于10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中的0.12M氯化鈉溶液中。活性是大約10個單位/mg。
PEG化的蛋氨酸酶可以通過本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員已知的方法測試。例如可以用體內(nèi)試驗來測定本發(fā)明方法制備的PEG-蛋氨酸酶的藥理學(xué)、安全性和功能特征。
這些試驗可以包括測定PEG-蛋氨酸酶的急性毒性、藥物動力學(xué)、蛋氨酸在血清中的去除，以及評定PEG-蛋氨酸酶的免疫原性。
將純化的無內(nèi)毒素的PEG-蛋氨酸酶注射入鼠的尾靜脈中，并每兩小時采集血樣。通過活性測定測量蛋氨酸酶的水平。蛋氨酸衍生作用后用HPLC測定蛋氨酸酶的水平。
可以在任何合適的實驗動物體內(nèi)進行急性毒性研究，如實施例5和15所說明的。在小鼠體內(nèi)將10-100單位/1-10mg PEG-蛋氨酸酶注入其尾靜脈。記錄活體信號和目測觀察。在注射前采集血樣，并在注射后每兩小時采集血樣。測定蛋氨酸酶活性和蛋氨酸水平。也測定腎和肝功能兩者的功能。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定對組織如肺、腎、肝和腦有無毒性作用。也分析血樣和骨髓。
在另一實施例中，蛋氨酸酶與一聚合物結(jié)合，產(chǎn)生了一種基本上無免疫原性的組合物，且也導(dǎo)致體內(nèi)蛋氨酸酶活性半衰期的增加。
在一實例中，蛋氨酸酶通過與一聚合物結(jié)合而進行了化學(xué)修飾。
在另一實例中，蛋氨酸酶通過與聚環(huán)氧烷(polyalkylene oxide)的結(jié)合作用而被化學(xué)修飾，聚環(huán)氧烷的例子包括但不限于聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷、環(huán)氧乙烷共聚物和環(huán)氧丙烷共聚物。
在優(yōu)選實例中，蛋氨酸酶通過與聚乙二醇結(jié)合而被化學(xué)修飾。
在另一優(yōu)選實例中，結(jié)合聚乙二醇的蛋氨酸酶基本上不含內(nèi)毒素。
本發(fā)明也提供了一種藥物組合物，其含有治療有效量的與聚合物結(jié)合的蛋氨酸酶。該聚合物可以是聚環(huán)氧烷，例如但不限于聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷、環(huán)氧乙烷共聚物和環(huán)氧丙烷的共聚物。
在一優(yōu)選實例中提供了一種藥物組合物，其含有治療有效量的與聚乙二醇結(jié)合的蛋氨酸酶。在另一優(yōu)選實例中，藥物組合物含有治療有效量的基本上不含內(nèi)毒素的且與聚乙二醇結(jié)合的蛋氨酸酶。這種組合物可以從天然生產(chǎn)蛋氨酸酶的生物體中分離的物質(zhì)中制備，或者優(yōu)選從已被改變來表達蛋氨酸酶的宿主制備。
也提供了一種制備無內(nèi)毒素蛋氨酸酶的方法，所述方法是通過無內(nèi)毒素蛋氨酸酶與聚合物偶聯(lián)，而生成基本上無免疫原性化學(xué)修飾的無內(nèi)毒素的蛋氨酸酶。
在一優(yōu)選實例中，該方法包括將蛋氨酸酶與聚乙二醇偶聯(lián)。
在另一優(yōu)選的實例中，通過無內(nèi)毒素蛋氨酸酶與琥珀酰亞胺碳酸甲氧聚乙二醇酯反應(yīng)而進行偶聯(lián)。
也提供了一種治療腫瘤患者的方法，包括施用治療有效量的蛋氨酸酶。
在一優(yōu)選實例中，蛋氨酸酶基本上無內(nèi)毒素。
在另一優(yōu)選實例中，蛋氨酸酶與聚合物結(jié)合。
在另一實驗中，聚合物是一種聚環(huán)氧烷。
在另一優(yōu)選實例中，蛋氨酸酶與聚乙二醇結(jié)合。
E.重組蛋氨酸酶制劑本發(fā)明進一步提供了凍干或結(jié)晶狀的蛋氨酸酶。詳細地說，已發(fā)現(xiàn)用本領(lǐng)域已知方法，蛋氨酸酶能容易地凍干或結(jié)晶。發(fā)現(xiàn)所得結(jié)晶或凍干形式的蛋氨酸酶制劑具有高的穩(wěn)定性，易水合化，且再水化后保持高活性。
能用各種本領(lǐng)域公知方法來獲得結(jié)晶或凍干形式的蛋氨酸酶。在實施例中使用Verdis，凍干裝置24，在100毫巴，-80℃，72小時，進行蛋氨酸酶的凍干和結(jié)晶，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能容易地采用其它本領(lǐng)域已知的方法用于制備凍干或結(jié)晶形式的蛋氨酸酶。
F.DNA片段和載體I.編碼蛋氨酸酶的DNA分子已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)導(dǎo)入合適的宿主細胞中時通過可操作地連接編碼蛋氨酸酶的分離DNA分子與啟動子，特別是RNA聚合酶啟動子如T7 RNA聚合啟動子的操作連接，重組蛋氨酸酶可以以大約總細胞蛋白質(zhì)的5～75％的水平被表達。因此本發(fā)明提供了當(dāng)導(dǎo)入合適條件下的宿主中時表達高水平重組蛋氨酸酶的高水平表達模型。
這里所使用的高水平表達模型，或本發(fā)明的表達模型是指包含一個或多個指導(dǎo)編碼蛋氨酸酶的可操作地連接的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的表達調(diào)控元件的核酸分子。表達模型可以是分離的核酸分子或者可以存在于載體中(下文說明)。
本發(fā)明表達模型包含指導(dǎo)重組蛋氨酸酶生產(chǎn)的調(diào)控元件，使得生產(chǎn)的重組蛋氨酸酶相當(dāng)于大約總細胞蛋白質(zhì)的5-75％，優(yōu)選多于總細胞蛋白質(zhì)的10％。優(yōu)選的表達控制元件RNA聚合酶啟動子，更優(yōu)選T7 RNA聚合酶啟動子。RNA聚合酶啟動子的另外的實施例包括但不限于Tac和Trc啟動子。
啟動子是由允許RNA聚合酶結(jié)合以及發(fā)生轉(zhuǎn)錄的DNA序列構(gòu)成的表達調(diào)控元件。與特定宿主系統(tǒng)相容的啟動子序列是本領(lǐng)域公知的，并且一般以在包含一個或幾個合適的限制酶切位點的質(zhì)粒載體中提供。有代表性的這樣的質(zhì)粒載體是包含T7 RNA聚合酶啟動子，PT7和PET的質(zhì)粒載體，其可以從多種渠道獲得，如由商家和the American Type Culture Collection獲得。
本發(fā)明表達模型進一步包括編碼蛋氨酸酶的核酸序列。正如這里所使用的，當(dāng)含有該序列的核酸分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯導(dǎo)致具有蛋氨酸酶活性的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生時，就認(rèn)為該核酸序列編碼蛋氨酸酶。
L-蛋氨酸酶(L-蛋氨酸-α-去氨基-γ巰基甲烷-裂合酶或蛋氨酸酶)是一種通過去氨基和去硫甲基作用而降解蛋氨酸的酶。蛋氨酸酶活性至少可以通過測定蛋氨酸裂解生成的α-丁酮酸的量而測得。一個單位(U)蛋氨酸酶被定義為在標(biāo)準(zhǔn)測定條件下每分鐘從蛋氨酸產(chǎn)生1微摩爾α-酮基丁酸根的酶的量，該標(biāo)準(zhǔn)條件描述于Ito等，J.Biochem.，791263-1272，1976；和Soda，“生化分析”(Anayt.Biochem)。25228-235，1968。
編碼蛋氨酸酶核酸序列可以包括由天然生產(chǎn)重組蛋氨酸酶的生物體獲得的未改變的序列，也可以包括由天然生產(chǎn)蛋氨酸酶的生物體獲得的已被改變包括一個或多個核酸或氨基酸取代基，缺失或增加的序列。
編碼蛋氨酸酶的核酸分子，不管其改變或未改變都能由天然產(chǎn)生蛋白酸酶的任何有機體中制得，優(yōu)選編碼蛋氨酸酶核酸分子的來源是惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。實施例9公開了來自惡臭假單胞菌的，編碼蛋氨酸酶核酸分子的分離與序列測定。另外優(yōu)選的編碼蛋氨酸酶核酸分子的來源包括但不限于陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)，巴西日本圓線蟲Nippostrongylus brasiliensis，和梭桿菌屬(Fusobacterium SP.)。
蛋氨酸酶完整編碼序列可以使用各種方法由各種來源獲得，特別是上文引述的那些來源。圖8提供的蛋氨酸酶和核酸序列大大方便于從不是惡臭假單胞菌的生物體內(nèi)分離編碼蛋氨酸酶核酸分子。
具體地，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能容易地使用圖8提供的核酸序列制備寡核苷酸引物以用于從蛋氨酸表達生物中選擇性擴增編碼蛋氨酸酶的核酸分子的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中。優(yōu)選的以圖8提供的序列為基礎(chǔ)的PCR引物對是5′-GCCGGTCTGTGGAATAAGCT-3′(有義)5′-CCAGGGTCGACTCCAGCGCC-3′(反義)應(yīng)用上述PCR引物的優(yōu)選PCR變性/復(fù)性/延伸反應(yīng)周期如下在95℃第一次在95℃變性10分鐘，然后在94℃30秒變性，在60℃退火30秒，在72℃延伸反應(yīng)2小時進行5個循環(huán)，在94℃30秒，60℃30秒變性25個周期，然后在72℃延伸1.5分鐘；然后在72℃延伸反應(yīng)10分鐘，進行25個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物是兩個區(qū)帶，收集其中的1365bp區(qū)帶，純化成插入的ONCase-1DNA。
或者，圖8核苷酸序列片段能用作探針使用現(xiàn)有技術(shù)由除由惡臭假單孢菌以外的有機體分離編碼蛋氨酸酶的DNA。用本領(lǐng)域公知方法制備和使用含大約18-20個核苷酸(編碼大約6-7個氨基酸的一段序列)寡聚體，并用于探查在足夠嚴(yán)格以減少假陽性條件下獲得雜交的基因組DNA庫。(參見Sambrook等，“分子克隆”(Molecular Cloing)，Cold Spring Harbor Press1989)。
