專利名稱：哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，更具體地說是利用貼壁依賴性生長細胞在攪拌培養(yǎng)體系中具有聚集、形成細胞團的傾向，不借助細胞固定化介質而實施哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)的工藝方法，屬于細胞工程技術領域。
背景技術：
動物細胞的固定化培養(yǎng)(animal cell immobilization culture)是指在無菌條件下將動物細胞接種于特定的支持物表面或限制在特定的液相空間，模擬機體內生理狀態(tài)下的基本生存條件，使其在特定的支持物表面或限制在特定的液相空間中生長、增殖的體外培養(yǎng)技術。相對于動物細胞懸浮培養(yǎng)而言，動物細胞固定化培養(yǎng)的技術特征主要表現為1.易于灌注技術的實施和優(yōu)化控制細胞培養(yǎng)環(huán)境；2.減少或消除高灌注速率下的細胞流失；3.培養(yǎng)體系中的細胞生長密度高；4.單位反應器體積細胞表達產物的產率高。因而，動物細胞固定化培養(yǎng)能有效地實施動物細胞的高密度長期連續(xù)灌注培養(yǎng)，提高動物細胞表達產品的生產效率。
根據所采用細胞固定化介質材料和固定化方式的不同，動物細胞固定化培養(yǎng)的方法主要包括微載體培養(yǎng)(microcarrier culture)、巨載體培養(yǎng)(macrocarrier culture)、中空纖維培養(yǎng)(hollow fiber culture)和微囊化培養(yǎng)(microencapsulation)。上述動物細胞固定化培養(yǎng)方法中，巨載體培養(yǎng)需在流化床生物反應器或填充床生物反應器中進行，細胞培養(yǎng)規(guī)模不易放大，載體內部可能存在明顯的傳質限制；中空纖維培養(yǎng)易在反應器內形成培養(yǎng)基成分和代謝產物的濃度梯度，培養(yǎng)規(guī)模放大困難；微囊化培養(yǎng)的微囊制備過程繁復、規(guī)模放大困難。除此之外，以上三種動物細胞固定化培養(yǎng)均存在細胞采樣、觀察不便的弊端。
相對于其他形式的動物細胞固定化培養(yǎng)而言，微載體和多孔微載體培養(yǎng)融合細胞懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，便于細胞采樣、觀察，培養(yǎng)規(guī)模放大容易，是動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)中的一項重要的、技術相對成熟的固定化培養(yǎng)技術。由于動物細胞固定化介質增加了細胞培養(yǎng)的成本。因此，無需借助固定化介質而直接利用生物反應器中形成的細胞團實現細胞固定化的無載體固定化培養(yǎng)(carrier-free immobilization culture)被看作降低動物細胞表達產品生產成本的一種技術途徑。
貼壁依賴性生長細胞在攪拌培養(yǎng)體系中懸浮培養(yǎng)具有聚集、形成細胞團的傾向。利用貼壁依賴性生長細胞在攪拌培養(yǎng)體系中懸浮培養(yǎng)具有聚集、形成細胞團的傾向，通過控制細胞團的粒徑分布，可以起到類似于微載體和多孔微載體固定化培養(yǎng)的目的，實施動物細胞的無載體固定化培養(yǎng)，并結合動物細胞培養(yǎng)過程的動態(tài)監(jiān)測和優(yōu)化控制，實現動物細胞的高密度長期培養(yǎng)及其表達產品的高效生產。與動物細胞的多孔微載體固定化培養(yǎng)相比，無載體固定化不僅節(jié)省了購買多孔微載體的動物細胞培養(yǎng)成本，還可通過對培養(yǎng)過程中細胞團的形成和解聚的控制使細胞培養(yǎng)規(guī)模的放大更易實施。此外，動物細胞無載體固定也易于監(jiān)測培養(yǎng)過程中的細胞生長。
由于細胞團中的細胞密度近似于組織中的細胞密度，存在于細胞團內的物質擴散限制可能影響細胞活力。因而，實施無載體固定化培養(yǎng)的基本前提是通過控制細胞團的粒徑分布，提高懸浮細胞團中的細胞活力。雖然，Tolbert等在1980年曾提出了利用貼壁依賴性生長細胞在攪拌培養(yǎng)體系中具有聚集、形成細胞團的傾向，將動物細胞以細胞團的形式懸浮培養(yǎng)的設想。但迄今為止，細胞團懸浮培養(yǎng)均未能解決細胞團粒徑分布、細胞團的解聚和游離細胞再聚集成團的有效控制的問題。細胞團懸浮培養(yǎng)基本上停滯在用攪拌式細胞瓶進行分批式或半連續(xù)式操作的實驗研究階段。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種利用貼壁依賴性生長細胞在攪拌培養(yǎng)體系中具有聚集、形成細胞團的傾向，通過控制細胞團的形成、細胞團的粒徑分布和細胞團的解聚、游離細胞的再集聚成團，起到類似于多孔微載體固定化培養(yǎng)的目的，實施哺乳動物細胞的無載體固定化培養(yǎng)的方法。
