專利名稱：結(jié)合白細胞介素2受體α基因負調(diào)控元件三聯(lián)體序列的人類蛋白cDNA克隆pTCF4L的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為一個結(jié)合白細胞介素2受體α(IL-2Rα)基因負調(diào)控元件(NRE)三聯(lián)體序列的人類蛋白cDNA克隆pTCF4L，涉及生物醫(yī)學高技術領域中，人IL-2Rα基因的表達調(diào)控領域。
背景技術：
白細胞介素2(IL-2)和白細胞介素2受體(IL-2R)的相互作用在調(diào)節(jié)T細胞免疫反應的強度和持續(xù)時間方面起著中心作用。IL-2R由α、β、γ鏈所組成低親和力受體僅含有α鏈；中等親和力受體含有β和γ鏈；高親和力受體含有α，β和γ鏈。IL-2Rβ和IL-2Rγ組成性地表達于靜止的人外周血T淋巴細胞和人急性T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat細胞表面，高親和力IL-2R的出現(xiàn)和T細胞增殖是受α鏈基因的誘導表達調(diào)控，因此α鏈基因的誘導表達是T細胞獲得對生理濃度IL-2完全反應能力所必需的。基因轉(zhuǎn)錄水平的表達調(diào)控是通過多種轉(zhuǎn)錄因子與基因的調(diào)控區(qū)的順式作用元件及啟動子的相互作用來完成的。IL-2Rα基因5’上游存在至少四個正調(diào)控區(qū)PRRI(-276/-244bp)，PRRII(-137/-64bp)，PRRIII/intronic IL-2 responseelement(-3780/-3703bp)，PRRIV/CD28rE(-8689/-8483bp)及一個負調(diào)控-368/-400bp。其中，該負調(diào)控區(qū)核心系列NRE(-391/-381bp)(5’-TTCATCCCAGG-3’)與HIV-1基因5’LTR的NRE核心序列(5’-TTCATCACATG-3’)有82％同源。本研究組還發(fā)現(xiàn)IL-2Rα基因-153/-143bp(5’-CCTGGTTTGAA-3’)亦與NRE有82％同源，是NRE的不完全反向重復序列(NIRS)。本發(fā)明主要集中從人類細胞中篩選IL-2Rα基因NRE結(jié)合蛋白cDNA。
發(fā)明目的為探討IL-2Rα基因NRE結(jié)合蛋白在該基因調(diào)控中作用機制。
內(nèi)容與要求應用基因組信息學原理、分子克隆、酵母單雜交等技術，從HTLV-I轉(zhuǎn)化的人T細胞MATCHMAKER cDNA文庫中獲得了一個結(jié)合IL-2Rα基因NRE三聯(lián)體的質(zhì)粒pTCF4L；借助核酸內(nèi)切酶解、細胞培養(yǎng)、逆轉(zhuǎn)錄PCR技術、核酸雜交分析，表明人Jurkat細胞中含有能與pTCF4L中cDNA雜交的mRNA；通過電泳遷移率分析(EMSA)，證實轉(zhuǎn)染了該質(zhì)粒的酵母裂解物能與IL-2Rα基因NRE核心序列三聯(lián)體特異結(jié)合；經(jīng)DNA序列測定和與網(wǎng)絡生物資源BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒包含的cDNA具有完整的開放閱讀框架，其cDNA編碼區(qū)2395bp，可編碼671個氨基酸殘基；推導序列顯示該編碼蛋白屬于E蛋白家族，其中第567-645位氨基酸含有典型的DNA結(jié)合結(jié)構域bHLH；并發(fā)現(xiàn)第546-549位氨基酸RSRS為該編碼蛋白所特有，可能與SR蛋白家族相關。
該質(zhì)粒達到的技術指標為1.應用酵母單雜交體系從從HTLV-I轉(zhuǎn)化的人T細胞MATCHMAKER cDNA文庫中獲得了能表達與人IL-2Rα基因NRE三聯(lián)體序列結(jié)合的蛋白cDNA克隆pTCF4L(見圖1)。
2.人Jurkat細胞中存在能與pTCF4L中cDNA雜交的mRNA(見圖2)。
3.轉(zhuǎn)染了pTCF4L的酵母裂解物能與IL-2Rα基因NRE核心序列三聯(lián)體特異結(jié)合(見圖3)。
4.pTCF4L包含的cDNA具有完整的開放閱讀框架，其cDNA編碼區(qū)2395bp，可編碼671個氨基酸殘基；推導序列顯示該編碼蛋白屬于E蛋白家族，其中第567-645位氨基酸含有典型的DNA結(jié)合結(jié)構域bHLH；并發(fā)現(xiàn)第546-549位氨基酸RSRS為該編碼蛋白所特有，可能與SR蛋白家族相關。


圖1.pTCF4L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母YM4271菌株后β-半乳糖苷酶活性分析。
圖示蘭斑為pTCF4L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化YM4271菌株后，在含有30mM 3-AT的SD/-His/-Ura/-Leu平板上生長，并顯示β-半乳糖苷酶活性。
圖2.pTCF4L質(zhì)粒的酶切及核酸雜交結(jié)果。
A.圖示pTCF4L質(zhì)粒經(jīng)Bgl II酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。1pTCF4L；2λDNA/HindIII+pBR322/Hinf I DNA marker。箭頭表示插入片段。
