專利名稱：生物催化制備(s)－4－氯－3－羥基丁酸酯的菌種和方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一株產(chǎn)高立體選擇性羰基還原酶的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)CGMCC No.1244，以及利用該出芽短梗霉菌催化不對(duì)稱還原反應(yīng)生產(chǎn)手性鹵代羥基丁酸酯的微生物轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
4-氯-3-羥基丁酸乙酯(ethyl 4-chloro-3-hydroxybutyrate，CHBE或ECHB)是一種重要的有機(jī)中間體，分子中有多功能基團(tuán)，其手性單一對(duì)映異構(gòu)體體(R)和(S)-CHBE均是非常有前景的重要的手性砌塊，還可經(jīng)由氯基的置換反應(yīng)、還原等反應(yīng)，導(dǎo)入所需的手性藥物中間體。(R)-CHBE可用于合成L-肉堿及1，4-二氫吡啶類β-阻滯劑等，(S)-CHBE可用于很多活性藥物的合成，如他汀類藥物——羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑和4-羥基吡咯烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等。
由于4-氯乙酰乙酸乙酯(ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate/ethyl4-chloroacetoacetate，COBE/ECAA/CAAE)易于合成且價(jià)格低廉，以其為底物進(jìn)行不對(duì)稱還原反應(yīng)獲取手性CHBE是非常經(jīng)濟(jì)有效的制備途徑。而且反應(yīng)產(chǎn)物(S)-CHBE不易為微生物代謝利用，用微生物活細(xì)胞催化方法制備(S)-CHBE非常有利。
目前所知的從COBE還原為手性醇的方法主要有三條路徑1、化學(xué)催化劑不對(duì)稱還原法所用催化劑包括銠、釕等金屬的價(jià)格昂貴，另外的問題是產(chǎn)物立體選擇性不夠高，催化還原反應(yīng)需要很高的氫氣壓，耗能高；2、酶催化不對(duì)稱還原法，用提取純化后的酶(商品酶)如乙醛還原酶等進(jìn)行不對(duì)稱還原，缺點(diǎn)是需要添加昂貴的輔酶；3、微生物催化不對(duì)稱還原法，即通過完整的微生物細(xì)胞(如面包酵母)的立體選擇性生物催化來實(shí)現(xiàn)，但要篩選獲得高立體選擇性的優(yōu)良微生物菌株比較困難；同時(shí)也需要添加輔酶，并不斷供給能量物質(zhì)，另外還有底物對(duì)菌體的毒性及在水溶液中的不穩(wěn)定性問題。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)高立體選擇性羰基還原酶的微生物新菌株，提供一種新的能有效催化不對(duì)稱還原反應(yīng)生產(chǎn)手性鹵代羥基丁酸酯的方法，并利用該微生物菌株催化COBE不對(duì)稱還原，以獲得高光學(xué)純度、高反應(yīng)產(chǎn)率、高產(chǎn)物濃度的(S)-CHBE。
本發(fā)明的能有效催化不對(duì)稱還原反應(yīng)生產(chǎn)手性鹵代羥基丁酸酯的微生物新菌株，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，菌落初期粘稠，白色，之后轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色，長時(shí)間放置后變成黑色皮革狀，菌落邊緣呈明顯的絲狀。從細(xì)胞形態(tài)上觀察，該菌具有酵母型及菌絲型形態(tài)特征。培養(yǎng)初期的幼齡菌絲通常壁薄，透明，分隔，隔距較長。菌絲分枝，菌絲的各處均可出芽形成出芽型的分生孢子，分生孢子形狀為細(xì)長的橢圓形；通常二次分生孢子是由初級(jí)分生孢子的酵母狀出芽過程中形成的；隨著菌體的老化，菌絲分節(jié)斷裂形成分節(jié)型的厚垣孢子。據(jù)其形態(tài)特征和孢子產(chǎn)生的特征，按照Hermanides-Nijhof的分類系統(tǒng)(De Hoog G S andHermanides-Nijhof E J.The black yeasts and allied hyphomycetes.Studies inMycology，1977，15141-177)，初步認(rèn)為應(yīng)屬于短梗霉屬的出芽短梗霉，擬命名為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)SW0202。
此菌株是選擇出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW13-02為出發(fā)菌株，按常規(guī)方法進(jìn)行紫外線、Co-60誘變處理制得。紫外線照射為15W，距離27cm，時(shí)間2～3分鐘；Co-60照射為劑量2～8萬倫琴，時(shí)間為20～30分鐘。經(jīng)處理的菌絲體移種到含0.1％～1.0％COBE的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，20～40℃培養(yǎng)3～7天，檢出在含高濃度COBE培養(yǎng)基上生長的菌落。
