專利名稱：一種表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體及其應(yīng)用，特別是涉及一種表達(dá)載體及利用該載體生產(chǎn)外源蛋白的方法。
背景技術(shù)：
目前，7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是半合成頭孢菌素的重要原料。7-ACA主要由頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通過酶法或傳統(tǒng)的化學(xué)法裂解脫去7-位的D-α-氨基己二酰側(cè)鏈得到。酶法具有工藝簡單、安全、高效、無污染及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比具有較大的競爭優(yōu)勢，因而用酶法裂解頭孢菌素C生產(chǎn)7-ACA以成趨勢。用酶法裂解生產(chǎn)7-ACA，分為一步酶法和兩步酶法(圖1)一步酶法是利用頭孢菌素C?；?Cephalosporin C acylase)直接催化頭孢菌素C，脫去7-位的D-α-氨基己二酰側(cè)鏈，生成7-ACA，雖然該法步驟簡單，但目前已知的CPC?；傅拿富钶^低，無法滿足工業(yè)催化的需要；兩步酶法是利用來源不同的兩種酶進(jìn)行兩步催化反應(yīng)，首先，頭孢菌素C在D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAAO)的作用下，生成一個具有酮基的中間體，此中間體較不穩(wěn)定，易被同時生成的H2O2氧化為戊二?；?7-氨基頭孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid，GL-7-ACA)，然后其在GL-7-ACA?；傅淖饔孟旅撊?cè)鏈，生成7-ACA。
產(chǎn)生GL-7-ACA酰化酶的菌株大多為假單胞菌(Pseudomonas sp.)，可把具有催化GL-7-ACA生成7-ACA活性的酶分為5類，同類酶的基因都具有95％以上的同源性，且酶學(xué)性質(zhì)幾乎完全相同。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們越來越重視用基因工程的方法來生產(chǎn)酶和改造酶。羅暉等(羅暉等，產(chǎn)GL-7-ACA?；钢亟M大腸桿菌的構(gòu)建和表達(dá)，微生物學(xué)通報，2004，31(4)，38-42)使用了一種快速獲取基因的方法，經(jīng)過微生物選擇性培養(yǎng)和特異性PCR擴(kuò)增的方法從自然界中快速獲取了GL-7-ACA?；富?，并構(gòu)建了基因工程菌BL21(DE3)/pET-Acy，實(shí)現(xiàn)了GL-7-ACA?；傅目寺∨c表達(dá)。
在用GL-7-ACA?；复呋疓L-7-ACA生產(chǎn)7-ACA的研究中，人們通常是先對菌株進(jìn)行培養(yǎng)和表達(dá)，然后進(jìn)行酶的分離純化和酶的固定化，最后將固定化酶與DAAO固定化酶混合起來一步催化CPC或分兩步進(jìn)行催化。長久以來，人們研究的重點(diǎn)都集中在提高酶的活力和穩(wěn)定性上，而對酶的提取工藝和催化工藝進(jìn)行改進(jìn)的研究相對較少。
噬菌體分為溫和噬菌體和烈性噬菌體。烈性噬菌體感染細(xì)胞后可立即在宿主細(xì)胞內(nèi)開始自身的生命循環(huán)，引起細(xì)胞的裂解；溫和噬菌體感染細(xì)胞后，細(xì)菌可不被裂解而繼續(xù)生長繁殖，成為溶源性細(xì)菌。在溶源性細(xì)菌中，噬菌體的DNA被整合到細(xì)菌的染色體上，與細(xì)菌的染色體一起復(fù)制，且隨細(xì)胞的分裂傳給子代細(xì)胞，使其子代細(xì)胞也成為溶源性細(xì)胞。當(dāng)需要細(xì)胞裂解時，可通過改變外界環(huán)境條件如紫外照射、提高環(huán)境溫度或添加化學(xué)試劑等來誘導(dǎo)宿主細(xì)胞，使噬菌體的DNA從宿主細(xì)胞的染色體上脫落下來，并在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制，開始自身的生命循環(huán)，從而達(dá)到裂解宿主細(xì)胞的作用。
將噬菌體的DNA整合到E.coli的染色體上以獲得溶源菌，利用溶源菌中的噬菌體來破細(xì)胞壁，使胞內(nèi)積累的蛋白質(zhì)釋放的破壁方法具有破壁效率高、可控、操作條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，具有潛在的應(yīng)用價值。在研究感染了λ噬菌體的E.coli的裂解時發(fā)現(xiàn)，對細(xì)胞起裂解作用的主要是λ噬菌體DNA上裂解基因所編碼的酶。λ噬菌體的裂解基因包括S、R和Rz三個基因，其中R基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種可溶于水的轉(zhuǎn)糖基酶(transglycosylase)，可分解細(xì)胞壁的肽聚糖。該酶與真正的溶菌酶的不同之處在于它可以引起肽鍵水解，而溶菌酶卻只使肽聚糖上相鄰的N-乙酰氨基葡萄糖殘基間裂開。Rz基因表達(dá)產(chǎn)物可能是一種肽鏈內(nèi)切酶(endopeptidase)，它可以切割肽聚糖的寡糖之間和/或肽聚糖與細(xì)胞壁外膜之間的交聯(lián)。R和Rz基因表達(dá)產(chǎn)物的功能是降解細(xì)胞壁，而S基因表達(dá)產(chǎn)物的作用是改變細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，在細(xì)胞質(zhì)膜上形成多孔的結(jié)構(gòu)，以使R和Rz基因表達(dá)產(chǎn)物穿過細(xì)胞質(zhì)膜到達(dá)細(xì)胞壁，從而作用于細(xì)胞壁。