B.圖示α-32p-dCTP標記的人Jurkat細胞cDNA探針與pTCF4L質(zhì)粒的核酸雜交結(jié)果。箭頭表示與圖A相應的特異雜交帶。
圖3.EMSA檢測轉(zhuǎn)染了pTCF4L的酵母裂解物與NRE核心序列三聯(lián)體的結(jié)合。
pTCF4L陽性克隆酵母裂解物能與α-32p-dCTP標記的NRE核心序列三聯(lián)體特異結(jié)合，該結(jié)合能被100摩爾倍數(shù)的未標記NRE核心序列三聯(lián)體明顯抑制。箭頭表示特異雜交帶。
1未加酵母裂解物；2pTCF4L酵母裂解物；3pTCF4L酵母裂解物，50摩爾倍數(shù)的未標記NRE核心序列三聯(lián)體；4pTCF4L酵母裂解物，100摩爾倍數(shù)的未標記NRE核心序列三聯(lián)體；5對照酵母裂解物。
實施例1.結(jié)合IL-2Rα基因NRE三聯(lián)體的cDNA質(zhì)粒的篩選根據(jù)CLONTECH公司酵母單雜交說明書的操作要求，構建包含NRE核心序列(下劃線標出)串連三聯(lián)體的誘餌序列5’-AATTCTGCTCCTTCATCCCAGGTGGTC CCTGCTCCTTCATCCCAGGGGTCCCTGCTCCTTCATCCCAGGTGTCC-3’。將以上DNA片段應用基因重組技術分別插入pHis，pHis-1，和pLacZ報告質(zhì)粒的啟動子上游，將構成的目的質(zhì)粒線性化后依次整合入YM4271酵母菌株染色體，在分析背景表達后，構建雙報告酵母菌株YM-NRE/His/LacZ。將HTLV-I轉(zhuǎn)化的人T細胞MATCHMAKER cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化YM-NRE/His/LacZ菌株，并通過含有30mM 3-AT的SD/-His/-Ura/-Leu平板篩選和檢測β-半乳糖苷酶(β-gal)活性。將酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌進行質(zhì)粒挽救；將挽救的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化酵母YM4271，以排除假陽性。用Bgl II酶切陽性克隆后，進行瓊脂糖凝膠電泳分離，檢測是否含有一定長度cDNA插入片段。由此，篩得質(zhì)粒pTCF4L。
2.細胞培養(yǎng)人Jurkat細胞在5％CO2，37℃的條件下，RPMI 1640(GIBCO-BRL)培養(yǎng)基中懸浮生長。該培養(yǎng)基含有10％胎牛血清，0.03％L-glutamine，0.2％NaHCO3，0.59％HEPES，氨芐青霉素和鏈霉素(各100U/ml)，pH 7.2。
3.pTCF4L質(zhì)粒的酶切及核酸雜交應用Trizol試劑(Invitrogen)制備人Jurkat細胞總RNA，然后，按以下步驟通過逆轉(zhuǎn)錄反應標記人Jurkat細胞總cDNA作為核酸雜交探針將10μg細胞總RNA加入29μl的逆轉(zhuǎn)錄體系，其中含有8μl 5x RT緩沖液(250mM Tris-HCl，pH 8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，1μl含20mM dATP，dGTP，dTTP混合液，2μl 50pM Oligo(dT)18，2μl 100mM dithiothreitol(DTT)，20units RNasin.65℃變性5min后驟冷，再加入100μCiα-32p-dCTP(3000Ci/mmole，福瑞科技，北京)，100units M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)，37℃保溫2h，100℃加熱3min后迅速插入冰浴。Bgl II酶切pTCF4L質(zhì)粒后，1％瓊脂糖凝膠電泳分離，根據(jù)Sambrool’s步驟進行Southernblotting轉(zhuǎn)膜和cDNA探針雜交，放射自顯影顯示雜交信號。
4.EMSA檢測pTCF4L酵母裂解物與NRE核心序列三聯(lián)體的結(jié)合酵母過夜培養(yǎng)，離心后用500μl預冷的Buffer A(50mM KCl，25mM HEPES pH 7.8，0.5％NP-40，1mM PMSF，0.1mM DTT)懸浮細胞，冰浴放置10min，4℃ 12,000x g離心5min，棄上清，沉淀用500μl Buffer B(不含NP-40，其余同Buffer A)洗1遍后，加入300μl Buffer C(500mMKCl，25mM HEPES pH 7.8，10％ glycerin，1mM phenylmethylsulfnyl fluoride(PMSF)，0.1mMDTT)懸浮沉淀，冰浴10min，4℃ 12,000x g離心10min，上清經(jīng)BCA法測定蛋白濃度后分裝，-70℃保存。
EMSA中用α-32p-dCTP(3,000Ci/mmole，福瑞科技，北京)標記的NRE三聯(lián)體探針。每個反應體系中含12μg酵母提取物，2×104cpm探針，5×103倍的鮭精DNA，適量的未經(jīng)標記的探針。加入結(jié)合緩沖液(40mM Tris-HCl，pH 7.4，100mM KCl，40mM EDTA，1mM DTT and 8％Ficoll-400)，最后加雙蒸水至24μl混勻，22℃反應30min后上樣電泳。電泳條件以1x TBE配制的5％聚丙烯酰胺膠(Acr∶Bis＝19∶1)，150V電壓預電泳至少1小時，電泳緩沖液為1x TBE，上樣后200～250V電泳3～4h。80℃真空干膠后。-70℃放射自顯影。
