專利名稱：高通量哺乳動物細胞培養(yǎng)基優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)、生物制藥領(lǐng)域，更具體地涉及高通量哺乳動物細胞微培養(yǎng)以及活細胞濃度檢測方法，用于細胞培養(yǎng)基成分優(yōu)化。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)的發(fā)展已使蛋白質(zhì)藥物大規(guī)模生產(chǎn)、取代從生物原料提取成為可能；毫無疑問，隨著人類基因組學和蛋白組學研究的開展，會有更多的基因功能得到鑒別，與之相應(yīng)的將是會有更多的蛋白質(zhì)藥物出現(xiàn)并用于臨床試驗和疾病治療。
蛋白質(zhì)藥物的生物合成有若干途徑可以選擇，包括哺乳動物細胞培養(yǎng)、微生物發(fā)酵、轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物。就目前來講，微生物發(fā)酵主要用于不需要修飾的蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)，而大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)主要用于翻譯后需要糖基化等修飾的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。雖然轉(zhuǎn)基因動物、植物在蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)方面有大幅度降低生產(chǎn)成本的可能，但技術(shù)研發(fā)過程復(fù)雜，技術(shù)市場取向目前尚不能同大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)相比。另外，蛋白質(zhì)修飾物種之間的差異也可以對影響藥物的功能和免疫反應(yīng)程度造成影響。
哺乳動物細胞培養(yǎng)的商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用需要大量的過程研發(fā)工作奠定基礎(chǔ)。過程研發(fā)的目的是在保證產(chǎn)物質(zhì)量的前提下，即在保證藥物性能的基礎(chǔ)上，提高產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，使實現(xiàn)商業(yè)利潤成為可能。經(jīng)過多年不斷努力，大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)工藝已經(jīng)日趨成熟。攪拌式生物反應(yīng)器目前是大規(guī)模細胞懸浮培養(yǎng)的首選設(shè)備，常用的操作模式有間歇和流加兩種。就生產(chǎn)原料來說，無血清和無蛋白細胞培養(yǎng)基是目前大規(guī)模細胞培養(yǎng)的主要材料，可以擺脫昂貴的血清或蛋白質(zhì)成份，避免外源生物污染(如病毒和瘋牛病)、資源限制和原料生物活性不穩(wěn)定性(批間差異)，提高過程穩(wěn)定性和操作規(guī)范化程度，降低一般占總成本大部分的下游過程成本。
細胞培養(yǎng)過程優(yōu)化包括培養(yǎng)基成分優(yōu)化、反應(yīng)器操作條件優(yōu)化和反應(yīng)器操作模式選擇等幾部分，而針對具體生產(chǎn)過程配置并優(yōu)化培養(yǎng)基成分是現(xiàn)代大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程研究的主要任務(wù)之一，工作量非常大。一般來說，每一細胞株都有獨特要求，沒有任何一種培養(yǎng)基會充分滿足所有細胞株的需要或發(fā)揮細胞的最大生產(chǎn)潛力。具體培養(yǎng)基成份的確定需要結(jié)合細胞生長、產(chǎn)物產(chǎn)率與質(zhì)量、反應(yīng)器類型和操作方式及物理環(huán)境等因素整體考慮。
