專利名稱：針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素Rantes－DT390的質(zhì)粒及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異攻擊并殺傷活化的Th1細(xì)胞的新型重組免疫毒素質(zhì)粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是將生物毒素與導(dǎo)向載體(抗體或細(xì)胞因子)連接起來構(gòu)成的雜合分子，又稱生物導(dǎo)彈或?qū)蚨舅?。最早的免疫毒?即第一代免疫毒素)是載體與毒素分子的化學(xué)偶聯(lián)物，這類免疫毒素免疫原性強(qiáng)、分子量大、滲透性差、在靶部位很難形成有效的濃度、穩(wěn)定性及均一性較差，毒副作用較強(qiáng)、難以大規(guī)模生產(chǎn)，從而限制了其應(yīng)用。隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的不斷發(fā)展，近年來人們通過基因重組技術(shù)對免疫毒素進(jìn)行了改進(jìn)，導(dǎo)向載體已由以前的單克隆抗體變成了基因工程抗體和一些配體等，生物毒素的品種更加多樣，在不影響其毒性作用的同時(shí)減小了其分子量大小。這種新工藝產(chǎn)生的新型免疫毒素穩(wěn)定性強(qiáng)、滲透性好、具有更好的導(dǎo)向特異性、且制備時(shí)簡單易行、可短期內(nèi)大量制備，在很大程度上彌補(bǔ)了第一代免疫毒素穩(wěn)定性差、半衰期短、免疫原性強(qiáng)等不足，極大地推動了免疫毒素在相關(guān)領(lǐng)域的深入研究。
有關(guān)免疫毒素在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，主要都集中于對某些惡性腫瘤及與免疫相關(guān)的人類疾病的導(dǎo)向治療。在惡性腫瘤的研究中，如血液系統(tǒng)腫瘤(白血病、復(fù)發(fā)性淋巴瘤等)、黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌、腦瘤等疾病，利用免疫毒素治療已取得了很大的進(jìn)展，有些已經(jīng)進(jìn)入臨床I、II、III期試驗(yàn)。這些免疫毒素的作用靶點(diǎn)主要是選擇針對T細(xì)胞表面抗原或細(xì)胞因子受體，如CD3、CD4、IL-2等，在接受這些免疫毒素的治療后，相應(yīng)的自身免疫性疾病或GvHD病情雖有減退，但毒副作用也較顯著，甚至使臨床治療被迫終止。產(chǎn)生毒副作用的主要原因之一是由于這類免疫毒素所選擇的導(dǎo)向分子特異性欠佳，往往導(dǎo)致殺傷許多其他無關(guān)細(xì)胞。自身免疫性疾病(Autoimmune Disease)是一類免疫相關(guān)的疾病，產(chǎn)生這類疾病的主要原因是由于各種刺激因素導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對自身抗原發(fā)起攻擊，造成自身組織損傷和功能障礙。目前的治療措施主要是采用各種非特異的免疫抑制劑，但往往使患者免疫系統(tǒng)受到普遍性抑制而導(dǎo)致感染、腫瘤的發(fā)生及骨髓抑制等，且不能有效地防止疾病的復(fù)發(fā)。因而促使相關(guān)領(lǐng)域的研究者從免疫治療的角度，尋求一種特異、安全、有效的治療方法如MHC阻斷法、CD4分子阻斷法、TCR阻斷法、細(xì)胞因子治療、T細(xì)胞接種以及口服抗原誘導(dǎo)耐受等等，但這些方法或因特異性不高、療效不穩(wěn)定，或因技術(shù)難度大、難以克服的毒副作用等而不能順利地過渡到臨床(見Waldor MK，et al.Science.1985，227415；Chen Y，etal.Nature.1995，376177；Weiner HL，Immunology Today.1997，18355；HolldaySD，et al.Environmental Health Perspectives.108 Suppl 3463-73，2000 Jun；Palmisano GL，et al.Clinical & Experimental Immunology.135(2)259-66，2004Feb；)，因而自身免疫性疾病的治療至今仍然是困擾臨床的一大難題。
隨著基礎(chǔ)免疫學(xué)的研究進(jìn)展，人們認(rèn)識到識別自身抗原的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，實(shí)際上是由CD4+TH1細(xì)胞所承擔(dān)的，而CD4+TH2僅具有一定的調(diào)節(jié)作用(見Lib lau RS，et al.Immunol.Today；1995，1634；Costa GL，et al.J.Immunol.2000，1643581)。由此提示，如果能利用特異性更高的免疫毒素只將這些活化的自身反應(yīng)性TH1細(xì)胞殺死，而不影響TH2細(xì)胞，則有可能彌補(bǔ)上述缺陷，可治療自身免疫性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種新型的特異攻擊Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒，為臨床治療自身免疫性疾病提供一種新方案，為重組免疫毒素的應(yīng)用開辟一條新途徑。