用作探針或聚合物酶鏈反應(yīng)(PCR)的特異性引物的DNA片段(即合成的寡核苷酸)以及編碼蛋氨酸酶的基因序列可容易地通過化學(xué)技術(shù)而合成，例如，Matteucci等(“美國化學(xué)學(xué)會雜志”J.Am.Chem.Soc.1033185-3191，1981)的磷酸三酯的方法或使用自動合成方法。另外，較大DNA片段可容易地通過公知方法制備，例如合成限定DNA片段的一組寡核苷酸，然后進行雜交作用并連接寡核苷酸構(gòu)成完整的片段。
除了以PCR和DNA探針為基礎(chǔ)的方法外，用預(yù)計為免疫原的圖8的肽片段激發(fā)的多克隆抗血清或單克隆抗體能分離編碼蛋氨酸酶的DNA分子。這樣的抗體可以用來探測由特定生物產(chǎn)生的表達文庫，如λgtll庫，以從除非惡臭假單胞菌以外的生物體獲得編碼蛋氨酸酶的DNA分子。
一旦獲得自然發(fā)生的編碼蛋氨酸酶的核酸分子，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能容易地使用隨機或位點特異性誘變方法來改變蛋氨酸酶編碼序列，以來提高表達水平，或者從已編碼的蛋氨酸酶取代，增加或缺失一個或多個氨基酸。
在一個實例中，在給定宿主細胞中改變了蛋氨酸酶編碼序列以提高重組蛋氨酸酶的表達水平，而不改變被編碼的蛋氨酸酶的氨基酸順序。特定宿主中重組蛋氨酸酶提高的表達可以通過改變存在于核酸分子中的一個或幾個密碼子而獲得，結(jié)果是得到的密碼子是經(jīng)常被宿主生物用來編碼特定蛋氨酸的密碼子。改變核苷酸序列使其包含優(yōu)選密碼子可以用本領(lǐng)域公知方法來實現(xiàn)，如定點誘變或者合成包含優(yōu)選密碼子的核酸分子。
除影響表達的改變外，也能改變編碼蛋氨酸酶的核酸分子以便于所得蛋白質(zhì)的純化。例如，如實施例中所公開的，通過改變重組蛋氨酸酶的氨基或羧基末端，以增加一段聚組氨酸序列，可以用Ni++瓊脂糖凝膠純化所得的融合蛋白質(zhì)。
也可以改變蛋氨酸酶編碼序列使在被編碼蛋氨酸酶的氨基酸順序中引起變化，如增加，取代，或缺失一個或幾個氨基酸殘基。所得重組蛋氨酸酶優(yōu)選具有導(dǎo)致重組蛋氨酸酶具有更好生物或生理特性的變化，如提高的活性，降低的Km，降低的免疫原性，或延長的血清半衰期。這樣被改變的類型可以合理設(shè)計或隨機發(fā)生。
當(dāng)變化是以起始和產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸順序以及期望的生理特性為基礎(chǔ)的特定選擇時，所說的改變是合理設(shè)計。例如一種類型的合理設(shè)計改變是用較小疏水性殘基取代疏水性氨基酸以提高溶解性。產(chǎn)生合理設(shè)計改變的優(yōu)選方法是應(yīng)用錯配序列PCR引物延伸方法的定點誘變。
當(dāng)改變不是合理選擇的時候，改變就是隨機發(fā)生的。隨機誘變技術(shù)，如化學(xué)誘變，PCR改組和接頭分區(qū)誘變，在給定蛋白質(zhì)編碼序列中產(chǎn)生大量各種隨機的和非特定的變化。這樣的方法可以用來從根本上改變編碼蛋氨酸酶的核酸分子。
然后按這種方式產(chǎn)生的重組蛋氨酸酶改變的形式用于根據(jù)本領(lǐng)域已知各種方法篩選期望性質(zhì)。選擇使用的挑選方法取決于宿主、載體和使用的誘變方法以及待選擇的性質(zhì)。
本發(fā)明進一步提供了包含一個或幾個本發(fā)明表達模型的載體。載體是能在宿主中自主復(fù)制的DNA分子。載體可以包含由自然存在質(zhì)粒衍生的附加型復(fù)制起點，基因組復(fù)制起點，或者能從病毒基因組衍生。本發(fā)明表達模型插入的載體的選擇如本領(lǐng)域公知的，直接取決于期望的功能特性，例如蛋白質(zhì)表達，和要轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在一實施方案中，載體包括一原核復(fù)制子。原核復(fù)制子如ColE1復(fù)制子是本領(lǐng)域公知的且容易地用在與本發(fā)明表達組件的結(jié)合中。另外，載體可以包括編碼可選擇標(biāo)記如抗藥性的基因。
真核表達載體也可以用在與本發(fā)明表達組件的結(jié)合中。真核細胞表達載體是本領(lǐng)域公知的并可從一些商業(yè)機構(gòu)獲得。有代表性的這樣的載體是PSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies，Inc.)，pTDT1(ATCC，#31255)，本文說明的載體pCDM8，和類似的真核表達載體。高水平表達載體能進一步用昆蟲細胞表達體系產(chǎn)生，如以桿狀病毒為基礎(chǔ)的表達體系。
一般情況下，編碼蛋氨酸酶高表達組件的產(chǎn)生典型地包括以下內(nèi)容首先獲得編碼蛋氨酸酶的DNA。如果期望的來自細菌源的序列沒有被內(nèi)含子間斷，則其適合于在任何宿主中表達。該序列可以通過在蛋氨酸酶編碼序列旁側(cè)區(qū)插入包含一個或幾個限制性內(nèi)切酶位點的序列而改變成易于切割和回收的形式。
然后，被切割或回收編碼序列與具有高表達控制元件的可操作連接，優(yōu)選置于可復(fù)制表達載體中。然后用表達組件或載體轉(zhuǎn)化合適的宿主，并且被轉(zhuǎn)化宿主在實現(xiàn)重組蛋氨酸酶生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)。任意地將重組蛋氨酸酶從培養(yǎng)基中或從細胞中分離出來。在一些例子中蛋白質(zhì)的回收和純化不一定是必須的，其中可以允許一些雜質(zhì)存在。
上面步驟中的每一步可以以各種方式進行。例如可以從基因組片段獲得所期望的編碼序列并直接用于合適的宿主。各種宿主中可操作的表達載體的構(gòu)建是使用兩個或多個合適的復(fù)制子和控制元件進行的。如果通常可得的，合適的限制酶切位點可以被加到編碼序列的終端，這樣提供一個插入到這些載體中的可切割基因。
II.轉(zhuǎn)化宿主細胞表達高水平重組蛋氨酸酶本發(fā)明進一步提供用本發(fā)明表達組件或載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，從而生產(chǎn)大約總細胞蛋白質(zhì)的5-75％重組蛋氨酸酶，優(yōu)選占總細胞蛋白質(zhì)量的大約10％以上。宿主細胞可以是原核或真核宿主。
任何原核宿主可以用來表達本發(fā)明高水平蛋氨酸酶編碼組件。優(yōu)選的原核宿主是大腸桿菌(E.coli)。在下面的實施例中，使用了大腸桿菌的DH5α和BL21(DE3)菌株。
優(yōu)選真核宿主細胞包括昆蟲細胞，酵母細胞和哺乳動物細胞，優(yōu)選昆蟲細胞如SP6和脊椎動物細胞，如那些來自小鼠、大鼠、猴、或人成纖維細胞系的細胞。其它優(yōu)選真核宿主細胞包括從ATCC獲得的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞CCL61，從ATCC獲得的NIH瑞士鼠胚胎細胞NIH/3T3(CRL1658)，幼倉鼠腎細胞(BHK)及類似的真核組織培養(yǎng)細胞系。
通過通常有賴于所使用宿主和載體類型的已知方法實現(xiàn)用本發(fā)明高水平表達重組組件對合適宿主的轉(zhuǎn)化。對于原核宿主細胞的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選對宿主細胞進行電穿孔或鹽處理方法，例如參見Cohen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110，1972；和Maniatis等，“分子克隆，實驗指南”(MolecularCloning，Alaboratory Mammal)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1982)。
關(guān)于真核細胞的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選電穿孔或使用陽離子脂質(zhì)，例如參見Graham等，Virol.52456，1973；和Wigler等，“美國國家科學(xué)院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)761373-76，1979。
成功轉(zhuǎn)化的細胞，即包含本發(fā)明表達組件的細胞可以用已知技術(shù)鑒別。例如由本發(fā)明表達組件的導(dǎo)入而產(chǎn)生的細胞可以被克隆制備單菌落?？梢允斋@、溶解來自這些菌落的細胞并用已知方法檢查它們DNA中rDNA的存在，所述方法由Southern，“分子生物雜志”(J.Mol.Biol)，98503，1975，或Berent等，“生物技術(shù)”(Biotech.)3208，1985描述。然而正如下文所說明的，本發(fā)明進一步提供了鑒別表達高水平重組蛋氨酸酶的轉(zhuǎn)化子的快速篩選方法。
III.鑒定表達高水平重組蛋氨酸酶的宿主本發(fā)明進一步提供鑒定能以5-75％總細胞蛋白質(zhì)的水平生產(chǎn)重組蛋氨酸酶的轉(zhuǎn)化宿主細胞。具體地，發(fā)現(xiàn)將大約5-75％的總細胞蛋白質(zhì)表達成重組蛋氨酸酶的轉(zhuǎn)化宿主細胞具有明顯的可觀察到的粉紅色。當(dāng)用大腸桿菌作為宿主時特別明顯。
為鑒定表達高水平重組蛋氨酸酶的轉(zhuǎn)化宿主細胞，讓轉(zhuǎn)化細胞在培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基中在重組蛋白質(zhì)被表達的條件下生長，并目測檢查生長的細胞?；诜奂t色的顯示來檢測和選擇和生長細胞或菌落。
為使用本發(fā)明方法選擇，使生長轉(zhuǎn)化宿主細胞生長，可使用許多培養(yǎng)/生長條件。生長培養(yǎng)基的成分決定于所用的宿主/載體的營養(yǎng)需要以及用于鑒定與重組蛋氨酸酶高水平表達有關(guān)的粉紅色的檢測系統(tǒng)并從而可以分離高水平表達克隆。優(yōu)選的培養(yǎng)基是轉(zhuǎn)化宿主細胞在其上可以平鋪，以單獨的菌落生長的固體培養(yǎng)基，每一個單菌落都來自單個宿主中。檢定高水平表達克隆的優(yōu)選方法是目測生長菌落。