HEK293、CHO、BHK和Vero等貼壁依賴性生長的哺乳動物細胞在攪拌培養(yǎng)體系中懸浮培養(yǎng)具有聚集、形成細胞團的傾向。HEK293、CHO、BHK和Vero等哺乳動物細胞在懸浮培養(yǎng)體系中形成細胞團的粒徑分布影響著細胞培養(yǎng)的具體操作工藝和細胞的生長代謝。細胞團粒徑過小不利于細胞截流和灌注培養(yǎng)的實施；細胞團粒經徑過大可能造成細胞團內傳質效率受限，影響細胞的生長代謝。對懸浮培養(yǎng)過程中細胞團的形成、粒徑分布和解聚的有效控制，是本發(fā)明的技術核心，也是利用動物細胞在懸浮培養(yǎng)中相互聚集、形成細胞團的生長特征，實施哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)技術的基本前提。
本發(fā)明依次包括以下步驟以攪拌式細胞培養(yǎng)瓶和裝備有內置式旋轉濾器的攪拌罐式生物反應器為實施哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)的懸浮培養(yǎng)體系；用0.25％(v/v)胰蛋白酶消化于T形組織培養(yǎng)瓶或轉瓶中培養(yǎng)的HEK293、CHO、BHK和Vero等哺乳動物細胞；用Ca2+濃度為500～2000μM、小牛血清濃度為1～5％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基(DMEM∶F12(1∶1，v/v))懸浮HEK293、CHO、BHK和Vero細胞，調整細胞濃度為2～6×105cells/ml；將細胞懸液移入攪拌式細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)的第1～3天，攪拌速度設置為25～50r/min，使細胞相互聚集、形成近似于球形的細胞團；自培養(yǎng)的第3～4天起，設置攪拌速度為50～100r/min，細胞團的形狀在逐漸加大的流體動力作用下形成較規(guī)則的球體，細胞團的平均粒徑控制在小于300μm的范圍內。
自培養(yǎng)的第2～3天起，每天取出將攪拌式細胞培養(yǎng)瓶、于潔凈工作臺內靜置1～3分鐘，使細胞團沉降于瓶底，按50-95％培養(yǎng)體積更換新鮮培養(yǎng)基；自培養(yǎng)的第2～3天起，每天取樣測量細胞團的粒徑、計數細胞密度。當細胞團的平均粒徑大于300μm和/或細胞密度達到4～7×106cells/ml時，按80-95％培養(yǎng)體積更換含500～750IU/ml肝素、1％(v/v)小牛血清的無Ca2+DMEM培養(yǎng)基，在攪拌速度設置為50～100r/min的條件下培養(yǎng)12～36小時，使細胞團解聚。
取5～10％(v/v)的細胞懸液接種新的攪拌式細胞培養(yǎng)瓶，按10～20倍細胞懸液體積加入Ca2+濃度為500～2000μM、小牛血清濃度為1～5％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基，按步驟4-6重復實施攪拌式細胞培養(yǎng)瓶中的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)；或將細胞懸液轉入攪拌罐式生物反應器中，按10～20倍細胞懸液體積加入Ca2+濃度為500～2000μM、小牛血清濃度為1～5％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度設置為37℃、溶解氧濃度控制在30～50％、pH控制在7.1～7.2。攪拌速度先設置為25～50r/min，使來自細胞團解聚的游離細胞重新形成球形的細胞團，隨后在50～120r/min的范圍內逐步提高攪拌速度，使細胞團的平均粒徑控制在小于300μm范圍內。
自細胞懸液轉入攪拌罐式生物反應器中培養(yǎng)的第2～3天起，每天取樣測定細胞團的粒徑和培養(yǎng)基的葡萄糖濃度、計數細胞密度，利用生物反應器中微孔徑為75μm的內置式旋轉過濾器截流細胞團，啟動生物反應器的培養(yǎng)基灌注系統，根據活細胞密度和葡萄糖濃度將灌注速率調整為0.15～1.5volume/day，實施攪拌罐式生物反應器中的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)。
