專利名稱：重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒(Norwalk-likeviruses，NLVs)衣殼蛋白(recombinant Beijing virus，rBJV)及其制備方法，具體涉及的是諾瓦克樣病毒第二個開放閱讀框基因重組桿狀病毒表達(dá)的衣殼蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
諾瓦克樣病毒是導(dǎo)致急性胃腸炎的主要病原之一，其通過水、食物等途徑在兒童和成人中引起急性胃腸炎的暴發(fā)和散發(fā)，其中生吃貝類食物是導(dǎo)致急性胃腸炎暴發(fā)流行的最常見原因。1987～1992年，在日本Kyushu地區(qū)暴發(fā)的急性胃腸炎中，有4次被證實(shí)與生食牡蠣有關(guān)。Schwab等用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法證實(shí)可以在貝類生物體內(nèi)累積，且用消滅大腸桿菌的方法不能凈化。諾瓦克樣病毒作為急性胃腸炎的主要病原，在美國、英國、荷蘭、日本、澳大利亞、南非等國家均有大量報道，在美國由諾瓦克樣病毒引起的急性胃腸炎已占到42％。諾瓦克樣病毒具有高感染性，能導(dǎo)致學(xué)校、軍隊、醫(yī)院、食堂、旅游區(qū)等人口密集的社區(qū)爆發(fā)流行急性胃腸炎。盡管引起的急性胃腸炎癥狀(嘔吐、腹瀉、腹部痙攣等)溫和、呈自限性，但諾瓦克樣病毒亦能在少數(shù)情況下導(dǎo)致死亡。
對我國部分地區(qū)人群諾瓦克樣病毒抗體水平調(diào)查顯示，我國感染諾瓦克樣病毒也相當(dāng)普遍。1998～2002年在福州地區(qū)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法對288份腹瀉患者糞便標(biāo)本諾瓦克樣病毒病原檢測顯示，諾瓦克樣病毒陽性率為39.9％。據(jù)報道，我國2003年10月22日廣州某小學(xué)引發(fā)了一次82人諾瓦克樣病毒合并金黃色葡萄球菌中毒的事件。
我國尚無重組諾瓦克樣病毒衣殼蛋白的報道，對我國抗體水平及抗原的調(diào)查所用檢測抗原均來自國外的重組蛋白。在各國的流行毒株均有差異，本發(fā)明用來產(chǎn)生重組蛋白的諾瓦克樣病毒是在我國分離的毒株，用此重組蛋白作為檢測抗原或用來制備檢測抗體所得到的檢測結(jié)果更貼近實(shí)際。并且，用本發(fā)明的實(shí)驗方法能夠得到其他國內(nèi)重組衣殼蛋白。
由于諾瓦克樣病毒無法用細(xì)胞培養(yǎng)又無合適的動物模型，只能從患者糞便標(biāo)本中獲得數(shù)量很少的病毒抗原，這對諾瓦克樣病毒血清學(xué)和流行病學(xué)研究造成了極大困難。而應(yīng)用基因工程技術(shù)可以獲得大量的人工重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白，使人們對諾瓦克樣病毒的研究不再受糞便標(biāo)本中病毒數(shù)量的影響，并且重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白所產(chǎn)生的病毒樣顆粒與天然病毒的形態(tài)和抗原性極為相似，對建立靈敏度高、診斷迅速和特異性強(qiáng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法和研制口服疫苗打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供諾瓦克樣病毒第二個開放閱讀框基因重組桿狀病毒表達(dá)衣殼蛋白及制備方法。
本發(fā)明提供的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白，是一種諾瓦克樣病毒衣殼蛋白第二個開放閱讀框基因重組桿狀病毒表達(dá)蛋白，所述第二個開放閱讀框基因共1623個堿基，編碼540個氨基酸殘基，重組蛋白分子量為58kDa，該衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中自我組裝成的病毒樣顆粒在抗原性和形態(tài)方面與天然病毒相似。
本發(fā)明的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白，其中用于產(chǎn)生所述第二個開放閱讀框基因重組桿狀病毒表達(dá)衣殼蛋白的共1623個堿基的第二個開放閱讀框基因，其核酸具有序列表中SEQ ID NO1所述的堿基序列。