IV.用高水平表達組件生產(chǎn)重組蛋氨酸酶本發(fā)明進一步提供生產(chǎn)重組蛋氨酸酶的方法。具體地，應(yīng)用用一個或幾個本發(fā)明高水平表達組件轉(zhuǎn)化的宿主能以工業(yè)化大量生產(chǎn)重組蛋氨酸酶。這種被轉(zhuǎn)化宿主以大約5-75％總細胞蛋白質(zhì)的水平表達重組蛋氨酸酶。使用本發(fā)明宿主，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能容易地用本領(lǐng)域已知方法生產(chǎn)用于各種診斷和治療方法中的重組蛋氨酸酶。
純化用包含編碼蛋氨酸酶的高水平表達模型的轉(zhuǎn)化宿主生產(chǎn)的重組蛋氨酸酶，或純化自然生產(chǎn)蛋氨酸酶的宿主生產(chǎn)的重組蛋氨酸酶的優(yōu)選方法包括下面步驟a)將含有蛋氨酸酶的轉(zhuǎn)化細胞提取物的含水緩沖液，在大約40-60℃加熱大約1-10分鐘，優(yōu)選50℃加熱1分鐘；b)在GS-3離心機轉(zhuǎn)子(Sorvall，Dvpont)上以大約10k至20k rpm將加熱的提取物離心大約15分鐘至1小時，優(yōu)選在4℃以大約13k rpm離心大約30分鐘；
c)使用大約50k至100k孔徑的過濾器將上清液超濾，優(yōu)選用10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.3)的Millipore Pre/ScaleTFF PLHK 100K 2.5ft2柱體；d)進行DEAE離子交換柱層析，用大約pH7.0-7.6 1-20mM磷酸鉀緩沖液中的低離子強度(大約10-50mM)KCl，收集含有40-200mM KCl梯度洗脫的蛋氨酸酶的級分，優(yōu)選使用DEAE-瓊脂糖FF柱；e)在大約pH8.0-8.6 10-20mM磷酸鉀緩沖液中的中等離子強度(50-100mM)KCl中進行第二次DEAE離子交換柱層析，并收集含有用磷酸鹽緩沖液(pH 8.3)、100-200mM KCl洗脫的蛋氨酸酶的級分。優(yōu)選使用DEAE-瓊脂糖FF柱；f)將步驟(e)中收集的所述級分與能吸附內(nèi)毒素的柱層析基質(zhì)接觸，并收集洗脫液，從而從e)步驟所述洗出液中除去了內(nèi)毒素，生成了每毫克蛋白質(zhì)具有至少20單位蛋氨酸酶活性和每mg蛋白質(zhì)只含1-100ng內(nèi)毒素的無內(nèi)毒素蛋氨酸酶，優(yōu)選使用ActicleanEtox柱。
細胞提取物優(yōu)選從已被改變來表達高水平重組蛋氨酸酶(大約5-75％總細胞蛋白質(zhì))的宿主細胞制備。對于細菌性細胞提取物，提取物一般通過首先收獲并沖洗細菌細胞培養(yǎng)物生成細胞團/丸粒(取決于收獲是用離心作用或者是用中空纖維過濾，兩種方法一般是已知的)來制備。
然后用常規(guī)方法破碎細胞，優(yōu)選使用勻漿器破碎細胞，如空腔型勻漿器，例如Microfluidics Corp.Model#HC8000。
加熱所得懸浮液，以沉淀選擇的蛋白質(zhì)和其它不溶性物質(zhì)。典型的加熱條件是在大約45-60℃加熱1-10分鐘，優(yōu)選步驟是在50℃加熱1分鐘。
離心加熱的提取物，去除碎屑，濾出上清液，并如上文所述以兩步驟加樣到DEAE離子交換層析基質(zhì)上。優(yōu)選的吸附和洗脫條件見實施例。在這些步驟中可以使用各種DEAE離子交換柱層析基質(zhì)，基質(zhì)的選擇不認(rèn)為是限定條件。商業(yè)上的來源包括Pharmacia Fine Chemicals，BioRad，和Sigma。
此后，去除內(nèi)毒素，生產(chǎn)上文提出的具有可接受水平內(nèi)毒素的蛋白質(zhì)。內(nèi)毒素去除步驟可以用各種已知方法進行，一般包括使溶液中的蛋白質(zhì)與能吸附內(nèi)毒素的柱層析基質(zhì)接觸，得到含有無內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的柱層析基質(zhì)洗脫液。用于除去內(nèi)毒素的優(yōu)選商售試劑是ActicleanEtox。
G.應(yīng)用蛋氨酸酶預(yù)防與高半胱氨酸過高相關(guān)的心血管疾病。
本發(fā)明的另一方面是蛋氨酸酶用于除去高半胱氨酸治療。
高半胱氨酸過高與各種類型心血管病相關(guān)。這些疾病與高半胱氨酸的關(guān)系是McCully在1969年首次發(fā)現(xiàn)的(McCully，KS，“美國病理學(xué)雜志”(Am.J.Pathol.)56111-28，1969)。McCully發(fā)現(xiàn)了升高的血漿高半胱氨酸濃度和動脈硬化疾病之間的關(guān)系。最近由Framingham Heart Study對1041人進行的研究發(fā)現(xiàn)升高的高半胱氨酸血漿水平引起動脈硬化增加的危險(Selbub，J.等，“英國藥學(xué)雜志”(N.Engl.J.)Med.32286-91，1995)。其它研究甚至將中等的高半胱氨酸血過高與外周血管，腦血管和冠狀心臟病疾病聯(lián)系起來(Kang，S.等，“營養(yǎng)學(xué)進展年刊”(Annu.Rev.Nutr.)12279-98，1992)。例如血管疾病患者空腹高半胱氨酸濃度比正常人高31％。血漿高半胱氨酸濃度超過正常值上限12％既與患心肌梗塞形成危險增加3.4倍相關(guān)(Stampfer，M.等，“美國醫(yī)學(xué)協(xié)會會刊”(JAMA)268877-81，1992)。高半胱氨酸代謝作用機理的研究發(fā)現(xiàn)，對2000多名受試者中，20例對照和跨地域研究表明，患中風(fēng)或其它心血管血液病的患者具有比沒有心血管疾病受試驗者更高的高光胱氨酸的血液水平。這與大多數(shù)心肌梗塞患者具有正常膽固醇水平的事實相反。在“內(nèi)科健康研究”(Physicians Health Study)發(fā)現(xiàn)了令人矚目的結(jié)果，預(yù)期表明，自后來被診斷患心肌梗塞的271名男性身上在患心肌梗塞之前取出的血樣中具有明顯高于未患心肌梗塞相當(dāng)?shù)膶φ战M中的高半胱氨酸平均基礎(chǔ)線水平。(Ueland，P.等，“心血管疾病止血和內(nèi)皮功能”Cardiovascular Disease Hemostasis and Endothelial Function，New YorkMarcel Dekler；183-236，1992)。盡管有多種條件能引起高半胱氨酸水平的升高，但不管代謝原因是什么，存在高水平高半胱氨酸與血管疾病之間的關(guān)系。在一定向研究中，在狒狒體內(nèi)誘發(fā)血管損傷，并用高半胱氨酸對狒狒輸注三個月(Ueland，P.等，上文)。通過口服蛋氨酸后測定患者體內(nèi)高半胱氨酸水平來診斷高半胱氨酸過高?？诜鞍彼峒ぐl(fā)后在動脈硬化患者體內(nèi)不正常的高半胱氨酸血漿濃度是正常者的12倍(Ueland，等，上文)。用HPLC測定能方便快捷地測定血漿高半胱氨酸水平。研究表明40％的人口可能有升高的高半胱氨酸水平，有患心血管病的危險(Stampfer，M.和Malinow，M.，“新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志”(New Engl.J.Med.)332326-329 1995)。高半胱氨酸血過高在誘發(fā)動脈硬化疾病方面具有急性作用，使個體有患心肌梗塞和腦血管病的危險。急救醫(yī)療介入表明上述個體的大部分有患心血管疾病的危險。本發(fā)明蛋氨酸酶可以作為急救醫(yī)療中一個可選擇的治療方法，可馬上降低有患病危險的人的高半胱氨酸水平。蛋氨酸酶催化兩種反應(yīng)，不只在蛋氨酸中而且也在高半胱氨酸中酶解N-C鍵和γC-S鍵(Hoffman，“生物技術(shù)和生物物理學(xué)”(Bioch.et Biophys.)Acta，“癌癥研究回顧”(Reviews on Cancer)，73849-87，1984)。圖7說明高半胱氨酸和蛋氨酸代謝的代謝循環(huán)。維生素B-12，B-6，和葉酸鹽影響圖中說明的循環(huán)的左側(cè)，對用蛋氨酸酶治療后保持一些人的正常高半胱氨酸水平是有幫助的。而循環(huán)的右側(cè)不取決于這些維生素的水平。在循環(huán)的右側(cè)，蛋氨酸的存在通過升高的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)導(dǎo)致過量高半胱氨酸水平，其可以導(dǎo)致癌癥以及動脈硬化疾病。對于循環(huán)右側(cè)不正常的患者，保持和短期使用蛋氨酸酶是必要的，可保持高半胱氨酸的正常水平。對于心血管疾病，蛋氨酸酶對蛋氨酸和高半胱氨酸兩者的底物特異性是重要的。蛋氨酸酶可降低高半胱氨酸前體蛋氨酸的水平，也可以直接降低高半胱氨酸水平。本領(lǐng)域現(xiàn)有研究只建議使用維生素B-12，B-6和葉酸鹽作為治療劑來降低過高的高半胱氨酸血。如圖7所示，只表明這些維生素沒有矯正任何該循環(huán)右側(cè)中的不正常癥狀，也沒有降低該循環(huán)右側(cè)不正常的患者體內(nèi)的高半胱氨酸水平。本發(fā)明包括用蛋氨酸酶治療患心血管疾病患者的方法。
一方面，提供了治療患心血管疾病患者的方法，包括給患者施用治療有效量的蛋氨酸酶。
用于高半胱氨酸去除的蛋氨酸酶的治療有效量是預(yù)測量，計算達到所期高半胱氨酸去除的水平，從而，例如，降低患動脈硬化的危險性。
因此，本發(fā)明蛋氨酸酶給藥的劑量范圍是足以產(chǎn)生所期效果的量，所期效果例如是降低患動脈硬化的危險或水平。劑量不應(yīng)大至引起副作用，如粘滯性過高，綜合癥，肺水腫，充血性心力衰竭等等。一般情況下劑量根據(jù)患者的年齡，癥狀，性別和疾病發(fā)展程度而不同，這是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠決定的。
劑量可以在任何復(fù)雜的情況下由醫(yī)生確定。
本發(fā)明蛋氨酸酶的治療有效量一般是當(dāng)以生理相容組合物給藥時足以使血管內(nèi)(血漿)或局部蛋氨酸酶的濃度是大約0.001至大約100U/ml，優(yōu)選高于大約0.1U/ml，更優(yōu)選高于1U/ml的量。給藥的一般劑量決定于體重，并且是在大約5-1000U/kg/天，優(yōu)選大約10-50U/kg/天，更優(yōu)選大約20-40Ukg/天的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選方法中，所用蛋氨酸酶基本上無內(nèi)毒素，如上文詳細討論的。特別優(yōu)選的是使用本發(fā)明生產(chǎn)的蛋氨酸酶，其來自重組源且基本上不含內(nèi)毒素。