由于培養(yǎng)基成分十分復(fù)雜(含數(shù)十種生化成分)，細胞培養(yǎng)周期長，以往的方法如采用小型生物反應(yīng)器或轉(zhuǎn)瓶或搖床，培養(yǎng)數(shù)有限，不能在有限的時間內(nèi)完成所需要的實驗數(shù)量，而且分部執(zhí)行又容易產(chǎn)生實驗結(jié)果批間的不可比性，耗時、效率低、成本高。例如優(yōu)化培養(yǎng)基成分假如培養(yǎng)基的化學成分有50種，每種化學成分只有2個濃度水平，如果每一個成分和每一個濃度水平搭配起來進行實驗，那么所需要的培養(yǎng)數(shù)為250，即1.126×1015個培養(yǎng)，這是不可能實現(xiàn)的。即使采用正交實驗方法，考慮到培養(yǎng)基組分的相互作用，實驗量也在萬次以上，采用常規(guī)方法也不可能完成。
針對以上實際問題，本領(lǐng)域技術(shù)人員主要通過合理地設(shè)計實驗，簡化實驗方案，降低工作量，另一方面則要依靠能模擬反應(yīng)器環(huán)境、操作模式的高通量細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，提高批次實驗數(shù)量來實現(xiàn)培養(yǎng)基的篩選。
刃天青，又稱樹脂天青、偶氮間苯四酚、樹脂酚天青，英文名稱Alamar Blue，Resazurin，Diazoresorcinol，Resazoin，分子式C12H7NO4，分子量229.2。由于其酚羥基在不同pH環(huán)境中解離程度不同而呈不同顏色，刃天青可用作酸堿指示劑，pH3.8(橙色)-6.5(深紫色)。刃天青經(jīng)氧化還原反應(yīng)，可被還原為試鹵靈(Resorufin)。該反應(yīng)也可以在刃天青被細胞吸收之后在細胞內(nèi)完成。在真核細胞線粒體中，刃天青可以作為呼吸鏈電子最終受體，經(jīng)酶催化，取代氧而被還原；在原核細胞中刃天青經(jīng)酶催化還原的機理目前尚不清楚。由于刃天青和試鹵靈在光吸收方面有較大區(qū)別，最大光吸收波長分別為573(試鹵靈)和605nm(刃天青)，刃天青在605nm有最大光吸收，而試鹵靈的光吸收接近于零，可應(yīng)用于細胞代謝活性分析。另外，試鹵靈具有熒光性質(zhì)，該特性也可應(yīng)用于細胞代謝活性分析，以及可以以此為指標的其它應(yīng)用如化學和生化物質(zhì)毒性、藥物篩選等方面。
美國專利5413916(Colorimetric toxicity test，1995年)采用大腸桿菌作為生物樣本、戊二醛作為細胞膜電子供體，利用刃天青的氧化還原顏色反應(yīng)，建立了一個顏色毒性檢測方法，反應(yīng)在試管中完成，并用分光光度計測量光吸收，波長為603nm。
美國專利5501959(Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assaysusing resazurin and poising agents，1996年)針對刃天青在培養(yǎng)液中存在時間較長(如24小時)會發(fā)生自還原(Autoreduetion)現(xiàn)象，提出使用平衡劑(Poisingagent)并控制培養(yǎng)液氧還電位的方法(商品名Alamar Blue)，來降低自還原現(xiàn)象所引起的檢測偏差。該專利用此方法結(jié)合熒光檢測(激發(fā)光540-560nm，熒光580-600nm)用來檢測細胞存活率，以此檢測藥物對腫瘤細胞的殺傷作用。
美國專利6271022(Device for incubating and monitoring multiwell assays，2001年)發(fā)明了一種可以對細胞在多孔板中監(jiān)測細胞生長的儀器，其檢測手段為相機和掃描儀，通過圖像分析對細胞生長進行監(jiān)測。該專利雖然提到將刃天青作為氧化還原指示劑使用，但未提供具體使用方法，權(quán)利要求中也未包括。
國際專利申請WO03016556(Measurement of microbiological activity in anopaque medium，2003年)針對金屬冶煉流體(Metal Working Fluids)的高散射性質(zhì)，通過測量未反應(yīng)熒光物質(zhì)和已反應(yīng)熒光物質(zhì)濃度并計算二者比率，來反映流體中微生物活性。
美國專利5055411(Methods used in testing human males for fertility，1991年)和美國專利5068089(Kit for testing human males for fertility，1991年)利用刃天青的氧化還原顏色反應(yīng)，建立了一個人精液活性檢測方法。該方法中反應(yīng)在試管中完成，并用與標準色板(Color Chart)對比的方法得到檢測結(jié)果。
