專利名稱：硫酸鹽還原原核生物檢測(cè)的組合基因探針及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用分子微生物生態(tài)學(xué)的熒光原位雜交技術(shù)，應(yīng)用組合基因探針對(duì)油田外排水中硫酸鹽還原原核生物進(jìn)行檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
對(duì)油田外排水中硫酸鹽還原原核生物(Sulfate reducing prokaryotes，SRPs)的檢測(cè)通常局限于硫酸鹽還原細(xì)菌(Sulfate reducing bacteria，SRB)的檢測(cè)，其所用的方法為絕跡稀釋法(參見中國石油天然氣總公司的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY/T5329-94)。這種方法通過對(duì)SRB進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)SRB對(duì)特定培養(yǎng)基的反應(yīng)來判斷油田外排水中SRB的數(shù)量。由于人工無法完全模擬自然環(huán)境的各種條件，人類無法在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)出自然界中所有的微生物，實(shí)際上，利用培養(yǎng)的方法只能檢測(cè)出自然界中少量的微生物，培養(yǎng)菌種不全面，所以目前廣泛采用的絕跡稀釋法并不能精確反映水樣中SRPs總菌情況，因而在石油開采過程對(duì)SRPs監(jiān)控?zé)o法準(zhǔn)確，嚴(yán)重影響石油開采技術(shù)的實(shí)施。另一方面，目前廣泛采用的、傳統(tǒng)的絕跡稀釋法對(duì)SRB培養(yǎng)通常需要兩個(gè)星期以上的時(shí)間，無法對(duì)石油開采過程進(jìn)行及時(shí)監(jiān)控，無法對(duì)殺菌等操作進(jìn)行及時(shí)調(diào)整。同時(shí)，絕跡稀釋法要求厭氧操作，操作復(fù)雜，易受污染，結(jié)果不準(zhǔn)確?？傊?，目前廣泛采用的絕跡稀釋法對(duì)SRB的檢測(cè)不能準(zhǔn)確地反映外排水的真實(shí)情況，無法很好地指導(dǎo)石油開采的生產(chǎn)和技術(shù)實(shí)施。
最近發(fā)展的分子微生物生態(tài)學(xué)的熒光原位雜交(FISH)技術(shù)，其工作原理是對(duì)微生物具有家族特異性的高度保守的核酸片斷序列進(jìn)行檢測(cè)，簡單來說是根據(jù)微生物16SrRNA序列中具有家族特異性的高度保守的核酸片斷序列設(shè)計(jì)基因探針，然后通過雜交反應(yīng)使探針與檢測(cè)的目標(biāo)序列相雜交，通過對(duì)探針上帶有的熒光進(jìn)行檢測(cè)可以檢測(cè)到帶有目標(biāo)核酸片段的微生物細(xì)胞。大量實(shí)踐證明了這種方法對(duì)微生物檢測(cè)的直觀、準(zhǔn)確、快速、易操作等優(yōu)點(diǎn)。
目前常規(guī)的FISH分析是利用單一探針來對(duì)特定微生物進(jìn)行檢測(cè)，而SRPs在“16SrRNA進(jìn)化史樹”上則分屬于不同的“進(jìn)化史樹樹枝”上，單一基因探針無法包含所有SRPs的進(jìn)化史信息，因而無法對(duì)所有的SRPs進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明通過對(duì)各組SRPs的16SrRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，根據(jù)在油田廣泛存在的124種SRPs的16SrRNA序列確定了8個(gè)基因探針序列，首次對(duì)這8個(gè)基因探針進(jìn)行了不同比例的組合，形成組合基因探針；首次利用基因探針對(duì)油田外排水中全部SRPs進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明這種組合基因探針能很好地檢測(cè)油田外排水中的SRPs。該發(fā)明利用基因探針系統(tǒng)和全面地對(duì)油田外排水中SRPs進(jìn)行檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)的絕跡稀釋法的種種缺點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確和有效地指導(dǎo)油田生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服目前廣泛采用的絕跡稀釋法耗時(shí)、檢測(cè)不全面等缺點(diǎn)，提出一種新的用于油田外排水中硫酸鹽還原原核生物檢測(cè)的組合基因探針及其檢測(cè)方法，能夠?qū)τ吞锿馀潘蠸RPs快速、全面、精確、便捷地檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)采油過程及時(shí)、準(zhǔn)確的調(diào)控。