可以使用本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員已知的方法給藥，且在本說明書中進行了說明。
本發(fā)明的另一方面是通過施用治療有效量的基本上不含內(nèi)毒素且與聚合物結(jié)合的蛋氨酸酶來治療患心血管疾病的患者。在一優(yōu)選方面，該聚合物是聚乙二醇。本發(fā)明另一優(yōu)選方面是所述心血管疾病是動脈硬化。本發(fā)明的另一方面是給顱外頸動脈狹窄，外周血管，腦血管，冠狀心臟病和閉塞性血管疾病患者給藥蛋氨酸酶。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種通過對患者給藥治療有效量的蛋氨酸酶來治療高半胱氨酸血過高患者的方法。所述蛋氨酸酶基本上不含內(nèi)毒素且與聚合物如聚乙二醇結(jié)合。
本發(fā)明也提供了降低患者體內(nèi)高半胱氨酸水平的方法，包括對患者給藥治療有效量的蛋氨酸酶的步驟，其中所述蛋氨酸酶基本上不含內(nèi)毒素。本發(fā)明另一方面是提供了一種預(yù)防患者發(fā)生心血管疾病的方法，包括對患者給藥治療有效量的蛋氨酸酶的步驟。在一優(yōu)選方面，給與患者的蛋氨酸酶基本上無內(nèi)毒素。另一優(yōu)選方面，所述蛋氨酸酶與一聚合物結(jié)合。再一方面提供預(yù)防患者發(fā)生心血管疾病的方法，包括對患者給藥治療有效量的蛋氨酸酶的步驟，所述蛋氨酸酶基本上無內(nèi)毒素，并且還和聚乙二醇結(jié)合。實施例7提供了體內(nèi)高半胱氨酸去除的例子。
H.蛋氨酸酶應(yīng)用于腫瘤顯像本發(fā)明另一方面提供了診斷患者體內(nèi)腫瘤的方法，包括通過對患者給藥蛋氨酸酶，去除患者體內(nèi)12C蛋氨酸，然后通過給與患者11C蛋氨酸來充實患者體內(nèi)的蛋氨酸，最后測定患者腫瘤細胞中存在的11C蛋氨酸，11C甲基化作用可以通過例如但不限于正電子發(fā)射斷層顯象(PET)掃描的方法來檢測。本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員熟悉其它檢測癌細胞攝入的11C的方法。這些方法描述在，例如，Lapela等，“核醫(yī)學(xué)雜志”(J.Nucl.Med.)351618-23，1994；Miyazawa等，“核醫(yī)學(xué)雜志”(J.Nucl.Med.)341886-91，1993；Leskinen-Kallio等，“核醫(yī)學(xué)雜志”(J.Nucl.Med.)33691-95，1992；Shields等，“核醫(yī)學(xué)雜志”(J.Nucl.Med)33581-84，1992；Huovinen等；“英國癌癥雜志”(BritJ.Cancer)67787-91，1993；Dethy等，“核醫(yī)學(xué)雜志”(J.Nucl.Med.)351162-66，1994；Lindholm等，“核醫(yī)學(xué)雜志”(J.Nucl.Med)341711-16，1993；Leskinen-Kallio等，“核醫(yī)學(xué)雜志”(J.Nucl.Med.)321211-18，1991；和Mineura等，“核醫(yī)學(xué)雜志”(J.Nucl.Med)32726-28，1991，這里一起引作參考。
本發(fā)明優(yōu)選方面，所提供的蛋氨酸酶基本上無內(nèi)毒素。
本發(fā)明另一優(yōu)選方面是，所述蛋氨酸酶是與聚合物，如聚乙二醇結(jié)合的。
實施例下面涉及本發(fā)明的實施例是詳細說明而不作為對本發(fā)明的特別限制。而且，在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可預(yù)見范圍內(nèi)的現(xiàn)在已知的或者以后可發(fā)展的本發(fā)明的這些變化被認(rèn)為在下文所要求的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例1擴大生產(chǎn)蛋氨酸酶惡臭假單孢菌株，被改良并如下挑選卡那霉素抗性，和高水平表達蛋氨酸酶的菌株于1993年10月從ATCC購得ATCC 8209惡臭假單孢菌(Pseudomonasputida)和ATCC 77100大腸桿菌。ATCC 77100在含有50μg/ml卡那霉素的LB(Sambrook等，“分子克隆，實驗指南”(Molecular CloningALaboratorymanual)A.1，1989)中生長。從ATCC 77100中分離質(zhì)粒pCN 51，一種包含能在惡臭假單孢菌(P.putida)和大腸桿菌(E.coli)兩者中復(fù)制的卡那霉素抗性基因的穿梭質(zhì)粒(Nieco等，Gene 87145-149，1990，這里引作參考)，并用Triton-溶菌酶方法(Sambrook等，“分子克隆，實驗指南”(Molecular CloningAlaboratory manual)1.29-1.30，1989)純化。ATCC 8209在LB培養(yǎng)基中生長，并用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法用pCN 51轉(zhuǎn)化，所述標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法如描述在例如Sambrook等，“分子克隆，實驗指南”(Molecular Cloninga laboratorymanual.)1.74-1.84，1989中的那些方法?？敲顾乜剐跃暝贚B培養(yǎng)基中用卡那霉素(100μg/ml)挑選，并進一步在LB板(Sambrook等，“分子克隆，實驗指南”(Molecular CloningAlaboratory manual)A.1-A.4，1989)上在100μg/ml卡那霉素中生長。單一菌落在含有100μg/ml卡那霉素的LB中生長過夜，然后置于高蛋氨酸酶表達條件下10％LB，0.1％磷酸鉀緩沖液(pH7.2)，0.1％尿素，0.025％酵母提取物，0.01％硫酸鎂和有50μg/ml卡那霉素的0.25％蛋氨酸，培養(yǎng)24小時。用本說明書說明的標(biāo)準(zhǔn)蛋氨酸酶測定方法測定蛋氨酸酶的表達。挑選過量生產(chǎn)蛋氨酸酶的惡臭假單孢菌菌株(Pseudomanas putida)并命名為AC-1。
然后應(yīng)用AC-1惡臭假單孢菌菌株(Pseudomonas putida)進行擴大生產(chǎn)的發(fā)酵過程。AC-1單一菌落在含有50μg/ml卡那霉素的LB板上生長。以250rpm/min振搖速度在26℃將挑選的菌落在5ml含50μg/ml卡那霉素的LB中溫育18小時。以200rpm/min震搖速度在26℃將2ml細菌在600ml含50μg/ml卡那霉素的LB中擴增6小時。然后以100rpm/min搖蕩在26℃將50ml細菌在2升含50μg/ml卡那霉素的LB中溫育過夜(18小時)。然后讓2升細菌(OD6001.2-1.6)在40升罐中在含有10％LB，0.1％磷酸鉀緩沖液(pH7.2)，0.1％甘油，0.1％尿素，0.025％酵母提取物，0.01％硫酸鎂和0.25％蛋氨酸的特定培養(yǎng)基中，在高通氣條件下，在26℃生長24小時。OD600達到1.2-1.8且活性達到20-30單位/升。收獲的細胞最佳密度是1.5-1.8OD600，具有2-3mg/l蛋氨酸酶，這相當(dāng)于1kg濕細胞/400升。優(yōu)選地，使用大約產(chǎn)率1kg濕細胞/10-20升的裝備完善的發(fā)酵罐。保持溫度4℃，用AGT柱(UFP-500-E-55型柱體，A/G Technology Corporation)收集細胞，然后在4℃，以9krpm，用自動冷凍離心機(Sorvall Superspeed RC2-B)離心10分鐘。然后收集細胞片狀沉淀物。
然后將細胞懸浮于提取溶液(20mM磷酸鉀，pH9.0)中，密度為500克濕細胞/升，三次用空腔勻漿器(Microfluidics Corp.Model#HC 8000)破碎細胞。細胞破碎后立即將勻漿物在-800℃下保存。勻漿物中蛋氨酸酶的比活度是0.08～0.1單位/mg蛋白。
將AC-1勻漿物懸浮于提取緩沖液(10mM磷酸鉀，pH7.2，10μM磷酸吡哆醛，0.01％β-巰基乙醇，1mM EDTA和20％乙醇)，并在50℃加熱2分鐘。加熱步驟可以進行任何長的時間，足以沉淀熱敏感雜質(zhì)蛋白而保持蛋氨酸酶活性。懸浮液在4℃以12krpm離心30分鐘。收集上清液并用Millipore Prep/Scale-TFF PLHK 100k2.5ft2柱體超濾。然后將pH調(diào)至7.2。
大約25-35g總蛋白質(zhì)的10L提取緩沖液(10mM磷酸鉀緩沖液pH7.2，10μm磷酸吡哆醛和0.01％J-巰基乙醇)樣品施加到10cm×50cmToyopear(DEAE-650M柱(Toso Haas Japan)上，該柱用10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)預(yù)平衡。該柱先用含有10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巰基乙醇的40mM氯化鉀的10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)20-30L預(yù)沖洗，直至OD280降低至0.1以下。然后將氯化鉀在提取緩沖液自初始濃度40mM提高至300mM，對柱子進行線性梯度洗脫。收集了400ml洗出級分。用本說明書說明的蛋氨酸酶活性測定來測定含蛋氨酸酶的級分并集中。用含有相同濃度磷酸吡哆醛和β-巰基乙醇的10mM磷酸鉀緩沖液，pH8.3，和150mM氯化鉀將集中的級分預(yù)平衡比。
將從DEAE-650M(5cm×20cm)柱的蛋氨酸酶峰得到的大約1-2g總蛋白質(zhì)的緩沖液樣品施加到DEAE-Sephadex A 50柱上，所述緩沖液含有10mM磷酸鉀pH8.3，150mM氯化鉀，10μM磷酸吡哆醛和0.01％J-巰基乙醇。用含10μM磷酸吡哆醛和0.01％β-巰基乙醇的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.3)中的150-500mM KCl線性梯度洗脫該柱，收集150ml洗出級分。集中用本文說明的活性測試測定的含蛋氨酸酶的級分。然后進一步純化集中的蛋氨酸酶以去除內(nèi)毒素。通過在0.12M氯化鈉和pH7.1的10mM磷酸鈉緩沖液中透析將樣品預(yù)平衡。將樣品加到5cm×15cm Acticlean Etox樹脂柱(SterogenBioseparations，Arcadia，CA)上。然后用相同緩沖液從柱上洗脫酶，收集具有蛋氨酸酶活性的洗出級分，然后測定洗出級分中內(nèi)毒素含量。表1給出該純化方法的結(jié)果。