本發(fā)明的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白，其中所述第二個開放閱讀框基因編碼的540個氨基酸殘基，具有序列表中SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
本發(fā)明所述的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白的制備方法其過程包括(1)設(shè)計擴(kuò)增諾瓦克樣病毒第二個開放閱讀框基因的特異性引物；(2)提取病毒RNA；(3)將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；(4)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得第二個開放閱讀框基因片段；(5)對第二個開放閱讀框基因進(jìn)行克隆、測序鑒定；(6)將第二個開放閱讀框基因定向亞克隆至pBlueBacHis2桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體；(7)純化質(zhì)粒pBacHis2-第二個開放閱讀框；(8)將純化好的質(zhì)粒pBacHis2-第二個開放閱讀框與線性化野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞sf9中，通過噬斑法篩選和純化重組病毒；(9)在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)病毒樣顆粒；
(10)純化重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白形成的病毒樣顆粒。
本發(fā)明可用于采用本發(fā)明的方法可同樣制備出諾瓦克樣病毒其他不同毒株的重組衣殼蛋白。
采用本發(fā)明的方法得到的諾瓦克樣病毒第二個開放閱讀框基因重組桿狀病毒表達(dá)衣殼蛋白，可用其制備檢測抗體并建立酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，檢測污染諾瓦克樣病毒的海洋生物或感染諾瓦克樣病毒患者糞便標(biāo)本中的諾瓦克樣病毒。
采用本發(fā)明的方法得到的諾瓦克樣病毒第二個開放閱讀框基因重組桿狀病毒表達(dá)衣殼蛋白，可作為檢測抗原建立間接酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，檢測人群中諾瓦克樣病毒抗體水平的血清學(xué)調(diào)查。
利用本發(fā)明的產(chǎn)品可用于研制開發(fā)預(yù)防諾瓦克樣病毒感染的基因工程口服疫苗。
本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在由于本發(fā)明的產(chǎn)品重組桿狀病毒表達(dá)的衣殼蛋白并非全病毒，因此無散毒危險。
利用本產(chǎn)品可獲得大量與天然病毒形態(tài)與抗原性相似的病毒樣顆粒。
作為診斷抗原特異性強(qiáng)，靈敏度高，診斷迅速，且較經(jīng)濟(jì)。
作為診斷抗原檢測諾瓦克樣病毒患者糞便標(biāo)本時，不再受糞便標(biāo)本中病毒數(shù)量的限制。


圖1為顯示有酶切位點(diǎn)的pBlueBacHis2桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體的序列。
圖2為病毒樣顆粒電鏡照片。
圖3為病毒樣顆粒電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明諾瓦克樣病毒第二個開放閱讀框基因重組桿狀病毒表達(dá)的衣殼蛋白，是利用基因工程技術(shù)，在對諾瓦克樣病毒衣殼蛋白基因完整開放閱讀框進(jìn)行克隆的基礎(chǔ)上，將其與桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHis2連接，與Bac-N-BlueDNA共轉(zhuǎn)染進(jìn)入昆蟲細(xì)胞，通過噬斑法篩選并純化重組病毒，在昆蟲細(xì)胞表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白，分子量約為58kDa，能自我組裝成病毒樣顆粒，其形態(tài)與免疫性與天然病毒極為相似。
