專利名稱：一種人酪氨酸酶表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人酪氨酸酶表達(dá)載體及其應(yīng)用，特別是涉及一種人酪氨酸酶表達(dá)載體及導(dǎo)入該載體的重組巴斯德畢赤酵母細(xì)胞和利用該重組細(xì)胞生產(chǎn)人酪氨酸酶的方法。
背景技術(shù)：
人酪氨酸酶(tyrosinase，EC 1.14.18.1)是人體內(nèi)合成黑色素的關(guān)鍵酶，它能夠催化黑色素形成反應(yīng)的前兩步反應(yīng)，即第一步酪氨酸羥基化形成多巴，第二步多巴被氧化為多巴醌。然后，在黑素細(xì)胞的脫黑素小體中，多巴醌進(jìn)一步反應(yīng)生成半胱氨酸酰基黑素，并聚合形成脫黑素；而在黑素細(xì)胞真黑素小體中，多巴醌在酪氨酸酶及其相關(guān)蛋白的作用下形成真黑素。
人類酪氨酸酶基因最早由Kwon于1987年克隆成功(Kwon，B.S.，Haq，A.K.，Pomerantz，S.H.，Halaban，R.Isolation and sequence of a cDNA clone for humantyrosinase that maps at the mouse c-albino locus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1987，84，7473-7477)，命名為Pme134，編碼566個(gè)氨基酸殘基，其中，自N端第1-12位氨基酸殘基可能為信號肽序列(有10個(gè)氨基酸是疏水氨基酸)。Pme134核苷酸序列的終止密碼子TAA后約180個(gè)堿基處有一多聚腺苷酸信號序列AATAAA。Pme134中還編碼有5個(gè)糖基化信號Asn-X-Thr/Ser。1988年Shibahara(Shibahara，S.，Tomita，Y.，Tagami，H.，Muller，R.M.，Cohen，T..Molecular basis for theheterogeneity of human tyrosinase.Tohoku J.Exp.Med.1988，156，403-414)等得到人類酪氨酸酶的mRNA，編碼529個(gè)氨基酸殘基。該氨基酸殘基序列自N端第1-18位氨基酸殘基為信號肽序列。人類酪氨酸酶成熟蛋白的氨基酸殘基序列由511個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。人酪氨酸酶基因位于11號染色體的11q14-q21區(qū)，該基因含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。5個(gè)外顯子長度分別為918、135、150、183和219bp。在翻譯起始位點(diǎn)上游713bp處還存在一個(gè)GATA重復(fù)序列，推測可能是一個(gè)DNA鉸鏈結(jié)構(gòu)。人酪氨酸酶基因5`端上游的啟動(dòng)子區(qū)有4個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，主要位于距起始密碼子ATG上游79個(gè)堿基處，該基因的5’端具有2個(gè)TATA盒樣結(jié)構(gòu)，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游32及6個(gè)堿基處。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游120個(gè)堿基處還有一GCCAATAC序列，可能起CAT盒作用。3個(gè)cAMP結(jié)合位點(diǎn)序列TGACGTCA分別位居第627、444及247位堿基處。在人11號染色體上還發(fā)現(xiàn)有一個(gè)酪氨酸酶假基因，是一個(gè)截短的酪氨酸酶基因，它只含有酪氨酸酶基因的第4、5外顯子和完整的第4內(nèi)含子(孫仁山，人類白化病的分子遺傳學(xué)研究[Y]，國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，1994，(5)250-253)。
研究表明，染色體酪氨酸酶基因突變是引起隱性遺傳性疾病眼—皮膚白化病(OCA)的主要原因，對I型OCA的發(fā)生進(jìn)行分子機(jī)理研究，表明酪氨酸酶基因含有4個(gè)重要的功能區(qū)，其中兩個(gè)功能區(qū)為兩個(gè)銅原子的結(jié)合部位，這兩個(gè)區(qū)域的突變會(huì)減弱其與銅原子的結(jié)合，或干擾銅原子與氧結(jié)合。另外兩個(gè)突變簇集區(qū)分別位于第1、4外顯子內(nèi)，這兩個(gè)區(qū)域也是重要的功能區(qū)，很可能是多巴或酪氨酸酶抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)。此外，白癜風(fēng)、黃褐斑及皮膚黑色素瘤等局部色素相關(guān)性病變與酪氨酸酶的局部表達(dá)異常有關(guān)。因此，人酪氨酸酶蛋白在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床方面的用途很廣，具有很好的市場前景。
以往，酪氨酸酶蛋白體外表達(dá)多是在大腸桿菌中進(jìn)行的，但是在大腸桿菌中表達(dá)存在易形成不溶性包涵體、不能糖基化等問題，而且由于采用質(zhì)粒表達(dá)，發(fā)酵過程需要添加昂貴的抗生素和IPTG等，大大提高了發(fā)酵成本。也有人試圖采用其他的真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)酪氨酸酶，例如釀酒酵母，但也存在過糖基化或糖基化不足、培養(yǎng)條件苛刻等諸多問題。