本發(fā)明與現有技術相比具有以下優(yōu)點①哺乳動物細胞在懸浮培養(yǎng)體系中所形成細胞團的形狀規(guī)則、大小較均一，細胞團的平均粒徑控制在小于300μm的范圍內。②細胞團解聚、游離細胞再集聚成團的條件溫和、可控。③按照本發(fā)明的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)的工藝，哺乳動物細胞培養(yǎng)的活細胞密度≥1×107ells/ml、細胞活力≥90％。④可節(jié)省購買多孔微載體的動物細胞培養(yǎng)成本。⑤便于監(jiān)測培養(yǎng)過程中的細胞生長，細胞培養(yǎng)規(guī)模放大容易。
下面將結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為在250ml攪拌式細胞培養(yǎng)瓶中實施HEK293細胞無載體固定化培養(yǎng)的活細胞密度和細胞團平均粒徑變化。活細胞密度(▲)；細胞團平均粒徑(○)。圖中各點代表至少3次培養(yǎng)結果的平均值和標準差。
圖2A和圖2B分別為倒置顯微鏡下觀察到的HEK293細胞團(圖2A)和掃描電鏡下觀察到的HEK293細胞團(圖2B)。
圖3A-3C分別反映在細胞團解聚條件下12h、24h和36h的293細胞團解聚；圖3D為在細胞團形成條件下，自HEK293細胞團解聚的游離細胞再集聚形成細胞團。
圖4為5L攪拌罐式生物反應器中無載體固定化培養(yǎng)HEK293細胞的細胞生長和細胞團粒徑分布。
圖5A-5C分別為倒置顯微鏡下觀察到的rCHO細胞團(圖5A)、BHK細胞團(圖5B)和Vero細胞團(圖5C)。
具體實施例方式
實施例1、HEK293細胞的無載體固定化培養(yǎng)(1)HEK293細胞無載體固定化培養(yǎng)的種子細胞準備將連續(xù)傳代培養(yǎng)的HEK293細胞(購自美國Invitrogen公司)接種于100ml的組織培養(yǎng)瓶中，加入10ml含5％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)。根據培養(yǎng)基的顏色變化更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞形成致密細胞層后，用0.25％(w/v)的胰蛋白酶進行消化，作為實施HEK293細胞無載體固定化培養(yǎng)的種子細胞。
(2)HEK293細胞在攪拌式細胞培養(yǎng)瓶中的細胞團形成和細胞團粒徑分布控制用Ca2+濃度為1000μM、小牛血清濃度為1％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮HEK293細胞，調整細胞懸液濃度為2～4×105cells/ml，按100～500ml/瓶接種工作體積為100～500ml的攪拌式細胞培養(yǎng)瓶，37℃、5％CO2培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)。
在培養(yǎng)的第1～3天攪拌速度設置為25～50r/min，使細胞相互聚集、形成近似于球形的細胞團。自培養(yǎng)的第2～3天起，每天將攪拌式細胞培養(yǎng)瓶于潔凈工作臺內靜置1～2分鐘，使細胞團沉降于瓶底，按50-95％培養(yǎng)體積更換新鮮培養(yǎng)基。
在對培養(yǎng)物作培養(yǎng)基更換處理的同時，用大口吸管吸取均勻懸浮的HEK293細胞團懸液2～3ml。取其中的1ml用0.25％(w/v)胰蛋白酶消化液分散細胞團，用細胞密度和活力自動分析系統(Cedex A20，Innovatis)計數活細胞密度。用剪除尖端的移液器吸頭吸取50-100μl樣品加入96孔細胞培養(yǎng)板中，在Nikon Eclipse TE300倒置顯微鏡的4×平場物鏡下觀察細胞團并用彩色數碼攝像頭(Pro-150ES，Pixera)攝取圖像，用Simple PCI圖像分析軟件(SimplePCI 5.1，Compix，Inc)中的圖像處理和分析模塊處理圖像，測量HEK293細胞團的粒徑、分析HEK293細胞團的粒徑分布。
自培養(yǎng)的第4天起，設置攪拌速度為50～100r/min.。養(yǎng)8天后，HEK293的活細胞密度由接種時的3.1×105cells/ml增加到的5.1×106cells/ml(圖1)。HEK293細胞團的形狀在逐漸加大的流體動力作用下形成如圖2所示的球狀細胞團。HEK293細胞團的平均粒徑控制在小于300μm的范圍內。
(3)HEK293細胞團的解聚當活細胞密度達到5×106cells/ml和/或細胞團的平均粒徑大于300μm時，按90％培養(yǎng)體積更換含500IU/ml肝素、1％(v/v)小牛血清的無Ca2+DMEM培養(yǎng)基，設置攪拌速度為60r/min，37℃、5％CO2培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)12～36小時，使細胞團松散、解聚(圖3A-3C)。