制備實(shí)施例(重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白的制備)1.設(shè)計擴(kuò)增諾瓦克樣病毒第二個開放閱讀框(ORF2)基因的特異性引物在基因庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)上下載已發(fā)表的諾瓦克樣病毒毒株序列，所用參考毒株為Camberwell virus、Lordsdale virus、Hawaii virus、Mexico virus、OTH25virus，它們在Genebank上的基因序列認(rèn)證號相應(yīng)分別為U46500、X86557、U07611、U22498、L23830。根據(jù)這些參考序列在ORF2基因外兩端區(qū)域設(shè)計一對引物。
合成引物。
2.提取病毒RNA用Trizol法提取病毒RNA，過程為將糞便標(biāo)本(250μl)在冰上融化，4℃，8000rpm離心分鐘，取上清；4℃，10000rpm離心5分鐘，取上清200μl；加入400μl Trizol，反復(fù)倒置1分鐘，室溫靜止10分鐘；加入氯仿400μl混勻，室溫靜止10分鐘；4℃，12000rpm離心15分鐘；取上層液加1.5倍體積異丙醇，-20℃沉淀2h；4℃，15000rpm離心10分鐘，去上清；37℃干燥；加入10μl用焦碳酸二乙酯處理過的無菌水。
3.將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA將提取的病毒RNA用所設(shè)計的特異性引物的下游引物在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板。
4.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得第二個開放閱讀框基因片段。
5.對第二個開放閱讀框基因進(jìn)行克隆、測序鑒定將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到的第二個開放閱讀框基因片段回收、純化。
將純化的第二個開放閱讀框基因片段與PMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌TG I中篩選出陽性克隆，測序鑒定，測序結(jié)果為序列表中SEQ ID NO1所述的堿基序列。
6.將第二個開放閱讀框基因定向亞克隆至pBlueBacHis2桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體設(shè)計一對帶酶切位點(diǎn)的特異性引物，此酶切位點(diǎn)在pBlueBacHis2桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體的多克隆位點(diǎn)中能找到(圖1)。
其中，圖1 EK cleavage site為蛋白酶K裂解位點(diǎn)(與本發(fā)明無關(guān))。圖1給出的序列是pBlueBacHis2桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體的多克隆位點(diǎn)，BamH I、Xho I、Sac I、Bgl II、Pst I、Kpn I、Nco I、EcoR I、Hind III及Sal I為限制性內(nèi)切酶名稱，指向的位置是每個酶識別的核苷酸序列。
以步驟5得到的陽性克隆為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物和pBlueBacHis2桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體用相同的限制性內(nèi)切酶酶切，所獲得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化后，用T4DNA酶連接并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌TG I中，篩選出陽性克隆(pBacHis2-第二個開放閱讀框)，測序鑒定結(jié)果為序列表中SEQ IDNO1所述的堿基序列。
7.純化質(zhì)粒pBacHis2-第二個開放閱讀框純化質(zhì)粒pBacHis2-第二個開放閱讀框，純化后的質(zhì)粒用分光光度儀測出OD260和OD280的值，OD260/OD280的值為1.81，該比值在1.6～1.8之間證明純度達(dá)到要求，根據(jù)OD260的值計算出質(zhì)粒濃度為0.2731μg/μl。
8.將純化好的質(zhì)粒pBacHis2-第二個開放閱讀框與線性化野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞sf9中，通過噬斑法篩選和純化重組病毒。
