專利名稱：一種辣椒游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種辣椒游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
目前，由于植物具有的雜種優(yōu)勢(shì)，使目前的作物育種側(cè)重在雜交育種上。這一方面可以利用雜種的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)形成高產(chǎn)，另一方面由于雜種的復(fù)雜遺傳背景，使其不宜留種使用，從而能保護(hù)雜種研制者的利益。在雜交育種中，所用父母本材料的遺傳背景必須是純合的，經(jīng)配種后才能得到性狀一致的雜種。而要得到遺傳背景純合的親本材料，在許多作物中都必須通過(guò)人工輔助自交授粉，經(jīng)5-8年時(shí)間才能達(dá)到相對(duì)純合。這種傳統(tǒng)的雜交育種手段非常費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。植物的雄性生殖細(xì)胞——花粉，由于經(jīng)減數(shù)分裂后只帶有一套母體的染色體，是單倍性細(xì)胞，通過(guò)花藥或未成熟花粉(小孢子)培養(yǎng)可以獲得單倍體植株，進(jìn)而通過(guò)染色體加倍成為雙單倍體材料，這樣可以達(dá)到該植株遺傳背景的完全純合狀態(tài)。這一方面可以克服雜合狀態(tài)時(shí)，顯性基因?qū)﹄[性基因的屏蔽作用，有利于隱性突變或基因重組性狀的表達(dá)，另一方面可以直接獲得純合材料，從而作為親本材料應(yīng)用于雜交育種。通常由小孢子培養(yǎng)來(lái)獲得純合材料僅需要1-2年時(shí)間，能大大加速育種進(jìn)程，提高育種效率。因此國(guó)際上對(duì)作物的單倍體育種研究非常重視，已在小麥、大麥、油菜、白菜等許多作物上建立了良好的單倍體育種技術(shù)體系。
辣椒(Capsicum annuum L.)的雜種優(yōu)勢(shì)明顯，目前雜交育種成為主要的育種手段。辣椒的花藥培養(yǎng)已經(jīng)有很多研究，最早成功于1973年王玉英及George等人的工作(Wang Y Y，Sun C S，Wang C C，et al.The induction of the pollenplantlets of triticale and Capsicum annuum from anther culture.Sci.Sinica，1973，16147-151；George L，Narayanswamy S.Haploid Capsicum throughexperimental androgenensis.Protoplasma，1973，78467-470)。之后1981年Dumas等對(duì)花藥培養(yǎng)體系進(jìn)行了較大的改進(jìn)，提高了出胚率(Dumas de Vaulx，R.，D.Chambonnet，E.Pochard.Culture in vitro d’anthères de piment(Capsicum annuumL.)Amélioration des taux d’obtention de plantes chez différents genotypes par destraitements à+35C.Agronomie，1981，1859-864)。在此基礎(chǔ)上又有許多相關(guān)試驗(yàn)(Morrison R A，Koning R E，Evans D A.Anther culture of an interspecifichybrid of Capsicum.J.Plant Physiol.，1986，1261-9；Kell K，Andersen S B，Effectsof donor plant temperature，photoperiod，and age on anther culture response ofCapsicum annuum L.Euphytica，1993，67105-109；MitykóJ，Andrasfalvy A，Csillery G，F(xiàn)ári M，Anther-culture response in different genotypes and F1 hybridsof pepper(Capsicum annuum L).Plant Breeding，1995，11478-80；王立浩，張寶璽，郭家珍，等.辣椒花藥培養(yǎng)中若干影響因素的研究.園藝學(xué)報(bào)，2004，31(2)199-204.)。1997年Ramon等建立了固液相雙層培養(yǎng)體系，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)操作并進(jìn)一步提高了出胚率(Ramon Dolcet-sanjuan，Elisabet Claveria，Agustin Huerta.Androgenesis in Capsicum annuum L-Effects of carbohydrate and carbon dioxideenrichment.J.Amer.Soc.Hort.Sci，1997，122(4)468-475)。但是所有這些都是在花藥培養(yǎng)上的研究成果。
