專利名稱：檢測貝類中諾沃克病毒的實時熒光檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種快速檢測諾沃克病毒的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
食源性病毒污染是食品安全性問題的一個重要方面。引起腹瀉的病原包括細(xì)菌、寄生蟲、病毒三大類。引起腹瀉的病毒包括輪狀病毒(Rotavirus)、腸腺病毒(Entericadenovirus)、杯狀病毒(Calicivirus)、星狀病毒(Astovirus)。杯狀病毒包括諾沃克(樣)病毒和札幌病毒兩大類。諾沃克病毒(Noroviruses)是一種分布很廣泛的病毒，食品(包括水)被諾沃克病毒感染后，出現(xiàn)以急性胃腸炎為主的臨床癥狀，即水樣腹瀉、嘔吐和腹痛等癥狀。若治療不及時或治療方法不正確，輕者影響人體的生長發(fā)育，嚴(yán)重者可導(dǎo)致脫水死亡。該類病毒主要存在于貝類等體內(nèi)。
目前我國對進(jìn)出口食品只進(jìn)行常規(guī)的細(xì)菌檢測，還沒有相應(yīng)方法對進(jìn)出口食品諾沃克病毒進(jìn)行檢測。也就是說，進(jìn)出口食品諾沃克病毒檢測仍處于空白狀態(tài)，這嚴(yán)重地制約著我國食品進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展，威脅著人民的身體健康。然而，目前尚沒有快速簡便地檢測和鑒定諾沃克病毒的檢測技術(shù)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的快速簡便地檢測和鑒定諾沃克病毒的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種快速簡便地檢測和鑒定諾沃克病毒的技術(shù)。
在本發(fā)明的第一方而，提供了一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，它包括步驟在聚合酶反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對和諾沃克病毒特異性探針，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有諾沃克病毒ORF1和ORF2的連接區(qū)。
在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對選自下組引物15’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO1；引物25’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO2。
在另一優(yōu)選例中，所述的諾沃克病毒特異性探針具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的諾沃克病毒特異性探針是Taqman探針。
在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中或之后，檢測諾沃克病毒特異性探針發(fā)出的熒光信號。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測試劑盒，它含有以下試劑(a)擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有諾沃克病毒ORF1和ORF2的連接區(qū)；(b)諾沃克病毒特異性探針。
在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對選自下組引物15’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO1引物25’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO2。
在另一優(yōu)選例中，所述的諾沃克病毒特異性探針具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的諾沃克病毒特異性探針是Taqman探針。


圖1牡蠣中諾沃克病毒的實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果。其中，從上至下各曲線分別為(a)加入含有諾沃克病毒樣品原液的牡蠣，10ul RNA溶液；(b)加入含有諾沃克病毒樣品原液的牡蠣，20ul RNA溶液；(c)未加入含有諾沃克病毒糞便的牡蠣；(d)空白對照。
圖2顯示了引物NLV-F/NLV-R和探針NLV濃度梯度實時PCR。其中，曲線自左到右對應(yīng)的質(zhì)粒拷貝數(shù)分別為3.521×108；3.521×107；3.521×106；3.521×105；3.521×104；3.521×103；3.521×102；3.521×101。
圖3顯示了Ct值與模板拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過對諾沃克病毒的各種基因序列的廣泛而深入的研究，認(rèn)為諾沃克病毒的ORF1和ORF2區(qū)的連接區(qū)序列特別適合用于檢測和鑒定諾沃克病毒。針對該區(qū)域不僅可以設(shè)計出特異性擴(kuò)增諾沃克病毒的引物，還可設(shè)計出諾沃克病毒特異性探針。這樣，在一次PCR反應(yīng)中，通過檢測TaqMan探針的熒光信號，就可快速簡便地鑒定諾沃克病毒。
如本文所用，術(shù)語“諾沃克病毒特異性探針”指這樣的引物(對)，它擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有諾沃克病毒ORF1和ORF2的連接區(qū)。一種優(yōu)選的引物對具有SEQ ID NO1和2所示的序列。
如本文所用，術(shù)語“諾沃克病毒特異性探針”指能夠結(jié)合于諾沃克病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物，但不結(jié)合于其他病毒(如)的擴(kuò)增產(chǎn)物的探針。更佳地，所述的諾沃克病毒特異性探針特異性結(jié)合于諾沃克病毒的ORF1和ORF2區(qū)的連接區(qū)。一種優(yōu)選的探針具有SEQ ID NO3所示的序列。
