專利名稱：植物表皮毛控制基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)和植物改良基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及新的植物表皮毛控制基因GaMYB2及其編碼蛋白。本發(fā)明還公開了GaMYB2基因的用途，尤其在改良棉纖維基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物表皮毛是單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞分化、極性生長和形態(tài)建成的一個(gè)模式系統(tǒng)(Hulskamp，2004，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.5，471-480)。植物表皮毛分為腺毛和非腺毛，主要的功能是保護(hù)植物，如抵御蟲害、減少蒸發(fā)、提高抗凍力和防紫外線等(Marks等，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，137-163)。其中，棉纖維和腺毛還具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(Wilkins等，2000，Crit.Rev.Plant Sci.19，511-550；Wagner等，2004，Ann.Bot.(Lond)93，3-11)。
棉纖維是棉花種子的表皮毛，它是紡織工業(yè)最重要的天然纖維原料。棉纖維是一個(gè)單細(xì)胞，是已知的最長的植物細(xì)胞，一般長2.2～3.0cm；棉纖維細(xì)胞不含木質(zhì)素，纖維素占細(xì)胞干重的95％(Kim和Triplett，2001，Plant Physiol.1271361-1366)。棉纖維發(fā)育研究的進(jìn)展主要是分離了一些棉纖維優(yōu)勢(shì)或特異表達(dá)基因(John&Crow，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA 895769-5773；Li等，2002，Biochim.Biophys.Acta 1487106-111；Ji等，2003，Nucleic.AcidsRes.312534-2543；Ruan等，2003，Plant Cell 15952-964)。植物纖維素合成酶的第一個(gè)亞基CesA1/CesA2首先克隆于棉花(Pear等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9312637-12642)。
MYB類基因是克隆棉纖維發(fā)育關(guān)鍵基因的焦點(diǎn)，一些自棉纖維中分離的MYB基因的表達(dá)特征和進(jìn)化關(guān)系受到重視(Cedroni等，2003，Plant Mol.Biol.51313-325)。迄今為止，只有棉花蔗糖合成酶基因Sus(sucrose synthase gene)在棉花植物中證實(shí)與棉纖維發(fā)育相關(guān)。反義RNA分析表明，Sus參與棉纖維伸長(Ruan等，2003，Plant Cell 15952-964)。
綜上所述，目前位置對(duì)調(diào)控植物表皮毛的基因還知之甚少，因此為了調(diào)控植物表皮發(fā)育，尤其是改良棉纖維的品質(zhì)性狀，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的植物表皮毛調(diào)控基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的植物表皮毛調(diào)控蛋白GaMYB2蛋白以及其活性片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的GaMYB2多肽，它包括具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有調(diào)控表皮毛發(fā)育的功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2中第12-117位所示的R2R3MYB結(jié)構(gòu)域和第171-197位所示的激活域，且具有調(diào)控表皮毛發(fā)育的功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含—核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的—種核苷酸序列有至少70％(更佳地至少80％，最佳地至少90％)相同性(a)編碼上述棉花GaMYB2多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中74-745位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-818位的序列；或(c)具有SEQ ID NO3中1-594位的序列；(d)具有SEQ ID NO3中1-597位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，尤其是植物細(xì)胞。還提供了由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞所再生的植株。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備棉花GaMYB2多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出棉花GaMYB2多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的棉花GaMYB2多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種改變植物表皮毛的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有GaMYB2多肽的DNA編碼序列，所述的GaMYB2多肽的選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有調(diào)控表皮毛發(fā)育的功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2中第12-117位所示的R2R3MYB結(jié)構(gòu)域和第171-197位所示的激活域，且具有調(diào)控表皮毛發(fā)育的功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使GaMYB2多肽的DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入GaMYB2多肽的DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