當(dāng)用含有琥珀突變?nèi)毕菪蚐基因的裂解基因S-RRz代替SRRz時，在誘導(dǎo)S-RRz表達(dá)后，細(xì)胞不被裂解而繼續(xù)正常生長，并且可以在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)積累基因R和Rz表達(dá)產(chǎn)生的酶。但是，當(dāng)在誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入2％(v/v)CH3Cl，或?qū)⒄T導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞經(jīng)凍融處理，則可以使細(xì)胞裂解。根據(jù)前面對S、R和Rz三個基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞裂解中不同作用的分析，認(rèn)為此時細(xì)胞的裂解是依賴S基因的。加入CH3Cl和凍融處理的作用相當(dāng)于S基因表達(dá)產(chǎn)物的功能，即破壞細(xì)胞質(zhì)膜，讓R和Rz產(chǎn)生的酶到達(dá)細(xì)胞的肽聚糖層。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可調(diào)控宿主細(xì)胞裂解的表達(dá)載體。
本發(fā)明所提供的表達(dá)載體是在啟動子下游含有S-RRz基因的表達(dá)質(zhì)粒。
所述S-RRz基因可具有序列表中序列2的核苷酸序列。
其中，用于構(gòu)建所述表達(dá)載體的出發(fā)載體可為基因工程領(lǐng)域中的質(zhì)粒表達(dá)載體，如pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD等；優(yōu)選為pET28a。
由本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建的外源蛋白表達(dá)載體、細(xì)胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明還提供了利用該表達(dá)載體生產(chǎn)外源蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)外源蛋白的方法，是先將外源基因插入上述表達(dá)載體得到外源基因表達(dá)載體，再將該外源基因表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)并裂解細(xì)胞得到外源蛋白。
所述外源蛋白優(yōu)選為GL-7-ACA酰化酶。
其中，用于構(gòu)建所述表達(dá)載體的出發(fā)載體可為基因工程領(lǐng)域中的質(zhì)粒表達(dá)載體，如pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD等；優(yōu)選為pET28a。
所述GL-7-ACA?；富虮磉_(dá)載體為pET-AS。
所述GL-7-ACA?；富蚓哂行蛄斜碇行蛄?的核苷酸序列。
所述裂解細(xì)胞的方法可為下述三種方法中的任意一種1)用2mmol/L EDTA重懸細(xì)胞，在37℃裂解20-40min；2)用pH8.0，0.1mol/L Tris-HCl緩沖液重懸細(xì)胞，在-30℃30min，37℃5min條件下進(jìn)行一次凍融；3)用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液pH值至8-10，裂解20-40min。
被導(dǎo)入所述GL-7-ACA酰化酶基因表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件與其相應(yīng)的宿主細(xì)胞相同。
所述宿主可為大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。所述大腸桿菌優(yōu)選為E.coli BL21(DE3)。
本發(fā)明的表達(dá)載體用S-RRz代替SRRz，在利用該表達(dá)載體生產(chǎn)外源蛋白的過程中通過Tris-HCl、EDTA和NaOH處理模擬S基因的作用來改變細(xì)胞膜的通透性，使R和Rz基因產(chǎn)生的酶可以穿過細(xì)胞質(zhì)膜到達(dá)細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞壁，從而有望解決細(xì)胞培養(yǎng)時產(chǎn)品積累量最大與細(xì)胞裂解效率最高的矛盾。
本發(fā)明巧妙地構(gòu)建了可調(diào)控宿主細(xì)胞壁裂解的表達(dá)載體，在生產(chǎn)過程中可實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞的可控裂解破壁，即當(dāng)目的蛋白(特別是GL-7-ACA酰化酶)大量積累后采用生物方法破壁，既可簡化外源蛋白的分離純化步驟，又可減少化學(xué)試劑的使用量。


圖1為酶法制備7-ACA的過程示意2為重組質(zhì)粒pET-AS的物理圖譜圖3為E.coli BL21(DE3)/pET-AS誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌SDS-PAGE電泳圖譜
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用酶如無特別說明均為TaKaRa公司產(chǎn)品。