實時熒光PCR是密閉擴(kuò)增檢測方法，擴(kuò)增體系加樣完畢后，即可進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，不需擴(kuò)增后再進(jìn)行分析；不僅減少環(huán)境污染的可能性，還由于有引物對與探針共同雜交，比普通PCR特異性更高。
TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)利用Taq酶5′→3′外切酶活性，在延伸的過程中實現(xiàn)對雜交探針的切斷，消除探針3′端熒光基團(tuán)對5′端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)信號的淬滅作用。熒光信號的強(qiáng)弱與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比，檢測系統(tǒng)通過檢測熒光可推測PCR產(chǎn)物的數(shù)量。
本發(fā)明方法中優(yōu)選的擴(kuò)增區(qū)域為諾沃克病毒的ORF1和ORF2的連接區(qū)序列，該區(qū)域是諾沃克病毒特有的，可用于檢測諾沃克病毒。
根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠設(shè)計和合成引物以及諾沃克病毒特異性探針，并用于常規(guī)的熒光實時PCR和TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)等檢測技術(shù)。
在本發(fā)明中，除了檢測所針對的靶序列與現(xiàn)有技術(shù)不同之外，諸如從樣品總抽提DNA、引物的標(biāo)記、PCR擴(kuò)增和熒光檢測等步驟的條件都與現(xiàn)有技術(shù)相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以用常規(guī)的條件進(jìn)行上述各種步驟。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對能對諾沃克病毒的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。實時熒光檢測結(jié)果表明，僅在含諾沃克病毒的標(biāo)本表現(xiàn)陽性，達(dá)到了預(yù)期的效果。這表明，通過合理選擇出的諾沃克病毒特異性探針是極為有效和特異的。
使用定量PCR儀進(jìn)行實時熒光檢測時，根據(jù)熒光標(biāo)記物(FAM、TET)的不同，可在530nm或640nm等波長檢測。在優(yōu)選例中，宜采用具備波長分辯能力的檢測儀，并可用常規(guī)方法或，采用儀器自配軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。擴(kuò)增產(chǎn)物在用常規(guī)方法進(jìn)行凝膠電泳，常規(guī)紫外檢測并拍照。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)可簡便、快速地檢測和鑒定諾沃克病毒。
(2)基于ORF1和ORF2連接區(qū)的引物對可有效地特異性擴(kuò)增諾沃克病毒的核酸序列，而諾沃克病毒特異性探針則可更特異性地區(qū)分諾沃克病毒和其他病毒。
(3)檢測結(jié)果線性好，可用于定量分析。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1一、實驗材料和方法1 菌株來源含有病毒的糞便樣品諾沃克病毒毒株32695，35616，35617，HuCV，札幌病毒(Sapporo virus)，均購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所。
2 供試貝類牡蠣、淡水河貝，均購自上海水產(chǎn)品市場。
3 試劑3.1 1mol/L Tris·Cl緩沖液，pH7.5稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，溶于800mL水中，攪拌，加入濃鹽酸42mL，冷卻至室溫，用稀鹽酸準(zhǔn)確調(diào)整pH至7.5，分裝后高壓滅菌備用。
3.2 5mol/L EDTA在800mL H2O中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA·2H2O)，在磁力攪拌器劇烈攪拌，然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。
3.3 甘氨酸緩沖液(pH 9.5)含有0.1M甘氨酸，0.3M NaCl。
50g甘氨酸，17.55g NaCl，加水至1L，調(diào)pH至9.5。
3.4 洗滌緩沖液含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，0.15M LiCl，1mM EDTA3.5 16％PEG 8000-0.525M NaCl溶液80g PEG，15.34g Nacl加水至500mL；3.6 Dynabeads-oligo(dT)25(Cat.No.61005，Dynal Biotech Inc.，Oslo，Norway)3.7 1X RNA bing buffer含有20mM Tri-HCl(pH7.5)，1.0M LiCl，2mM EDTA3.8 氯仿；3.9 異丙醇；3.10 70％乙醇；3.11 無水乙醇3.12 RNaseA 2mg/μL；3.13 雙蒸水；3.14 TE緩沖液，pH8.0量取10mL 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)和2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加水定容至1000mL，分裝后高壓滅菌備用。
3.15 10×PCR緩沖液含500mmol/L KCL，100mmol/L Tris·Cl(pH8.3)，15mmol/L MgCl2，0.1％明膠；3.16 10×MgCl2 25mmol/L；3.17 10×dNTP含2.5mmol/L dATP，dUTP，dCTP，dGTP；3.18 Taq酶5Unit/μL；
3.19 引物 根據(jù)表1的序列進(jìn)行合成引物，加超純水配制成100μmol/L儲存，直接用于PCR測試的引物濃度為5μmol/L。
