專利名稱：一種以節(jié)桿菌as－1菌株制備的生物制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以節(jié)桿菌AS-1菌株制備的生物制劑及其應(yīng)用，屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙草作為人們吸食的一種嗜好品，煙堿在燃燒過程中揮發(fā)使煙氣呈堿性而產(chǎn)生刺激性氣味，刺激性對煙葉質(zhì)量有負(fù)面效應(yīng)。煙堿含量的高低對煙草產(chǎn)品的質(zhì)量起著相當(dāng)重要的作用，煙葉煙堿含量的高低直接影響到品質(zhì)的好壞，但不同類型煙葉的煙堿含量均有一個適中的指標(biāo)。煙堿含量增加，對煙葉質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響，這就是高品質(zhì)煙葉需要化學(xué)成分協(xié)調(diào)的原因之一。
好的烤煙上部葉在現(xiàn)代混合型卷煙和低焦油烤煙型卷煙葉組配方中起著主導(dǎo)作用，對卷煙香味及其風(fēng)格具有很大貢獻(xiàn)，在國際市場上十分暢銷。相比之下，那些質(zhì)量水平不高、風(fēng)格不突出或不利工業(yè)降本增效的上部煙葉，對煙草工商業(yè)永遠(yuǎn)都沒有吸引力。人們也已經(jīng)看到，在WTO和WHO的影響下，烤煙上部葉將大有用武之地。上部煙葉在可用性上存在的問題首要問題是煙葉煙堿含量過高。因此降低煙葉煙堿含量，有助于提高上部煙葉的可用性、提高吸食安全性、提高國內(nèi)煙葉的市場競爭能力有重要意義。
不同類型煙草、同一類型煙草不同土壤和施肥、灌溉條件等栽培技術(shù)水平對煙葉煙堿的影響不同，煙堿含量也隨葉片著生部位的變化而變化，葉位由下而上煙堿含量逐步提高。目前降低煙堿的途徑為1.調(diào)整煙草生長的環(huán)境條件，應(yīng)用有效的綜合農(nóng)業(yè)措施如適量施用氮磷肥、增加鉀肥的使用量、用石灰和適當(dāng)使用餅肥，調(diào)節(jié)pH值、按煙株生長發(fā)育規(guī)律澆水、適時移栽、依據(jù)實際情況，適時打頂、適當(dāng)留葉、應(yīng)用生長調(diào)節(jié)劑、適熟采收，優(yōu)化調(diào)制條件和利用陳化及發(fā)酵等來綜合降低煙堿含量，該方法存在年度間降煙堿效果不穩(wěn)定、操作環(huán)節(jié)過多、農(nóng)戶分散不易操作等缺點。2.在卷煙中通過提高過濾效率，稀釋煙氣等，這些措施雖然可以任意調(diào)節(jié)煙氣中煙堿，但往往沒有合適的選擇性，使消費者難以接受。3.利用陳化和發(fā)酵降解煙堿以及利用微生物降解倉儲期煙葉煙堿已有報道，已經(jīng)報道能夠降低煙堿的微生物包括Alcaligenes paradoxus爭論產(chǎn)堿菌，Arthrobacter globiformils球形節(jié)桿菌，Arthrobacter nicotianae煙草節(jié)桿菌，Arthrobacter nicotinovorans噬煙堿節(jié)桿菌，Arthrobacter oxydans氧化節(jié)桿菌，Bac illus megaterium巨大芽孢桿菌，Bacillus mycoides蕈狀芽孢桿菌，Bacilluspumilus短小芽孢桿菌，Bacillus subtills枯草芽孢桿菌，Cellulomonas sp.纖維單胞菌，Corynebacterium sp.棒桿菌屬，Enterobacter cloacae陰溝腸桿菌，Micrococcusnicotianae煙草微球菌，Pseudomonas sp.假單胞桿菌，Pseudomonas nicotianae煙草假單胞菌，Pseudomonas putida惡臭假單胞桿菌，Deharyomyces nicotianae，Cunninghamella echinulata刺孢小克汗霉菌，Pellicularia filamentosa絲核薄膜草菌，yeast酵母。但該措施難以解決菌株的使用時期、施用后煙葉水分含量提高容易引起煙葉霉變等問題，工廠中一直沒有采用。隨著人們對煙氣中有害成分的日益關(guān)注，降低煙堿的同時香味仍能為消費者接受，是煙草業(yè)多年來面臨的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于微生物代謝產(chǎn)物降解煙堿的機理，研究和發(fā)現(xiàn)了一種可以降解煙葉煙堿，提高煙葉品質(zhì)的節(jié)桿菌AS-1菌株，采用該菌株經(jīng)過試管種培養(yǎng)、菌種搖床擴大培養(yǎng)、種子罐、發(fā)酵罐液體發(fā)酵后，制備成一種能降低煙草煙堿含量但并不影響煙葉感官質(zhì)量的生物制劑。
本發(fā)明的生物制劑，由生產(chǎn)菌株經(jīng)液體發(fā)酵生產(chǎn)方法制備。其中1、生產(chǎn)菌株為節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)AS-1，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.1281、保藏日為2004年12月28日；該菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，G+，好氧，不形成芽孢，接觸酶陽性，不分解纖維素，認(rèn)為該菌株屬于節(jié)桿菌屬。