實(shí)施例1、含有GL-7-ACA?；富蚝挺耸删w裂解酶S-RRz基因的重組表達(dá)載體pET-AS的構(gòu)建1、含有GL-7-ACA?；富虻闹亟M載體pET-Acy的構(gòu)建按照文獻(xiàn)(羅暉等，產(chǎn)GL-7-ACA?；钢亟M大腸桿菌的構(gòu)建和表達(dá)，微生物學(xué)通報，2004，31(4)，38-42)的方法構(gòu)建含有GL-7-ACA?；富虻闹亟M載體pET-Acy。
2、含有λ噬菌體裂解酶S-RRz基因的重組載體pUC18-S-RRz的構(gòu)建按照清華大學(xué)博士論文尹進(jìn)，基因工程大腸桿菌中聚-β-羥基丁酸酯的分離提取，(1998.4)的方法構(gòu)建含有λ噬菌體裂解酶S-RRz基因的重組載體pUC18-S-RRz。
3、重組表達(dá)載體pET-AS的構(gòu)建1)以步驟1的含有GL-7-ACA?；富虻闹亟M質(zhì)粒pET-Acy為模板，在引物15’-TATGCGTACATATGGAGCCGACCTCGACGC-3’(劃線部分堿基為Nde I識別位點(diǎn))和引物25’-TAGGAATTCTCATGGCTTGAAGTTG-3’(劃線部分堿基為EcoR I識別位點(diǎn))的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到帶有Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)的GL-7-ACA?；富颉CR的反應(yīng)體系為10μL的10×PCR緩沖液，0.3μL dNTP(10mM，賽百盛公司)，1μL引物1(終濃度50pmol)，1μL引物2(終濃度50pmol)，0.5μL質(zhì)粒pET-Acy溶液(濃度為50ng/μL)，0.2μL pfu DNA聚合酶(5U/μL，北京奇華盛生物技術(shù)發(fā)展中心)，用無菌水補(bǔ)足至總體積20μL。PCR反應(yīng)條件為94℃1分鐘；94℃1分鐘，56℃1.5分鐘，72℃2.5分鐘，30個循環(huán)；72℃10分鐘。
2)將步驟1)獲得的帶有Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)的GL-7-ACA?；富蛴肗de I和EcoR I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并與用同樣酶酶切的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET28a(Novagen公司)用T4DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP-10F’感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen公司)，用含有100μg/mL卡那霉素的LB抗性平板37℃培養(yǎng)16hr進(jìn)行篩選，挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12-24小時，離心收集菌體并用堿裂解法提取質(zhì)粒，用EcoR I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后用0.7％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，得到7.4kbp的條帶，表明得到了含有GL-7-ACA?；富虻闹亟M質(zhì)粒，將其命名為pET-AcyII。
3)將步驟2的重組質(zhì)粒pUC18-S-RRz用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳后回收得到電泳純的λ噬菌體裂解酶基因S-RRz片段，將其與同樣酶酶切的質(zhì)粒pET-AcyII用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP-10F’感受態(tài)細(xì)胞，在含有100μg/mL卡那霉素的LB抗性平板37℃培養(yǎng)16hr進(jìn)行篩選，挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12-24小時，離心收集菌體并用堿裂解法提取質(zhì)粒，用EcoR I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后用0.7％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，得到9.0kbp的條帶，表明得到了含有GL-7-ACA?；富蚝挺耸删w裂解酶S-RRz基因的重組質(zhì)粒pET-AS，其物理圖譜如圖2所示。
實(shí)施例2、GL-7-ACA?；傅谋磉_(dá)1)將實(shí)施例1的重組質(zhì)粒pET-AS用CaCl2法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞E.coli BL21(DE3)(Promega公司)，利用引物1和引物2進(jìn)行菌落PCR篩選得到含有GL-7-ACA酰化酶基因和λ噬菌體裂解酶S-RRz基因的基因工程菌，將其命名為E.coli BL21(DE3)/pET-AS；2)將E.coli BL21(DE3)/pET-AS接種于LB液體培養(yǎng)基中(LB培養(yǎng)基的配方為酵母粉0.5％、胰蛋白胨1％、NaCl 1％，pH 7.0)，37℃搖床培養(yǎng)12-24小時。取菌液按5％的比例轉(zhuǎn)接于含卡那霉素50μg/mL的50mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時，再加入1mmol/L的IPTG或乳糖25-37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10-24小時，使OD600＝3，離心收集菌體。將收集的菌體進(jìn)行全菌SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示(泳道1為Marker，泳道2-3為全菌蛋白)，在18kD和58kD處有兩條明顯的蛋白條帶，其中18kD蛋白條帶對應(yīng)GL-7-ACA酰化酶的α亞基，58kD的蛋白條帶對應(yīng)GL-7-ACA?；傅摩聛喕?，表明GL-7-ACA?；傅摩羴喕挺聛喕庸ふ_，該基因工程菌表達(dá)的GL-7-ACA酰化酶蛋白正確。測得的GL-7-ACA?；傅拿富顬?50U/L。