純化的蛋氨酸酶在7.5％SDS-PAGE凝膠上的分析顯示一條43kd蛋白質(zhì)帶，代表當(dāng)用SDS-PAGE分析從第二個柱中得到的活性級分時發(fā)現(xiàn)的172kd蛋白質(zhì)的一個亞單位。HPLC分析表明用該方法分離的蛋氨酸酶的純度是98.7％，通過只有一個蛋白質(zhì)峰可證明。
本文說明的提取方法產(chǎn)生了基本上無內(nèi)毒素的基本上提純的蛋氨酸酶制劑。本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員明白可以對說明的提取方法進行修飾，這些改變包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
實施例2人腫瘤對升高的蛋氨酸水平的依賴性蛋氨酸依賴性經(jīng)常發(fā)生在人癌癥情況下，來自所有主要器官系統(tǒng)的20種NCI人腫瘤細胞系用于試驗蛋氨酸依賴性。所有20個細胞系都發(fā)現(xiàn)是蛋氨酸依賴性的。另外測試了新鮮的人腫瘤樣品，也發(fā)現(xiàn)是蛋氨酸依賴性的。正常人細胞系不是蛋氨酸依賴性的。
圖1給出了一個這種試驗的結(jié)果。在圖1中，正常細胞株和腫瘤細胞系與10％透析的血清一起在Eagle′s MEM中生長，所述透析的血清是下列樣品之一不含高半胱氨酸含蛋氨酸(MET+HCY-)的樣品；不含蛋氨酸含高半胱氨酸(MET-HCY-)的樣品或不含蛋氨酸不含高半胱氨酸(MET-HCY-)的樣品。在含蛋氨酸(MET)培養(yǎng)基，無MET培養(yǎng)基，含高半胱氨酸(HCY)培養(yǎng)基中和在無MET培養(yǎng)基，含高半胱氨酸(HCY)培養(yǎng)基中和在無MET，無HCY培養(yǎng)基中篩選腎，結(jié)腸，肺和前列腺癌細胞系和黑素瘤和正常成纖維細胞株。細胞在補充有10％的透析后胎牛血清，10μm羥鈷胺素和100μm葉酸的Eagle′s極限必需培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基)中生長。該培養(yǎng)基以下面方式補加或不補加蛋氨酸MET+HCY用100μm不含高半胱氨酸的L-蛋氨酸補加該培養(yǎng)基。METHCY+用200μm不含蛋氨酸的D，L-高半胱氨酸補加該培養(yǎng)基。METHCY該培養(yǎng)基不含蛋氨酸且不含高半胱氨酸。胎牛血清對磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(血清∶PBS為1∶12)透析10次。
通過在450nm測定染料XTT的代謝還原的吸收來測定細胞增殖。通過每孔中接種5×103和2×104個細胞范圍之內(nèi)的細胞讓細胞在48孔平皿上生長?；罴毎斜淮x還原成水溶性甲產(chǎn)物的XTT(2，3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓氫氧化物被用來測定細胞增殖。在450nm處測定還原產(chǎn)物的吸收值。在37℃PBS中預(yù)溫制備1mg/mlXTT，在PBS中制備5mM吩嗪N-甲硫酸酯(PMS)。新鮮XTT溶液與PMS儲溶液以每1ml XTT 511PMS的比例混合。每孔裝入1ml培養(yǎng)基。向每孔中加入0.25ml混合的XTT。接種3小時后用Hitachi U-2000分光光度計在450nm處讀出還原的XTT的吸收值。細胞最初培養(yǎng)24小時后每三天測定一次XTT的OD。在MET+HCY-或MET-HCY+中，包皮成纖維細胞株FS-3和HS-68基本上相等地增殖。但是本發(fā)明書報導(dǎo)了一個新發(fā)現(xiàn)，即在MET HCY培養(yǎng)基中，兩種成纖維細胞株增殖到某一程度后保持至少16天。
表2詳細說明了20種腫瘤細胞系的細胞增殖的測定結(jié)果。在該測定中，將5×103-2×104個細胞/孔的細胞懸浮液在48孔平板上在含有10％胎牛血清的MEM中培養(yǎng)24小時。用Hanks堿性鹽溶液(HBSS)將細胞洗滌兩次后分為三組。第一組細胞在MET+HCY-培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第二組細胞在MET-HCY+培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第三組細胞在MET-HCY-培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞在用95％空氣/5％CO2通氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天換一次培養(yǎng)基。在表2中，細胞系生長旺盛的用a+++表示，有所生長的用a++表示，稍有些生長的用a+表示，沒有生長的用a-表示。大約一半的腫瘤細胞系在無MET含HCY的培養(yǎng)基中不能生長，而其它細胞系不同程度生長，而用相同的培養(yǎng)基以及在含MET的培養(yǎng)基中，正常細胞可以生長。盡管在無MET無HCY的培養(yǎng)基中，正常細胞株能生長到一定程度后保持2星期或更長時間，但所有被試20種腫瘤細胞系在該培養(yǎng)基中死亡，這表明有可能所有的癌細胞通過去除MET而被有選擇地殺死。這一實施例提供了證據(jù)證明對于癌癥治療尤其是用蛋氨酸酶作為治療劑來說，蛋氨酸依賴性可能是普遍的和選擇性的目標(biāo)。


實施例3小鼠異種移植模型中蛋氨酸酶對人腫瘤生長的抑制作用為試驗蛋氨酸酶對減緩腫瘤生長的藥效，使用了小鼠異種移植模型。人肺癌腫瘤(H460)被移植到裸鼠的皮下組織中。每四只小鼠一組將小鼠分為四組。移植四天后，通過每4小時向腹腔內(nèi)注射給予A組0.4ml緩沖液(0.12M氯化鈉，10mM磷酸鈉，pH7.1)；通過每4小時向腹腔內(nèi)注射給予B組蛋氨酸酶(1單位/g)；通過每4天向腹腔內(nèi)注射給予C組5-FU(60mg/kg)；通過每4天腹腔內(nèi)注射給予D組長春新堿(VCR)(0.9mg/kg)。每兩天測量一次腫瘤大小和體重。結(jié)果示于表2和3。結(jié)果表明，用蛋氨酸酶治療大大減緩了裸鼠體內(nèi)H460人非小細胞肺癌的生長。在這些實驗中，小鼠喂進不去除蛋氨酸的正常食物。蛋氨酸酶抗H460的藥效完全與5-氟尿嘧啶和長春新堿治療相反，后兩種藥物沒有抗該腫瘤的活性。給予蛋氨酸酶40-120活性單位/天的10天治療內(nèi)沒有引起體重減少，這表明其具有低毒性。相反，長春新堿引起體重減少，表明有毒性。因此，蛋氨酸酶是一種有新的腫瘤選擇性作用方法的毒性小的高效抗腫瘤劑，證明有抗人固體腫瘤潛力的臨床效果。
實施例4
制備PEG-蛋氨酸酶分子量為5000的甲氧聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(M-SC 5000 PEG)被溶解于20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.3)中，濃度在2mM和20mM之間。M-SC5000 PEG與蛋氨酸酶的摩爾比自6∶1至240∶1變化。PEG化反應(yīng)在反應(yīng)緩沖液(25mM磷酸鈉緩沖液，pH8.3)中在4℃或20℃進行30分鐘至60分鐘。用終止緩沖液(0.14M磷酸鈉緩沖液，pH6.5)在0℃終止反應(yīng)。然后按照本文說明的凝膠過濾層析去除未反應(yīng)的M-SC 5000 PEG。使用30k AmiconCentriprep濃縮器，在0.12M氯化鈉和10mM磷酸鈉(pH7.2)中配制成最終PEG-蛋氨酸酶。然后通過0.2μm微粒膜過濾器的過濾作用將PEG-蛋氨酸酶滅菌。該PEG-蛋氨酸酶可以在-70℃保存至6個月而不喪失活性。
測定蛋氨酸酶活性。PEG-蛋氨酸酶保留至少60％未PEG化蛋氨酸酶的活性。按照Laemmli和Sambrook的說明(Laemmli，“成熟”(Mature)227-680，1970；Sambrook等，“分子克隆，實驗指南”(Molecular Cloninga laboratorymanual)18，47-18.59，1989)，通過天然和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PEG-蛋氨酸酶，并進行了如下改進在有或沒有SDS的0.2MTris-甘氨酸緩沖液(pH8.3)中的7.5％聚丙烯酰胺預(yù)制凝膠中進行PEG-蛋氨酸酶電泳。凝膠用考馬斯藍染色，并用40％甲醇10％乙酸去色。盡管在SDS凝膠中可見一條非常小的電泳帶，但當(dāng)PEG-蛋氨酸酶施用到天然凝膠上時，見不到未修飾蛋氨酸酶的電泳帶。
然后如下用HPLC凝膠過濾柱分析PEG-蛋氨酸酶將PEG-蛋氨酸酶(20μl，1-2mg/ml以一個20μl的加樣器加到0.2M磷酸納緩沖液(pH7.2)中的Progel-TSK G3000SW(Supelco)柱上，并用0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.2)以流速1.0ml/min洗脫。只檢測到一個蛋白質(zhì)峰，即不含未反應(yīng)的PEG的PEG-蛋氨酸酶峰；檢測不到未PEG化的蛋氨酸酶峰。PEG-蛋氨酸酶的純度大約是100％。
a)PEG化反應(yīng)的時間進程研究如下測量聚乙二醇與蛋氨酸酶結(jié)合作用的時間進程0.07mM蛋氨酸酶與0.4mM-SC 5000 PEG在4℃在0.2M磷酸鈉緩沖液(pH8.3)中反應(yīng)不同時間，至多反應(yīng)2小時。在各時間點用0.2M磷酸鈉(pH6.5)終止反應(yīng)。用30kAmicon離心制備濃縮器去除未反應(yīng)的PEG。結(jié)果見表3。
按照本文的說明在天然和SDS-PAGE凝膠上分析PEG-蛋氨酸酶測到有高分子量帶出現(xiàn)，并在表3中標(biāo)明-、+-、+、或++符號，-表明沒有PEG-蛋氨酸酶或蛋氨酸酶，+-表明有少量PEG-蛋氨酸或蛋氨酸酶，++表明有大量PEG-蛋氨酸酶或蛋氨酸酶。表3也表明PEG-蛋氨酸酶或蛋氨酸酶的活性。

*M＝蛋氨酸酶**p＝M-SC 5000-PEG.