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是可以以甲醇作為唯一碳源的新型酵母表達(dá)系統(tǒng)(Ogata，K.，Nishikawa，H.and Ohsugi，M.A yeast capable of utilizingmethanol.Agric.B畢赤巴斯德ol.Chem.1969，33，1519-1520)。它帶有編碼醇氧化酶的兩個(gè)基因，分別為AOX1和AOX2。細(xì)胞中AOX1的表達(dá)產(chǎn)物絕大部分具有醇氧化酶活性(Tschopp，J.F.，Brust，P.F.，Cregg，J.M.，Stillman，C.A.andGingeras，T.R.Expression of the LacZ gene from twomethanol-regulatedpromoters in Pichia pastoris.Nucleic Acids Res.1987，15，3859-3876)。典型的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體含有乙醇氧化酶基因5′AOX1啟動(dòng)子、3′AOX1終止子，這兩段序列之間是供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)。通常以組氨醇脫氫酶(Histidinol dehydrogenase，HIS)基因HIS4作為營養(yǎng)互補(bǔ)型篩選標(biāo)志或Zeocin及卡那霉素基因(kanamycin)賦予酵母的遺傳霉素(G418)抗性作為篩選標(biāo)志。作為一個(gè)能在大腸桿菌中繁殖、擴(kuò)增的穿梭質(zhì)粒，它還含有pBR322質(zhì)粒的部分序列和氨芐青霉素(AmpR)抗性基因的篩選標(biāo)志。表達(dá)載體通過同源重組整合到酵母細(xì)胞的染色體DNA中。巴斯德畢赤酵母表達(dá)體系具有下述獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)(1)高表達(dá)。它能利用很強(qiáng)的啟動(dòng)子，具有極快的細(xì)胞生長速度，所以表達(dá)量相對很高。(2)高穩(wěn)定。該系統(tǒng)的載體能和細(xì)胞基因組進(jìn)行整合，所以構(gòu)建的菌株遺傳性狀穩(wěn)定，一般不會(huì)出現(xiàn)外源基因隨生長繁殖而丟失的現(xiàn)象。(3)高分泌。在已研究的一些例子中，它可利用多種信號肽引導(dǎo)外源基因分泌表達(dá)，其外源蛋白胞外分泌表達(dá)量最高可達(dá)10g/L。
另外，畢赤巴斯德酵母對表達(dá)的外源蛋白具有糖基化作用(Monteino R，GarciaR，Quintero O，et all Variation in N-linked oligosaccharide structureson heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastorislProtein Expr Purif，1998，14(2)197-207)，可通過N-連接使寡糖鏈與外源蛋白肽鏈糖基化識(shí)別位點(diǎn)(Asn-X-Ser-Thr)天冬酰胺上的氮原子(N)共價(jià)結(jié)合；也可通過O-連接使寡糖鏈與外源蛋白肽鏈絲氨酸P蘇氨酸上的羥基(OH)共價(jià)結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人酪氨酸酶表達(dá)載體。
本發(fā)明所提供的人酪氨酸酶表達(dá)載體，是含有人酪氨酸酶基因(tyr)和His-tag基因的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體。
所述人酪氨酸酶基因編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列。
序列表中的序列3由511個(gè)氨基酸殘基組成。
所述人酪氨酸酶基因可具有序列表中序列2的核苷酸序列，或與序列表中序列2的自5′端第11位至1546位堿基限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且編碼序列3的氨基酸殘基序列的核苷酸序列。
序列表中的序列2由1558個(gè)堿基組成，自5′端第4-10位堿基為EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，第11-1546位堿基為人酪氨酸酶的編碼序列，第1547-1554位堿基NotI識(shí)別位點(diǎn)。
所述His-tag基因編碼6個(gè)組氨酸殘基。
所述His-tag基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中的序列1由113個(gè)堿基組成，自5′端第5-10位堿基為SnaBI識(shí)別位點(diǎn)，第23-40位堿基為His-tag編碼序列，第50-67位堿基為凝血酶編碼基因，第64-69位堿基為EcoRI識(shí)別位點(diǎn)。
所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可為pPIC3.5K、pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K。
所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體優(yōu)選為pPIC3.5K。將所述人酪氨酸酶基因插入到pPIC3.5K的多克隆位點(diǎn)中的EcoRI和NotI識(shí)別位點(diǎn)之間，將所述His-tag基因插入到多克隆位點(diǎn)中的SnaBI和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)之間構(gòu)建得到人酪氨酸酶表達(dá)載體pPIC3.5KHis-tyr。
將上述人酪氨酸酶表達(dá)載體導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞得到的重組細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞可為巴斯德畢赤酵母GS115，KM71或SMD1168。
可利用電轉(zhuǎn)化法將上述人酪氨酸酶表達(dá)載體導(dǎo)入所述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)人酪氨酸酶的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)人酪氨酸酶的方法，包括培養(yǎng)上述重組巴斯德畢赤酵母細(xì)胞，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)人酪氨酸酶的步驟。
上述表達(dá)人酪氨酸酶的方法中，還包括利用金屬親和柱層析分離純化所述人酪氨酸酶的步驟。
所述金屬親和層析可為鎳離子親和柱層析。