含COBE的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基由麥芽粉配成10°Be′的麥芽汁加2％的瓊脂制成。
此菌株已于2004年11月17日保存在中國北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心，保存號(hào)CGMCC No.1244。
本發(fā)明催化COBE不對(duì)稱還原生產(chǎn)(S)-CHBE的微生物轉(zhuǎn)化方法，包括以下3個(gè)步驟步驟(1)將菌株SW0202，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、發(fā)酵，發(fā)酵液過濾獲得濕菌體；步驟(2)以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)為原料，用磷酸鹽緩沖溶液配制成溶液，或直接加入反應(yīng)體系作為生物催化用底物；
步驟(3)將步驟(1)的發(fā)酵液、濕菌體或用載體固定化后加入到步驟(2)的底物溶液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
其中步驟(3)中底物溶液濃度為0.1-50％，加濕菌體量為1～40g/g底物，酶反應(yīng)溫度為20-50℃，酶解時(shí)間為1-20小時(shí)。
步驟(1)中產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為麥芽糖0.5～5.0％，酵母膏1～5％，蛋白胨0.5～2％，硫酸銨0.1～1.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.5％，硫酸鎂0.01～0.1％，pH值為4～9，溫度20-40℃，培養(yǎng)1-5天。
步驟(3)中用載體固定化是指濕菌體用生理鹽水制成菌懸液，以載體包埋制得固定化細(xì)胞，載體為海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、幾丁質(zhì)。
步驟(3)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以采用分批補(bǔ)料轉(zhuǎn)化法或有機(jī)溶劑/水雙相體系轉(zhuǎn)化法，有機(jī)溶劑/水雙相體系轉(zhuǎn)化法是指培養(yǎng)細(xì)胞在含20～60％有機(jī)溶劑與水的雙相體系中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，有機(jī)溶劑為癸醇、十二醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯、辛烷、壬烷、十一烷或十二烷。
反應(yīng)完畢后得到的轉(zhuǎn)化液，用乙酸乙酯萃取，再脫水，脫色，蒸發(fā)回收溶劑，得到無色油狀液體(S)-CHBE。
以下具體描述各個(gè)步驟催化用菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵斜面培養(yǎng)配制含葡萄糖1～10％，麥芽粉浸汁5～30％，瓊脂1～2.5％，pH6～9的培養(yǎng)基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，下同。100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面、接種，20～40℃培養(yǎng)3～7天。
種子培養(yǎng)和發(fā)酵麥芽糖0.5～5.0％，酵母膏1～5％，蛋白胨0.5～2％，硫酸銨0.1～1.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.5％，硫酸鎂0.01～0.1％，pH值為4～9的培養(yǎng)基，裝液量20～150ml/250ml三角瓶，100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、接種，接種量5～10％，20～40℃，搖瓶轉(zhuǎn)速100～250r/min。在上述條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)1～5天，分別作為種子或發(fā)酵培養(yǎng)液。
底物COBE溶液的制備以常規(guī)化學(xué)合成方法制備得到的商品COBE，檢驗(yàn)合格后用0.1M，pH6.6磷酸鹽緩沖溶液配制成所需濃度溶液，或直接按需要量加入反應(yīng)體系，經(jīng)微孔濾膜無菌過濾后作為生物催化用底物。
微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)
用培養(yǎng)后的發(fā)酵液獲得的濕菌體作為酶源，以COBE磷酸鹽緩沖溶液為底物，底物濃度為0.1-50％，加濕菌體量為1～40g/g底物，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為20～50℃，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為1～20小時(shí)。在此條件下所得的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行手性氣相色譜分析(GC)測(cè)定表明，已轉(zhuǎn)化的主要組分為(S)-CHBE。