完整花藥連同其內(nèi)部的未成熟花粉粒(小孢子)一起進(jìn)行體外培養(yǎng)，稱作花藥培養(yǎng)。由于花藥壁細(xì)胞是二倍體細(xì)胞，因此通過(guò)花藥培養(yǎng)獲得的再生植株有可能來(lái)自單倍性的花粉粒，也可能來(lái)自藥壁的二倍體細(xì)胞，這樣會(huì)造成再生植株的混雜，大大影響該方法的育種應(yīng)用。將未成熟花粉粒(小孢子)自花藥中分離出來(lái)，單獨(dú)培養(yǎng)，稱為游離小孢子培養(yǎng)。由于游離小孢子的單細(xì)胞性、單倍性以及大群體特性，使得它在雄性生殖的研究及應(yīng)用上，具有比花藥培養(yǎng)更多的優(yōu)點(diǎn)如可以完全避免花藥壁二倍體細(xì)胞的干擾，獲得大量完全真實(shí)的單倍體或雙單倍體植株，有利于育種應(yīng)用；此外，單細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以用于基因?qū)?，基因表達(dá)，雄核發(fā)育的調(diào)控研究，細(xì)胞的分裂、分化和發(fā)育等理論研究。人們一直很關(guān)注該技術(shù)的建立，但是辣椒的游離小孢子培養(yǎng)系統(tǒng)卻一直沒(méi)有成功報(bào)道。說(shuō)明可能由于辣椒小孢子的特異性，需要一個(gè)非常規(guī)的培養(yǎng)技術(shù)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種辣椒(Capsicum annuum L.)游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下方案先對(duì)花藥進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后進(jìn)行小孢子的游離培養(yǎng)。
具體地說(shuō)，該方法采用以下步驟(1)花藥預(yù)培養(yǎng)摘取小孢子處于單核后期的花蕾，剝?nèi)セㄝ嗖糠?。?0％乙醇浸10秒后，0.1％升汞振蕩滅菌10分鐘。無(wú)菌水清洗4次，剝?nèi)』ㄋ幗臃N于PAC培養(yǎng)基上，之后給以35℃或32℃高溫暗處理8天，轉(zhuǎn)入26℃暗培養(yǎng)。
(2)游離小孢子及其細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)將在固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)15天后的無(wú)菌花藥轉(zhuǎn)接入盛有2ml PMC液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(φ6cm)中，每皿12個(gè)花藥，用鑷子輕夾花藥，釋放出小孢子及其細(xì)胞團(tuán)，然后將花藥壁等碎片夾出。干凈的小孢子懸浮液于26℃暗培養(yǎng)，4周后即可獲得小孢子胚狀體。
可用以下方法進(jìn)行鑒定(1)植株誘導(dǎo)將具胚狀體的培養(yǎng)皿自暗室中移至光照條件下，二周后，將魚(yú)雷期及子葉期的胚狀體轉(zhuǎn)接入植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基PPI中，2000Lux，16小時(shí)光照，25℃下培養(yǎng)，誘導(dǎo)植株形成。
(2)倍性鑒定取各瓶苗中齡葉片約150mg，在2ml LB01(Dolezel et al.Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry.Biol.Plant.，1989.31113-120)細(xì)胞裂解液中用鋒利刀片切碎后，經(jīng)50μm尼龍膜過(guò)濾，濾液收集在BD流式細(xì)胞儀上樣管中。1000rpm離心5分鐘后，倒去上清液，沉淀中加入200μl濃度為50μg/ml的PI(propidium iodide)核染色劑，避光冷藏20分鐘后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定植株的倍性水平。激發(fā)光波長(zhǎng)488nm。對(duì)照材料為二倍體的供體母株葉片。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明在辣椒的游離小孢子培養(yǎng)體系上另辟蹊徑，通過(guò)游離培養(yǎng)經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的花藥中的小孢子細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)，獲得了胚狀體及其植株，顯微鏡檢提供了胚狀體的單細(xì)胞、單倍體發(fā)育途徑的細(xì)胞學(xué)證據(jù)。該技術(shù)體系的建立，不僅是辣椒單倍體育種技術(shù)上的突破，而且該游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)體系還可能成為進(jìn)行植物細(xì)胞分化、發(fā)育研究的良好實(shí)驗(yàn)體系。