本發(fā)明的人酪氨酸酶基因表達(dá)載體構(gòu)建容易，并通過同源重組使人酪氨酸酶基因整合入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的基因組中，穩(wěn)定表達(dá)人酪氨酸酶，避免了在大腸桿菌中表達(dá)該蛋白的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，而且在發(fā)酵過程中無需使用昂貴的抗生素和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，使生產(chǎn)成本大大降低，此外，巴斯德畢赤酵母的高密度生長，也有利于人酪氨酸酶的表達(dá)，表達(dá)量可達(dá)0.39g/L，本發(fā)明具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1為人酪氨酸酶畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5KHis-tyr的構(gòu)建過程示意2為重組巴斯德畢赤酵母胞內(nèi)蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜圖3為重組巴斯德畢赤酵母胞內(nèi)蛋白western-blot鑒定結(jié)果圖4為經(jīng)鎳離子親和柱層析純化的人酪氨酸酶蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用酶試劑均為TaKaRa公司產(chǎn)品。
實(shí)施例1、人酪氨酸酶畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5KHis-tyr的構(gòu)建如圖1所示，載體pPIC3.5KHis-tyr的構(gòu)建過程包括以下步驟一、His-tag編碼基因的克隆及含有該基因的重組載體pPIC3.5Khis的構(gòu)建引物序列如下引物1(上游引物)5’-gaagtacgtaatgggcagcagccatcatcatcatc-3’引物2(下游引物)5’-gagagaattcacccatttgctgtccaccagt-3’1、以質(zhì)粒pET-28a(+)為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增His-tag基因，PCR反應(yīng)條件為94℃3分鐘；94℃1分鐘，57℃1分鐘，72℃30秒，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘，4℃保溫。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明獲得了長度約為113bp(包括His-tag在內(nèi)的結(jié)構(gòu)基因長度約為90bp)的DNA擴(kuò)增片段，經(jīng)測序，表明該DNA擴(kuò)增片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，其中包括nt5-10 SnaBI識(shí)別位點(diǎn)；nt23-40 His-tag；nt50-67凝血酶編碼基因；nt64-69 EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，得到了正確的含有His-tag編碼基因的DNA片段。
2、將步驟1擴(kuò)增的包含有His-tag基因的DNA擴(kuò)增片段用限制性內(nèi)切酶SnaBI和EcoRI酶切后，與經(jīng)相同酶酶切的質(zhì)粒載體pPIC3.5K(Invitrogen公司)用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(TaKaRa公司)，用含有100μg/L氨芐青霉素和50μg/L卡那霉素的抗性LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，將陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，用堿裂解法提質(zhì)粒，得到重組載體pPIC3.5KHis。
二、人酪氨酸酶畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5KHis-tyr的構(gòu)建引物序列如下引物3(上游引物)5’-aggtgaattccatttccctagagcctgtgtctc-3’引物4(下游引物)5’-attagcggccgcttataaatggctctgatacaa-3’1、以質(zhì)粒pRHOHT2(Shibahara，S.，Tomita，Y.，Tagami，H.，Muller，R.M.，Cohen，T..Molecular basis for the heterogeneity of human tyrosinase.Tohoku J.Exp.Med.1988，156，403-414)為模板，在引物3和引物4的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增人酪氨酸酶基因，PCR反應(yīng)條件為94℃3分鐘；94℃1分鐘，57℃1分鐘，72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘，4℃保溫。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明獲得了長度約為1558bp(含tyr的結(jié)構(gòu)基因的長度約為1536bp)的DNA擴(kuò)增片段，經(jīng)測序，表明該DNA擴(kuò)增片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，其中包括nt 4-10 EcoRI識(shí)別位點(diǎn)；nt 11-1546 tyr；nt 1547-1554 NotI識(shí)別位點(diǎn)，得到了正確的含有人酪氨酸酶基因的DNA片段。
2、將步驟1擴(kuò)增的包含人酪氨酸酶基因的DNA擴(kuò)增片段用限制性內(nèi)切酶NotI和EcoRI酶切后，與經(jīng)相同酶酶切的步驟一構(gòu)建的重組載體pPIC3.5KHis用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(TaKaRa公司)，用含有100μg/L氨芐青霉素和50μg/L卡那霉素的抗性LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，將陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，用堿裂解法提質(zhì)粒，得到人酪氨酸酶畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5KHis-tyr。