b)用M-SC 5000 PEG對蛋氨酸酶PEG化的濃度依賴性0.07mM蛋氨酸酶與各種濃度(0.4mM至4.0mM)的M-SC 5000 PEG在0.2M磷酸鈉緩沖液(pH8.3)中反應(yīng)。摩爾比是1∶6～1∶60。反應(yīng)在實施例a相同的條件下在4℃進行60分鐘。
結(jié)果見表4。

*M蛋氨酸酶**PPEG.***P-MPEG-蛋氨酸酶。
C)PEG-蛋氨酸酶的藥物動力學(xué)蛋氨酸酶PEG化作用的M-SC 5000 PEG對蛋氨酸酶的摩爾比分別是1∶6(P1)和1∶12(P2)。反應(yīng)在上文(b)中相同的條件下進行。純化的P1和P2以及未修飾的蛋氨酸酶分別注入三組不同小鼠的尾靜脈。在0，1，2，3，4和20小時取血樣，對蛋氨酸酶和PEG-蛋氨酸酶進行活性測定，并測定去除蛋氨酸的水平，結(jié)果見表5。

M蛋氨酸酶。**P1，P2PEG-蛋氨酸酶實施例5使用PEG-蛋氨酸酶在豚鼠體內(nèi)進行抗原性實驗蛋氨酸酶與M-SC 5000 PEG分別以摩爾比1∶60，1∶120和1∶240在20℃反應(yīng)30分鐘。其它條件與上文(a)相同。通過蛋氨酸酶活性測試，電泳和HPLC分析PEG-蛋氨酸酶。檢測不到未修飾蛋氨酸酶的帶或峰。因此，PEG-蛋氨酸酶是唯一的酶源。
每2天對豚鼠腹腔內(nèi)給藥2mg蛋氨酸酶或PEG-蛋氨酸酶，共給藥三次。兩星期后，靜脈內(nèi)給藥4mg蛋氨酸酶或PEG-蛋氨酸酶。在該實驗中分別以0.2磷酸鈉緩沖液和BSA作為陰性和陽性對照物。根據(jù)表6的標(biāo)準(zhǔn)評估結(jié)果。結(jié)果見表7。根據(jù)豚鼠體內(nèi)試驗，蛋氨酸酶的PEG化作用產(chǎn)生了極低抗原性的成分。已知豚鼠與人相比對抗原更敏感。
表6豚鼠體內(nèi)PEG-蛋氨酸酶抗原性研究的評估標(biāo)準(zhǔn)0.正常1.不安靜2.立毛3.發(fā)抖4.鼻流粘液5.打噴嚏6.咳嗽7.呼吸過度8.排尿9.排便10. 流淚11. 呼吸困難
12. 有鼾音 13.發(fā)紺14. 步態(tài)蹣跚 15.跳躍16. 喘息并扭動 17.抽搐18. 側(cè)位 19.潮式呼吸20. 死亡評估標(biāo)準(zhǔn)(-)陰性無變化(+)輕變1-4(++) 中度1-10(+++) 嚴(yán)重1-19(++++) 死亡20

結(jié)果表明，PEG-蛋氨酸酶與牛血清白蛋白(B.S.A)相反，蛋氨酸酶在豚鼠體內(nèi)無抗原性，這表明當(dāng)對哺乳動物給藥時，PEG-蛋氨酸酶是非抗原性的。
實施例6給藥蛋氨酸酶用于人癌癥治療已開始進行蛋氨酸酶第I階段劑量遞增研究來測定蛋氨酸酶毒性，藥物動力學(xué)和最大容許劑量。通過給2名晚期乳腺癌患者靜脈內(nèi)(iv)輸注2小時給予5000單位(0.5g)和10000單位(1.0g)蛋氨酸酶的2小時輸注。從0至24小時以頻繁間隔取血樣和尿樣。根據(jù)WHO等級系統(tǒng)進行毒性評估。從血清中蛋氨酸酶和蛋氨酸兩者的水平而獲得藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)。
沒有發(fā)現(xiàn)急性臨床毒性，測定的所有毒性標(biāo)準(zhǔn)都有0的最小等級?；颊?和患者2體內(nèi)蛋氨酸酶的半衰期分別是2小時和3.2小時。輸注后30分鐘內(nèi)開始去除血清蛋氨酸，且在輸注完成后保持4個小時。患者1和患者2體內(nèi)最低血清蛋氨酸水平分別是處理前水平的35％和19％。結(jié)果示于表8-10和圖4-6。如下對患者進行治療患者1日期1994年12月14日。診斷晚期乳腺癌，腋窩淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移。女性，46歲。2小時內(nèi)靜脈內(nèi)輸注200ml給藥5000單位(0.4g)根據(jù)提取方法(實施例1)純化的蛋氨酸酶。治療前以及治療后每2小時直至治療后20小時取血樣。測量蛋氨酸和蛋氨酸酶水平并計算相對水平，圖4。
患者2日期1995年2月2日。診斷晚期乳腺癌，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。女性，54歲。2小時內(nèi)靜脈內(nèi)輸注400ml給藥10000單位(0.8g)根據(jù)提取方法(實施例1)純化的蛋氨酸酶。治療前以及治療后每2小時直至治療后20小時取血樣。測量蛋氨酸和蛋氨酸酶的水平并計算相對水平，圖5。
患者3日期1995年10月15日。診斷晚期乳腺癌，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。女性，45歲。10小時內(nèi)靜脈內(nèi)輸注1000ml給藥20000單位(1.6g)根據(jù)提取方法(實施例1)純化的蛋氨酸酶。治療前以及治療后每2小時取血樣，直至治療后20小時，測量蛋氨酸和蛋氨酸酶水平，并計算相對水平，圖6。
患者3在輸注后的6小時內(nèi)保持最大水平的50％高的蛋氨酸酶血清水平。通過10個小時的輸注，蛋氨酸去除超過200倍，從23.1μM降至0.1μM。在所有毒性標(biāo)準(zhǔn)測定中沒有發(fā)現(xiàn)臨床毒性。
根據(jù)WHO毒性標(biāo)準(zhǔn)在四個方面進行毒性評估a.病史和診斷數(shù)據(jù)；b.身體檢查；c.實驗室評估；和d.藥物動力學(xué)評估(血清中蛋氨酸酶和蛋氨酸含量)。表8-11和圖4-6所示結(jié)果證明本發(fā)明蛋氨酸酶在人體中是無毒性的且可以用來降低蛋氨酸水平。




實施例7體內(nèi)高半胱氨酸的去除通過如下對小鼠給藥該酶證明了本發(fā)明的蛋氨酸酶用于去除高半胱氨酸的體內(nèi)效力給小鼠腹腔內(nèi)注射實施例1的方法純化的4單位蛋氨酸酶。注射大約1小時后，通過對50μl PITC衍生化的鼠血清進行反相FPLC分析來測定蛋氨酸，高半胱氨酸和半胱氨酸的血樣濃度。將色譜圖與PITC衍生的原樣品蛋氨酸，高半胱氨酸，和半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖相比較。測試的靈敏性是大約0.5μM蛋氨酸。
如表11所示，與未處理的小鼠對照的高半氨酸和半胱氨酸相比，蛋氨酸酶具有顯著的體內(nèi)高半胱氨酸去除活性，而沒有任何明顯的體內(nèi)半胱氨酸的去除作用。

實施例8蛋氨酸酶用于腫瘤顯像如本說明書所說明的，通過給藥純化的蛋氨酸酶，從患者體內(nèi)去除[12C]蛋氨酸。優(yōu)選地，該蛋氨酸酶無內(nèi)毒素。通過靜脈內(nèi)輸入4～8小時給藥蛋氨酸酶(10000-20000單位)。然后給予大約5-50mCi[11C]蛋氨酸酶。然后應(yīng)用正電子發(fā)射斷層顯像(PET)成像來測定患者細胞[11C]示蹤劑的攝入。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法，通過計算標(biāo)準(zhǔn)化攝入值(S、U、V)和動態(tài)流入常數(shù)(Ki)值定量測定示蹤劑攝入量。細胞內(nèi)升高水平的[11C]蛋氨酸表明這些細胞可能是腫瘤細胞。腫瘤細胞優(yōu)先攝入[11C]蛋氨酸提供了一種在正常細胞中選擇性地檢測腫瘤細胞的方法。
上文的具體說明，包括具體實例和實施例是為了詳細說明本發(fā)明而不作為限定。不超過本發(fā)明真正精神和范圍，可以進行多種其它的變化和修飾。
實施例9
分離編碼蛋氨酸酶的核酸分子蛋氨酸酶基因克隆插入物的PCR反應(yīng)用ATCC8209衍生的惡臭假單孢菌AC-1的基因組DNA作為模板；所用引物如下t15′-GCCGGTCTGTGGAATAAGCT-3′(有義)，Hind IIIt25′-CCAGGGTCGACTCCAGCGCC-3′(反義)Sal IPCR反應(yīng)條件如下在95℃第一次變性10分鐘，然后在94℃變性30秒，在60℃退火30秒，在72℃延伸2分鐘，進行5個循環(huán)然后在94℃變性30秒，60℃退火30秒，然后在72℃延伸1.5分鐘，進行25個循環(huán)；然后在75℃最后伸展10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物有兩條電泳帶，收集其中1365bp的帶，純化物是插入物ONCase-1DNA。
克隆和轉(zhuǎn)化ONCase-1DNA與pT7Blue T-載體(Novagen)在EcoR VT-克隆位點連接。用標(biāo)準(zhǔn)方法將pONCase-1DNA轉(zhuǎn)化到DH5-α細菌細胞中。
DNA序列測定用T7 DNA聚合酶和雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)進行DNA序列測定。使用引物游走方法。用[35S]dATP標(biāo)記。在含有8M尿素的6％聚丙烯酰胺楔形或非楔形凝膠上分析測序反應(yīng)。以ACGT順序裝載DNA樣品。通過Mac載體分析DNA序列。圖8提供了DNA序列和相應(yīng)的氨基酸順序。
實施例10重組蛋氨酸酶的高表達克隆蛋氨酸酶表達克隆的插入物的PCR反應(yīng)用pONCase-1克隆作為模板，所用引物如下t14.5′-GGAATTCCATATGCACGGCTCCAACAAGC-3′(有義)NdeIt15.5′-AGTCATCCTAGGTCACATCACATCACATCAGGCACTCGCCTTGAGTGC-3′(反義) BamHIt18.5′-AGTCATCCTAGGTCAGGCACTCGCCTTGAGTGC-3′(反義)BamHI
PCR反應(yīng)條件如下在95℃第一次變性10分鐘，然后在94℃變性1分鐘，在56℃退火1.5分鐘，并在72℃延伸2分鐘，進行5個循環(huán)；然后在94℃變性30秒，在56℃退火30秒，然后在72℃延伸1.5分鐘，進行20個循環(huán)；然后在72℃最后延伸10分鐘。收集并純化兩個PCR擴增產(chǎn)物，ONCase-2(1238bp)，ONCase-3(1220bp)帶。
克隆和轉(zhuǎn)化用Nde I和Bam HI消化ONCase-2和ONCase-3DNA，并與pT7.7載體在Nde I和Bam HI克隆位點連接。然后用標(biāo)準(zhǔn)方法將PONCase-2和PONCase-3DNA序列轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)細菌細胞中。
選擇pAC-1和pAC-2克隆在含氨芐青霉素的平板上選擇陽性克隆。在4℃保存24小時后，表達高水平重組蛋氨酸酶的陽性克隆具有明顯的用于鑒別和選擇的粉紅色。通過活性分析來測定陽性克隆的蛋氨酸酶的表達水平。選擇的兩種高表達克隆是包含ONCase-3的pAC-1克隆和包含ONCase-2的pAC-2克隆。
構(gòu)建pAC-3克隆和pAC-4克隆從pBR322在AvaI和Cla I位點獲得四環(huán)素抗性基因。Ava I端被補充到平端，并與pAC-1連接，所述pAC-1被BamHI和ClaI限制性內(nèi)切酶消化，BamHI端被補為平端。從含四環(huán)素的平板上挑選在4℃保留24小時后變成粉色的陽性克隆。通過活性分析測定高表達重組蛋氨酸酶克隆，并命名為pAC-3克隆。