美國專利5766875(Metabolic monitoring of cells in a microplate reader，1998年)采用雙波長方法和不同pH指示劑，利用細胞代謝對生長環(huán)境pH的影響，在微孔板上檢測細胞代謝活性。
國際專利申請WO0198531(Resazurin-based cytotoxicity assay，2001年)利用活肝細胞和活肝細胞株(HepG2)能首先將刃天青轉(zhuǎn)化為熒光化合物試鹵靈(第一信號)，再將試鹵靈進一步轉(zhuǎn)化為非熒光化合物(第二信號)的代謝特性，測定死亡細胞數(shù)量。該方法可應(yīng)用于肝癌藥物篩選和藥物毒性研究。
Ahmed等(A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor anddetermine the proliferation of 1ymphocytesan alternative to[3H]thymidineincorporation assay，Journal of Immunological Methods 170(1994)211-224)和Zhi-Jun等(A dye-based lymphocyte proliferation assay that permitsmultiple immunological analysesmRNA，cytogenetic，apotosis，andimmunophenotying studies，Journal of Immunological Methods210(1997)25-39)報導(dǎo)了采用刃天青作為氧化還原指示劑，用比色法檢測96孔板中淋巴細胞和雜交瘤細胞的生長的方法。該方法使用普通酶標儀，分別對570nm(還原態(tài)刃天青)和600nm(氧化態(tài)刃天青)讀光密度，并用(OD570nm-OD600nm)值代表細胞量。在Ahmed等的文章中，作者特別強調(diào)，刃天青必須在細胞培養(yǎng)初期進入到培養(yǎng)液中。尚未有聯(lián)合細胞培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)后加入刃天青進行活性檢測，且不影響細胞存活的高通量細胞培養(yǎng)條件篩選方法。
因此，本領(lǐng)域也迫切需要一種簡便的、具有良好重復(fù)性和可比性的、能夠模擬反應(yīng)器環(huán)境、操作模式的簡單、低成本高通量細胞微培養(yǎng)方法，不但可以進行間歇和流加培養(yǎng)，也可以方便地監(jiān)測細胞濃度。本領(lǐng)域迫切的需要可以有效地應(yīng)用于細胞培養(yǎng)基成分優(yōu)化和過程優(yōu)化的快速簡便的篩選方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供一種在多孔板(如96孔板)中細胞微培養(yǎng)方法，提供一種活細胞終點檢測方法，可以利用酶標儀快速、簡便有效地測定微培養(yǎng)中活細胞濃度，可以有效地應(yīng)用于細胞培養(yǎng)基成分優(yōu)化。
公開了一種細胞培養(yǎng)基優(yōu)化的方法，該方法包括步驟a.將細胞接種到多孔板中的不同成分的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基為至少2種；b.在相同條件下培養(yǎng)這些細胞；c.檢測活細胞數(shù)；和d.選擇活細胞數(shù)最多的培養(yǎng)基作為優(yōu)選培養(yǎng)基。
在該方法的一個優(yōu)選例中，該培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基。
在該方法的另一個優(yōu)選例中，步驟c為加入刃天青，測定605nm下的光密度。更優(yōu)選的，刃天青在培養(yǎng)結(jié)束時加入。
在該方法的另一個優(yōu)選例中，檢測活細胞濃度范圍在0.05-10×106細胞/ml之間。
在該方法的還有一個優(yōu)選例中，檢測活細胞是通過酶標定法。
在該方法的還有一個優(yōu)選例中，刃天青在溶液中以10-40μl/孔存在。更優(yōu)選的，刃天青在溶液中以20-30μl/孔存在。
附圖簡述

圖1顯示了實施例1刃天青濃度與OD605的關(guān)系。
圖2顯示了實施例2溶液pH對刃天青在605nm光吸收的影響。
圖3顯示了實施例3溫度對刃天青在605nm光吸收的影響。
圖4顯示了實施例4雜交瘤(4a)和CHO細胞在605nm的光吸收(4b)。