在另一優(yōu)選例中，所述的植物是擬南芥或棉花。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種GaMYB2多肽的用途，其特征在于，它用于改變植物的表皮毛。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了GaMYB2基因的序列。下劃線的序列為編碼區(qū)，方框中的序列為內(nèi)含子。
圖2顯示了GaMYB2基因編碼的蛋白序列。下劃線的序列為R2R3MYB結(jié)構(gòu)域，方框中的序列為激活域。
圖3顯示了GaMYB2基因在棉花中的表達(dá)特征。DPA代表開花后的天數(shù)(dayspost-anthesis)。His代表histone3基因。
圖4顯示了GaMYB2基因?qū)M南芥表皮毛發(fā)育的調(diào)控。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次從亞洲棉(Gossypium arboreum)(也稱為木本棉)中分離到一個(gè)植物表皮毛調(diào)控基因，命名為GaMYB2。原位雜交和RT-PCR分析分析表明GaMYB2是一個(gè)棉纖維高表達(dá)的基因。酵母單雜交和擬南芥植物分析實(shí)驗(yàn)表明，GaMYB2調(diào)控棉纖維特異表達(dá)啟動(dòng)子GaRDL1。GaMYB2能控制擬南芥表皮毛的發(fā)育，不僅GL1∷GaMYB2完全互補(bǔ)擬南芥gl1突變體，而且35S∷GaMYB2可促使擬南芥種子產(chǎn)生表皮毛。因此，GaMYB2是一個(gè)控制棉纖維發(fā)育的關(guān)鍵基因，調(diào)控表皮毛發(fā)育。
在本發(fā)明中，術(shù)語“GaMYB2蛋白”、“GaMYB2多肽”或“植物表皮毛調(diào)控蛋白GaMYB2”可互換使用，都指具有植物表皮毛調(diào)控蛋白GaMYB2氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的植物表皮毛調(diào)控蛋白GaMYB2。
如本文所用，術(shù)語“GaMYB2”是Gossypium arboreum MYB 2的縮寫。
如本文所用，術(shù)語“內(nèi)含子”是指基因上一些DNA序列，它們能被轉(zhuǎn)錄，但在翻譯前即被加工剪切除去了。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的GaMYB2蛋白或多肽”是指GaMYB2多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化GaMYB2蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。GaMYB2多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括棉花GaMYB2蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然棉花GaMYB2蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“棉花GaMYB2多肽”指具有棉花GaMYB2蛋白活性的SEQ IDNO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與棉花GaMYB2蛋白相同功能(即調(diào)控表皮毛發(fā)育功能)的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括棉花GaMYB2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與棉花GaMYB2DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗棉花GaMYB2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含棉花GaMYB2多肽或其片段的融合蛋白(如與GST形成的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了棉花GaMYB2多肽的片段。通常，該片段具有棉花GaMYB2多肽序列的至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供棉花GaMYB2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然棉花GaMYB2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“棉花GaMYB2蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0。1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼GaMYB2蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的棉花GaMYB2核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或GaMYB2蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的GaMYB2多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼棉花GaMYB2多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，棉花GaMYB2多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含棉花GaMYB2編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得表皮毛改變的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的棉花GaMYB2蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于篩選促進(jìn)或?qū)笹aMYB2蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)棉花GaMYB2DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于棉花GaMYB2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與棉花GaMYB2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