本發(fā)明所述的針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。此種質(zhì)粒由Rantes cDNA堿基序列(來自gene bank)和白喉毒素的活性片段DT390 cDNA堿基序列(來自gene bank)連接而成。Rantes是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答的過程中，活化的T細(xì)胞將表達(dá)多種受體，如細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IL-18的受體以及多種化學(xué)趨化因子CCR-5，CXCR-3等的受體。這些T細(xì)胞的膜受體中，現(xiàn)已證實(shí)Rantes受體的表達(dá)僅限于活化的Th1細(xì)胞，而Th2細(xì)胞沒有表達(dá)，并且這種膜受體的表達(dá)是穩(wěn)定和持續(xù)的(見Karlsson I，et al.Journal of Virology，2004Nov，78(21)11807-15；Emingil G，et al.Journal of Clinical Periodontology.2004Oct，31(10)829-34.)。因此，Rantes受體不僅可以作為識別Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的標(biāo)志，也為相關(guān)的免疫治療提供了一個(gè)理想的靶位。本發(fā)明選用Rantes為導(dǎo)向分子，白喉毒素的活性片段DT390為毒素分子，構(gòu)建Rantes-DT390重組免疫毒素質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入體內(nèi)，表達(dá)重組免疫毒素，可特異攻擊并殺傷活化的Th1細(xì)胞，誘導(dǎo)自身免疫耐受，從而解決了原有免疫毒素特異性欠佳、需要提純的問題，實(shí)現(xiàn)有效治療自身免疫性疾病的目的。因此，本發(fā)明所述的針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)?？稍谥苽渲委熁蝾A(yù)防自身免疫性疾病的藥中應(yīng)用。
本發(fā)明所述針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒的制備方法依次包括以下步驟1、通過RT-PCR反應(yīng)，獲得Rantes基因；2、將上述擴(kuò)增的Rantes基因片段插入到含有DT390片段的真核質(zhì)粒中，即構(gòu)建成重組質(zhì)粒。再轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；3、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析，以保證重組質(zhì)粒中Rantes插入片段的正確性；4、通過蛋白合成抑制實(shí)驗(yàn)測定重組免疫毒素質(zhì)粒的表達(dá)活性。
上述制備方法中，構(gòu)建重組質(zhì)粒可選用的真核質(zhì)粒載體為SRα或pSecTag2。
本發(fā)明所述的新型免疫毒素質(zhì)粒及其制備方法具有以下有益效果1.選擇新型細(xì)胞因子Rantes為導(dǎo)向分子，由于Rantes受體只表達(dá)在活化的Th1細(xì)胞表面，Th2細(xì)胞表面沒有表達(dá)，因而由Rantes導(dǎo)向的重組免疫毒素只針對Th1細(xì)胞，從而使導(dǎo)向攻擊更特異、更有效，減少臨床應(yīng)用的毒副作用。
2.毒素分子選用的是白喉毒素的活性片段DT390，是細(xì)菌毒素的跨膜結(jié)構(gòu)域和酶性結(jié)構(gòu)域，去除了DT分子的細(xì)胞結(jié)合區(qū)，可進(jìn)一步減少非特異性結(jié)合和降低不良反應(yīng)。
3.通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染活體肌肉細(xì)胞的方法，將免疫毒素Rantes-DT390的質(zhì)粒直接導(dǎo)入動物肌肉，使免疫毒素Rantes-DT390在骨骼肌內(nèi)高效表達(dá)而起到治療作用。
4.免疫毒素質(zhì)粒是通過DNA重組技術(shù)來獲得的，它可直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞而表達(dá)重組免疫毒素，勿需進(jìn)一步提純免疫毒素蛋白質(zhì)。同時(shí)避免了原來化學(xué)偶聯(lián)免疫毒素復(fù)雜的制備工藝和難以標(biāo)化的缺點(diǎn)，使其更易產(chǎn)業(yè)化。
5.免疫毒素Rantes-DT390亦可用于移植排斥反應(yīng)及某些腫瘤的防治。


圖1是本發(fā)明所述針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素Rantes-DT390質(zhì)粒的一種示意圖，真核質(zhì)粒載體為SRα；圖2是本發(fā)明所述重組免疫毒素Rantes-DT390對活化T細(xì)胞的蛋白合成抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；
圖3是本發(fā)明所述重組免疫毒素Rantes-DT390治療組與對照組的臨床評分圖；圖4是流式細(xì)胞儀測定本發(fā)明所述重組免疫毒素Rantes-DT390對活化T、Th1、Th2和B細(xì)胞的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
圖中，1-1-DT390、1-2-Rantes、1-3-SRα真核質(zhì)粒、3-1-未治療組、3-2-治療組。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1重組免疫毒素真核質(zhì)粒的制備載體選用含有DT390的SRα真核質(zhì)粒(由美國Wisconsin大學(xué)PhD.Hu Huaizhong提供，invitrogen公司)，具體步驟如下1、小鼠Rantes基因的預(yù)處理(以下試劑均購于promega公司)(1)用Trizol試劑按以下步驟提取小鼠肝總RNA1)小鼠肝組織100mg。
2)加1mlTrizol。
3)勻漿。
勻漿要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管，組織勻漿量＞100mg時(shí)分裝，1ml/每EP管。