圖5顯示了實施例5低細胞密度條件下活細胞濃度檢測(CHO)。
圖6顯示了實施例6高細胞密度條件下活細胞濃度檢測(CHO)。
圖7顯示了實施例7低細胞密度條件下活細胞濃度檢測(雜交瘤)。
圖8顯示了實施例8高細胞密度條件下活細胞濃度檢測(雜交瘤)。
圖9顯示了實施例9刃天青在高通量細胞培養(yǎng)中活細胞濃度檢測。
圖10顯示了實施例10雜交瘤培養(yǎng)基配方的高通量篩選。
圖11顯示了實施例11雜交瘤培養(yǎng)基組分的高通量優(yōu)化-異亮氨酸。
圖12顯示了實施例12雜交瘤培養(yǎng)基組分的髙通量優(yōu)化-鐵復(fù)合物。
具體實施例方式
本發(fā)明利用細胞培養(yǎng)多孔板(如96孔板)作為細胞生長容器，以搖床作為傳動裝置實現(xiàn)流體混合，達到增加培養(yǎng)數(shù)量、實現(xiàn)高通量培養(yǎng)基成分優(yōu)化的目的。
本發(fā)明利用活細胞對刃天青的還原反應(yīng)所導(dǎo)致的605nm光密度降低值來反應(yīng)培養(yǎng)中活細胞密度，可以簡便地用于活細胞密度終點檢測，活細胞濃度檢測范圍在0.05-10×106細胞/ml之間。此外，由于刃天青的氧化還原反應(yīng)不影響細胞的代謝，因此不象與核或細胞器結(jié)合的試劑那樣，測試后造成細胞死亡。
本文所述的高通量細胞培養(yǎng)方法和活細胞檢測方法可以高效率地應(yīng)用于細胞培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)基成分優(yōu)化。常規(guī)的正交實驗需要進行大量的重復(fù)實驗，若采用常規(guī)實驗設(shè)備如轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐將受到實驗室規(guī)模等的限制，對大量濃度變量同時實驗是不可能的，而分批實驗也會由于細胞接種質(zhì)量和細胞計數(shù)差異等因素使批次結(jié)果間失去可比性。而本發(fā)明在一塊96孔板中就可進行幾組甚至幾十組實驗，而且培養(yǎng)規(guī)模小、速度快，結(jié)合簡便的細胞濃度檢測方法，大大節(jié)約了研究成本，對于細胞培養(yǎng)條件的研究是一個重要的進步。
下文提供了實施例進一步說明了本發(fā)明。這些例子不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1刃天青濃度與605nm光吸收的關(guān)系(1)在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入100μl無血清培養(yǎng)基(本實驗室配制)；(2)每孔分別加入刃天青溶液(Sigma，1.2mM，pH7.5 PBS)5、10、20、30、40和50μl，每種濃度重復(fù)4個孔，混勻；(3)以無血清培養(yǎng)基作為空白對照，用酶標儀(Microplate Reader 550，Bio-Rad)讀取605nm光密度。
實驗結(jié)果表明(見圖1)，刃天青濃度在一定范圍與OD605呈線性關(guān)系；從信號大小方面看出，刃天青溶液比例在20-30μl左右時比較適中。
實施例2溶液pH對刃天青自605nm光吸收的影響(1)分別配制pH5.0、5.5、6.5、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0緩沖液(pH5.5-6.0為檸檬酸緩沖液，pH6.5-8.0為磷酸鹽緩沖液，pH8.5-9.0為Tris-HCl緩沖液)；(2)分別加入100μl緩沖液到96孔細胞培養(yǎng)板(Corning)中，每種pH重復(fù)4個孔；(3)每孔加入刃天青溶液20μl，混勻；(4)以對應(yīng)緩沖液作為空白對照，用酶標儀讀取605nm光密度。
實驗結(jié)果表明(見圖2)，在5.0-6.0范圍內(nèi)pH對刃天青在605nm光吸收影響很大，而在6.5-9.0范圍內(nèi)pH影響很小。
實施例3溫度對刃天青OD605nm光吸收的影響(1)在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入100μl無血清培養(yǎng)基；(2)每孔分別加入刃天青溶液5、10、20、30、40和50μl，每種濃度重復(fù)4個孔，混勻；(3)將96孔細胞培養(yǎng)板4℃放置20分鐘后用酶標儀讀取605nm光密度；(4)將96孔細胞培養(yǎng)板室溫放置20分鐘后用酶標儀讀取605nm光密度；(5)將96孔細胞培養(yǎng)板37℃放置20分鐘后用酶標儀讀取605nm光密度。
