專利名稱：一種黃桿菌微膠囊化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化生物制劑，具體地說是一種黃桿菌(采用海藻酸鈉(Na·Alg)-殼聚糖(CS)-氯化鈣(CaCl2)復(fù)凝聚)微膠囊化方法。
背景技術(shù)：
生物微膠囊是將酶、輔酶、蛋白質(zhì)等生物大分子或微生物、動植物細(xì)胞包封在一層親水性的半透膜內(nèi)所形成的珠狀、橢桿狀或橢球狀微膠囊，使生物大分子和細(xì)胞阻隔在微膠囊的膜內(nèi)或膜外，而氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)以及其它的小分子物質(zhì)則可以自由通過微膠囊膜進(jìn)行物質(zhì)傳遞，從而達(dá)到催化、培養(yǎng)或免疫隔離的目的。通常，微膠囊的直徑或有效尺寸約為5μm-200μm，膠囊壁厚約為0.2μm-5μm。
復(fù)凝聚技術(shù)是制備微膠囊的常用技術(shù)之一。復(fù)凝聚微膠囊技術(shù)是利用非水溶性的固體粉末或液體對細(xì)菌進(jìn)行包囊，其必要條件是有關(guān)的兩種聚合物離子的電荷相反，且離子所帶電荷數(shù)恰好相等。此外，還必須調(diào)節(jié)體系的溫度和鹽分的含量。常用的芯材和壁材包括人工合成和天然的兩類，如瓊脂類、殼聚糖類(CS)、海藻酸鈉類、明膠-阿拉伯膠-紫膠類、淀粉類、乙基(羧甲基)纖維素、硫酸纖維素納(NACS)-聚氯化二烯丙基二甲基銨(PDADMAC)，聚丙烯酸酯類、聚烯類、聚氨酯等。
Na·Alg和CS具有良好的生物相容性，以此作為微膠囊主體材料的配方較多，但對于Flavobacterium sp.固定化來說，由于Flavobacterium sp.特殊的生理特性，在短時間培養(yǎng)后，常常出現(xiàn)膠囊溶解現(xiàn)象，致使固定化失敗。
此外，由于微膠囊個體直徑為小，使用過程中易流失，難以控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于在針對Na·Alg-CS-CaCl2復(fù)凝聚的缺陷，利用低濃度Na·Alg在一定時間內(nèi)對微膠囊壁做二次修飾，同時利用低濃度檸檬酸做囊內(nèi)液化，改善微膠囊結(jié)構(gòu)缺陷，制備性能更加優(yōu)良的固定化微生物菌劑。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種黃桿菌微膠囊化方法，可按如下步驟進(jìn)行具體操作1)壁材配制按質(zhì)量百分比配制2.0-3.0％海藻酸鈉的(Na·Alg)水溶液(用自來水浸潤24h)，滅菌冷卻(使用前于111℃下濕熱滅菌30min，冷卻到45℃，備用)，向其中加入海藻酸鈉的水溶液總質(zhì)量15-30％的黃桿菌(Flavobacterium sp.)液體種子(菌齡16-20h)，攪拌均勻；2)芯材配制按質(zhì)量百分比配制含0.3-0.7％殼聚糖和1.0-2.5％氯化鈣的水溶液，pH＝3.5-5.5，滅菌冷卻，備用；(使用前于111℃下濕熱滅菌30min，備用)3)囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液配制按質(zhì)量百分比配制0.05-0.25％海藻酸鈉水溶液，滅菌(使用前于111℃下濕熱滅菌30min，備用)；按照摩爾濃度配制0.045-0.065mol/L檸檬酸水溶液，滅菌(使用前于121℃下濕熱滅菌20min，備用)；4)微膠囊制備在40-45℃下，(通過9#針頭注射器)將壁材溶液在無菌條件下按60-80滴/分鐘的速度滴入芯材溶液中，不斷攪拌；膠珠成型后，穩(wěn)定4h；然后將膠珠轉(zhuǎn)移到囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液的混合液中，攪拌15-20min，囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液的體積比為1-1.5∶1；取出膠珠用無菌水或無菌生理鹽水浸泡6-24h(通常為16h)，置于增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后制得微膠囊。
所述壁材配制中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度較好為2.25-2.75％，通常向其中加入總質(zhì)量20％左右的黃桿菌液體種子，攪拌均勻；壁材配制中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度最好為2.5％；芯材配制中殼聚糖和氯化鈣的質(zhì)量百分比較好分別為0.4-0.6％和1.5-2.2％，pH＝4.0-5.0；芯材配制中殼聚糖和氯化鈣的質(zhì)量百分比最好分別為0.5％和2.0％，pH＝4.8；囊壁修飾液中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度較好為0.10-0.20％；囊內(nèi)液化液中檸檬酸水溶液的摩爾濃度較好為0.050-0.060mol/L；囊壁修飾液中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度最好為0.15％；囊內(nèi)液化液中檸檬酸水溶液的摩爾濃度最好為0.055mol/L；所述增殖培養(yǎng)是將制備的微膠囊在無菌條件下按照4％的質(zhì)量濃度加入到增殖培養(yǎng)基中，控制溫度28-30℃，搖床轉(zhuǎn)速130rpm-140rpm，培養(yǎng)時間24小時，之后更換培養(yǎng)基，共2次培養(yǎng)，備用。