或者，發(fā)酵產(chǎn)得濕菌體，或用生理鹽水制成菌懸液，以海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、幾丁質(zhì)等載體包埋等方法制得固定化細(xì)胞。以此作為酶源進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。菌絲體或固定化細(xì)胞可反復(fù)回用，進(jìn)行多次生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
分批補(bǔ)料轉(zhuǎn)化法于發(fā)酵培養(yǎng)基中，或菌體懸浮液中，每小時(shí)一次加入0.1～2.0％的COBE底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，連續(xù)6～7次，最后一次加底物后再轉(zhuǎn)化1小時(shí)，產(chǎn)物(S)-CHBE的濃度可以達(dá)到1.5～20％，摩爾轉(zhuǎn)化率70～80％，對(duì)映體過量值為97～98％e.e.。
有機(jī)溶劑/水雙相體系轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)細(xì)胞在含20～60％的癸醇，或十二醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯、辛烷、壬烷、十一烷、十二烷等有機(jī)溶劑與水的雙相體系中，在最佳條件下，定期添加COBE，葡萄糖，有機(jī)相中(S)-CHBE的濃度可以達(dá)到20～60g/L，mol轉(zhuǎn)化率80～100％，對(duì)映體過量值為97～98％e.e.
底物COBE與產(chǎn)物CHBE的氣相色譜(GC)測(cè)定反應(yīng)結(jié)束后，用適量的乙酸乙酯萃取，無水MgSO4脫水，過濾，用GC分析。使用VARIAN3900氣相色譜儀，VARIAN CP WAX 52CB極性色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)，色譜條件為進(jìn)樣量0.5μl，進(jìn)樣口250℃，檢測(cè)器250℃，流量2.0ml/min，采用程序升溫100℃保留2min，以5℃/min升溫至180℃，保留7min，載氣H2流速30ml/min，尾吹N2流速25ml/min，燃燒氣H2流速30ml/min，空氣流速300ml/min。
產(chǎn)物CHBE對(duì)映異構(gòu)體過量值(e.e.)測(cè)定采用手性氣相色譜法(Allan C.Dahland Jorgen gaard Madsen；TetrahedronAsymmetry，1998，9，4395～4417)。樣品處理方法取乙酸乙酯萃取液0.5ml，置于5ml具塞試管中，常溫蒸發(fā)去溶劑。然后，滴入2滴乙酸酐和2滴吡啶，置于沸水浴中保持1h，冷后加5ml乙酸乙酯稀釋；手性色譜柱CP-Chirasil Dex CB 0.25mm×25m 0.25um；色譜條件為110℃保留2min，以2℃/min升溫至126℃，保留2min，以5℃/min升溫至160℃，保留2min；進(jìn)樣量0.2ul；柱流速2.0ml/min；載氣H2流速30ml/min，燃燒氣H2流速30ml/min，空氣流速300ml/min，尾吹N2流速25ml/min；進(jìn)樣口250℃，檢測(cè)器250℃，分流比50∶1。
產(chǎn)物(S)-CHBE的提取轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心(10,000rpm，20min，4℃)，上清液用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，再向其中加入1～5％(w/v)的無水硫酸鎂，攪勻后靜置過夜，除去殘余的水份。將有機(jī)相用濾紙過濾，收集有機(jī)相。40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到無色油狀液體(S)-CHBE。取(S)-CHBE 0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5ml，用GC-MASS進(jìn)行定性分析，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma Co.)的離子流圖與質(zhì)譜圖對(duì)照，確定為同一物質(zhì)。
有益效果本發(fā)明微生物轉(zhuǎn)化法相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)不對(duì)稱合成法、面包酵母氧化還原方法或用添加輔酶NADH/NAD+的酶催化不對(duì)稱還原方法具有以下優(yōu)點(diǎn)①生成的(S)-CHBE對(duì)映體過量值高，達(dá)到97％e.e.以上；②生物催化劑為微生物菌體，可以自行發(fā)酵生產(chǎn)，質(zhì)量穩(wěn)定，成本低廉，還可制備成固定化細(xì)胞，進(jìn)行多次生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)；③在水/溶劑雙相體系中，通過供給能量物質(zhì)，連續(xù)補(bǔ)加底物，可以獲得高光學(xué)純度、高反應(yīng)產(chǎn)率、高產(chǎn)物濃度；④在整個(gè)反應(yīng)過程中不需要添加輔酶；⑤反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。