實(shí)施例2、人酪氨酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)及Western-blot鑒定一、人酪氨酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)
1、質(zhì)粒pPIC3.5KHis-tyr的線性化用SacI限制性內(nèi)切酶酶切實(shí)施例1獲得的人酪氨酸酶畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5KHis-tyr，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后回收得到電泳純的線性化質(zhì)粒pPIC3.5KHis-tyr。
2、將線性化的質(zhì)粒pPIC3.5KHis-tyr轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母具體過程包括以下步驟1)取甘油管保存的巴斯德畢赤酵母GS115，劃線于YPD瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)12-24小時(shí)使其活化，挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD600值為1.4-1.5。
2)移取1mL步驟1)的培養(yǎng)液于EP離心管中(平行做兩管)，4℃5000rpm離心5分鐘收集酵母細(xì)胞，棄上清，用1mLYPD/HEPES(YPD中含20％HEPES)和37.5μL1M DTT的YPD液體培養(yǎng)基懸浮上述酵母細(xì)胞沉淀，在30℃培養(yǎng)15分鐘后，4℃5000rpm離心5分鐘收集酵母細(xì)胞，棄上清。
3)取1.5mL 1M山梨醇懸浮步驟2)的酵母細(xì)胞沉淀，4℃ 5000rpm離心5分鐘，棄上清，重復(fù)3次，然后用20μL 1M山梨醇懸浮酵母細(xì)胞，合并2管，得到40μL的電感受態(tài)酵母細(xì)胞。
4)取5μL步驟1中線性化質(zhì)粒pPIC3.5KHis-tyr和40μL的電感受態(tài)酵母細(xì)胞GS115混合后，轉(zhuǎn)移到2mm電擊杯中，在電壓1500V進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。
5)取出電擊杯，迅速加入1mL含182mg/mL山梨醇的YPD液體培養(yǎng)基，然后將其轉(zhuǎn)移到滅菌的Eppendorf管中，30℃培養(yǎng)1.5小時(shí)。
6)將步驟5)的培養(yǎng)液涂布于含有50mg/mL G418(Geneticin)的YNB抗性平板上，30℃培養(yǎng)2-5天，得到轉(zhuǎn)化有人酪氨酸酶畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5KHis-tyr的陽性單菌落。
3、人酪氨酸酶的表達(dá)培養(yǎng)基生長培養(yǎng)基(g/L)酵母浸出物10g，蛋白胨20g，甘油20mL，磷酸緩沖液(pH7.0)100mL，13.4％YNB 100mL，0.02％生物素20mL，蒸餾水780mL。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L)酵母浸出物10g，蛋白胨20g，甘油20mL，磷酸緩沖液(pH7.0)100mL，13.4％YNB 100mL，0.02％生物素20mL，甲醇20mL，蒸餾水760mL。
挑取生長較好的陽性克隆接種于生長培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)約48h，在無菌條件下離心并更換甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30℃繼續(xù)培養(yǎng)48-96小時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
二、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
Western-blot檢測系統(tǒng)一抗小鼠抗酪氨酸酶單克隆抗體(Tyrosinase Ab-1，Clone T311)，NeoMarkers，USA；二抗堿磷酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCIP/NBT北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
培養(yǎng)結(jié)束后，取1mL步驟一的菌液離心收集菌體，將菌體細(xì)胞用玻璃珠振蕩法裂解細(xì)胞，取25μL細(xì)胞裂解液，加入SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖2所示(泳道1-2為表達(dá)的巴斯德酵母畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，泳道3為野生型巴斯德畢赤酵母GS115，泳道M為蛋白Marker(Marker的分子量范圍20-200KD)，在75KD處(箭頭所示位置)有一蛋白條帶，電泳結(jié)束后棄去積層膠，依次將負(fù)極板、緩沖料、濾紙、膠、NC膜、濾紙、緩沖料、正極板疊好，按常規(guī)方法(Frederick M.Ausubel et al.顏?zhàn)臃f，王海林譯。精編分子生物學(xué)指南，科學(xué)出版社，1998366)進(jìn)行Western-blot鑒定，結(jié)果如圖3所示(泳道1為蛋白Marker(Marker的分子量范圍20-200KD)，泳道2為表達(dá)的巴斯德酵母畢赤酵母轉(zhuǎn)化子)，表明獲得了分子量為75KD(箭頭所示位置)的人酪氨酸酶(人酪氨酸酶未糖基化分子量為55KD，糖基化后為75KD)，與文獻(xiàn)報(bào)道的糖基化的人酪氨酸酶大小一致。
實(shí)施例3、人酪氨酸酶蛋白的純化上樣緩沖液(MCAC-0)Tris-HCl 20mM pH7.9，NaCl 500mM，甘油10％，PMSF(苯甲磺酰氟)1mM。
洗脫緩沖液(MCAC-500)咪唑500mM，Tris-HCl 20mM，NaCl 500mM，甘油10％，PMSF 1mM。