節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)AS-1系本發(fā)明人于2004年發(fā)現(xiàn)的一個菌株。該菌株從云南賓川采集正常新鮮煙葉樣品，經(jīng)過常規(guī)的系列稀釋涂布于NA培養(yǎng)基上分離得到，該菌株經(jīng)常規(guī)的體外煙堿測定，發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低煙堿的含量，使含煙堿的培養(yǎng)基由白色變?yōu)樗{(lán)色。
2、液體發(fā)酵生產(chǎn)制備生物制劑的過程為菌劑的制備(1)試管培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基，將該菌種接種在試管斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1-2天。
(2)搖瓶培養(yǎng)采用NA液體培養(yǎng)基，將上述試管中培養(yǎng)菌接種在灌裝液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于搖床30℃振蕩培養(yǎng)1-2天。
液體發(fā)酵生產(chǎn)過程包括試管種培養(yǎng)、菌種搖床擴大培養(yǎng)、種子罐、發(fā)酵罐液體發(fā)酵制備生物制劑；其中a.試管種培養(yǎng)為將Arthrobacter sp.AS-1的菌體接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為1000毫升蒸餾水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃下培養(yǎng)1-2天，獲得試管種；b.菌種搖床擴大培養(yǎng)為將斜面種子接種到三角瓶液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為1000毫升蒸餾水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃、轉(zhuǎn)速200-300rpm的搖床培養(yǎng)16-20小時；c.液體種子罐發(fā)酵為將搖床擴大的菌種按0.5-2％的比例接種于不同容量的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基配方為搖床擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)溫度為28-30℃，培養(yǎng)時間為16-20小時；d.液體發(fā)酵罐制備生物制劑為將經(jīng)種子罐發(fā)酵逐級擴大的菌種按1-3％的比例接種于不同容量的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基配方為菌種搖床擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)溫度為28-30℃，pH7.0-7.2，培養(yǎng)時間為24-48小時，當(dāng)發(fā)酵液中細(xì)菌數(shù)量達(dá)到7.0×108個/ml時，得到生物制劑。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1.發(fā)酵周期短，節(jié)約能源、生產(chǎn)成本低；2.微生物來自煙田土壤，對植物和人畜無害，易生產(chǎn)、耐儲存，易于產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，可操作性強；3.能降堿增香，提高煙草的品質(zhì)，且降煙堿效果并不影響煙葉感官質(zhì)量。
具體實施例方式實施例1(用于烤煙煙葉)本發(fā)明的生物制劑，由生產(chǎn)菌株(Arthrobacter sp.)AS-1菌株，按液體發(fā)酵生產(chǎn)方法制備。具體制備過程及條件與發(fā)明內(nèi)容描述部分相同。
本發(fā)明的生物制劑的應(yīng)用將成熟好的煙葉按部位(中、上部)采收，進(jìn)入烤房前用本發(fā)明的生物制劑按5％的量(生物制劑在稀釋液中的含量)均勻噴淋在煙葉的中、上部，然后編桿入爐，按常規(guī)方法烘烤。烘烤后的煙葉經(jīng)測定表明，本發(fā)明的生物制對上部煙葉的煙堿降解率達(dá)34.68％，對中部煙葉的煙堿降解率達(dá)36.86％。
烤煙煙葉感官質(zhì)量評吸結(jié)果表明，采用本發(fā)明的生物制劑處理后，煙葉勁頭明顯下降，香氣量明顯提高，香氣質(zhì)有所改善，刺激性明顯減弱，雜氣明顯減輕(枯焦氣、粉雜氣)，口感好于對照。