從pBR 322在位點Ava I和Hind III也獲得了四環(huán)素抗性基因。Ava-1端充入一個平端，并與用Hind III和Cla I限制性內(nèi)切酶消化的pAC-1連接，Cla I端充入一個平端。從含四環(huán)素的平板上挑選在4℃保存24小時后變粉色的陽性克隆。用活性分析測定高表達重組蛋氨酸酶克隆，并命名為pAC-4克隆。表12和圖9提供了各種高水平表達克隆。


實施例11重組蛋氨酸酶表達克隆的發(fā)酵作用在含有氨芐青霉素(100μg/ml)或四環(huán)素(10μg/ml)的Terrific Broth培養(yǎng)基中，在28℃或37℃，400rpm搖蕩，在6L培養(yǎng)瓶或發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組蛋氨酸酶的表達克隆。
實施例12重組蛋氨酸酶的純化圖10和11提供了純化方法的略圖。
(1)樣品上柱前的處理在4℃以800×g離心10分鐘收集細菌，然后將細菌片狀沉淀物懸浮于提取溶液(20mM磷酸鉀(pH9.0)，10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巰基乙醇)，并用空腔型勻漿器(Microfluidics Corp.model#HC 8000)破碎。然后在50℃將勻漿物進行熱處理1分鐘。用自動冷凍離心機(SORVALL SuperspeedRC2-B)在4℃以13rpm將懸浮液離心30分鐘。然后收集上清液。接著通過Millipore prep/Scale-TFF PLHK 100k 2.5ft2柱體用緩沖液(10mM磷酸鉀，pH8.3)超濾。通過超濾將pH調(diào)至7.2。
(2)柱層析條件第一柱DEAE瓊脂糖FF柱XK 100/60，高度32cm，體積2.5L溶液[A]含有10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巰基乙醇的40mM氯化鉀，10mM磷酸鉀(pH7.2)。
含有10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巰基乙醇的200mM氯化鉀，10mM磷酸鉀(pH7.2)。
流速5ml/min樣品大約100-200g總蛋白質(zhì)(10-20mg/ml)被施加到第一柱子上。
梯度[1]用大約10體積的溶液A預(yù)先沖洗至OD280降到低于0.1。
梯度20％-100％溶液B級分收集200ml洗脫級分。通過活性分析鑒別含rMETase的級分并集中。
第二柱DEAE瓊脂糖FF柱XK 50/30，高度25cm，體積500mL溶液[A]含10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巰基乙醇的100mM氯化鉀，10mM磷酸鉀(pH8.3)。
含10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巰基乙醇的200mM氯化鉀，10mM磷酸鉀(pH8.3)。
流速5ml/min樣品在含有10μm磷酸吡哆醛的100mM氯化鉀，10mM磷酸鉀(pH8.3)中透析24小時后將大約10-20g總的蛋白質(zhì)(2-4mg/ml)施加到第二柱子上。
梯度[1]用大約5體積的溶液A預(yù)先沖洗至OD280降到低于0.05。
梯度0％～60％溶液B。
級分收集200ml洗脫級分。通過活性分析鑒別含rMETase的級分并集中。
第三柱Sephacryl S-200HR柱Hi Prep 26/60，體積320ml。
溶液0.15M氯化鈉的10mM磷酸鈉(pH7.2)溶液。
流速1.2ml/min樣品大約10ml濃縮樣品。(在0.15M氯化鈉，10mM磷酸鈉(pH7.2)中透析12小時)，施加到第三柱上。
級分通過黃顏色和活性分析鑒別含rMETase的洗脫級分并收集。
第四柱ActicleanEtox100-200ml體積的純化的rMETase(10-20mg蛋白質(zhì)/ml)被加到500mlActicleanEtox柱上，用洗脫緩沖液(0.15M氯化鈉的10mM磷酸鈉溶液，pH7.2)洗脫以去除內(nèi)毒素。ActicleanEtox可再生使用，并可用1M氫氧化鈉洗凈，并可以高壓滅菌。
濃縮終洗脫液用30K Amicon離心制備濃縮機濃縮最終洗脫液。純化的rMETase的制劑是0.15M氯化鈉，10mM磷酸鈉，pH7.2。
純化rMETase。組氨酸在Ni++瓊脂糖凝膠柱上進行層析上柱前預(yù)處理后，將細胞勻漿物懸浮在結(jié)合緩沖液中(5mM咪唑，0.5MNaCl，20mM Tris-HCl，pH7.9)。然后用10體積結(jié)合緩沖液沖洗柱子，接著用6體積洗滌緩沖液(60mM咪唑，0.5M氯化鈉，20mM Tris，HCl，pH7.9)沖洗。6體積洗脫緩沖液(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris·HCl pH7.9)通過柱子后發(fā)生洗脫。通過黃顏色鑒別含rMETase的級分，并收集。
實施例13用HPLC測定rMETase的純度柱SUPELCO，8-08541，Progel TM-TSK，G 3000-SWXL，30cm×7.8mm。
洗脫溶液0.15M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)。
流速1ml/min樣品20μl(0.1-1mg/ml)生產(chǎn)rMETase的實施例見圖10和11。純化見圖12。
實施例14結(jié)晶和凍干形式的含重組蛋氨酸酶(rMETase)的制劑溶液制劑以10-20mg/ml的濃度，配制rMETase溶液，所述溶液是0.15M氯化鈉，10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)。rMETase的穩(wěn)定性見圖13。
結(jié)晶形式將0.15M氯化鈉和10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中的rMETase(10-20mg/ml)用Sephadex G-25(DNA級，超細，Sigma)柱脫鹽。該溶液在干冰和丙酮浴中冷凍，然后用Verdis Freeze Mobile 24，在100毫巴真空中在-80℃結(jié)晶72小時。
凍干形式在0.15M氯化鈉和10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中的rMETase(10-20mg/ml)在干冰和丙酮浴中冷凍，并用Verdis Freeze Mobil 24在100毫巴真空中在-80℃凍干72小時。
活性測試測試是在1ml體積含10μM磷酸吡哆醛和10mM蛋氨酸的50mM磷酸鹽緩沖液pH8.0中在37℃，用不同量的酶進行10分鐘。加入0.5ml 4.5％TCA終止反應(yīng)。懸浮液以15K rpm離心2分鐘。將0.5ml上清液與0.5ml 0.05％3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙及1ml 1M乙酸鈉(pH5.2)溶液一起在50℃溫育30分鐘。然后用分光光度計在OD335測定α-丁酮酸根。用Lowry Reagent試劑盒(Sigma)的方法測定蛋白質(zhì)的量，以單位/mg蛋白質(zhì)計算比活度。
比較rMETase活性，結(jié)果表明不同制劑之間沒有大的差別。
實施例15重組蛋氨酸酶(PEG-rMETase)的化學(xué)修飾在0.15M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中以0.1M和0.2M之間的濃度配制純化的rMETaes。活性大約是20單位/mg。
將分子量5000的M-SC 5000 PEG(Methoxy-SC-PEG，MW 5000，購自Shear water聚合物公司)以2mM和20mM之間的濃度溶于20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.3)中。M-SC 5000 PEG與rMETase的摩爾比自10∶1至120∶1變化。
PEG化反應(yīng)在反應(yīng)緩沖液(25mM磷酸鈉緩沖液，pH8.3)中，在20℃進行60分鐘。用終止緩沖液(0.14M磷酸鈉緩沖液，pH6.5)在0℃終止反應(yīng)。然后用30K Amicon Centriprep濃縮器去除未反應(yīng)的M-SC 5000 PEG。用30KAmicon Centriprep濃縮器離心時在0.15氯化鈉和10mM磷酸鈉(pH7.2)中配制最后的PEG-蛋氨酸酶。
PEG-rMETase的體外測試用活性分析，電泳和HPLC分析PEG-rMETase，圖14-16。
活性分析PEG-rMETase的活性是未修飾rMETase的活性的80％至20％之間。
電泳在不變性和SDS-PAGE兩者中對PEG-rMETase進行電泳。
HPLC分析將PEG-rMETase加到凝膠過濾柱上，沒有測到原來的rMETase的峰，只發(fā)現(xiàn)PEG-METASE的峰。保留時間(RT)隨PEG和rMETase分子比的增大而變短。
PEG-rMETase的藥物動力學(xué)將純化的無內(nèi)毒素的PEG-rMETase注入小鼠的尾靜脈。每2小時采集血樣。通過活性分析測定rMETase的水平(圖16)。
實施例16重組蛋氨酸酶的藥效和毒性rMETase對細胞的體外生長抑制在補加有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)KB3-1細胞(人鱗狀上皮細胞癌)。向培養(yǎng)基中加入各種濃度的rMETase。并在37℃，5％CO2條件下溫育。在OD570處測量相對細胞數(shù)。結(jié)果證明rMETase有效抑制細胞生長(圖17)。
rMETase對H460和HT29的體外生長抑制人肺癌細胞H460和人結(jié)腸癌細胞HT29在不同濃度rMETase(0-4單位/ml)中生長4天，然后計數(shù)存活細胞。實試重復(fù)三次。結(jié)果證明rMETase有效抑制H460和HT29兩者的細胞生長(圖25)。
體外比較正常細胞和人癌細胞對rMETase的敏感性用正常人包皮成纖維細胞HS-68和人角化細胞作為對照物，與人結(jié)腸癌SW-620和人肺癌細胞H322m相比較。細胞與不同濃度(0-4單位/ml)rMETase一起生長三天后計數(shù)存活細胞數(shù)。實驗重復(fù)三次。結(jié)果證明SW-620和H322m細胞在rMETase濃度為1單位/ml時死亡，而正常人HS-68細胞仍存活，只是生長速度減慢。正常人包皮成纖維細胞與肺癌細胞相比對rMETase也有小得多的敏感性(圖26)。