制棉花GaMYB2蛋白的分子，也包括那些并不影響棉花GaMYB2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的棉花GaMYB2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的棉花GaMYB2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)棉花GaMYB2蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷棉花GaMYB2蛋白功能的抗體以及不影響棉花GaMYB2蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用棉花GaMYB2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與棉花GaMYB2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗棉花GaMYB2蛋白的抗體可用于檢測樣品中是否存在棉花GaMYB2蛋白。一種檢測檢測樣品中是否存在GaMYB2蛋白的方法是利用GaMYB2蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與GaMYB2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在GaMYB2蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從亞洲棉中分離出的。其基因組序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為818個(gè)堿基，包含2段CDS(即74-209和288-745位)；相應(yīng)的cDNA序列列于SEQ ID NO3，其中開放讀框位于1-594位(其中)，編碼全長為198個(gè)氨基酸的棉花GaMYB2蛋白(SEQ ID NO2)。GaMYB2為改良植物的表皮毛(尤其是棉花的棉纖維)的提供了新的途徑，因而具有巨大的潛在應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular cloningA laboratorymanual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 GaMYB2基因的分離棉花DNA提取采用冷酚法。2g材料(亞洲棉(Gossypium arboreum)的棉纖維)，在液氮中磨成粉末，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加入8ml提取緩沖液(1M Tris·HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，震蕩混勻，冰上放置1小時(shí)，每隔10分鐘混勻一次。4℃，13000g離心20分鐘。重復(fù)酚∶氯仿∶異戊醇抽提2～4次，最后用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次。取上清夜，加入1/2體積的高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉，1.2M NaCl)和1/2體積異丙醇，混勻，-70℃放置1小時(shí)。4℃，13000g離心20分鐘。以下根據(jù)提取DNA和RNA而采取相應(yīng)的操作。去上清液，用1ml 70％乙醇清洗沉淀2次，室溫吹20分鐘，沉淀溶于1ml無菌水。4℃，13000g離心10分鐘。取上清液，加5～10μl RNase(10mg/ml)，37℃，30分鐘。
用以下引物GaMYB2-F 5’-CCTTCCCT TGTTTCTCACTAATC-3’(SEQ ID NO4)和GaMYB2-R 5’-CACACCAATAATTGTTGTTTTTTT CTTC-3’(SEQ ID NO5)。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃預(yù)變性30秒鐘，60℃復(fù)性30秒鐘，72℃延伸30秒鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。亞克隆后測序，確認(rèn)序列是否正確。
測序結(jié)果如SEQ ID NO1和圖1所示，這是一基因組序列，它包含的多核苷酸序列全長為818個(gè)堿基，包含2段CDS(即74-209和288-745位)；相應(yīng)的cDNA序列列于SEQ ID NO3，其中開放讀框位于1-594位(其中)，編碼全長為198個(gè)氨基酸的棉花GaMYB2蛋白(SEQ ID NO2和圖2)。
用上述相同方法抽提棉花的各種組織的DNA，用相同引物進(jìn)行常規(guī)的RT-PCR。還用基于SEQ ID NO1的探針進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)，結(jié)果表明GaMYB2是一個(gè)棉纖維高表達(dá)的基因(圖3)。
實(shí)施例2載體構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化根據(jù)GaMYB2基因的全長編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3中最前20bp和最后20bp)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將GaMYB2的基因組DNA克隆至中間載體pBluescript(購自Stratagene公司)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI121(購自Clontech公司)，在保證閱讀框的前提下鑒定好的表達(dá)載體，在將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中，獲得陽性克隆，用于轉(zhuǎn)化棉花等植物。
農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化采用凍融法。將單菌落LBA4404或GV3101(Invitrogen)，3mlLB培養(yǎng)基(25μg/ml利福霉素Rif和50μg/ml卡拉霉素Kan或慶大霉素Gen)，28℃，220rpm，過夜培養(yǎng)。2ml菌液，50ml LB培養(yǎng)基(25μg/ml Rif和50μg/mlGen)，28℃，220rpm，培養(yǎng)到OD600＝0.5(約6小時(shí))。在冰上放置30分鐘，4℃，5000g離心5分鐘。重懸于10ml 0.15M NaCl。4℃，5000g離心5分鐘。重懸于1ml 20mM CaCl2，50μl/管分裝，液氮速凍，-70℃保存感受態(tài)細(xì)胞?；旌虾康幕螂p元載體和50μl/管感受態(tài)細(xì)胞，在冰上放置30分鐘，液氮速凍1分鐘。在37℃水浴中5分鐘使菌液融化，加1ml LB培養(yǎng)基，28℃，220rpm，培養(yǎng)2～4小時(shí)。取50～100μl涂LB培養(yǎng)基平板(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml卡拉霉素Kan或潮霉素Hyg)。