實(shí)施例3、用λ噬菌體裂解酶S-RRz裂解細(xì)胞可用以下三種方法中的任一方法裂解實(shí)施例2中經(jīng)離心收集的菌體細(xì)胞a)用0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸菌體細(xì)胞，在-30℃30min，37℃5min條件下進(jìn)行一次凍融，測定菌懸液OD600值；b)用2mmol/L EDTA重懸菌體細(xì)胞，37℃空氣浴搖床振搖(60rpm)30min后，測定菌懸液OD600值；c)用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至8-10，裂解30min測定菌懸液OD600值。并以用去離子水重懸等量的菌體細(xì)胞，37℃空氣浴搖床振搖(60rpm)30min后的菌懸液OD600值為對照。結(jié)果表明與對照相比，2mmol/L EDTA裂解樣品的OD600值下降27％，0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液凍融樣品的OD600值下降33.3％，1mol/L NaOH溶液裂解樣品的OD600值下降15.1％，表明上述方法模擬S基因的作用改變了細(xì)胞膜的通透性，使R和Rz基因產(chǎn)生的酶可以穿過細(xì)胞質(zhì)膜到達(dá)細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞壁。
實(shí)施例4、將經(jīng)λ噬菌體裂解酶S-RRz裂解的細(xì)胞固定化用于GL-7-ACA催化生產(chǎn)7-ACA
1)用λ噬菌體裂解酶S-RRz裂解細(xì)胞將E.coli BL21(DE3)/pET-AS接種于LB液體培養(yǎng)基中(LB培養(yǎng)基的配方為酵母粉0.5％、胰蛋白胨1％、NaCl 1％，pH 7.0)，37℃搖床培養(yǎng)12-24小時。取菌液按5％的比例轉(zhuǎn)接于含卡那霉素50μg/mL的50mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時，再加入0.01-2mmol/L的IPTG或乳糖25-37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10-24小時，使OD600＝3，離心收集菌體。用0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸菌體細(xì)胞，在-30℃30min，37℃5min條件下進(jìn)行一次凍融，得到菌體裂解液。
2)稱500mg的丙烯酰胺和40mgBis(N-N’亞甲基雙丙烯酰胺)混均后，用2ml水溶解，迅速加入到步驟1)的菌體裂解液中，再加入0.5ml 5％TEMED(四甲基己二胺)和0.5ml 2.5％過硫酸銨，迅速攪勻后冰浴3-5分鐘，得到10％的聚丙烯酰胺凝膠，再用水沖洗凝膠后，將凝膠切成0.1cm3大小，用蒸餾水洗凈，抽干，與用0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)緩沖液溶解的50ml濃度為0.5g/L的GL-7-ACA溶液混合，28℃搖床振蕩(60rpm)60min。采用C18柱(SHIMADZU公司)的HPLC法檢測反應(yīng)產(chǎn)物，流動相為7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸，流速為1mL/min。檢測結(jié)果表明，60min內(nèi)GL-7-ACA基本轉(zhuǎn)化為7-ACA，7-ACA的生成率約為90％。
序列表<160>2<210>1<211>2163<212>DNA<213>假單胞菌(Pseudomonas sp.)<400>1atgctgagag ttctgcaccg ggcgacgtcc gccctggtta tggcgactgt gatcggcctt 60gcgcccggcg tcgcctttgc gctggccgag ccgacctcga cgccgcaggc gccgattgcg 120gcctataaac cgagaagcaa tgagatcctg tgggacggct acggcgtccc gcacatctac 180ggggtcgacg cgccccccgc cttctacggc tacggctggg cccaggcgcg aagccacggc 240gacaatatcc tgcgcctgta tggagaagcg cggggcaagg gggccgaata ctggggcccg 300gattacgaac agacgaccgt ctggctgctg accaacggcg tgccggagcg cgcccagcag 360tggtatgcgc agcagtcgct ggatttccgc gccaacctcg acgccttcgc ggcgggcatc 420aacgcctatg ccgaacagaa cccagacgac atctcgcccg aggtgcggca ggtgctgccg 480gtttccggcg ccgacgtggt ggcgcacgcc catcgcctga tgaacttcct ctatgtcgcg 540tcgcccggcc gcaccctggg cgagggcgat ccgccggacc tggccgatca