圖1為35℃下預(yù)培養(yǎng)5-8天后花藥中的小孢子DAPI熒光染色揭示發(fā)育中小孢子的細(xì)胞核發(fā)生對(duì)稱分裂，未發(fā)育小孢子細(xì)胞核消失。
圖2為懸浮培養(yǎng)中的游離小孢子細(xì)胞團(tuán)。
圖3為細(xì)胞團(tuán)分化出子葉端及胚根端。
圖4為形成胚狀體的TTC活力染色。
圖5為游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)形成的處于不同發(fā)育時(shí)期的胚狀體。
圖6為自胚狀體形成的完整植株。
具體實(shí)施例方式
1材料與方法辣椒(包括甜椒、辣椒品種，Capsicum annuum L)供體母株生長(zhǎng)于具防蟲(chóng)網(wǎng)的塑料大棚內(nèi)，試驗(yàn)在5月至9月下旬間進(jìn)行。
花藥培養(yǎng)摘取小孢子處于單核后期的花蕾，剝?nèi)セㄝ嗖糠?。?0％乙醇浸10秒后，0.1％升汞振蕩滅菌10分鐘。無(wú)菌水清洗4次，剝?nèi)』ㄋ幗臃N于固體培養(yǎng)基PAC(表1，參照CP培養(yǎng)基(Dumas，1981)，有改動(dòng))上，之后給以35℃或32℃高溫暗處理8天，轉(zhuǎn)入26℃暗培養(yǎng)。
游離小孢子及其細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)自預(yù)培養(yǎng)15天后的花藥中采用直接擠壓法游離小孢子及其細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基PMC(表1，參照CP培養(yǎng)基，有改動(dòng))中，每皿(φ6cm)2ml，12個(gè)花藥，26℃暗培養(yǎng)，4周后調(diào)查胚狀體形成情況。
在花藥培養(yǎng)及游離細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，采用FDA檢查細(xì)胞的活力(Heslop HJ，Heslop H Y.Evalution of pollen viability by enzymatically-induced fluorescenceIntracellular hydrolysis of fluorescein diacetate.Stain Technol，1970，45115-120)。DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的分裂情況(Colemen AW，Goff L J.Application of fluorochrome to pollen biology I.Mithramycin and4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)as vital stain and for quantification ofnuclear DNA.Stain Technol，1985，60145-154)。對(duì)形成的胚狀體采用0.5％氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察胚狀體活力情況(國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)，國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程，顏啟傅等譯，技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1976，P24-26，31-32)。
植株誘導(dǎo)將具胚狀體的培養(yǎng)皿自暗室中移至光照條件下，二周后，將魚(yú)雷期及子葉期的胚狀體轉(zhuǎn)接入植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基PPI(表1，參照NT培養(yǎng)基)中，2000Lux，16小時(shí)光照，25℃下培養(yǎng)，誘導(dǎo)植株形成。
倍性鑒定取各瓶苗中齡葉片約150mg，采用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國(guó)BD公司)測(cè)定植株的倍性水平。核染色劑為碘化丙啶(propidium iodide)，濃度50μg/ml，激發(fā)光波長(zhǎng)488nm。對(duì)照材料為二倍體的供體母株葉片。DNA數(shù)據(jù)獲取軟件為CellQuest，倍性分析軟件為ModFit。
表1 辣椒小孢子植株誘導(dǎo)所用培養(yǎng)基

2結(jié)果與分析2.1胚狀體發(fā)育的細(xì)胞學(xué)證據(jù)實(shí)驗(yàn)鏡檢了自花藥預(yù)培養(yǎng)開(kāi)始至游離細(xì)胞的培養(yǎng)，胚狀體形成的全部發(fā)育過(guò)程。