實(shí)施例3植物轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因后代的篩選在本實(shí)施例中，以棉花和擬南芥的轉(zhuǎn)基因?yàn)槔?，其他植物的轉(zhuǎn)化可以此為參照。
a.棉花的轉(zhuǎn)基因采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化棉花。
取5日齡的無菌苗下胚軸上部切段(0.5cm)預(yù)培養(yǎng)36小時(shí)。培養(yǎng)基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L。
下胚軸切段于農(nóng)桿菌菌液(SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L)中浸泡20分鐘。
共培養(yǎng)3天。培養(yǎng)基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L。
愈傷組織起始誘導(dǎo)25～30天。培養(yǎng)基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+Km50mg/L+頭孢霉素(cef)300mg/L或MSB+2，4-D 0.1mg/L+IAA0.1mg/L+ZT0.1mg/L+Km 50mg/L+cef 300mg/L。
胚性愈傷組織誘導(dǎo)及繼代篩選，每15天增殖一次。挑選松軟、淡綠色或灰色的愈傷組織用于胚性愈傷的誘導(dǎo)；挑選新鮮、黃色、致密、顆粒狀的胚性愈傷組織繼代增殖。培養(yǎng)基SH或MSB(NH4NO3為0.3mg/L)+IAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+Km75mg/L+Cef 300mg/L。
胚狀體形成和成熟。培養(yǎng)基MSB(KNO3加倍無激素)+Km 75mg/L+Cef 300mg/L。
胚狀體(萌發(fā))伸長、生長。培養(yǎng)基MSB(無激素)+活性炭250mg/L+Km75mg/L+Cef 300mg/L。
胚狀體真葉生長。培養(yǎng)基MSB+IBA0.4mg/L+KT0.1mg/L+Km75mg/L+Cef300mg/L。部分成正常小植株；部分采取嫁接。
結(jié)果提示，GaMYB2調(diào)控棉纖維特異表達(dá)啟動(dòng)子GaRDL1(以下簡稱為GL1)(SEQID NO6)，調(diào)控棉花的表皮毛發(fā)育。
b.擬南芥的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的轉(zhuǎn)化采用花芽浸泡法(floral dip)(方法按Clough和Bent，1998，Plant J.16，735-743進(jìn)行)。將含雙元載體的單菌落GV3101(Invitrogen)，3ml LB培養(yǎng)基(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小時(shí)。2ml菌液，50ml LB培養(yǎng)基(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小時(shí)。50ml菌液，250ml LB培養(yǎng)基(50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小時(shí)。4200rpm(2900g)，15分鐘。菌體重懸于500ml含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株地上部分在菌液中浸泡5sec，平放于塑料盆內(nèi)，保濕，避光，16～24小時(shí)。T0代種子在4℃春化2～4d，用20％漂水處理15分鐘，無菌水清洗3～4遍。懸于0.5％的瓊脂糖(55℃)，鋪在0.6％瓊脂的LB培養(yǎng)基(50μg/ml Kan或Hyg)，22℃，連續(xù)光照，約一周后，綠色抗性苗移栽到營養(yǎng)土(泥炭∶蛭石∶珍珠巖1∶1∶1)中生長。
結(jié)果見圖4。圖4表明，轉(zhuǎn)入擬南芥后，GL1∷GaMYB2使野生型表皮毛減少。此外，GL1∷GaMYB2完全互補(bǔ)擬南芥gl1突變體，使gl1無毛突變體的體毛恢復(fù)。此外，35S∷GaMYB2可促使擬南芥種子產(chǎn)生表皮毛。這些結(jié)果表明，GaMYB2能控制擬南芥表皮毛的發(fā)育。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植物的分子生物學(xué)鑒定在本實(shí)施例中，選取實(shí)施例3獲得的擬南芥T3代純合株系，采用抗生素篩選、PCR、GUS染色和Southern雜交分析等方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行驗(yàn)證。
a.PCR分析DNA提取方法和PCR反應(yīng)條件見實(shí)施例1。引物為SEQ ID NO4和5。
b.GUS染色分析GUS染色液浸泡植物材料，37℃，12～24小時(shí)。70％乙醇脫色，樣品在70％乙醇中保存。GUS染色液(100mM pH7.0磷酸緩沖液，50mM K3[Fe(CN)6]，50mMK4[Fe(CN)6]，10mM EDTA，1mM X-gluc，0.1％Triton X-100)。
c.Southern雜交分析10μg DNA，選3～5種限制酶，完全酶切(過夜)。0.7％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后切去凝膠的無用部分。在變性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中浸泡45分鐘，溫和搖動(dòng)。去離子水漂洗，在中和液(1.5M NaCl，1M Tris·HCl，pH7.4)中浸泡45分鐘，溫和搖動(dòng)。
采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜Hybond-XL(Amersham-PharmaciaBiotech)，轉(zhuǎn)移緩沖液為20XSSC(3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉)，轉(zhuǎn)移時(shí)間為12-18小時(shí)。用6XSSC漂洗尼龍膜，夾在濾紙中間，壓在玻璃板之間，80℃烘2小時(shí)。