實驗結(jié)果表明(見圖3)，在4-37℃范圍內(nèi)溫度對刃天青在605nm光密度基本上沒有影響。
實施例4雜交瘤細胞(鼠源，融合伴侶細胞為SP2/0)和中國倉鼠卵巢細胞(ATCCCRL9096，DHFR缺陷型)在605nm的光吸收(1)細胞計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基配成細胞懸液，在96孔細胞培養(yǎng)板的第1列中加入200μl細胞懸液；(2)分別在培養(yǎng)板的第2-12列中加入100μl無血清培養(yǎng)基；(3)在第一列中取出100μl細胞加入第2列，吹打混勻后取出100μl加入第3列；(4)重復(fù)以上操作至第12列后，取出100μl丟棄；至此細胞從第1列至第12列倍比稀釋完成；(5)用酶標儀讀取605nm光密度。
實驗結(jié)果表明(見圖4a和4b)，在較低的細胞密度時，由細胞本身產(chǎn)生的605nm光密度保持在很低的水平，與刃天青產(chǎn)生的光密度相比，由細胞密度引入的誤差可以忽略。如果細胞密度較高(如雜交瘤細胞密度在106/ml以上，CHO細胞密度在5×106/ml以上)，細胞所引起的光密度仍占總光吸收的很小部分，但可以采取對照實驗排除。
實施例5低細胞密度條件下活細胞濃度檢測(CHO)(1)細胞計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基配成1×106細胞/ml的細胞懸液，分別在96孔細胞培養(yǎng)板的第1列中加入200μl；(2)分別在培養(yǎng)板的第2-12列中加入100μl無血清培養(yǎng)基；(3)在第一列中取出100μl細胞加入第2列，吹打混勻后取出100μl加入第3列。重復(fù)3.的操作至第12列后，取出100μl丟棄；至此細胞從第1列至第12列倍比稀釋完成；(4)依次加入30μl刃天青溶液；(5)用酶標儀讀取0時605nm光密度；此后分別在20、60、90、120、180、240分鐘各讀數(shù)一次，讀數(shù)間隔期間將培養(yǎng)板放置在37℃ CO2培養(yǎng)箱中。
實驗結(jié)果見圖5，在細胞密度0.05-1×106細胞/ml范圍內(nèi)，反應(yīng)時間60分鐘后，刃天青在605nm的光密度減少與細胞濃度呈線性關(guān)系。
實施例6髙細胞密度條件下活細胞濃度檢測(CHO)
(1)細胞計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基配成10×106細胞/ml的細胞懸液，分別在96孔細胞培養(yǎng)板的第1列中加入200μl；(2)分別在培養(yǎng)板的第2-12列中加入100μl無血清培養(yǎng)基；(3)在第一列中取出100μl細胞加入第2列，吹打混勻后取出100μl加入第3列。重復(fù)3.的操作至第12列后，取出100μl丟棄；至此細胞從第1列至第12列倍比稀釋完成；(4)依次加入30μl刃天青溶液；(5)用酶標儀讀取0時605nm光密度，此后分別在15、20、25、30分鐘各讀數(shù)一次，讀數(shù)間隔期間將培養(yǎng)板放置在37℃ CO2培養(yǎng)箱中。
實驗結(jié)果表明(見圖6)，在細胞濃度為1-10×106/ml范圍內(nèi)，反應(yīng)時間20分鐘后，刃天青在605nm的光密度減少與細胞濃度呈線性關(guān)系。
實施例7低細胞密度條件下活細胞濃度檢測(雜交瘤)(1)細胞計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基配成1×106細胞/ml的細胞懸液，分別在96孔細胞培養(yǎng)板的第1列中加入200μl；(2)分別在培養(yǎng)板的第2-12列中加入100μl無血清培養(yǎng)基；(3)在第一列中取出100μl細胞加入第2列，吹打混勻后取出100μl加入第3列。重復(fù)(3)的操作至第12列后，取出100μl丟棄；至此細胞從第1列至第12列倍比稀釋完成；(4)依次加入20μl刃天青溶液；(5)用酶標儀讀取0時605nm光密度，此后分別在60、90、120、180、240分鐘各讀數(shù)一次，讀數(shù)間隔期間將培養(yǎng)板放置在37℃ CO2培養(yǎng)箱中。
實驗結(jié)果表明(見圖7)，在細胞密度0.05-1×106細胞/ml范圍內(nèi)，反應(yīng)時間90分鐘后刃天青在605nm的光密度減少與細胞濃度呈線性關(guān)系。