本發(fā)明提出的一種硫酸鹽還原原核生物檢測(cè)的組合基因探針，其特征在于，由SRPs中的8個(gè)基因序列的兩種或兩種以上組合而成，所述8個(gè)基因序列為探針 探針堿基序列探針I(yè) TCCACTTCGGTCTCCCAT探針I(yè)I CCGGCTCCAGTACTCAAG探針I(yè)II CAACGTTTACTGCATAAT探針I(yè)V ACCGGTATTCCTCCCCAT探針V CCCAGATATCAGGGTAGA探針VI TCGGGCAGTTATCCCGGG探針VII CAGGCGGATCACTTAATG探針VIIICCCCGGTAAGCTTCCCGG本發(fā)明提出的硫酸鹽還原原核生物的檢測(cè)方法，包括以下步驟1)從油田外排水中的SRPs篩選出上述8個(gè)基因序列作為檢測(cè)的基因探針，2)選取所述8個(gè)基因探針之中的兩個(gè)或兩個(gè)以上制成組合基因探針溶液(其中各探針的相對(duì)比例可任意選取)；3)從待檢測(cè)的油田外排水中取水樣品，用濃度為2-10％的異多醛溶液固定該水樣品中的微生物細(xì)胞；4)取所述固定好的微生物細(xì)胞水樣品1-10μl滴入載玻片中，在室溫下對(duì)載玻片上的固定微生物樣品進(jìn)行干燥；再利用50％-100％的酒精對(duì)該載玻片上的微生物樣品脫水；5)在該載玻片上的水樣品上加入所述的1-10μl組合基因探針溶液，加入濃度為2.0-5.5M的NaCl和濃度為10％-40％甲酰胺的雜交溶液，在34-62℃的反應(yīng)溫度下雜交1-2.5小時(shí)；6)用pH8濃度為1.2M的磷酸鹽緩沖溶液清洗該載玻片上的探針溶液10-30分鐘，再用蒸餾水清洗該載玻片上水樣品，后干燥；7)用熒光顯微鏡觀察該載玻片上微生物樣品，對(duì)其中帶有熒光的SRPs細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)載波片上孔洞的面積以及樣品的體積，計(jì)算樣品中總SRPs的數(shù)量。
本發(fā)明的特點(diǎn)和積極效果本發(fā)明利用新近發(fā)展的FISH手段，首次開發(fā)了能夠全面檢測(cè)油田外排水中SRPs的組合基因探針，研究確定了組合基因探針檢測(cè)SRPs的最優(yōu)工作條件，首次對(duì)油田外排水中SRPs進(jìn)行了檢測(cè)。通過對(duì)油田外排水中存在的各種SRPs的檢測(cè)分析，了解了目前在中國采油外排水普遍存在的124種SRPs，基于此確定了能夠檢測(cè)這124種SRPs的8個(gè)基因探針序列，而對(duì)8個(gè)基因探針進(jìn)行組合設(shè)計(jì)的組合基因探針則能夠?qū)τ吞锿馀潘谐Ｒ姷?24種SRPs很好地進(jìn)行檢測(cè)。
利用本發(fā)明的組合基因探針對(duì)硫酸鹽還原原核生物的檢測(cè)方法克服了廣泛采用的絕跡稀釋法耗時(shí)、培養(yǎng)菌種不全面的缺點(diǎn)。絕跡稀釋法需要兩個(gè)星期以上才有檢測(cè)結(jié)果，并且該方法能檢測(cè)油田外排水中所有的124種SRPs，比絕跡稀釋法所能檢測(cè)出的SRPs種屬要多得多。該方法準(zhǔn)確、直觀、快速、而且操作方便易于掌握，成本小得多，整個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間僅為10-12小時(shí)。能夠及時(shí)反應(yīng)油田排水的情況，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)采油過程及時(shí)、準(zhǔn)確的調(diào)控。準(zhǔn)確地指導(dǎo)油田生產(chǎn)實(shí)踐。