專利名稱：一種用于除皺祛疤的注射液的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組織工程技術，尤其涉及一種用于除皺祛疤的注射液的制備方法。
背景技術：
在現(xiàn)有技術中，所使用的除皺祛疤的注射液由濃度為1000萬-4000萬加5％的葡萄糖液組成。在這種注射液的制備方法中，原代細胞的培養(yǎng)多選用懸液法，這種方法的缺點是成功率不高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術中存在的問題，提供了一種注射液，經臨床試驗具有良好的除皺祛疤效果。
根據(jù)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明的用于除皺祛疤的注射液的制備方法，包括A.從患者身上取下皮膚組織；B.將所取下的皮膚組織放入培養(yǎng)箱進行擴增培養(yǎng)；C.將擴增培養(yǎng)的成纖維細胞按每毫升900萬個-980萬個的比例加入標準注射液中，制成細胞懸濁液。
所述步驟A進一步包括用5％的碘塊消毒液在耳后或胳膊內側消毒，然后用2％的利多卡因進行局部表面麻醉。用取皮器將3-4平方毫米的全層皮膚取下，放入組織保存液中，將創(chuàng)傷部位縫合，創(chuàng)口貼覆蓋。
所述步驟B進一步包括B1.將取得的組織塊和組織液放入培養(yǎng)箱中消化10分鐘；B2.去除表皮及真皮下的脂肪；B3.將組織塊剪成若干塊，并將所剪成的若干塊組織以互相為0.5厘米的間隔放入六孔培養(yǎng)板中；B4.將六孔培養(yǎng)板小心放入孵箱，4小時之后沿培養(yǎng)箱的箱壁輕輕補加0.5毫升培養(yǎng)液，24天后再補加1毫升培養(yǎng)液；B5.對組織塊進行傳代培養(yǎng)4-6周。
所述步驟B5進一步包括每隔2-3天換液一次，當細胞達到50％-70％匯集細胞后傳代。
本發(fā)明的制備方法采用組織培養(yǎng)法，取得了較高的成功率。


圖1示出了制備本發(fā)明注射液的流程圖。
具體實施例方式
為了便于本領域一般技術人員理解和實現(xiàn)本發(fā)明，下面詳細說明本發(fā)明。
一、自體細胞的提取用5％的碘塊消毒液在耳后或胳膊內側消毒，然后用2％的利多卡因進行局部表面麻醉。用取皮器將3-4平方毫米的全層皮膚取下，放入組織保存液(DMEM+10％胎牛血清+0.25％的胰酶，美國Hyclone公司)中，將創(chuàng)傷部位縫合，創(chuàng)口貼覆蓋。
二、注射液的制備如圖1所示，在步驟1中，將取得的組織塊和組織液放入培養(yǎng)箱(SanyaCO2培養(yǎng)箱)中消化10分鐘。然后在步驟2中，去除表皮及真皮下的脂肪。在步驟3中，將組織塊剪成若干塊(每塊約為1-2平方毫米)，并將所剪成的若干塊組織以互相為0.5厘米的間隔放入六孔培養(yǎng)板中。在步驟4中，將六孔培養(yǎng)板小心放入孵箱。在步驟5中，4小時之后沿培養(yǎng)箱的箱壁輕輕補加0.5毫升培養(yǎng)液，在步驟6中，24天后再補加1毫升培養(yǎng)液。
培養(yǎng)24小時可以看到有細胞從組織塊邊緣延伸出來，48小時有大量細胞從邊緣生長出來并開始增殖。培養(yǎng)72小時后用0.25％胰酶在37℃孵箱中消化10-15分鐘，然后常規(guī)傳代培養(yǎng)。
在步驟7中，傳代培養(yǎng)每隔2-3天換液一次，當細胞達到50％-70％匯集細胞后傳代。在步驟8中，當體外培養(yǎng)4-6周后的真皮成纖維細胞按每毫升900萬個-980萬個的比例加入0.9％的生理水。制成細胞懸濁液。
注射液的作用機理當自體的成纖維細胞回注于本人的皺紋基底真皮層中，成活的成纖維細胞可分泌大量的膠原蛋白，起到除皺的作用。
三.產品檢測1.病毒檢測將皮膚組織進行培養(yǎng)四周后，取1ml含有細胞的培養(yǎng)液送北京傳染病醫(yī)院進行HIV和肝炎病毒的檢驗，確定此為無病毒細胞。
2.免疫反應測試第四周將0.1ml細胞懸浮液對受術者進行皮試(同青霉素皮試方法)，以確保無免疫反應。
3.成品檢測
1)外觀本品為淡白色混懸液。
2)無菌試驗按《中國生物制品規(guī)程》(2000年版)通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》A/B項進行，結果符合無菌要求。
產品的儲存和運輸應在2℃-10℃、陰涼、干燥、清潔、避免陽光直射、無腐蝕性氣體、無重壓的環(huán)境中進行。
臨床報告一、病例選擇年齡在50歲以下(包括50歲)，皺紋為額頭、眼周、口周皺紋，疤痕為粉刺、創(chuàng)傷疤痕(大小范圍無要求)。