實施例8髙細胞密度條件下活細胞濃度檢測(雜交瘤)(1)細胞計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基配成10×106細胞/ml的細胞懸液，分別在96孔細胞培養(yǎng)板的第1列中加入200μl；(2)分別在培養(yǎng)板的第2-12列中加入100μl無血清培養(yǎng)基；(3)在第一列中取出100μl細胞加入第2列，吹打混勻后取出100μl加入第3列。重復(fù)3.的操作至第12列后，取出100μl丟棄；至此細胞從第1列至第12列倍比稀釋完成；(4)依次加入20μl刃天青溶液；(5)用酶標儀讀取0時605nm光密度，此后分別在15、20、30、90分鐘各讀數(shù)一次，讀數(shù)間隔期間將培養(yǎng)板放置在37℃ CO2培養(yǎng)箱中。
實驗結(jié)果表明(見圖8)，在細胞濃度為1-10×106/ml范圍內(nèi)，反應(yīng)時間20分鐘后刃天青在605nm的光密度減少與細胞濃度呈線性關(guān)系。
實施例9刃天青在髙通量細胞培養(yǎng)中活細胞濃度檢測(1)雜交瘤細胞計數(shù)，并用無血清培養(yǎng)基配成1×105細胞/ml的細胞懸液，在96孔細胞培養(yǎng)板的第A、B排中分別加入110μl細胞懸液。共接種5塊培養(yǎng)板，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)24小時后取出一塊培養(yǎng)板，反復(fù)吹打混勻B1-B12孔中的細胞，每孔取出50μl細胞懸液，臺盼藍染色后用血球計數(shù)板計數(shù)活細胞；(3)在培養(yǎng)板的F-H排做細胞測活的標準曲線，按照實施例8的實驗步驟1-4稀釋細胞；(4)在A、F-H排分別加入刃天青，每孔20μl；(5)用酶標儀讀取0時605nm光密度，此后在20和90分鐘各讀數(shù)一次，讀數(shù)間隔期間將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中；(6)分別在第48、60、72和84小時取出一塊培養(yǎng)板重復(fù)以上檢測。
實驗結(jié)果表明(見圖9)，兩種活細胞檢測方法相比較，刃天青法測得的活細胞數(shù)比臺盼藍法測得的活細胞數(shù)高，但是兩者的趨勢一致，具有可比性。
實施例10雜交瘤培養(yǎng)基配方的髙通量篩選(1)在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入100μl不同配方的培養(yǎng)基(從A到H依次為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8)，每種配方重復(fù)4個孔；(2)細胞離心，棄去上清，用PBS洗兩遍，再用PBS懸浮、計數(shù)。用PBS配成1×106細胞/ml的細胞懸液，每孔分別加入10μl，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)；(3)48小時后取出培養(yǎng)板，每孔中加入20μl刃天青溶液；(4)用酶標儀讀取0時605nm的光密度，在20和90分鐘分別讀取605nm光密度，讀數(shù)間隔期間將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中；
(5)按照實施例7的實驗步驟在培養(yǎng)板中作細胞標準曲線，計算活細胞數(shù)。
實驗結(jié)果表明(圖10)，該方法可以用于培養(yǎng)基配方的高通量篩選。
實施例11雜交瘤培養(yǎng)基組分的髙通量優(yōu)化-異亮氨酸(1)在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入100μl無血清培養(yǎng)基，在A7-A9孔中分別加入100μl含50mM異亮氨酸(Isoleucine)的無血清培養(yǎng)基，吹打混勻后取出100μl加入B7-B9孔。重復(fù)上述操作，倍比稀釋至H7-H9，混勻后取出100μl丟棄。至此細胞從第1排至第8排倍比稀釋完成，異亮氨酸濃度分別為25.15、12.65、6.40、3.28、1.71、0.93、0.54、0.35mM；(2)細胞離心，棄去上清，用PBS洗兩遍，用PBS懸浮；細胞計數(shù)，用PBS配成1×106細胞/ml的細胞懸液，在培養(yǎng)板的各孔中分別加入10μl，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)；(3)48小時后取出，每孔分別加入20μl刃天青溶液；(4)用酶標儀讀取0時605nm的光密度，在20和90分鐘分別讀取605nm光密度，讀數(shù)間隔期間將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中；(5)按照實施例7的實驗步驟在培養(yǎng)板中作細胞標準曲線，計算活細胞數(shù)。