將實(shí)施例2中表達(dá)的目的蛋白用鎳離子親和柱層析法進(jìn)行純化，具體步驟如下1)收集實(shí)施例2中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的酵母細(xì)胞，將其溶于上樣緩沖液MCAC-0中，低溫勻漿15,000rpm離心10min，收集粗蛋白溶液；2)將粗蛋白溶液加入鎳離子親和層析柱(購自QIAGEN公司)上層，保持0.01ml/秒流速，至目的蛋白被全部吸附；3)加入洗脫緩沖液MCAC-500洗脫，收集5ml蛋白洗脫液，即得到純化的人酪氨酸酶，可-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 將獲得的經(jīng)純化的人酪氨酸酶進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4所示(泳道1為純化的人酪氨酸酶，泳道2為蛋白Marker(Marker的分子量范圍20-200KD)，表明獲得了高純度的人酪氨酸酶。結(jié)果表明實(shí)施例2中的人酪氨酸酶表達(dá)量為0.39g/L。
序列表<160>3<210>1<211>113<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gaagtacgta atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg 60cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtgaattct ctc 113<210>2<211>1558<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2aggtgaattc catttcccta gagcctgtgt ctcctctaag aacctgatgg agaaggaatg 60ctgtccaccg tggagcgggg acaggagtcc ctgtggccag ctttcaggca gaggttcctg120tcagaatatc cttctgtcca atgcaccact tgggcctcaa tttcccttca caggggtgga180ggagtcgtgg ccttccgtct tttataatag gacctgccag tgctctggtg accgcaactt240catgggattc aactgtggaa actgcaagtt tggcttttgg ggaccaaact gcacagagag300acgactcttg gtgagaagaa acatcttcga tttgagtgcc ccagagaagg acaaattttt360tgcctacctc actttagcaa agcataccat cagctcagac tatgtcatcc ccatagggac420ctatggccaa atgaaaaatg gatcaacacc catgtttaac gacatcaata tttatgacct480ctttgtctgg atgcattatt atgtgtcaat ggatgcactg cttgggggat ctgaaatctg540gagagacatt gattttgccc atgaagcacc agcttttctg ccttggcata gactcttctt600
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65 70 75 80Asn Cys Gly Asn Cys Lys Phe Gly Phe Trp Gly Pro Asn Cys Thr Glu85 90 95Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp Leu Ser Ala Pro Glu100 105 110Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala Lys His Thr Ile Ser115 120 125Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly Gln Met Lys Asn Gly130 135 140Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr Asp Leu Phe Val Trp145 150 155 160Met His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu Gly Gly Ser Glu Ile165 170 175Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro Ala Phe Leu Pro Trp180 185 190His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Glu Ile Gln Lys Leu Thr195 200 205Gly Asp Glu Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp Trp Arg Asp Ala Glu210 215 220Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr Met Gly Gly Gln His Pro Thr225 230 235 240Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe Ser Ser Trp Gln Ile245 250 255Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His Gln Ser Leu Cys Asn260 265 270Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro Gly Asn His Asp Lys275 280 285Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe Cys Leu290 295 300Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp Lys Ala Ala Asn Phe305 310 315 320Ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Ala Ser Pro Leu Thr Gly Ile