25ng經(jīng)割膠醇化的PCR產(chǎn)物，采用Primer-a-Gene Labeling System(Promega)標(biāo)記探針。α-32P-dCTP，50μl反應(yīng)體系，37℃，1小時(shí)。采用QIAquick NucleotideRemoval Kit(QIAGEN)純化探針。沸水浴中10分鐘，放置冰上。
將尼龍膜放入雜交管中，加10ml預(yù)雜交液(50％甲酰胺，5XSSC，5XDenhardt，1％SDS，100μg/ml變性魚精DNA)，42℃，2～4小時(shí)。加入變性的探針，雜交16～24小時(shí)。
去雜交液，在室溫用含0.1％SDS的2XSSC洗膜2次，每次5分鐘。在室溫用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次5分鐘。在42℃用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次15分鐘。在室溫用2XSSC洗膜2次。取出尼龍膜，滴干雜交液，用保鮮膜包裹，膠帶固定，壓增感屏和X-ray膠片，-70℃，2d。膠片用D-72液顯影。
試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株中的確轉(zhuǎn)入了棉花的GaMYB2基因，而對(duì)照的擬南芥植株則不含GaMYB2基因。
實(shí)施例5GaMYB2蛋白的表達(dá)(1)表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)GaMYB2基因的全長編碼序列(SEQ ID NO3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼讀框的引物。GaMYB2基因的全長基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，克隆至表達(dá)載體pRS426-CUP(購自Clontech公司)，在保證閱讀框正確的前提下鑒定表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入模式生物釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
(2)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母A.用無菌牙簽挑取YEPD平板中釀酒酵母單菌落于2mL液體YEPD培養(yǎng)基中，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
B.次日轉(zhuǎn)入200mLYEPD培養(yǎng)基中28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)直至OD600＝1.0～1.3之間。
C.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50mL離心管中4000rpm，4℃離心10min，棄取上清。
D.將等體積的去離子水加入離心管中，重懸細(xì)胞，4000rpm，4℃離心10min。棄取上清。
E.將一半體積的去離子水加入離心管中，重懸細(xì)胞，4000rpm，4℃離心10min。棄取上清。
F.將一半體積的1M山梨醇加入離心管中，重懸細(xì)胞，4000rpm，4℃離心10min。棄取上清。
G.將500μL的1M山梨醇加入離心管。
H.將100μL感受態(tài)酵母細(xì)胞與100ng質(zhì)粒DNA混勻，加入至0.1cm電擊杯中冰浴20min，放置于BioRed電穿孔儀中按25μF，1500V電擊。
I.然后迅速加入1mL 1M山梨醇，混勻后將部分細(xì)胞涂布于選擇平板上(無尿嘧啶培養(yǎng)基)30℃培養(yǎng)3～6天，從而獲得轉(zhuǎn)入GaMYB2蛋白的酵母菌株。
轉(zhuǎn)入GaMYB2蛋白的酵母菌株的細(xì)胞裂解物在對(duì)應(yīng)于約20KDa處有一明顯的GaMYB2蛋白條帶。
實(shí)施例6抗GaMYB2蛋白抗體的產(chǎn)生將實(shí)施例5中獲得的重組棉花GaMYB2蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀棉花GaMYB2蛋白基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與GaMYB2蛋白發(fā)生結(jié)合。
實(shí)施例7GaMYB2的突變體用常規(guī)的定點(diǎn)誘變方法，對(duì)SEQ ID NO3的核苷酸序列進(jìn)行取代或添加，從而使SEQ ID NO2的195位的Leu變?yōu)镮le(突變體1)，SEQ ID NO2的195位的Leu變?yōu)閍la(突變體2)、和在SEQ ID NO2的198位之后添加一個(gè)Ala(突變體3)。然后按實(shí)施例3b中相同的方法轉(zhuǎn)化擬南芥。
結(jié)果表明，在啟動(dòng)子GL1控制下的這三種突變體同樣可以互補(bǔ)擬南芥gl1突變體，使gl1無毛突變體的體毛恢復(fù)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>植物表皮毛控制基因<130>044446<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>818<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<220>
<221>CDS<222>(74)..(209)<223>
<220>
<221>CDS<222>(288)..(745)<223>
<400>1ccttcccttg tttctcacta atcatctctg tcttcccttc tcactctttg cctcttctca 60ctgtcggcta ata atg gct cca aag aag gat gga gtg agc aaa agg gtt 109Met Ala Pro Lys Lys Asp Gly Val Ser Lys Arg Val1 5 10ttt aac aaa ggt tct tgg aca gct gag gaa gat aga aga ttg gct aaa157Phe Asn Lys Gly Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Leu Ala Lys15 20 25tat att gag att cat ggc gca aag aga tgg aaa aca atc gcc att aaa205Tyr Ile Glu Ile His Gly Ala Lys Arg Trp Lys Thr Ile Ala Ile Lys30 35 40tca g gtaatttact ttctgttgaa gagaaactcc attttttgga gcattggaat 259Ser45