裸鼠體內(nèi)rMETase對細胞的生長抑制給Balb/cnu/nu，雌性，八只一組的小鼠注射2×105個細胞。對照生理鹽水。第I組30單位rMETase，第II組100單位rMETase；從第5天至第14天，一天兩次腹腔內(nèi)注射。測量腫瘤大小和體重。第18天取血樣。結(jié)果證明rMETase有效地抑制腫瘤生長而不減輕體重，且對血細胞生成無任何影響(圖18-22)。
裸鼠體內(nèi)rMETase對H460和HT29細胞的生長抑制分別皮下(S.C.)移植，106個H460細胞和HT29細胞，從第2天至第16天通過腹腔內(nèi)注射每天兩次給藥40單位或100單位rMETase。對照組每天兩次腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.2ml。第16天殺死小鼠。結(jié)果證明rMETase有效抑制腫瘤生長而不減輕體重，且不影響血細胞生成。
純化的重組METASE的中試的第一階段臨床試驗患者1，女性，50歲，IV期乳腺癌并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，靜脈內(nèi)輸注10小時給藥10000單位(0.5g)rMETase。
患者2，48歲，女，IV期乳腺癌并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，靜脈內(nèi)輸注24小時給藥5000單位(0.25g)rMETase。
患者3，56歲，女，III期腎癌，靜脈內(nèi)輸入24小時給藥10000單位(0.5g)rMETase。表13。記錄身體檢查，治療前，治療期間每兩小時取血樣，直至輸液完后第48小時(如指明的)。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)進行實驗室測定。
結(jié)果表明，所有患者在輸液開始后rMETase水平立即升高，并在輸液期間保持高水平。一個患者在48小時后蛋氨酸酶水平降回基礎(chǔ)線。結(jié)果表明，輸液開始后rMETase水平立即升高，在10小時時達到最高點。輸液停止后8小時，蛋氨酸酶水平是峰值的50％，且在輸液后16小時仍保持峰值的20％。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)評估實驗室檢查結(jié)果，表明患者1，2或3沒有急性毒性反應(yīng)。表14和15和圖23和24。結(jié)果表明rMETase不引起任何毒性。




序列表<110>抗癌公司(ANTICANCER，INC.)譚玉英(TAN，Yuying)瓦萊利.里什科(LISHKO，Valeriy)<120>蛋氨酸酶在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化學(xué)治療中的應(yīng)用<130>31276-20002.75<140>200410078709.x<141>2004-09-17<150>PCT/US96/09935<151>1996-06-07<150>US 08/486,519<151>1995-06-07<150>US 08/624,541<151>1996-05-03<160>7<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(有義)<400>1gccggtctgt ggaataagct20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(反義)<400>2ccagggtcga ctccagcgcc20<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(有義)<400>3ggaattccat atgcacggct ccaacaagc 29<210>4<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(反義)<400>4agtcatccta ggtcacatca tcatcatcat catggcactc gccttgagtg c51<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(反義)<400>5agtcatccta ggtcaggcac tcgccttgag tgc33<210>6<211>1260<212>DNA<213>惡臭假單胞菌(P.putida)<220>
<221>CDS<222>(48)…(1241)<400>6gccggtctgt ggaataagct tataacaaac cacaagaggc ggttgcc atg cac ggc56Met His Gly1tcc aac aag ctc cca gga ttt gcc acc cgc gcc att cac cat ggc tac 104Ser Asn Lys Leu Pro Gly Phe Ala Thr Arg Ala Ile His His Gly Tyr5 10 15gac ccc cag gac cac ggc ggc gca ctg gtg cca ccg gtc tac cag acc 152Asp Pro Gln Asp His Gly Gly Ala Leu Val Pro Pro Val Tyr Gln Thr20 25 30 35gcg acg ttc acc ttc ccc acc gtg gaa tac ggc gct gcg tgc ttt gcc 200Ala Thr Phe Thr Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gly Ala Ala Cys Phe Ala40 45 50ggc gag cag gcc ggc cat ttc tac agc cgc atc tcc aac ccc acc ctc 248Gly Glu Gln Ala Gly His Phe Tyr Ser Arg Ile Ser Asn Pro Thr Leu55 60 65aac ctg ctg gaa gca cgc atg gcc tcg ctg gaa ggc ggc gag gcc ggg 296Asn Leu Leu Glu Ala Arg Met Ala Ser Leu Glu Gly Gly Glu Ala Gly70 75 80ctg gcg ctg gcc tcg ggc atg ggg gcg atc acg tcc acg cta tgg aca 344Leu Ala Leu Ala Ser Gly Met Gly Ala Ile Thr Ser Thr Leu Trp Thr8590 95ctg ctg cgc ccc ggt gac gag gtg ctg ctg ggc aac acc ctg tac ggc 392Leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Val Leu Leu Gly Asn Thr Leu Tyr Gly100 105110 115tgc acc ttt gcc ttc ctg cac cac ggc atc ggc gag ttc ggg gtc aag 440Cys Thr Phe Ala Phe Leu His His Gly Ile Gly Glu Phe Gly Val Lys120125130ctg cgc cat gtg gac atg gcc gac ctg cag gca ctg gag gcg gcc atg 488Leu Arg His Val Asp Met Ala Asp Leu Gln Ala Leu Glu Ala Ala Met135 140 145
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1.重組宿主細胞，包含編碼蛋氨酸酶的表達模型，該表達模型包含編碼可操作地連接到啟動子序列上的蛋氨酸酶的核苷酸序列，其中所述啟動子序列能夠引導(dǎo)在宿主細胞中蛋氨酸酶的表達，使得蛋氨酸酶的表達是該宿主細胞所產(chǎn)生的總蛋白的5-75％。
2.權(quán)利要求1的重組宿主細胞，其中所述蛋氨酸酶來自產(chǎn)蛋氨酸酶的細菌或真菌。
3.權(quán)利要求2的重組宿主細胞，其中所述蛋氨酸酶來自選自惡臭假單孢菌、陰道毛滴蟲，巴西日本圓線蟲，和梭桿菌屬的細菌或真菌。
4.權(quán)利要求1的重組宿主細胞，其中所述編碼蛋氨酸酶的核苷酸序列如圖8中所示或是其簡并形式。
5.權(quán)利要求4的重組宿主細胞，其中圖8的核酸序列的所述簡并形式包含在所述宿主細胞中更通常使用的一個或多個密碼子。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的重組宿主細胞，其中所述啟動子是RNA聚合酶啟動子。
7.權(quán)利要求6的重組宿主細胞，其中所述啟動子是T7 RNA聚合酶啟動子。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的重組宿主細胞，其為大腸桿菌。
9.權(quán)利要求8的重組宿主細胞，其為大腸桿菌BL 21(DE3)。
10.一種生產(chǎn)蛋氨酸酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求1-9中任一項的重組宿主細胞。
11.一種鑒別表達高含量的蛋氨酸酶的權(quán)利要求1-9中任一項的重組宿主細胞的方法，該方法包括下列步驟在表達蛋氨酸酶的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞；和選擇粉紅色的轉(zhuǎn)化宿主細胞。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述宿主細胞為大腸桿菌。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述宿主細胞是在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的。
14.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述宿主細胞是在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組宿主細胞，包含編碼蛋氨酸酶的表達模型，該表達模型包含編碼操作連接到啟動子序列上的蛋氨酸酶的核苷酸序列，其中所述啟動子序列能夠引導(dǎo)在宿主細胞中蛋氨酸酶的表達，使得蛋氨酸酶的表達是該宿主細胞所產(chǎn)生的總蛋白的5－75％。本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)蛋氨酸酶的方法和鑒別表達高含量的蛋氨酸酶的重組宿主細胞的方法。
文檔編號C12N5/10GK1690193SQ200410078709
公開日2005年11月2日 申請日期1996年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者譚玉英, 瓦萊利·里什科 申請人:抗癌公司