(4)HEK293細胞在攪拌罐式生物反應器中的無載體固定化培養(yǎng)培養(yǎng)于500ml攪拌式細胞培養(yǎng)瓶的HEK293細胞經細胞團解聚處理后，接種于工作體積為5L、裝備有內置式旋轉濾器的攪拌罐式生物反應器內，按10倍細胞懸液體積補充Ca2+濃度為1000μM、小牛血清濃度為1％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基至生物反應器設定的工作體積，培養(yǎng)溫度設置為37℃、溶解氧濃度控制在30～50％、pH控制在7.1～7.2。在5L拌罐式生物反應器中培養(yǎng)的第1～3天攪拌速度設置為35～50r/min，使來自細胞團解聚的游離細胞相互聚集、重新形成近似于球形的細胞團；從在5L拌罐式生物反應器中培養(yǎng)的第4天起，根據HEK293細胞團的平均粒徑變化，在50～120r/min的范圍內逐步提高攪拌速度，使細胞團的平均粒徑控制在小于300μm范圍內。
自細胞懸液轉入攪拌罐式生物反應器中培養(yǎng)的第2～3天起，每天取樣按上述方法測量細胞團的粒徑、計數活細胞密度；用YSI 7100型多參數生物分析系統(YSI 7100，YellowSprings Instruments)檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖、乳酸濃度。啟動生物反應器的培養(yǎng)基灌注系統，利用生物反應器中微孔徑為75μm的內置式旋轉濾器截流細胞團，根據活細胞密度和葡萄糖濃度將灌注速率調整為0.15～1.5volume/day，實施攪拌罐式生物反應器中的HEK293細胞無載體固定化培養(yǎng)。
在5L拌罐式生物反應器中培養(yǎng)的第17天，HEK293的活細胞密度由接種時的4.2×105cells/ml增加到的13.7×106cells/ml，HEK293細胞團的平均粒徑控制在小于300μm的范圍內，HEK293細胞的活力在整個培養(yǎng)過程中保持在大于90％的水平(圖4)。
實施例2、CHO細胞的無載體固定化培養(yǎng)將表達含KGDW插入序列的尿激酶原(KGDW-pro-UK)的CHO工程細胞系G6-1(由軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所采用基因重組技術構建，簡稱CHO細胞)接種于1000ml的轉瓶中，加入100ml含1％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基，置轉速為2r/min的轉瓶培養(yǎng)裝置上、37℃培養(yǎng)。根據培養(yǎng)基的顏色變化更換新鮮培養(yǎng)基，使細胞形成致密細胞層。
培養(yǎng)于1000ml轉瓶中的CHO細胞經0.25％(w/v)的胰蛋白酶進行消化處理后，用Ca2+濃度為1500μM、小牛血清濃度為1％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮CHO細胞，將細胞懸液注入工作體積為2L的攪拌罐式生物反應器中，細胞接種濃度為3.4×105cells/ml。培養(yǎng)溫度設置為37℃、溶解氧濃度控制在30～40％、pH控制在7.0～7.1。
在培養(yǎng)的第1～3天攪拌速度設置為35～50r/min，使CHO細胞相互聚集、形成近似于球形的細胞團。按前述方法計數活細胞密度、測量CHO細胞團的平均粒徑；從培養(yǎng)的第4天起，根據CHO細胞團平均粒徑的變化，在50～100r/min的范圍內逐步提高攪拌速度，使細胞團的平均粒徑控制在小于300μm范圍內。
自細胞懸液轉入攪拌罐式生物反應器中培養(yǎng)的第2～3天起，每天取樣按上述方法檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖和乳酸濃度，采用溶圈法測定培養(yǎng)基中CHO細胞表達產物KGDW-pro-UK的濃度。同時，啟動生物反應器的培養(yǎng)基灌注系統，利用生物反應器中微孔徑為75μm的內置式旋轉濾器截流細胞團，根據活細胞密度和葡萄糖濃度將灌注速率調整為0.25～1.0volume/day，實施攪拌罐式生物反應器中的CHO細胞無載體固定化培養(yǎng)。
培養(yǎng)12天后，CHO細胞的活細胞密度達到5.9×106cells/ml，KGDW-pro-UK的濃度達到2984IU/ml。掃描電鏡觀察，CHO細胞在攪拌罐式生物反應器中形成粒徑分布相對均勻、形狀較規(guī)則的細胞團(圖5A)。