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<210>2<211>198<212>PRT<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>2Met Ala Pro Lys Lys Asp Gly Val Ser Lys Arg Val Phe Asn Lys Gly1 5 10 15Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Glu Ile20 25 30His Gly Ala Lys Arg Trp Lys Thr Ile Ala Ile Lys Ser Gly Leu Asn35 40 45Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro50 55 60Asn Ile Lys Arg Gly Asn Ile Ser Asp Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile65 70 75 80Arg Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg85 90 95Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His100 105 110Leu Ser Lys Lys Ile Ile Asn His Asp Val Arg Thr Glu Gln Thr Ser115 120 125Ser Ser Glu Gln Ile Val Pro His Lys Ala Trp Glu Thr Val His Met130 135 140Glu Glu Glu Glu Val Val Lys Gly Ser Asp Glu Ile Glu Asn Ser Glu145 150 155 160Phe Ser Ile Asp Val Asp Glu Phe Phe Asp Phe Thr Thr Glu Gly Cys165 170 175Phe Thr Leu Asp Trp Val Ash Lys Phe Leu Glu Leu Asp Asp Gln Gln180 185 190Asp Pro Leu Ala Met Val195<210>3<211>597<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>3atggctccaa agaaggatgg agtgagcaaa agggttttta acaaaggttc ttggacagct60gaggaagata gaagattggc taaatatatt gagattcatg gcgcaaagag atggaaaaca120atcgccatta aatcaggttt gaatcgatgc ggcaagagtt gcaggttgag atggttgaac180tacttgagac ctaacattaa gagaggcaac atatcagatg aagaagagga cttaattatt240aggcttcata aactgctggg gaacaggtgg tctttgattg ctgggagact tccagggcga300acagacaatg aaattaagaa ctactggaat tcccatttga gcaagaaaat aataaaccat360
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1.一種分離的GaMYB2多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有調(diào)控表皮毛發(fā)育的功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2中第12-117位所示的R2R3MYB結(jié)構(gòu)域和第171-197位所示的激活域，且具有調(diào)控表皮毛發(fā)育的功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中74-745位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-818位的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-594位的序列；(d)具有SEQ ID NO3中1-597位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出GaMYB2多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的GaMYB2多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種改變植物表皮毛的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有GaMYB2多肽的DNA編碼序列，所述的GaMYB2多肽的選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有調(diào)控表皮毛發(fā)育的功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2中第12-117位所示的R2R3MYB結(jié)構(gòu)域和第171-197位所示的激活域，且具有調(diào)控表皮毛發(fā)育的功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使GaMYB2多肽的DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入GaMYB2多肽的DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的植物表皮毛調(diào)控蛋白－GaMYB2蛋白，編碼GaMYB2蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種GaMYB2蛋白的方法。GaMYB2蛋白是一個(gè)控制棉纖維發(fā)育的關(guān)鍵基因，可控制表皮毛的發(fā)育。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1778813SQ200410084399
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月22日
發(fā)明者陳曉亞, 王水, 李春紅, 王凌健 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院