9.在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)病毒樣顆粒用感染復(fù)數(shù)為10的純化的重組病毒在無血清培養(yǎng)基中感染HighFive細(xì)胞，用感染復(fù)數(shù)為10的純化的重組病毒在無血清培養(yǎng)基中感染HighFive細(xì)胞，表達(dá)的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白在HighFive細(xì)胞中自我組裝成病毒樣顆粒。
10.純化重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白形成的病毒樣顆粒重組病毒感染5天后，收獲細(xì)胞裂解液。4℃，3000×g離心30min除去細(xì)胞碎片，將上清4℃，8300×g進(jìn)一步離心30min以除去桿狀病毒粒子。4℃，100000×g超速離心2h濃縮病毒樣顆粒，將病毒樣顆粒沉淀用含有10μM亮抑酶肽的Grace’s培養(yǎng)基重懸過夜，加入氯化銫使病毒樣顆粒終濃度為1.36g/mL，10℃，38000rpm離心22h。含有病毒樣顆粒的分級液用Centricon-30過柱以除去鹽分，純化的病毒樣顆粒用含有10μM亮抑酶肽的Grace’s培養(yǎng)基洗脫下來。純化的病毒樣顆粒用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖2)以及進(jìn)行電鏡鑒定(圖3)。
圖2為病毒樣顆粒電鏡照片，電鏡照片中的病毒樣顆粒約為38nm，標(biāo)尺為100nm。
圖3為病毒樣顆粒電泳結(jié)果，其中M蛋白MarkerD1細(xì)胞對照D2野生型病毒對照rBJV重組病毒其中rBJV蛋白帶中所指箭頭即約58kDa的重組桿狀病毒表達(dá)的衣殼蛋白。
應(yīng)用實(shí)施例(用重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白制備抗體)取400μg純化的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白，加生理鹽水稀釋至4mL，再加等體積的弗氏完全佐劑充分乳化。取健康的2公斤的雄性兔2只，每只皮下注射諾瓦克樣病毒衣殼蛋白與弗氏完全佐劑混合物4mL，分8點(diǎn)注射，每點(diǎn)500μL，第二次以后均以諾瓦克樣病毒衣殼蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合免疫，每次免疫后間隔4周再免疫1次，共免疫4次，最后一次免疫10天后，采血，分離血清，測效價。用雙瓊脂擴(kuò)散試驗方法測定效價，效價為1∶20000，表明該血清為高免血清，同時也證明了該諾瓦克樣病毒衣殼蛋白的抗原性。
獲得諾瓦克樣病毒衣殼蛋白后，可以建立間接酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測人群體內(nèi)諾瓦克樣病毒抗體水平；抗諾瓦克樣病毒衣殼蛋白的高免血清獲得后，更可以利用衣殼蛋白和高免血清建立競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測海洋生物或感染諾瓦克樣病毒患者糞便標(biāo)本中的諾瓦克樣病毒。
另外，根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)(倉堯卿，諾沃克病毒研究的困難和進(jìn)展，國外醫(yī)學(xué)預(yù)防·診斷·治療用生物制品分冊，2001，24(2)49-52)，重組桿狀病毒表達(dá)的NLVs衣殼蛋白可以作為候選疫苗，但其中存在的問題還需進(jìn)一步研究。作為實(shí)例，用重組桿狀病毒表達(dá)的NLVs衣殼蛋白給志愿者口服100μg與200μg時，顯示安全并具免疫原性，給予大劑量時，所有志愿者均發(fā)生血清學(xué)應(yīng)答。
序列表<110>國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心東北農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白及其制備方法<130>SCP0196/2004<140>
<141>
<150>
<151>
<160>2<170>
<210>1<211>1623<212>DNA<213>Norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Beijing/2002/China，capsid protein，complete cds.