本發(fā)明的特點(diǎn)是選育了一株高對(duì)映體選擇性菌株——出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202(即CGMCC1244)，在單一水相體系中催化不對(duì)稱還原COBE生成的產(chǎn)物(S)-CHBE對(duì)映體過量值達(dá)到97％e.e.。在水/溶劑雙相體系中，通過供給能量物質(zhì)，連續(xù)補(bǔ)加底物，可以獲得高光學(xué)純度、高反應(yīng)產(chǎn)率、高產(chǎn)物濃度，更主要的是在整個(gè)反應(yīng)過程中不需要添加輔酶。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化工藝可以直接用發(fā)酵培養(yǎng)液添加底物COBE進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可以用發(fā)酵后分離得到的游離菌體或其固定化細(xì)胞加底物COBE溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，菌體或其固定化細(xì)胞可反復(fù)利用多次。
實(shí)施例實(shí)施例1斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基為100ml麥芽汁(含麥芽粉10％)，葡萄糖2g，瓊脂2g，pH6.5，121℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為表1所示的各種微生物菌株，28℃培養(yǎng)2天，作為斜面活化種子。
種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽糖3％，酵母膏2％，蛋白胨0.5％，(NH4)2SO40.5％，KH2PO40.2％，MgSO4·7H2O 0.07％，pH7.0，裝液量為250ml三角瓶裝液50ml，120℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子，160轉(zhuǎn)/分鐘搖床，28℃培養(yǎng)2天，作為種子或發(fā)酵酶液。
發(fā)酵酶液中濕菌體量為2.5g/100ml，離心10分鐘(8,000轉(zhuǎn)/分鐘)收集菌體，用磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH6.6)清洗兩次，將菌體轉(zhuǎn)入25ml含葡萄糖的相同的緩沖液中，使菌體濃度為發(fā)酵液中的兩倍，同時(shí)加入0.3g底物(COBE)，于30℃，160轉(zhuǎn)/分鐘下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4干燥過夜，過濾后進(jìn)行氣相色譜分析(S)-CHBE含量與對(duì)映體過量值。結(jié)果如表1表1產(chǎn)羰基還原酶微生物菌株的篩選

實(shí)施例2用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202(即CGMCC 1244)，按實(shí)例1方法發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)后，稱取12g濕菌體加于250ml三角瓶裝50ml 0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液中，含底物COBE量為0.5g，分別添加0％，1％，3％，5％，7％，9％的葡萄糖，于30℃，160r/min下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)過程中必要時(shí)用Na2CO3調(diào)節(jié)pH使其維持pH6.5～pH6.6，反應(yīng)4小時(shí)后結(jié)束，測(cè)定其產(chǎn)物量及對(duì)映體過量值。反應(yīng)液離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4干燥，過濾后進(jìn)行氣相色譜分析(S)-CHBE含量與對(duì)映體過量值。結(jié)果如表2表2添加不同葡萄糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

由表2可以看出，添加葡萄糖并不影響產(chǎn)物的對(duì)映體過量值，而其產(chǎn)率則隨葡萄糖濃度的增加有所增加。