ggggtccaac 600tcctgggccg tggcgccggg caagacggcg aacgggaacg ccctgctgct gcggaacccg 660cacctgtcct ggacgacgga ctacttcacc tactacgagg cgcatctcgt cacgccggac 720ttcgaagtct atggcgcgac ccagatcggc ctgccggtca tccgcttcgc cttcaatcag 780cggatgggca tcaccaatac cgtcaacggc atggtggggg ccaccaacta tcggctgacg 840cttcaggacg gcggctatct gtacgacggt caggtgcggc cgttcgagcg gcgtcaggcc 900tcgtatcgcc tgcgtcaggc ggacgggtcg acggtcgaca agccgttgga gattcgctcc 960agcgtccatg gcccggtctt cgagcgcgcg gacggcacgg ccgtcgccgt tcgggtcgcc1020ggtttggatc ggccgggcat gctcgagcag tatttcgaca tgatcacggc cgacagcttc1080gacgactacg aagccgccat ggcgcggatg caggtgccga ccttcaacat cgtctgcgcc1140gaccgcgaag ggaccatcaa ctacagcttc aacggcgtgg cgccccaacg ggccgagggc1200gacatcgcct tctggcaggg gctcgtgcct ggcgattcct cgcgttacct gtggaccgag1260
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權(quán)利要求
1.一種表達(dá)載體，是在啟動子下游含有S-RRz基因的表達(dá)質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述S-RRz基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于用于構(gòu)建所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD。
4.由權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體構(gòu)建的外源蛋白表達(dá)載體、細(xì)胞系及工程菌。
5.利用權(quán)利要求1-3任一項權(quán)利要求所述的表達(dá)載體生產(chǎn)外源蛋白的方法，是先將外源基因插入所述表達(dá)載體得到外源基因表達(dá)載體，再將該外源基因表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)并裂解細(xì)胞得到外源蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述外源蛋白為GL-7-ACA?；?。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD；優(yōu)選為pET28a。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述GL-7-ACA?；富虮磉_(dá)載體為pET-AS。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一所述的方法，其特征在于所述裂解細(xì)胞的方法為下述三種方法中的任意一種1)用2mmol/L EDTA重懸細(xì)胞，在37℃裂解20-40min；2)用pH8.0，0.1mol/L Tris-HCl緩沖液重懸細(xì)胞，在-30℃、30min，37℃、5min條件下進(jìn)行一次凍融；3)用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液pH值至8-10，裂解20-40min。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一所述的方法，其特征在于所述宿主為大腸桿菌、酵母菌、枯草桿菌；優(yōu)選為大腸桿菌；更優(yōu)選為E.coli BL21(DE3)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)載體及其應(yīng)用。其目的是提供一種可調(diào)控宿主細(xì)胞裂解的表達(dá)載體及利用該載體生產(chǎn)外源蛋白的方法。所述表達(dá)載體是在啟動子下游含有S RRz基因的表達(dá)質(zhì)粒。利用該表達(dá)載體生產(chǎn)外源蛋白的方法，是先將外源基因插入上述表達(dá)載體得到外源基因表達(dá)載體，再將該外源基因表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)裂解細(xì)胞得到外源蛋白。本發(fā)明巧妙地構(gòu)建了可調(diào)控宿主細(xì)胞壁裂解的表達(dá)載體，在生產(chǎn)過程中可實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞的可控裂解破壁，即當(dāng)目的蛋白(特別是GL－7－ACA酰化酶)大量積累后采用生物方法破壁，既可簡化外源蛋白的分離純化步驟，又可減少化學(xué)試劑的使用量。
文檔編號C12P21/02GK1760365SQ20041008362
公開日2006年4月19日 申請日期2004年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月13日
發(fā)明者周航, 于慧敏, 羅暉, 沈忠耀 申請人:清華大學(xué)