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提出的檢測(cè)方法結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例一、勝利油田孤島采油廠外排水樣中的SRPs進(jìn)行檢測(cè)1)制備組合基因探針溶液，將本發(fā)明的8種探針I(yè)-VIII，以相對(duì)比例為15％，8％，16％，11％，15％，10％，6％和19％制成組合基因探針溶液；2)從油田外排水中取水樣品，用濃度為2％的異多醛溶液固定該水樣品中包括SRPs在內(nèi)的微生物細(xì)胞；3)取上述固定好的微生物細(xì)胞水樣品3μl滴入載玻片中，在室溫下對(duì)載玻片上的固定微生物樣品進(jìn)行干燥，再用50％、80％和100％的酒精依次對(duì)該載玻片上的微生物樣品脫水；4)在該載玻片上的水樣品上加入所述的3μl組合基因探針溶液，加入含2.0M的NaCl和10％甲酰胺的雜交溶液，在40℃的反應(yīng)溫度下雜交1小時(shí)；5)用清洗液(磷酸鹽緩沖溶液，1.2M，pH8)清洗該載玻片上的探針溶液20分鐘，再用蒸餾水清洗該載玻片上水樣品5次，后干燥；6)用熒光顯微鏡觀察該載玻片上微生物樣品，對(duì)其中帶有熒光的SRPs細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)載波片上孔洞的面積以及樣品的體積，計(jì)算樣品中總SRPs的數(shù)量。
本實(shí)施例方法的檢測(cè)結(jié)果表明，油田外排水中SRPs的相對(duì)含量為20％，絕對(duì)數(shù)量為8.3×106個(gè)/l。
實(shí)施例二勝利油田勝利采油廠外排水樣中的SRPs進(jìn)行檢測(cè)1)制備組合基因探針溶液，將本發(fā)明的4種探針I(yè)、IV、V和VII，以相對(duì)比例為15％，30％，20％和35％制成組合基因探針溶液；2)從油田外排水中取水樣品，用濃度為8％的異多醛溶液固定該水樣品中包括SRPs在內(nèi)的微生物細(xì)胞；3)取上述固定好的微生物細(xì)胞水樣品10μl滴入載玻片中，在室溫下對(duì)載玻片上的固定微生物樣品進(jìn)行干燥，再用50％、80％和100％的酒精依次對(duì)該載玻片上的微生物樣品脫水；
4)在該載玻片上的水樣品上加入所述的10μl組合基因探針溶液，加入含5.5M的NaCl和40％甲酰胺的雜交溶液，在52℃的反應(yīng)溫度下雜交1.5小時(shí)；5)用清洗液(磷酸鹽緩沖溶液，1.2M，pH8)清洗該載玻片上的探針溶液10分鐘，再用蒸餾水清洗該載玻片上水樣品10次，后干燥；6)用熒光顯微鏡觀察該載玻片上微生物樣品，對(duì)其中帶有熒光的SRPs細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)載波片上孔洞的面積以及樣品的體積，計(jì)算樣品中總SRPs的數(shù)量。
本實(shí)施例方法的檢測(cè)結(jié)果表明，油田外排水中SRPs的相對(duì)含量為26％，絕對(duì)數(shù)量為1.5×106個(gè)/l。
實(shí)施例三勝利油田東辛采油廠外排水樣中的SRPs進(jìn)行檢測(cè)1)制備組合基因探針溶液，將本發(fā)明的2種探針I(yè)V和VI，以相對(duì)比例為65％，35％制成組合基因探針溶液；2)從油田外排水中取水樣品，用濃度為10％的異多醛溶液固定該水樣品中包括SRPs在內(nèi)的微生物細(xì)胞；3)取上述固定好的微生物細(xì)胞水樣品1μl滴入載玻片中，在室溫下對(duì)載玻片上的固定微生物樣品進(jìn)行干燥，再用50％、80％和100％的酒精依次對(duì)該載玻片上的微生物樣品脫水；4)在該載玻片上的水樣品上加入所述的1μl組合基因探針溶液，加入含3.5MNaCl，30％甲酰胺的雜交溶液，在62℃的反應(yīng)溫度下雜交2.5小時(shí)；5)用清洗液(磷酸鹽緩沖溶液，1.2M，pH8)清洗該載玻片上的探針溶液30分鐘，再用蒸餾水清洗該載玻片上水樣品7次，后干燥；6)用熒光顯微鏡觀察該載玻片上微生物樣品，對(duì)其中帶有熒光的SRPs細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)載波片上孔洞的面積以及樣品的體積，計(jì)算樣品中總SRPs的數(shù)量。
本實(shí)施例方法的檢測(cè)結(jié)果表明，油田外排水中SRPs的相對(duì)含量為28％，絕對(duì)數(shù)量為6.7×106個(gè)/l。
通過和絕跡稀釋法對(duì)比的結(jié)果表明該方法的檢測(cè)結(jié)果更全面，更加切實(shí)可行。
上述各實(shí)施例中的所采用的探針組合，及具體條件參數(shù)均只用于說明如何實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的舉例，不能用以限制各權(quán)利要求中確定的保護(hù)范圍，本發(fā)明方法適用于8種探針之中的任意2種以上的組合，均可應(yīng)用于油田回注水種SRPs的檢測(cè)。