實(shí)施例3用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202(即CGMCC1244)，按實(shí)例1方法發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)后，發(fā)酵酶液中濕菌體量為2.5g/100ml，稱取3～18g濕菌體加于250ml三角瓶裝0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液50ml(測(cè)定干菌體濃度約為16～96g/L)，起始底物COBE量為0.5g，于30℃，160轉(zhuǎn)/分鐘下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。4小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4干燥，過濾后進(jìn)行氣相色譜分析(S)-CHBE含量與對(duì)映體過量值。結(jié)果如表3表3不同的菌體量對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

實(shí)施例4
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實(shí)例1方法發(fā)酵產(chǎn)酶，按實(shí)例2方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，50ml反應(yīng)體系中含底物COBE量為1.22g。于反應(yīng)不同時(shí)間取樣，進(jìn)行氣相色譜分析(S)-CHBE含量并計(jì)算轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。結(jié)果如表4表4轉(zhuǎn)化時(shí)間曲線

實(shí)施例5用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實(shí)例1方法發(fā)酵產(chǎn)酶，于250ml三角瓶裝0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液50ml，加入12g濕菌體，加入溶解有3.6g COBE的苯二甲酸二丁酯溶液50ml，按實(shí)例2方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，8小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束，用手性柱進(jìn)行氣相色譜分析，反應(yīng)液有機(jī)相中(S)-CHBE含量達(dá)到58.8g/L，水相中(S)-CHBE含量10.0g/L，相應(yīng)mol轉(zhuǎn)化率為94.8％(w/w)，(S)-CHBE對(duì)映體過量值為97.1％e.e.。
實(shí)施例6用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實(shí)例1方法發(fā)酵產(chǎn)酶，于250ml三角瓶裝0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液50ml中加入12g濕菌體(測(cè)定干菌體濃度約為49.2gDCW/L)，按實(shí)例5方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化4小時(shí)，取樣測(cè)定反應(yīng)液有機(jī)相中(S)-CHBE含量，反應(yīng)結(jié)束后分離出反應(yīng)液有機(jī)相，再次加入新的有機(jī)相底物(含底物COBE量為2％的乙酸正丁酯)與葡萄糖，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在同一條件轉(zhuǎn)化4小時(shí)，如此反復(fù)轉(zhuǎn)化重復(fù)利用5次。結(jié)果如表5所示。
表5發(fā)酵濕菌體反復(fù)分批轉(zhuǎn)化結(jié)果

實(shí)施例7按實(shí)例1方法，發(fā)酵，得濕菌體100g，加100ml生理鹽水制成菌體懸液，30℃保溫；另稱取20g卡拉膠，加400ml生理鹽水，加熱溶解后，冷卻到55℃保溫。兩者在50℃以下混勻，倒入平皿，冷卻，加KCl溶液，放冰箱中硬化3小時(shí)，稱重得約500g固定化細(xì)胞。將此固定化細(xì)胞，按實(shí)例5方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。反復(fù)分批轉(zhuǎn)化5次結(jié)果見表6。
表6固定化細(xì)胞反復(fù)分批酶轉(zhuǎn)化結(jié)果

實(shí)施例8用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實(shí)例1方法發(fā)酵產(chǎn)酶，按實(shí)例2方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，于0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液100ml中，加濕菌體50g，加入3.65g的COBE，分為一次性加入、兩次加入、三次加入、五次加入和十次加入。每次加入量，分別為3.65g，1.825g，1.217g，0.913g，0.73g，0.365g。同時(shí)測(cè)定pH，若低于pH6.6，則用1mol/LNa2CO3調(diào)至pH6.6，反應(yīng)結(jié)束，進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果如表7表7分次添加底物的轉(zhuǎn)化結(jié)果

實(shí)施例9