4)顛倒混勻10下，室溫5分鐘。
5)加氯仿1/5體積(0.2ml，必須按總體積的1/5)。
6)顛倒混勻10下，室溫5分鐘。
7)離心12000g，4℃，15分鐘。
8)轉(zhuǎn)上層水相(約400μl)于另一1.5mlEP管中。
9)加等體積異丙醇(約400μl)，混勻室溫10分鐘。
10)離心12000g，4℃，10分鐘。
11)棄上清。
12)加冰預(yù)冷的75％乙醇(用DEPC水配)1ml。
13)離心7500g，4℃，5分鐘。
14)棄上清，空氣干燥5-10分鐘(不能完全干燥)。
15)溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)(可在55-60℃水中，＜10分鐘，助溶)。
(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依次按以下步驟進(jìn)行1)按下表配備試劑(稀釋10倍后用)。
試劑 濃度(μg/μl)體積(μl)RNA11.5Oligo(dT)150.0522)混勻，離心，70℃，5min。
3)立即冰水浴，稍離心。
4)按下表配備試劑試劑 濃度 體積(μl)終濃度M-MLV Buffer 5×41×dNTP 10mM10.5mMRNasin40U/μl 0.5 20UM-MLV 200U/μl1200UddH2O13.55)混勻，離心，42℃，60min。
6)95℃，10min(破壞MLV)。
7)4℃保存(3)cDNA的PCR反應(yīng)反應(yīng)體系試劑 濃度 體積(μl)Taq Buffer 10×2MgCl225mM 1.2dNTP 10mM 0.2上游引物 12.5pmol/μl 0.5下游引物 12.5pmol/μl 0.5cDNA模板 2ddH2O 13.3Taq酶2.5U/μl 0.3
PCR擴(kuò)增的引物上游5′-CAT GCC ATG GGC CTC ACC ATA TGG CTC GGA C-3′下游5′-CCG GAA TTC CTA GCT CAT CTC CAA ATA GTT-3′PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性3min，94℃變性35sec、58℃復(fù)性30sec、72℃延伸55sec，34個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。
(4)擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳分析2、重組免疫毒素SRα真核表達(dá)質(zhì)粒的預(yù)處理(1)用限制性內(nèi)切Nco I及EcoRI雙酶切SRα真核質(zhì)粒，反應(yīng)體積20μl(其中含有NcoI酶1μl、EcoRI酶1μl、10×NEbuffer22μl、SRα真核質(zhì)粒10μl、ddH2O6μl)，37℃過夜(內(nèi)切酶均購自New England公司)；(2)反應(yīng)后用1％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈照射下，按膠回收試劑盒(購自O(shè)miga公司)的方法回收大片段。
3、Rantes與SRα真核表達(dá)質(zhì)粒的連接及轉(zhuǎn)化(1)將上述步驟中所獲得的載體片段及插入片段粗略定量后，按插入片段載體分子摩爾數(shù)比＝3～10∶1的連接反應(yīng)原則進(jìn)行連接實(shí)驗(yàn)；(2)反應(yīng)體系如下表，整個(gè)反應(yīng)過程在PCR儀中16℃過夜。連接反應(yīng)時(shí)應(yīng)分別設(shè)立無插入片段和無載體的對照管。使上述擴(kuò)增的Rantes基因片段插入到含有DT390片段的SRα真核質(zhì)粒中，Rantes基因片段與DT390片段通過Nco I酶切位點(diǎn)連接，與SRα真核質(zhì)粒通過EcoR I酶切位點(diǎn)連接，連接酶為T4DNA，所構(gòu)建成的重組質(zhì)粒見圖1。
試劑體積(μl)ddH2O 1110×buffer 2Rantes 2SRα 4T4DNA ligase1Total Volume20(3)將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法按《分子克隆操作指南》進(jìn)行，主要步驟如下A、取連接產(chǎn)物4μl加入感受態(tài)細(xì)胞30μl置于1.5ml Ep管中，陰性對照為感受態(tài)細(xì)胞30μl置于1.5ml Ep管中；B、置于冰上30min，每隔幾分鐘輕彈；C、42℃水浴30Sec；D、冰上放置3min；E、加0.3ml SOC培養(yǎng)基(10ml SOC+50μl 2mol/L Mgcl2)，置于冰上；F、37℃，250rpm振搖1小時(shí)；G、取50μl轉(zhuǎn)化細(xì)胞+5μl 0.1g/ml Amp，均勻涂布于含Amp的平板，置37℃孵箱培養(yǎng)過夜。
4、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析，以保證重組質(zhì)粒中Rantes插入片段的正確性。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