實施例3、BHK細胞的無載體固定化培養(yǎng)將連續(xù)傳代培養(yǎng)的BHK細胞(來自美國模式培養(yǎng)物保藏所)接種于1000ml的轉瓶中，加入100ml含5％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基，置轉速為2r/min的轉瓶培養(yǎng)裝置上、37℃培養(yǎng)。根據培養(yǎng)基的顏色變化更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞形成致密細胞層后，用0.25％(w/v)的胰蛋白酶進行消化、作為實施BHK細胞無載體固定化培養(yǎng)的種子細胞。
用Ca2+濃度為2000μM、小牛血清濃度為5％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮BHK細胞，調整細胞懸液濃度為5.2×105cells/ml，按250ml/瓶接種工作體積為250ml的攪拌式細胞培養(yǎng)瓶，37℃、5％CO2培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)。
在培養(yǎng)的第1～2天攪拌速度設置為25～50r/min，使細胞相互聚集、形成近似于球形的細胞團。自培養(yǎng)的第2～3天起，每天將攪拌式細胞培養(yǎng)瓶于潔凈工作臺內靜置1～2分鐘，使細胞團沉降于瓶底，按50-95％培養(yǎng)體積更換新鮮培養(yǎng)基。自培養(yǎng)的第3天起，設置攪拌速度為50～100r/min.。
培養(yǎng)7天后，BHK細胞的活細胞達到的6.4×106cells/ml。BHK細胞團的形狀在逐漸加大的流體動力作用下形成如圖5B所示的球狀細胞團。BHK細胞團的平均粒徑控制在小于300μm的范圍內。按90％培養(yǎng)體積更換含750IU/ml肝素、1％(v/v)小牛血清的無Ca2+DMEM培養(yǎng)基，設置攪拌速度為75r/min，37℃、5％CO2培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)24h，使BHK細胞團松散、解聚。
取5％(v/v)的BHK細胞懸液接種新的攪拌式細胞培養(yǎng)瓶，按20倍細胞懸液體積加入Ca2+濃度為2000μM、小牛血清濃度為5％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基，按上述方法實施無載體固定化培養(yǎng)方式下的BHK細胞傳代培養(yǎng)。
實施例4、Vero細胞的無載體固定化培養(yǎng)將連續(xù)傳代培養(yǎng)的Vero細胞(來自美國模式培養(yǎng)物保藏所)接種于100ml的組織培養(yǎng)瓶中，加入10ml含2％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)。根據培養(yǎng)基的顏色變化更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞形成致密細胞層后，用0.25％(w/v)的胰蛋白酶進行消化、作為實施Vero細胞無載體固定化培養(yǎng)的種子細胞。
用Ca2+濃度為500μM、小牛血清濃度為2％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮Vero細胞，調整細胞懸液濃度為2.5×105cells/ml，按100ml/瓶接種工作體積為100ml的攪拌式細胞培養(yǎng)瓶，37℃、5％CO2培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)。
在培養(yǎng)的第1～3天攪拌速度設置為30～50r/min，使細胞相互聚集、形成近似于球形的細胞團。自培養(yǎng)的第4天起，每天將攪拌式細胞培養(yǎng)瓶于潔凈工作臺內靜置1～3分鐘，使細胞團沉降于瓶底，按50-95％培養(yǎng)體積更換新鮮培養(yǎng)基。自培養(yǎng)的第4天起，設置攪拌速度為50～100r/min.。
培養(yǎng)9天后，Vero細胞的活細胞達到的4.8×106cells/ml。Vero細胞團的形狀在逐漸加大的流體動力作用下形成如圖5B所示的球狀細胞團。Vero細胞團的平均粒徑控制在小于300μm的范圍內。按90％培養(yǎng)體積更換含500IU/ml肝素、1％(v/v)小牛血清的無Ca2+DMEM培養(yǎng)基，設置攪拌速度為85r/min，37℃、5％CO2培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)36h，使Vero細胞團松散、解聚。
取10％(v/v)的Vero細胞懸液接種新的攪拌式細胞培養(yǎng)瓶，按10倍細胞懸液體積加入Ca2+濃度為500μM、小牛血清濃度為2％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基，按上述方法實施無載體固定化培養(yǎng)方式下的Vero細胞傳代培養(yǎng)。