實驗結(jié)果表明(圖11)，當異亮氨酸濃度過高時對細胞生長有抑制作用，但可以告知培養(yǎng)基中可使用的最高濃度，從而用于培養(yǎng)基中的單一成分的優(yōu)化。
實施例12雜交瘤培養(yǎng)基組分的髙通量優(yōu)化-鐵復(fù)合物(1)在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入100μl無血清培養(yǎng)基，在A10-A12孔中分別加入100μl含500倍濃度鐵復(fù)合物的無血清培養(yǎng)基，吹打混勻后取出100μl加入B10-B12孔，重復(fù)上述操作，倍比稀釋至H10-H12，混勻后取出100μl丟棄。至此細胞從第1排至第8排倍比稀釋完成，F(xiàn)e復(fù)合物濃度分別為500、250、125、63、31、16、8、4倍濃度；(2)細胞離心，棄去上清，用PBS洗兩遍，用PBS懸浮；細胞計數(shù)，用PBS配成1×106細胞/ml的細胞懸液，在培養(yǎng)板的各孔中分別加入10μl，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)；(3)48小時后取出，每孔分別加入20μl刃天青溶液；(4)用酶標儀讀取0時605nm的光密度，在20和90分鐘分別讀取605nm光密度，讀數(shù)間隔期間將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中；
(5)按照實施例7的實驗步驟在培養(yǎng)板中做細胞標準曲線，計算活細胞數(shù)。
實驗結(jié)果表明(圖12)，當鐵復(fù)合物濃度過高時對細胞生長有抑制作用，但可以告知培養(yǎng)基中可使用的最高濃度，從而用于培養(yǎng)基中的單一成分的優(yōu)化。
權(quán)利要求
1.一種細胞培養(yǎng)基優(yōu)化的方法，其特征在于，該方法包括步驟a.將細胞接種到多孔板中的不同成分的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基為至少2種；b.在相同條件下培養(yǎng)這些細胞；c.檢測活細胞數(shù)；和d.選擇活細胞數(shù)最多的培養(yǎng)基作為優(yōu)選培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c為加入刃天青，測定605nm下的光密度。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所檢測活細胞濃度范圍在0.05-10×106細胞/ml之間。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測活細胞是通過酶標定法。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，刃天青在培養(yǎng)結(jié)束時加入。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述刃天青在溶液中以10-40μl/孔存在。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述刃天青在溶液中以20-30μl/孔存在。
全文摘要
公開了一種細胞培養(yǎng)基優(yōu)化的方法，該方法包括步驟a.將細胞接種到多孔板中的不同成分的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基為至少2種；b.在相同條件下培養(yǎng)這些細胞；c.檢測活細胞數(shù)；和d.選擇活細胞數(shù)最多的培養(yǎng)基作為優(yōu)選培養(yǎng)基。
文檔編號C12N5/06GK1778899SQ20041008434
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者沈秉謙, 貢向輝, 楊勝利 申請人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司