5、重組免疫毒素(Rantes-DT390)真核質(zhì)粒在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)(1)在轉(zhuǎn)染前24h，將NIH3T3細(xì)胞(購自invitrogen公司)接種于六孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞約1×106，置于37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)；(2)待細(xì)胞長滿至約80-90％融合后，分別以SRα空質(zhì)粒及Rantes-DT390 SRα質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞NIH-3T3，具體操作按Qiagen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒中的說明書進(jìn)行；(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后72h，收集細(xì)胞。將變性后的蛋白質(zhì)marker和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞裂解上清液在5％的濃縮膠和10％的分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳；(4)電泳完備后，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，電轉(zhuǎn)移后的膜用封閉液(約10％的PBS脫脂奶粉)封閉處理2h，再加入Rantes多克隆抗體應(yīng)用液作用1h，充分洗滌后再加入酶標(biāo)二抗兔抗羊IgG，作用1h。最后加底物顯色。
實(shí)施例2體外重組免疫毒素Rantes-DT390的生物活性測定1、蛋白合成抑制試驗(yàn)(1)在無菌操作臺上取小鼠脾臟，獲得脾細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶(約10×106個(gè)細(xì)胞/ml)，加入conA(10ug/ml)混合培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)3天后，收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/ml；(3)轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(培養(yǎng)液為不含亮氨酸的DMEM培養(yǎng)基)，分別將上述轉(zhuǎn)染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀釋的濃度加入，50μl/孔，各濃度設(shè)立三復(fù)孔；(4)繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入3H亮氨酸10μl(5μci/ml)，2h后收集細(xì)胞，液閃測定并計(jì)算蛋白合成抑制率(有關(guān)結(jié)果如圖2所示)。由此表明，重組免疫毒素Rantes-DT390對活化T細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞抑制效應(yīng)。
2、流式細(xì)胞儀測定其細(xì)胞毒性(1)在無菌操作臺上取小鼠脾臟，用RPMI1640培養(yǎng)基制成脾細(xì)胞懸液，與conA(10ug/ml)混合培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)3天后，加入上述轉(zhuǎn)染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀釋的濃度，50μl/孔，各濃度設(shè)立三復(fù)孔；(3)繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定免疫毒素Rantes-DT390分別對活化T、Th1、Th2細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞毒性(CD4+T細(xì)胞膜表面標(biāo)記；IFN-γTh1細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記；IL-4Th2細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記；CD19+B細(xì)胞膜表面標(biāo)記)；(4)流式細(xì)胞儀測定結(jié)果顯示，T細(xì)胞及Th1細(xì)胞數(shù)目下降40％-60％，而對Th2及B細(xì)胞無此影響(如圖4所示)。由此表明重組免疫毒素Rantes-DT390具有良好的靶向特異性。
實(shí)施例3重組免疫毒素Rantes-DT390真核質(zhì)粒對自身免疫性疾病動物模型EAE(experimental allergic encephalomyelitis)的初步治療效果1、EAE(Experimental Allergic Encephalomyelitis)動物模型的建立根據(jù)常規(guī)方法用C57BL/6小鼠建立EAE模型。
(1)用C57BL/6小鼠建立EAE動物模型，將自提的MBP粗提液與FCA(內(nèi)含結(jié)核分枝桿菌5mg/ml)等體積混和，使用3ml注射器反復(fù)推拉成為油包水的乳劑，采用腹腔注射的方法。
(2)免疫劑量每只小鼠注射MBP∶FCA(1∶1)混和液0.4ml，百日咳桿菌菌液∶PBS(1∶50)混和液0.2ml(內(nèi)含百日咳桿菌0.6-1.8×106個(gè))。
(3)對照組每只小鼠腹腔注射百日咳桿菌菌液與PBS混和液0.2ml(內(nèi)含百日咳桿菌0.6-1.8×106個(gè))。
(4)免疫時(shí)間第1天、第7天免疫兩次。
2.重組質(zhì)粒對EAE模型的初步治療
(1)用Rantes-DT390重組質(zhì)粒對EAE動物模型進(jìn)行治療試驗(yàn)治療時(shí)間在MBP免疫小鼠后第1天、第3天分別治療2次；治療方法使用陽離子脂質(zhì)體包被的Rantes-DT390重組質(zhì)粒，采用試驗(yàn)小鼠大腿肌肉注射的方式；治療劑量50μg/只。
(2)觀察治療后治療組及未治療組的癥狀表現(xiàn)，根據(jù)臨床評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分(Kono分級法)，具體為0分沒有任何臨床癥狀；1分動物尾部無力；2分動物尾部無力+前肢或后肢中等無力；3分前肢或后肢嚴(yán)重?zé)o力，人為翻身后不能恢復(fù)；4分肢體麻痹，人為翻身后不能恢復(fù)；5分瀕死狀態(tài)(有關(guān)結(jié)果如圖3所示)。