本發(fā)明的特定實施例已經對本發(fā)明的內容做了詳盡的說明。對本領域的一般技術人員而言，在不背離本發(fā)明精神的前提下對它所做的任何顯而易見的改動，特別是對若干步驟和/或參數的等同替換，都構成對本發(fā)明專利權的侵犯，將承擔相應的法律責任。
權利要求
1.哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)促使哺乳動物細胞在懸浮培養(yǎng)條件下形成細胞團調整培養(yǎng)基中的Ca2+濃度為500～2000μM，血清濃度為1～5％(v/v)，細胞接種密度為2～6×105cells/ml，攪拌速度為25～50r/min；(2)控制細胞團的平均粒徑提高攪拌速度至50～120r/min；(3)利用細胞團的自然沉降和旋轉過濾器截流細胞團，更換培養(yǎng)基或連續(xù)灌注培養(yǎng)基；(4)使細胞團松散、解聚調整培養(yǎng)基中的Ca2+濃度為0μM，血清濃度為1％(v/v)，攪拌速度為50～100r/min、在培養(yǎng)基中加入濃度為500～750IU/ml的肝素；(5)使自細胞團解聚的游離細胞再形成細胞團，放大培養(yǎng)規(guī)模調整培養(yǎng)基中的Ca2+濃度為500～2000μM、血清濃度為1～5％(v/v)、細胞接種密度2～6×105cells/m1，攪拌速度為25～50r/min。
2.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，其特征在于所述哺乳動物細胞為貼壁依賴性生長的哺乳動物細胞。
3.根據權利要求2所述的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，其特征在于所述哺乳動物細胞為HEK293、CHO、BHK和Vero細胞。
4.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，其特征在于所述控制細胞團的平均粒徑為控制細胞團的平均粒徑分布在300μm的范圍內。
5.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，其特征在于所述截流細胞團的旋轉濾器是微孔徑為75μm的內置式旋轉濾器。
6.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，其特征在于所述連續(xù)灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)基灌注速率為0.15～1.5volume/day。
7.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，其特征在于放大培養(yǎng)規(guī)模指將步驟(5)得到的細胞團解聚后接種到裝備有內置式旋轉濾器的攪拌罐式生物反應器中培養(yǎng)。
8.根據權利要求1至7中任何一項所述的哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，其特征在于所述哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)在攪拌式細胞培養(yǎng)瓶或裝備有內置式旋轉濾器的攪拌罐式生物反應器中實施。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種哺乳動物細胞無載體固定化培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)促使哺乳動物細胞在懸浮培養(yǎng)條件下形成細胞團(2)控制細胞團的平均粒徑(3)利用細胞團的自然沉降和旋轉過濾器截流細胞團，更換培養(yǎng)基或連續(xù)灌注培養(yǎng)基(4)使細胞團松散、解聚(5)使自細胞團解聚的游離細胞再形成細胞團，放大培養(yǎng)規(guī)模。本發(fā)明的優(yōu)點在于①懸浮培養(yǎng)體系中所形成細胞團的形狀規(guī)則、大小較均一，細胞團的平均粒徑控制在小于300μm的范圍內②細胞團解聚、游離細胞再集聚成團的條件溫和、可控③哺乳動物細胞培養(yǎng)的活細胞密度≥1×10
文檔編號C12N5/071GK1778901SQ20041009177
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月26日 優(yōu)先權日2004年11月26日
發(fā)明者陳昭烈, 劉興茂, 劉紅, 吳本傳, 葉玲玲, 倪小平, 王啟偉, 于蕊 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所