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實(shí)例1方法發(fā)酵產(chǎn)酶，按實(shí)例7方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心(10,000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘，4℃)得上清液，上清液用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，再向其中加入1～3％(w/v)的無水硫酸鎂，攪拌后靜置過夜，除去殘余的水份。將所得有機(jī)相用濾紙過濾，收集有機(jī)相。40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，所得油狀物用減壓蒸餾的方法提純，在4～6mmHg條件下，收集80～84℃的餾分，經(jīng)GC分析，純度為78.04％。
粗產(chǎn)品用精餾方法或硅膠柱純化(己烷/乙酸乙酯＝3/1，v/v)，得到(S)-CHBE成品(含量98％，光學(xué)純度97.8％e.e.)，[α]D25＝-21.40°(c＝7.0，CHCl3)。用GC-MASS進(jìn)行定性分析，與標(biāo)樣離子流圖和質(zhì)譜圖對(duì)照，確定樣品與標(biāo)準(zhǔn)品為同一物質(zhì)(圖譜略)。
權(quán)利要求
1.一種高對(duì)映體選擇性羰基還原酶的微生物菌株，它是出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，即CGMCC No.1244。
2.一種制造手性鹵代羥基丁酸酯的方法，包括以下3個(gè)步驟步驟(1)將權(quán)利要求1所述的菌株SW0202，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、發(fā)酵，發(fā)酵液過濾獲得濕菌體；步驟(2)以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)為原料，用磷酸鹽緩沖溶液配制成溶液，或直接加入反應(yīng)體系作為生物催化用底物；步驟(3)將(1)的發(fā)酵液、濕菌體或用載體固定化后加入到(2)的底物溶液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中底物溶液濃度為0.1-50％，加濕菌體量為1～40g/g底物，酶反應(yīng)溫度為20-50℃，酶解時(shí)間為1-20小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為麥芽糖0.5～5.0％，酵母膏1～5％，蛋白胨0.5～2％，硫酸銨0.1～1.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.5％，硫酸鎂0.01～0.1％，pH值為4～9，溫度20-40℃，培養(yǎng)1-5天。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中用載體固定化是指濕菌體用生理鹽水制成菌懸液，以載體包埋制得固定化細(xì)胞，載體為海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、幾丁質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)采用有機(jī)溶劑/水雙相體系轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)細(xì)胞在含20～60％有機(jī)溶劑與水的雙相體系中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，有機(jī)溶劑為癸醇、十二醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯、辛烷、壬烷、十一烷或十二烷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)高立體選擇性羰基還原酶的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)CGMCC No.1244，以及利用該出芽短梗霉菌催化不對(duì)稱還原反應(yīng)生產(chǎn)手性鹵代羥基丁酸酯的微生物轉(zhuǎn)化方法。該方法在優(yōu)化條件下發(fā)酵產(chǎn)酶，游離酶或其固定化細(xì)胞用于4－氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的不對(duì)稱還原，生成(S)－4－氯－3－羥基丁酸乙酯(S－CHBE)；在單一水相體系中微生物酶催化不對(duì)稱還原COBE生成的(S)－CHBE對(duì)映體過量值達(dá)到97％e.e.，在水/溶劑雙相體系中，通過供給能量物質(zhì)，連續(xù)補(bǔ)加底物，可以獲得高光學(xué)純度、高反應(yīng)產(chǎn)率、高產(chǎn)物濃度，更主要的是在整個(gè)反應(yīng)過程中不需要添加輔酶。
文檔編號(hào)C12P7/62GK1778889SQ20041009111
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月18日
發(fā)明者孫志浩, 鄭璞, 何軍邀, 鐘萍 申請(qǐng)人:江南大學(xué)