35℃高溫處理5天后，自花藥中游離小孢子。FDA檢查顯示，約25％的小孢子仍具有較好的活力，這些小孢子細(xì)胞膨大飽滿并成圓形，而其它細(xì)胞不發(fā)出綠色熒光，失去活力，細(xì)胞仍然保持剛游離時(shí)具明顯萌發(fā)溝的狀態(tài)。DAPI檢查顯示，膨大細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞核發(fā)生了均等分裂(圖1)，而一直培養(yǎng)在26℃下的對(duì)照材料小孢子細(xì)胞核基本為非對(duì)稱分裂，形成在染色深淺，大小上有差異的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞及生殖細(xì)胞核。
35℃培養(yǎng)10天時(shí)，小孢子細(xì)胞核已經(jīng)發(fā)生了2-多次分裂，發(fā)育極不同步；細(xì)胞壁形成或未形成，從而形成了多核細(xì)胞或多細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞壁的形成有在一次核分裂后隨即產(chǎn)生并導(dǎo)致細(xì)胞分裂的，也有在核分裂多次后才形成細(xì)胞壁，產(chǎn)生細(xì)胞分裂的，甚至在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)有12個(gè)左右的細(xì)胞核而尚沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞分裂的。觀察也可見(jiàn)，發(fā)生了分裂的細(xì)胞已經(jīng)脫出了花粉壁，而沒(méi)有分裂的細(xì)胞盡管已經(jīng)有多核，仍尚處于花粉壁中，在后期發(fā)生了細(xì)胞分裂，形成細(xì)胞團(tuán)后才能脫出花粉壁。
培養(yǎng)15天后，將小孢子及其細(xì)胞團(tuán)自花藥中游離出來(lái)進(jìn)行液體培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的分裂仍然很不同步，有多細(xì)胞團(tuán)，也有僅處于二次分裂的細(xì)胞(圖2)。細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中能夠繼續(xù)生長(zhǎng)分化，在游離培養(yǎng)10天后，可以觀察到一些細(xì)胞團(tuán)已經(jīng)有極性形成，產(chǎn)生子葉和胚根的分化(圖3)。游離培養(yǎng)25天后，自球形期胚至子葉期胚的各級(jí)胚狀體逐步形成，胚狀體的發(fā)育程度表現(xiàn)出極其不同步特性(圖5)，這與早期細(xì)胞分裂的不同步性是相一致的。
在暗培養(yǎng)條件下，液體培養(yǎng)基中形成的胚狀體顏色為白色或灰白色。對(duì)其采用TTC染色法進(jìn)行了活力檢查，可見(jiàn)大部分胚狀體具較好活力(圖4)。
2.2自胚狀體的植株再生懸浮培養(yǎng)獲得的小孢子胚狀體在轉(zhuǎn)接入植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，經(jīng)二次繼代培養(yǎng)(約40天)，得到了株型正常的植株(圖6)。表2列出了國(guó)際上辣椒單倍體誘導(dǎo)技術(shù)的有關(guān)工作及其結(jié)果?？梢钥闯鑫覀兘⒌挠坞x小孢子培養(yǎng)技術(shù)，不管是在出胚率還是在胚的質(zhì)量(與再生植株能力密切相關(guān))上，都比以前報(bào)道的工作有了較大的提高。
表2 辣椒(Capsicum annuum L)單倍體育種不同技術(shù)及其效果*

*表中所列數(shù)值全部為該報(bào)道中最好結(jié)果的數(shù)值辣椒的花藥培養(yǎng)中始終存在一個(gè)胚狀體發(fā)育很不同步，發(fā)育不正常，質(zhì)量差，成苗率低的問(wèn)題。其正常胚僅占全部胚狀體的1/20-1/10，而最后的植株成苗率僅為胚狀體總數(shù)的1/10-1/100[8]。因此辣椒花藥培養(yǎng)的限制因素不是在分裂細(xì)胞頻率以及胚狀體的數(shù)目上，而是在胚狀體的進(jìn)一步正常發(fā)育，特別是原胚的正常發(fā)育從而提高具子葉，生長(zhǎng)點(diǎn)的正常胚狀體的比例上。本研究自預(yù)培養(yǎng)15天后的花藥中游離小孢子細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)，一方面，證明了對(duì)這些發(fā)育程度不等的細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)能夠獲得小孢子胚狀體，另一方面可能由于細(xì)胞團(tuán)在懸浮培養(yǎng)中的營(yíng)養(yǎng)供給及生長(zhǎng)空間較花藥中好，本研究中獲得了最高為12個(gè)花藥產(chǎn)生22個(gè)胚狀體的結(jié)果，且子葉期胚的的比例約為23％，與常規(guī)花藥培養(yǎng)比較，表現(xiàn)較好。