實施例2(用于白肋煙煙葉)本發(fā)明的生物制劑，由生產(chǎn)菌株(Arthrobacter sp.)AS-1菌株，按液體發(fā)酵生產(chǎn)方法制備。具體制備過程及條件與發(fā)明內(nèi)容描述部分相同。
本發(fā)明的生物制劑的應(yīng)用將砍收好的煙株進(jìn)入晾房，晾制一周后，用本發(fā)明的生物制劑按5％的量(生物制劑在稀釋液中的含量)均勻噴淋在白肋煙上、中、下部位，按常規(guī)方法晾制。晾制后的白肋煙經(jīng)測定表明，本發(fā)明的生物制劑對上部白肋煙葉的煙堿降解率達(dá)46.56％、對中部白肋煙葉的煙堿降解率達(dá)51.82.％，對下部白肋煙葉的煙堿降解率達(dá)54.63％。
白肋煙煙葉感官質(zhì)量評吸結(jié)果表明，采用本發(fā)明的生物制劑處理后，煙葉勁頭明顯下降，香氣量明顯提高，香氣質(zhì)有所改善，刺激性明顯減弱，感官評吸質(zhì)量好于CK對照。
權(quán)利要求
1.一種以節(jié)桿菌AS-1菌株制備的生物制劑，由生產(chǎn)菌株按液體發(fā)酵生產(chǎn)方法制備，其特征在于該生物制劑的生產(chǎn)菌株為節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)AS-1菌株，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.1281；液體發(fā)酵生產(chǎn)制備生物制劑的過程為(1).液體發(fā)酵生產(chǎn)過程包括試管種培養(yǎng)、菌種搖床擴大培養(yǎng)、種子罐發(fā)酵、發(fā)酵罐液體發(fā)酵制備生物制劑；其中a.試管種培養(yǎng)為將Arthrobacter sp.AS-1的菌體接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為1000毫升蒸餾水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃下培養(yǎng)1-2天，獲得試管種；b.菌種搖床擴大培養(yǎng)為將斜面菌種接種到三角瓶液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為1000毫升蒸餾水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃、轉(zhuǎn)速200-300rpm的搖床培養(yǎng)16-20小時；c.液體種子罐發(fā)酵為將搖床擴大的菌種按0.5-2％的比例接種于不同容量的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基配方為搖床擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)溫度為28-30℃，培養(yǎng)時間為16-20小時；d.液體發(fā)酵罐制備生物制劑為將經(jīng)種子罐發(fā)酵逐級擴大的菌種按1-3％的比例接種于不同容量的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基配方為菌種搖床擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)溫度為28-30℃，pH7.0-7.2，培養(yǎng)時間為24-48小時，當(dāng)發(fā)酵液中細(xì)菌數(shù)量達(dá)到7.0×108個/ml時，得到生物制劑。
2.權(quán)利要求1所述的以節(jié)桿菌AS-1菌株制備的生物制劑，用于煙草降堿增香、提高煙草的品質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以節(jié)桿菌AS－1菌株制備的生物制劑及其應(yīng)用，屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。本生物制劑的生產(chǎn)菌株為節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)AS－1菌株，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.1281；該生物制劑由試管種培養(yǎng)、菌種搖床擴大培養(yǎng)、種子罐、發(fā)酵罐液體發(fā)酵工序制備。菌種接種量為0.5－2％，采用的培養(yǎng)基配方為(W/V)牛肉膏0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，pH6.8－7.2?？刂瓢l(fā)酵溫度在28－30℃，pH7.0－7.2，種子罐發(fā)酵為16－20小時，發(fā)酵罐發(fā)酵時間為24－48小時，當(dāng)發(fā)酵液中細(xì)菌數(shù)量達(dá)到7.0×10
文檔編號C12N1/20GK1654632SQ200410079650
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者雷麗萍, 李梅云, 鄧建華, 崔國民, 高家合, 楊樹軍, 李云華 申請人:云南省煙草科學(xué)研究所