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.通過優(yōu)化Na·Alg-CS-CaCl2配方各組分的含量，制備得到平均直徑為20μm-30μm的微膠囊，膠囊的微觀結(jié)構(gòu)均勻，尺寸均一，擴(kuò)散傳質(zhì)性能優(yōu)異，固定后的黃桿菌Flavobacterium sp.活性良好。
2.利用二次囊壁修飾和囊內(nèi)液化等技術(shù)措施，成功地改善了膠囊的機(jī)械強(qiáng)度，在5000rpm速度下離心30min，膠囊不變形，不破碎；同時，上述措施還大大提高了微膠囊的包埋率，平均包埋率大于85％。
3.用于黃桿菌屬Flavobacterium sp.固定，長期培養(yǎng)微膠囊不溶解。
4.膠珠直徑1.5mm-2.5mm，結(jié)構(gòu)均勻，強(qiáng)度高，通透性好，對微膠囊起到了良好的束縛保護(hù)作用。
5.按上述配方制備的微膠囊具有優(yōu)異的緩釋性能，液體培養(yǎng)30天，失重不明顯。
總之，本發(fā)明對Na·Alg-CS微膠囊組方進(jìn)行了優(yōu)化，并創(chuàng)新性地同時進(jìn)行了低濃度Na·Alg囊壁修飾和檸檬酸囊內(nèi)液化，改善了微膠囊的結(jié)構(gòu)，成功固定了Flavobacterium sp.。對制得的Flavobacterium sp.微膠囊連續(xù)培養(yǎng)30天，測試了微膠囊的緩釋性能和機(jī)械強(qiáng)度，結(jié)果表明按照本發(fā)明制備的微膠囊菌劑具有優(yōu)良的物理和生理特性。同時，本發(fā)明設(shè)計(jì)了膠珠包膠囊的成囊方式，使微膠囊被束縛在直徑較大的膠珠內(nèi)部，膠珠壁為多孔結(jié)構(gòu)，成功地避免了微膠囊流失。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例1(1)黃桿菌Flavobacterium sp.斜面培養(yǎng)在牛肉蛋白胨基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，1.5-2.0％瓊脂，pH＝7.0-7.2)的試管中接入黃桿菌Flavobacterium sp.，置28℃-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；(2)黃桿菌Flavobacterium sp.液體種子制備用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上接取2環(huán)菌苔，接入到液體種子培養(yǎng)基(1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，在搖床轉(zhuǎn)速130rpm-140rpm、28℃-30℃條件下，培養(yǎng)16-20小時，制得液體種子；(3)壁材配制按質(zhì)量百分比稱取2.2％Na·Alg，以97.8％質(zhì)量比的自來水浸潤24小時，于111℃下濕熱滅菌30min，冷卻到45℃；加入上述總質(zhì)量20％的液體種子，攪拌均勻；(4)芯材配制按質(zhì)量百分比稱取0.6％CS和1.0％CaCl2，用98.4％的自來水溶解，調(diào)節(jié)pH＝3.6，于111℃下濕熱滅菌30min；(5)囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液配制按質(zhì)量百分比配置0.25％Na·Alg水溶液，于111℃下濕熱滅菌30min；按照摩爾濃度配制0.065mol/L檸檬酸水溶液，于121℃下濕熱滅菌20min；(6)微膠囊制備將壁材溶液在無菌條件下注入注射器內(nèi)，利用9#針頭按照60-80滴/分鐘的速度滴入芯材溶液中，不斷攪拌。膠珠成型后，維持4h，然后將膠珠轉(zhuǎn)移到囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液的混合液中，攪拌15-20min，用無菌生理鹽水浸泡16h，置于增殖培養(yǎng)基(3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，增殖24h，更換培養(yǎng)基，再次增殖24h，制得微膠囊；(7)機(jī)械強(qiáng)度和緩釋性檢測按照4％接種量將微膠囊接入增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后，取1g微膠囊置于生理鹽水中，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，囊體不變形、不破碎；微膠囊失重率小于29％。