5.pTCF4L質(zhì)粒中插入cDNA片段的測序結(jié)果及推導編碼氨基酸序列。
兩側(cè)數(shù)字分別代表兩端核苷酸序列和推導氨基酸序列編號，方框示RS結(jié)構域，下劃線示bHLH結(jié)構域。
1 C TAG CTT GGG TGG TCA TAT GGC CAT GGA GGC CCC GGG GAT CCG AAT 4647 TCG CGG CCG CGT CGA CCA GCA GGC GCG GGA GCG GGC GCA GGA GCA 9192 GGC GGC GGC GGT GGC GGC GGC GGT TAG ACA TGA ACG CCG CCT CGG 136137 CGC CGG CGG TGC ACG GAG AGC CCC TTC TCG CGC GCG GGC GGT TTG 181182 TGT GAT TTT GCT AAA ATG CAT CAC CAA CAG CGA ATG GCT GCC TTA 2261M H H Q Q R M A A L 10227 GGG ACG GAC AAA GAG CTG AGT GAT TTA CTG GAT TTC AGT GCG ATG 27111 G T D K E L S D L L D F S A M25272 TTT TCA CCT CCT GTG AGC AGT GGG AAA AAT GGA CCA ACT TCT TTG 31626 F S P P V S S G K N G P T S L40317 GCA AGT GGA CAT TTT ACT GGC TCA AAT GTA GAA GAC AGA AGT AGC 36141 A S G H F T G S N V E D R S S55362 TCA GGG TCC TGG GGG AAT GGA GGA CAT CCA AGC CCG TCC AGG AAC 40656 S G S W G N G G H P S P S R N70407 TAT GGA GAT GGG ACT CCC TAT GAC CAC ATG ACC AGC AGG GAC CTT 45171 Y G D G T P Y D H M T S R D L 85
452 GGG TCA CAT GAC AAT CTC TCT CCA CCT TTT GTC AAT TCC AGA ATA49686G S H D N L S P P F V N S R I 100497 CAA AGT AAA ACA GAA AGG GGC TCA TAC TCA TCT TAT GGG AGA GAA541101 Q S K T E R G S Y S S Y G R E 115542 TCA AAC TTA CAG GGT TGC CAC CAG CAG AGT CTC CTT GGA GGT GAC586116 S N L Q G C H Q Q S L L G G D 130587 ATG GAT ATG GGC AAC CCA GGA ACC CTT TCG CCC ACC AAA CCT GGT631131 M D M G N P G T L S P T K P G 145632 TCC CAG TAC TAT CAG TAT TCT AGC AAT AAT CCC CGA AGG AGG CCT676146 S Q Y Y Q Y S S N N P R R R P 160677 CTT CAC AGT AGT GCC ATG GAG GTA CAG ACA AAG AAA GTT CGA AAA721161 L H S S A M E V Q T K K V R K 175722 GTT CCT CCA GGT TTG CCA TCT TCA GTC TAT GCT CCA TCA GCA AGC766176 V P P G L P S S V Y A P S A S 190767 ACT GCC GAC TAC AAT AGG GAC TCG CCA GGC TAT CCT TCC TCC AAA811191 T A D Y N R D S P G Y P S S K 205812 CCA GCA ACC AGC ACT TTC CCT AGC TCC TTC TTC ATG CAA GAT GGC856206 P A T S T F P S S F F M Q D G 220857 CAT CAC AGC AGT GAC CCT TGG AGC TCC TCC AGT GGG ATG AAT CAG901221 H H S S D P W S S S S G M N Q 235902 CCT GGC TAT GCA GGA ATG TTG GGC AAC TCT TCT CAT ATT CCA CAG946236 P G Y A G M L G N S S H I P Q 250947 TCC AGC AGC TAC TGT AGC CTG CAT CCA CAT GAA CGT TTG AGC TAT991251 S S S Y C S L H P H E R L S Y 265992 CCA TCA CAC TCC TCA GCA GAC ATC AAT TCC AGT CTT CCT CCG ATG1036266 P S H S S A D I N S S L P P M 2801037 TCC ACT TTC CAT CGT AGT GGT ACA AAC CAT TAC AGC ACC TCT TCC1081281 S T F H R S G T N H Y S T S S 2951082 TGT ACG CCT CCT GCC AAC GGG ACA GAC AGT ATA ATG GCA AAT AGA1126296 C T P P A N G T D S I M A N R 310