325 330 335Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala Leu His Ile Tyr Met340 345 350Asn Gly Thr Met Ser Gln Val Gln Gly Ser Ala Asn Asp Pro Ile Phe355 360 365Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu Gln Trp Leu Arg370 375 380Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu Ala Asn Ala Pro Ile385 390 395 400Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe Ile Pro Leu Tyr Arg405 410 415Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr Ser420 425 430Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp Tyr Ile Lys Ser435 440 445Tyr Leu Glu Gln Ala Ser Arg Ile Trp Ser Trp Leu Leu Gly Ala Ala450 455 460Met Val Gly Ala Val Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gly Leu Val Ser Leu465 470 475 480Leu Cys Arg His Lys Arg Lys Gln Leu Pro Glu Glu Lys Gln Pro Leu485 490 495Leu Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln Ser His Leu500 505 510
權(quán)利要求
1.一種人酪氨酸酶表達(dá)載體，是含有人酪氨酸酶基因和His-tag基因的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人酪氨酸酶表達(dá)載體，其特征在于所述人酪氨酸酶基因編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人酪氨酸酶表達(dá)載體，其特征在于所述人酪氨酸酶基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，或與序列表中序列2的自5′端第11位至1546位堿基限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且編碼序列3的氨基酸殘基序列的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人酪氨酸酶表達(dá)載體，其特征在于所述His-tag基因編碼6個(gè)組氨酸殘基；所述His-tag基因優(yōu)選為具有序列表中序列1的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人酪氨酸酶表達(dá)載體，其特征在于所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體為pPIC3.5K、pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K；優(yōu)選為pPIC3.5K。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人酪氨酸酶表達(dá)載體，其特征在于所述人酪氨酸酶表達(dá)載體為pPIC3.5KHis-tyr。
7.將權(quán)利要求1-6中任一所述的人酪氨酸酶表達(dá)載體導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞得到的重組細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組細(xì)胞，其特征在于所述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母GS115、KM71或SMD1168。
9.一種表達(dá)人酪氨酸酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求7或8所述的重組巴斯德畢赤酵母細(xì)胞，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)人酪氨酸酶的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)人酪氨酸酶的方法，其特征在于所述方法中還包括利用金屬親和柱層析分離純化人酪氨酸酶的步驟；所述金屬親和柱層析優(yōu)選為鎳離子親和柱層析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人酪氨酸酶表達(dá)載體及其應(yīng)用，其目的是提供一種人酪氨酸酶表達(dá)載體及導(dǎo)入該載體的重組巴斯德畢赤酵母細(xì)胞和利用該重組細(xì)胞生產(chǎn)人酪氨酸酶的方法。該人酪氨酸酶表達(dá)載體是含有人酪氨酸酶基因和His－tag基因的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體。表達(dá)人酪氨酸酶的方法，包括培養(yǎng)重組巴斯德畢赤酵母細(xì)胞，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)人酪氨酸酶及利用金屬親和層析分離純化人酪氨酸酶的步驟。本發(fā)明的人酪氨酸酶基因表達(dá)載體通過同源重組使人酪氨酸酶基因整合入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的基因組中，穩(wěn)定表達(dá)人酪氨酸酶，而且在發(fā)酵過程中無需使用昂貴的抗生素和IPTG，使生產(chǎn)成本大大降低，此外，巴斯德畢赤酵母的高密度生長，也有利于人酪氨酸酶的表達(dá)，表達(dá)量可達(dá)0.39g/L。
文檔編號C12N15/52GK1603417SQ20041008871
公開日2005年4月6日 申請日期2004年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月1日
發(fā)明者陳國強(qiáng), 王宏濤, 李振國, 吳瓊 申請人:清華大學(xué)