SEQUENCE LISTING<110>四川大學(xué)<120>針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素Rantes-DT390的質(zhì)粒及制備方法與應(yīng)用<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1386<212>DNA<213>小鼠<400>1ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa tcttttgtga tggaaaactt tgctagctac60cacgggacta aacctggtta tgtagattcc attcaaaaag gtatacaaaa gccaaaatct120ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg aaagggtttt atagtaccga caataaatac180gacgctgcgg gatactctgt agataatgaa aacccgctct ctggaaaagc tggaggcgtg240gtcaaagtga cgtatccagg actgacgaag gttctcgcac taaaagtgga taatgccgaa300actattaaga aagagttagg tttaagtctc actgaaccgt tgatggagca agtcggaacg360gaagagttta tcaaaaggtt cggtgatggt gcttcgcgtg tagtgctcag ccttcccttc420gctgagggga gttctagcgt tgaatatatt aataactggg aacaggcgaa agcgttaagc480gtagaacttg agattaattt tgaaacccgt ggaaaacgtg gccaagatgc gatgtatgag540tatatggctc aagcctgtgc aggaaatcgt gtcaggcgat cagtaggtag ctcattgtca600tgcataaatc ttgattggga tgtcataagg gataaaacta agacaaagat agagtctttg660aaagagcatg gccctatcaa aaataaaatg agcgaaagtc cggccaaaac agtatctgag720gaaaaagcta aacaatacct agaagaattt catcaaacgg cattagagca tcctgaattg780tcagaactta aaaccgttac tgggaccaat cctgtattcg ctggggctaa ctatgcggcg840tgggcagtaa acgttgcgca agttatcgat agcgaaacag ctgataattt ggaaaagaca900
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1.一種針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素基因，其特征在于它具有序列表中SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列。
2.一種針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
3.一種權(quán)利要求2所述的針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟(1)通過RT-PCR反應(yīng)，獲得Rantes基因；(2)將上述擴(kuò)增的Rantes基因片段插入到含有DT390片段的真核質(zhì)粒中構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增，然后篩選出含有正確插入片段的克??；(3)利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析；(4)通過蛋白合成抑制實(shí)驗(yàn)測定重組免疫毒素質(zhì)粒的表達(dá)活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒的制備方法，其特征在于構(gòu)建重組質(zhì)?？蛇x用的真核質(zhì)粒載體為SRα或pSecTag2。
5.權(quán)利要求2所述的針對活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒在制備治療或預(yù)防自身免疫性疾病的藥中的應(yīng)用。
全文摘要
一種針對活化Th1細(xì)胞的新型重組免疫毒素質(zhì)粒，以趨化因子Rantes為導(dǎo)向分子、白喉毒素的活性片段DT390為毒素分子，通過基因重組構(gòu)建而成。該免疫毒素質(zhì)粒的制備方法包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌的制備等步驟。該免疫毒素質(zhì)粒具有嚴(yán)格的靶向性，可以通過Rantes的導(dǎo)向作用，以DT390特異性攻擊活化的Th1細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性免疫耐受，從而避免了無選擇性地殺傷所有T細(xì)胞。特別適用于自身免疫性疾病和器官移植排斥反應(yīng)的防治，亦可應(yīng)用于某些腫瘤的治療。
文檔編號C12N15/11GK1641023SQ200410081390
公開日2005年7月20日 申請日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日
發(fā)明者張 林, 賈怡, 李虹, 陳文捷, 李明遠(yuǎn) 申請人:四川大學(xué)