無(wú)疑，本發(fā)明中游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)路線，對(duì)于研究培養(yǎng)基因素或其它因素對(duì)于小孢子細(xì)胞分裂、分化的影響，研究植物細(xì)胞的發(fā)育及形態(tài)建成，優(yōu)化辣椒的雄性單性生殖技術(shù)，提高正常胚狀體頻率是一個(gè)很好的研究體系。
2.3再生植株的倍性鑒定取生長(zhǎng)良好的葉片，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色體倍性分析。結(jié)果表明，在再生株中，存在著單倍體，二倍體及混倍體植株。由于胚狀體發(fā)育的早期鏡檢顯示分裂細(xì)胞團(tuán)來(lái)自小孢子，因此后二者應(yīng)該是在小孢子細(xì)胞團(tuán)的分裂分化過(guò)程中，染色體自然加倍形成的雙單倍體材料，以及可能同一細(xì)胞團(tuán)中，部分細(xì)胞染色體發(fā)生了加倍，而部分細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生染色體加倍產(chǎn)生的混倍體材料。
權(quán)利要求
1.一種辣椒游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)方法，其特征在于先對(duì)花藥進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后進(jìn)行進(jìn)行小孢子的游離培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的辣椒游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)花藥培養(yǎng)摘取小孢子處于單核后期的花蕾，剝?nèi)セㄝ嗖糠?；?0％乙醇浸10秒后，0.1％升汞振蕩滅菌10分鐘；無(wú)菌水清洗4次，剝?nèi)』ㄋ幗臃N于PAC培養(yǎng)基上，之后給以35℃或32℃高溫暗處理8天，轉(zhuǎn)入26℃暗培養(yǎng)；(2)游離小孢子及其細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)自預(yù)培養(yǎng)15天后的花藥中采用直接擠壓法游離小孢子及其細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)于PMC培養(yǎng)基中，每皿2ml，12個(gè)花藥，26℃暗培養(yǎng)，4周后即可獲得小孢子胚狀體；(3)倍性鑒定取各瓶苗中齡葉片約150mg，在2ml LB01細(xì)胞裂解液中用鋒利刀片切碎后，經(jīng)50μm尼龍膜過(guò)濾，濾液收集在BD流式細(xì)胞儀上樣管中；1000rpm離心5分鐘后，倒去上清液，沉淀中加入200μl濃度為50μg/ml的PI核染色劑，避光冷藏20分鐘后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定植株的倍性水平，激發(fā)光波長(zhǎng)488nm，對(duì)照材料為二倍體的供體母株葉片。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種辣椒游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)方法。該方法先對(duì)花藥進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后進(jìn)行小孢子的游離培養(yǎng)。本發(fā)明在辣椒的游離小孢子培養(yǎng)體系上另辟蹊徑，通過(guò)游離培養(yǎng)經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的花藥中的小孢子細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)，獲得了胚狀體及其植株，顯微鏡檢提供了胚狀體的單細(xì)胞、單倍體發(fā)育途徑的細(xì)胞學(xué)證據(jù)。該技術(shù)體系的建立，不僅是辣椒單倍體育種技術(shù)上的突破，而且該游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)體系還可能成為進(jìn)行植物細(xì)胞分化、發(fā)育研究的良好實(shí)驗(yàn)體系。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1769428SQ20041008670
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月28日
發(fā)明者劉凡, 趙泓, 陳彬, 耿三省, 張?jiān)略?申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院