實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于配制壁材溶液時，按照質(zhì)量百分比稱取2.75％Na·Alg；配制芯材溶液時，按質(zhì)量百分比稱取0.4％CS和1.5％CaCl2，調(diào)節(jié)pH＝4.0；配制囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液配制時，按質(zhì)量百分比稱取0.10Na·Alg；按照摩爾濃度稱取0.050mol/L檸檬酸。經(jīng)上述步驟制得的微膠囊機(jī)械強(qiáng)度較好，30d失重率小于26％。
實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于配制壁材溶液時，按照質(zhì)量百分比稱取2.5％Na·Alg；配制芯材溶液時，按質(zhì)量百分比稱取0.5％CS和2.0％CaCl2，調(diào)節(jié)pH＝4.8；配制囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液配制時，按質(zhì)量百分比稱取0.15Na·Alg；按照摩爾濃度稱取0.055mol/L檸檬酸。經(jīng)上述步驟制得的微膠囊機(jī)械強(qiáng)度良好，30d失重率小于23％。
權(quán)利要求
1.一種黃桿菌微膠囊化方法，可按如下步驟操作，其特征在于1)壁材配制按質(zhì)量百分比配制2.0-3.0％海藻酸鈉的水溶液，滅菌冷卻，向其中加入海藻酸鈉的水溶液總質(zhì)量15-30％的黃桿菌液體種子，攪拌均勻；2)芯材配制按質(zhì)量百分比配制含0.3-0.7％殼聚糖和1.0-2.5％氯化鈣的水溶液，pH＝3.5-5.5，滅菌冷卻，備用；3)囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液配制按質(zhì)量百分比配制0.05-0.25％海藻酸鈉水溶液，滅菌；按照摩爾濃度配制0.045-0.065mol/L檸檬酸水溶液，滅菌；4)微膠囊制備在40-45℃下，將壁材溶液在無菌條件下按60-80滴/分鐘的速度滴入芯材溶液中，不斷攪拌；膠珠成型后，穩(wěn)定4h；然后將膠珠轉(zhuǎn)移到囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液的混合液中，攪拌15-20min，囊壁修飾液和囊內(nèi)液化液的體積比為1-1.5∶1；取出膠珠用無菌水或無菌生理鹽水浸泡6-24h，置于增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后制得微膠囊。
2.按照權(quán)利要求1所述黃桿菌微膠囊化方法，其特征在于壁材配制中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為2.25-2.75％，向其中加入總質(zhì)量20％的黃桿菌液體種子，攪拌均勻；芯材配制中殼聚糖和氯化鈣的質(zhì)量百分比分別為0.4-0.6％和1.5-2.2％，pH＝4.0-5.0；囊壁修飾液中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.10-0.20％；囊內(nèi)液化液中檸檬酸水溶液的摩爾濃度為0.050-0.060mol/L。
3.按照權(quán)利要求1所述黃桿菌微膠囊化方法，其特征在于壁材配制中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為2.5％；芯材配制中殼聚糖和氯化鈣的質(zhì)量百分比分別為0.5％和2.0％，pH＝4.8；囊壁修飾液中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.15％；囊內(nèi)液化液中檸檬酸水溶液的摩爾濃度為0.055mol/L。
4.按照權(quán)利要求1所述黃桿菌微膠囊化方法，其特征在于所述增殖培養(yǎng)是將制備的微膠囊在無菌條件下按照4％的質(zhì)量濃度加入到增殖培養(yǎng)基中，控制溫度28-30℃，搖床轉(zhuǎn)速130rpm-140rpm，培養(yǎng)時間24小時，之后更換培養(yǎng)基，共2次培養(yǎng)，備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化生物制劑，具體地說是一種黃桿菌微膠囊化方法，可按如下步驟操作，向Na·Alg溶液里加入黃桿菌液體種子，在45℃下，通過9#針頭注射器，控制下滴速度60－80滴/分鐘，向CS和CaCl
文檔編號C12N11/00GK1778893SQ20041008756
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者李海波, 李培軍, 鞠京麗, 張軼, 許華夏 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所