二、治療過程1.患者術前檢查血、尿、便常規(guī)、心電圖、肝腎功能、HIV、HbsAg。
2.將注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因，或者表皮用2.5％利多卡因和2.5％丙氨卡因軟膏麻醉。
3.將1.5ml細胞懸液吸入3ml的注射器備用。
4.取2.2cm長的4.5號針頭，采用多點斜面(針頭與皮膚的角度20-45°)將細胞懸液注入到真皮層的上層與中層，每個注射部位選取10-15點，每點注射細胞懸液0.05-0.1ml。注射時應將注射部位表皮拉緊，使其發(fā)白，注射時應使注射部位留有彌散空間。對皺紋或疤痕部全部注射，注射完后用冰袋外敷2小時。
術后24小時內注射局部可有輕度腫脹、麻木等感覺，一般無其它的局部和全身反應。
療程一般皺紋注射2次，大的皺紋或瘢痕注射三次，每次注射間隔2-4周。
四、術后觀察、調護
1.手術后，用冰袋敷注射處2小時。
2.觀察局部及全身的情況。
3.每天二口服維生素C(每次200mg，每天共400mg)，或者局部搽含有維生素C的面霜，約6個月。
4.術后3天內防曝曬及慎用刺激性化妝品。
五、療效分析經過65例的病例分析，其中一次注射的病例有42例，兩次注射的有15例，其中第一次與第二次注射之間的觀察時間為6個月，結果病人感覺滿意的58例(滿意率為89.2％)，其皺紋、疤痕明顯消失，皮膚基質狀況得到改善。
其中有5例治療者至今已觀察三年，其皺紋、疤痕已完全消失。效果良好。
雖然通過實施例描繪了本發(fā)明，但本領域普通技術人員知道，在不脫離本發(fā)明的精神和實質的情況下，就可使本發(fā)明有許多變形和變化，本發(fā)明的范圍由所附的權利要求來限定。
權利要求
1.一種用于除皺祛疤的注射液的制備方法，其特征在于，包括A.從患者身上取下皮膚組織；B.將所取下的皮膚組織放入培養(yǎng)箱進行擴增培養(yǎng)；C.將擴增培養(yǎng)的成纖維細胞按每毫升900萬個-980萬個的比例加入標準注射液中，制成細胞懸濁液。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于除皺祛疤的注射液的制備方法，其特征在于，所述步驟A進一步包括用5％的碘塊消毒液在耳后或胳膊內側消毒，然后用2％的利多卡因進行局部表面麻醉。用取皮器將3-4平方毫米的全層皮膚取下，放入組織保存液中，將創(chuàng)傷部位縫合，創(chuàng)口貼覆蓋。
3.根據(jù)權利要求1所述的用于除皺祛疤的注射液的制備方法，其特征在于，所述步驟B進一步包括B1.將取得的組織塊和組織液放入培養(yǎng)箱中消化10分鐘；B2.去除表皮及真皮下的脂肪；B3.將組織塊剪成若干塊，并將所剪成的若干塊組織以互相為0.5厘米的間隔放入六孔培養(yǎng)板中；B4.將六孔培養(yǎng)板小心放入孵箱，4小時之后沿培養(yǎng)箱的箱壁輕輕補加0.5毫升培養(yǎng)液，24天后再補加1毫升培養(yǎng)液；B5.對組織塊進行傳代培養(yǎng)4-6周。
4.根據(jù)權利要求1所述的用于除皺祛疤的注射液的制備方法，其特征在于，所述步驟B5進一步包括每隔2-3天換液一次，當細胞達到50％-70％匯集細胞后傳代。
5.根據(jù)權利要求1所述的用于除皺祛疤的注射液的制備方法，其特征在于，所述步驟B3中所述若干小塊的大小約為1-2平方毫米。
6.根據(jù)權利要求1所述的用于除皺祛疤的注射液的制備方法，所述步驟C中的所述標準注射液為濃度0.9％的生理鹽水注射液。
7.根據(jù)權利要求1所述的用于除皺祛疤的注射液的制備方法，所述步驟C中所述標準注射液為濃度5％的葡萄糖注射液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于除皺祛疤的注射液的制備方法，包括從患者身上取下皮膚組織；將所取下的皮膚組織放入培養(yǎng)箱進行擴增培養(yǎng)；將擴增培養(yǎng)的成纖維細胞按每毫升900萬個－980萬個的比例加入標準注射液中，制成細胞懸濁液。所述步驟A進一步包括用5％的碘塊消毒液在耳后或胳膊內側消毒，然后用2％的利多卡因進行局部表面麻醉。用取皮器將3－4平方毫米的全層皮膚取下，放入組織保存液中，將創(chuàng)傷部位縫合，創(chuàng)口貼覆蓋。本發(fā)明的制備方法采用組織培養(yǎng)法，取得了較高的成功率。
文檔編號C12N5/08GK1768856SQ20041008880
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權日2004年11月4日
發(fā)明者邱立東 申請人:北京東南醫(yī)療美容醫(yī)院