表1 PCR引物和探鐘序列

3.20 溴化乙錠10mg/mL；3.21 DNA分子量標(biāo)記100bp-2000bp；3.22 瓊脂糖；3.23 50×TAE緩沖液稱取484g Tris，量取114.2mL冰醋酸，200mL 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，溶于蒸餾水中，定容至2L。分裝后高壓滅菌備用；3.24 10×上樣緩沖液含0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青FF，30％甘油水溶液。
4 試驗用試劑盒4.1 TRIzol RNA抽提試劑盒(Invitrogen公司，Cat.No.15596-026)4.2 TRI REAGENT RNA提取試劑盒(Sigma公司，Cat.No.T-9424)4.3 Access RT-PCR System(Promega公司，Cat.#A1250)5 儀器5.1 ABI 7700定量PCR儀；5.2 PCR儀；5.3 電泳儀；5.4 電泳槽；5.5 凝膠分析成像系統(tǒng)；5.6 冷凍干燥離心機(jī)；5.7 冷凍離心機(jī)；
5.8 勻漿器；5.9 水浴鍋；5.10 微波爐；5.11 微量加樣器0.1μL-2.5μL，0.5μL-10μL，2μL-20μL，10μL-100μL，20μL-200μL，200μL-1000μL；5.12 RNase free吸嘴；5.13 天平感量0.001g；5.14 高壓滅菌鍋；5.15 -80℃低溫冰箱；5.16 PCR反應(yīng)管200μL，500μL兩種規(guī)格；5.17 RNase free Eppendorf離心管1.5mL；5.18 15mL、50mL離心管。
6 序列分析軟件Clustalx，Genedoc，GC7 病毒RNA提取方法7.1 糞便病毒RNA的提取(1)10倍稀釋糞便樣品(2)每100μL稀釋樣品加入1mL TRIzol Reagent，顛倒混勻，15-30℃放置5mins。
(3)加入0.2mL氯仿，震蕩15secs，15-30℃放置5mins。
(4)4℃，＜12000g離心15mins。
(5)移取上層清夜(約0.6mL)入RNase-free新管，(6)加入0.5mL異丙醇，15-30℃放置10mins。
(7)4℃，＜12000g離心10mins。
(8)棄上清液，加入1mL 75％乙醇(冰冷)震蕩洗滌RNA，(9)4℃，7500g離心5mins。棄液體，室溫自然干燥10mins。
(10)加入50μL RNase-free水，55-60℃助溶10mins。(-80℃保存?zhèn)溆没蛄⒓催M(jìn)行后續(xù)實驗)，每次RT-PCR取10μL作為模板。
7.2 貝類中病毒的富積(1)解剖取下新鮮貝類的胃、腸組織(-80℃保存?zhèn)溆没蛄⒓催M(jìn)行后續(xù)實驗)；(2)每25g組織加入175mL甘氨酸緩沖液；(3)20℃勻漿器高速勻漿3min。勻漿液按30mL/管分裝入50mL離心管[可加入病毒溶液，終濃度分別為15-1.5PFU(10倍梯度)]；(4)37℃溫育30min(降解貝類RNA)。4℃，15000g離心30min；(5)分別移取上清至新管，加入等體積的16％PEG 8000(聚乙二醇，Sigma)/0.525M NaCl混合液，冰上放置(沉淀)至少1小時；(6)4℃，10000g離心5min，棄上清，保留沉淀。
7.3 貝類病毒的提取(1)在2.7.3步驟(6)的沉淀中加入5mL Tri-reagent(Sigma公司)，劇烈震蕩混合，20℃放置5min。
(2)轉(zhuǎn)移溶液入15mL離心管，加入1.2mL氯仿，劇烈震蕩30s，20℃放置5min。
(3)12000g離心5min，取上清。
(4)加入0.5體積(約2.5mL)異丙醇，20℃放置5min。5000g離心5min。
(5)75％乙醇(冰冷)洗滌沉淀。
(6)沉淀重懸于300μL RNase-free的水，加熱至90℃，震蕩助溶。
(7)加入400μL 1×RNA binding buffer，震蕩30s，60℃放置3min。
(8)加入100μL Dynabeads-oligo(dT)25(Dynal，Oslo，Norway)，輕柔混合30s，磁性抽提器上放置1min。
(9)棄上清，加入500μL 2×RNA binding buffer、20℃8rpm晃動5min洗滌。
(10)微型離心管在磁性抽提器上放置1min，棄上清。洗滌緩沖液洗滌3次。
(11)沉淀用100μL RNase-free water懸浮，90℃放置2min釋放RNA。磁性抽提器上放置1min，取上清、棄沉淀(-80℃保存?zhèn)溆没蛄⒓催M(jìn)行后續(xù)實驗)。每次RT-PCR取10μL作為模板。
8實時熒光PCR使用Access RT-PCR System試劑盒進(jìn)行實時熒光RT-PCR。反應(yīng)體系見表2。
表2實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系

二、實驗結(jié)果(a)RT-PCR檢測貝類樣品中的諾沃克病毒采用引物NLV-F/NLV-R分別對上述樣品進(jìn)行常規(guī)RT-PCR檢測，四個諾沃克樣病毒樣品均得到109bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)對PCR產(chǎn)物克隆測序，序列與GenBank中的諾沃克樣病毒序列不同株系相一致。用引物NLV-F/NLV-R和探針NLV-P對貝類中提取的諾沃克病毒RNA進(jìn)行檢測，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，札幌病毒RNA、未含諾沃克病毒的貝類RNA陰性對照和空白對照未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。說明引物NLV-F/NLV-R和TaqMan MGB探針NLV-P能特異檢測諾沃克病毒(表3)。
表3糞便病毒樣品的RT-PCR檢測結(jié)果

(-表示陰性，Negative；+表示陽性，Positive)在未感染諾沃克病毒的牡蠣腸胃組織中分別加入諾沃克病毒樣品35616原液140μL，按照“7.病毒RNA提取方法”中所述的方法進(jìn)行病毒RNA提取。用引物NLV-F/NLV-R和探針NLV-P對貝類中提取純化的病毒RNA溶液進(jìn)行實時熒光RT-PCR檢測，加入諾沃克病毒樣品35616原液的牡蠣樣品中均出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線。