<400>1
atgaagatgg cgtcgaatga cgccagctca tctgatgggt ctacagcaaa cctcgtccca60gaggtcaaca atgaggttat ggctttggag cccgttgttg gtgccgcaat tgcggcacct 120gtagcgggcc aacaaaatgt aattgacccc tggattagaa ataattttgt acaagcccct 180ggtggagagt tcacagtatc ccctagaaac gctccaggtg aaatactatg gagcgcgccc 240ttgggccctg atctgaatcc ctacctttct catttggccc gaatgtacaa tggttatgca 300ggtggttttg aagtgcaggt aatcctcgcg gggaacgcgt tcaccgccgg taaaatcata 360tttgcagcag tcccaccaaa ttttccaact gaaggcttga gccccagcca ggtcaccatg 420ttcccccata taatagtaga tgttagacaa ctggaacctg tgttgatccc cttacctgat 480gttaggaata atttctacca ctataatcag tcaaatgacc ctaccattaa actgatagca 540atgctataca caccacttag ggctaataat gctggggatg atgtcttcac agtctcttgt 600cgagtcctca cgaggccatc ccccgatttt gatttcatat ttttggtgcc acccacagtt 660gagtcaagaa ctaaaccatt caccgtccca attttaactg ttgaggaaat gaccaattca 720agattcccca ttcctttgga aaagttgttc acgggtccca gcagtgcctt tgttgtccag 780ccacaaaatg gcagatgcac gactgacggc gtgctcttag gcactaccca actgtctcct 840gtcaacatct gcaccttcag aggggatgtc acccacattg caggtactca tgattacaca 900atgaatttgg cttctcaaaa ttggaacaat tacgacccaa cagaagaaat cccagcccct 960ctgggaactc cagatttcgt gggaaagatc caaggcgtgc tcactcaaac cacaagggga 1020gacggctcaa cccgtggcca caaagctaca gtgagcactg ggagtgtcca ctttactcca 1080aagctgggca gtgttcaatt caccactgat acaaacaatg attttgaaac tggccaaaac 1140acgaaattca ccccagtcgg tgtcgtccag gatggcaata gtacccacca aaatgaaccc 1200caacaatggg tgctcccaaa ttactcaggc agaactggcc acaatgtaca cctagcccct 1260gccgtagccc ccacttttcc gggtgagcaa cttcttttct tcaggtccac tatgcccggt 1320tgcagcgggt atcccaacat gaatttggat tgcctactcc cccaggaatg ggtgcagcac 1380ttctaecaag aggcagctcc agcacaatct gatgtggctc tgctgagatt tgtgaatcca 1440gacacaggta gggtcctgtt tgagtgcaaa cttcataaat caggctatgt cacagtggct 1500cacactggcc agcatgattt ggttatcccc cccaatggct attttagatt tgattcctgg 1560
gttaaccaat tctacacact tgcccccatg ggaaatggag cggggcgtag acgtgcgtta1620taa 1623<210>2<211>540<212>DNA<213>Norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Beijing/2002/China，capsid protein，complete cds.
<400>2Met Lys Met Ala Ser Asn Asp Ala Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Ala1 5 10 15Asn Leu Val Pro Glu Val Asn Asn Glu Val Met Ala Leu Glu Pro Val20 25 30Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Val Ala Gly Gln Gln Asn Val Ile35 40 45Asp Pro Trp Ile Arg Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly Glu Phe50 55 60Thr Val Ser Pro Arg Asn Ala Pro Gly Glu Ile Leu Trp Ser Ala Pro65 70 75 80Leu Gly Pro Asp Leu Asn Pro Tyr Leu Ser His Leu Ala Arg Met Tyr85 90 95Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val Gln Val Ile Leu Ala Gly Asn100 105 110Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe115 120 125Pro Thr Glu Gly Leu Ser Pro Ser Gln Val Thr Met Phe Pro His Ile130 135 140Ile Val Asp Val Arg Gln Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp145 150 155 160Val Arg Asn Asn Phe Tyr His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Pro Thr Ile165 170 175Lys Leu Ile Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly180 185 190Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro195 200 205Asp Phe Asp Phe Ile Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Arg Thr210 215 220