在實(shí)際應(yīng)用中各種探針組合方式可根據(jù)油田具體采油廠的情況而定，通常首先利用8種探針的各種組合進(jìn)行分析，再確定該采油廠的最佳探針組合方式(2種以上探針的組合)，形成的組合基因探針可以應(yīng)用于該采油廠SRPs的日常檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種硫酸鹽還原原核生物檢測(cè)的組合基因探針，其特征在于，由SRPs中的8個(gè)基因序列的兩種或兩種以上組合而成，所述8個(gè)基因序列為探針 探針堿基序列探針I(yè) TCCACTTCGGTCTCCCAT探針I(yè)I CCGGCTCCAGTACTCAAG探針I(yè)IICAACGTTTACTGCATAAT探針I(yè)V ACCGGTATTCCTCCCCAT探針V CCCAGATATCAGGGTAGA探針VI TCGGGCAGTTATCCCGGG探針VIICAGGCGGATCACTTAATG探針VIII CCCCGGTAAGCTTCCCGG。
2.一種硫酸鹽還原原核生物的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟1)從油田外排水中的SRPs篩選出8個(gè)基因序列作為檢測(cè)的基因探針，包括探針探針堿基序列探針I(yè) TCCACTTCGGTCTCCCAT探針I(yè)I CCGGCTCCAGTACTCAAG探針I(yè)II CAACGTTTACTGCATAAT探針I(yè)V ACCGGTATTCCTCCCCAT探針V CCCAGATATCAGGGTAGA探針VI TCGGGCAGTTATCCCGGG探針VII CAGGCGGATCACTTAATG探針VIIICCCCGGTAAGCTTCCCGG2)選取所述8個(gè)基因探針之中的兩個(gè)或兩個(gè)以上制成組合基因探針溶液；3)從待檢測(cè)的油田外排水中取水樣品，用濃度為2-10％的異多醛溶液固定該水樣品中的微生物細(xì)胞；4)取所述固定好的微生物細(xì)胞水樣品1-10μl滴入載玻片中，在室溫下對(duì)載玻片上的固定微生物樣品進(jìn)行干燥；再利用50％-100％的酒精對(duì)該載玻片上的微生物樣品脫水；5)在該載玻片上的水樣品上加入所述的1-10μl組合基因探針溶液，加入濃度為2.0-5.5M的NaCl和濃度為10％-40％甲酰胺的雜交溶液，在34-62℃的反應(yīng)溫度下雜交1-2.5小時(shí)；6)用pH8濃度為1.2M的磷酸鹽緩沖溶液清洗該載玻片上的探針溶液10-30分鐘，再用蒸餾水清洗該載玻片上水樣品，后干燥；7)用熒光顯微鏡觀察該載玻片上微生物樣品，對(duì)其中帶有熒光的SRPs細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)載波片上孔洞的面積以及樣品的體積，計(jì)算樣品中總SRPs的數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及硫酸鹽還原原核生物檢測(cè)的組合基因探針及其檢測(cè)方法，屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該組合基因探針由SRPs中的8個(gè)基因序列的兩種或兩種以上組合而成，該檢測(cè)方法為取水樣品，用異多醛溶液固定該水樣品中的微生物細(xì)胞；滴入載玻片中，進(jìn)行干燥、脫水后加入所述的組合基因探針溶液，再加入NaCl和甲酰胺的雜交溶液，雜交后；用磷酸鹽緩沖溶液清洗該載玻片上的探針溶液，再用蒸餾水清洗該載玻片上水樣品，后干燥；用熒光顯微鏡觀察該載玻片上微生物樣品，對(duì)其中帶有熒光的SRPs細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。本發(fā)明能夠?qū)τ吞锿馀潘蠸RPs快速、全面、精確、便捷地檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)采油過程及時(shí)、準(zhǔn)確的調(diào)控。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1635162SQ200410086710
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者吳曉磊, 曾景海, 屈睿, 晏蕓 申請(qǐng)人:清華大學(xué)