結(jié)果表明，引物NLV-F/NLV-R和探針NLV-P能夠檢測出按照2.7的方法從貝類中富集提取和純化的諾沃克病毒RNA(圖1)。
(b)引物NLV-F/NLV-R和探針NLV-P的檢測靈敏度使用引物NLV-F/NLV-R對諾沃克病毒進(jìn)行RT-PCR檢測，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，對克隆質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-7倍，用引物NLV-F/NLV-R和探針NLV-P分別測定各稀釋質(zhì)粒的Ct值，不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒實時熒光PCR檢測結(jié)果見圖2和表4，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。
結(jié)果表明，可見Ct值與模板拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系良好，在質(zhì)粒拷貝數(shù)為35.21時仍能檢測出。說明使用引物NLV-F/NLV-R和探針NLV-P進(jìn)行檢測時，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，有較高的靈敏度。
表4不同克隆質(zhì)粒稀釋液的Ct值

實施例2對水產(chǎn)品的檢測按實施例1相同方式，用引物(SEQ ID NO1和2)通過普通RT-PCR方法，或者結(jié)合SEQ ID NO3所示的探針通過實時熒光RT-PCR，分別對購自市場上的20批牡蠣和文蛤樣品進(jìn)行諾沃克樣病毒實時熒光RT-PCR檢測，從2批牡蠣中檢測出II型諾沃克樣病毒。
此外，用測序儀對檢測出的樣品的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了核苷酸序列測定，結(jié)果表明擴(kuò)增出的正是諾沃克病毒ORF1和ORF2之間的連接區(qū)。
表5不同批次樣品的實際檢測結(jié)果

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>潘，良文<120>檢測貝類中諾沃克病毒的實時熒光檢測方法和試劑盒<130>048369<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1gatgagrtty tcwgayytva gcac 24<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2tcgacgccat cttcattcac 20<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>3agattgcgat cgccct 1權(quán)利要求
1.一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于，它包括步驟在聚合酶反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對和諾沃克病毒特異性探針，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有諾沃克病毒ORF1和ORF2的連接區(qū)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對選自下組引物15’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO1；引物25’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO2。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的諾沃克病毒特異性探針具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的諾沃克病毒特異性探針是Taqman探針。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中或之后，檢測諾沃克病毒特異性探針發(fā)出的熒光信號。
6.一種檢測試劑盒，其特征在于，它含有以下試劑(a)擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有諾沃克病毒ORF1和ORF2的連接區(qū)；(b)諾沃克病毒特異性探針。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對選自下組引物15’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO1引物25’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO2。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的諾沃克病毒特異性探針具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的諾沃克病毒特異性探針是Taqman探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測諾沃克病毒的方法，在聚合酶反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增諾沃克病毒的特異性引物對和諾沃克病毒特異性探針。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明可快速簡便地檢測和鑒定諾沃克病毒。
文檔編號C12Q1/70GK1779441SQ20041008434
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者潘良文, 李曉虹, 張舒亞, 嚴(yán)羅美 申請人:潘良文, 李曉虹, 張舒亞, 嚴(yán)羅美