Lys Pro Phe Thr Val Pro Ile Leu Thr Val Glu Glu Met Thr Asn Ser225 230 235 240Arg Phe Pro Ile Pro Leu Glu Lys Leu Phe Thr Gly Pro Ser Ser Ala245 250 255Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr Asp Gly Vai Leu260 265 270Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Pro Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly275 280 285Asp Val Thr His Ile Ala Gly Thr His Asp Tyr Thr Met Asn Leu Ala290 295 300Ser Gln Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu Ile Pro Ala Pro305 310 315 320Leu Gly Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly Val Leu Thr Gln325 330 335Thr Thr Arg Gly Asp Gly Ser Thr Arg Gly His Lys Ala Thr Val Ser340 345 350Thr Gly Ser Val His Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser Val Gln Phe Thr355 360 365Thr Asp Thr Asn Asn Asp Phe Glu Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe Thr370 375 380Pro Val Gly Val Val Gln Asp Gly Asn Ser Thr His Gln Asn Glu Pro385 390 395 400Gln Gln Trp Val Leu Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Thr Gly His Asn Val405 410 415His Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu420 425 430Phe Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asn435 440 445Leu Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln His Phe Tyr Gln Glu450 455 460Ala Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val Ala Leu Leu Arg Phe Val Asn Pro465 470 475 480Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu Cys Lys Leu His Lys Ser Gly Tyr485 490 495Val Thr Val Ala His Thr Gly Gln His Asp Leu Val Ile Pro Pro Asn500 505 510Gly Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr Thr Leu Ala515 520 525Pro Met Gly Asn Gly Ala Gly Arg Arg Arg Ala Leu530 535 540
權(quán)利要求
1.重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白，其特征為它是一種諾瓦克樣病毒衣殼蛋白第二個開放閱讀框基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的衣殼蛋白，所述第二個開放閱讀框基因共1623個堿基，編碼540個氨基酸殘基，重組蛋白分子量為58kDa，該衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中自我組裝成的病毒樣顆粒在抗原性和形態(tài)方面與天然病毒相似。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白，其中用于產(chǎn)生所述第二個開放閱讀框基因重組桿狀病毒表達(dá)衣殼蛋白的共1623個堿基的第二個開放閱讀框基因，其核酸具有序列表中SEQ ID NO1所述的堿基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白，其中所述第二個開放閱讀框基因編碼的540個氨基酸殘基，具有序列表中SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白的制備方法，其過程包括(1)設(shè)計擴(kuò)增諾瓦克樣病毒第二個開放閱讀框基因的特異性引物；(2)提取病毒RNA；(3)將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；(4)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得第二個開放閱讀框基因片段(5)對第二個開放閱讀框基因進(jìn)行克隆、測序鑒定；(6)將第二個開放閱讀框基因定向亞克隆至pBlueBacHis2桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體；(7)純化質(zhì)粒pBacHis2-第二個開放閱讀框；(8)將純化好的質(zhì)粒pBacHis2-第二個開放閱讀框與線性化野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞sf9中，通過噬斑法篩選和純化重組病毒；(9)在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)病毒樣顆粒；(10)純化重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白形成的病毒樣顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白在制備檢驗抗體中的用途，用于建立酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，檢測海洋生物或感染諾瓦克樣病毒患者糞便標(biāo)本中的諾瓦克樣病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白在制備檢驗抗原中的用途，用于建立酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，進(jìn)行諾瓦克樣病毒抗體水平的血清學(xué)調(diào)查。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒衣殼蛋白在制備疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克樣病毒(NLVs)衣殼蛋白(rBJV)，其是一種諾瓦克樣病毒衣殼蛋白第二個開放閱讀框基因重組桿狀病毒表達(dá)蛋白，該第二個開放閱讀框基因共1623個堿基，編碼540個氨基酸殘基。其制備方法包括設(shè)計擴(kuò)增引物；提取病毒RNA；反轉(zhuǎn)錄；擴(kuò)增；克隆、測序鑒定；定向亞克隆；純化質(zhì)粒；共轉(zhuǎn)染、篩選和純化重組病毒；表達(dá)衣殼蛋白；純化重組病毒樣顆粒。該衣殼蛋白可直接作為抗原用于建立酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗方法，進(jìn)行諾瓦克樣病毒抗體水平的血清學(xué)調(diào)查，也能用來制備抗體建立酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗方法檢測諾瓦克樣病毒，更可以進(jìn)一步用其研制開發(fā)預(yù)防諾瓦克樣病毒感染的基因工程口服疫苗。
文檔編號C12N15/09GK1778812SQ200410091368
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月24日
發(fā)明者樊景鳳, 靳淼, 王君偉 申請人:國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心, 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)