1127 GGA AGC GGG GCA GCC GGC AGC TCC CAG ACT GGA GAT GCT CTG GGG1171311 G S G A A G S S Q T G D A L G 3251172 AAA GCA CTT GCT TCG ATC TAT TCT CCA GAT CAC ACT AAC AAC AGC1216326 K A L A S I Y S P D H T N N S 3401217 TTT TCA TCA AAC CCT TCA ACT CCT GTT GGC TCT CCT CCA TCT CTC1261341 F S S N P S T P V G S P P S L 3551262 TCA GCA GGC ACA GCT GTT TGG TCT AGA AAT GGA GGA CAG GCC TCA1306356 S A G T A V W S R N G G Q A S 3701307 TCG TCT CCT AAT TAT GAA GGA CCC TTA CAC TCT TTG CAA AGC CGA1351371 S S P N Y E G P L H S L Q S R 3851352 ATT GAA GAT CGT TTA GAA AGA CTG GAT GAT GCT ATT CAT GTT CTC1396386 I E D R L E R L D D A I H V L 4001397 CGG AAC CAT GCA GTG GGC CCA TCC ACA GCT ATG CCT GGT GGT CAT1441401 R N H A V G P S T A M P G G H 4151442 GGG GAC ATG CAT GGA ATC ATT GGA CCT TCT CAT AAT GGA GCC ATG1486416 G D M H G I I G P S H N G A M 4301487 GGT GGT CTG GGC TCA GGG TAT GGA ACC GGC CTT CTT TCA GCC AAC1531431 G G L G S G Y G T G L L S A N 4451532 AGA CAT TCA CTC ATG GTG GGG ACC CAT CGT GAA GAT GGC GTG GCC1576446 R H S L M V G T H R E D G V A 4601577 CTG AGA GGC AGC CAT TCT CTT CTG CCA AAC CAG GTT CCG GTT CCA1621461 L R G S H S L L P N Q V P V P 4751622 CAG CTT CCT GTC CAG TCT GCG ACT TCC CCT GAC CTG AAC CCA CCC1666476 Q L P V Q S A T S P D L N P P 4901667 CAG GAC CCT TAC AGA GGC ATG CCA CCA GGA CTA CAG GGG CAG AGT1711491 Q D P Y R G M P P G L Q G Q S 5051712 GTC TCC TCT GGC AGC TCT GAG ATC AAA TCC GAT GAC GAG GGT GAT1756506 V S S G S S E I K S D D E G D 5201757 GAG AAC CTG CAA GAC ACG AAA TCT TCG GAG GAC AAG AAA TTA GAT1801521 E N L Q D T K S S E D K K L D 535
1802 GAC GAC AAG AAG GAT ATC AAA TCA ATT ACT AGG TCA AGA TCT AGC1846536 D D K K D I K S I T S 5501847 AAT AAT GAC GAT GAG GAC CTG ACA CCA GAG CAG AAG GCA GAG CGT1891551 N N D D E D L T P E Q K A E R 5651892 GAG AAG GAG CGG AGG ATG GCC AAC AAT GCC CGA GAG CGT CTG CGG1936566 EK E R R M A N N A R E R L R5801937 GTC CGT GAC ATC AAC GAG GCT TTC AAA GAG CTC GGC CGC ATG GTG1981581V R D I N E A F K E L G R M V5951982 CAG CTC CAC CTC AAG AGT GAC AAG CCC CAG ACC AAG CTC CTG ATC2026596Q L H L K S D K P Q T K L L I6102027 CTC CAC CAG GCG GTG GCC GTC ATC CTC AGT CTG GAG CAG CAA GTC2071611L H Q A V A V I L S L E Q Q V6252072 CGA GAA AGG AAT CTG AAT CCG AAA GCT GCG TGT CTG AAA AGA AGG2116626R E R N L N P K A A C L K R R6402117 GAG GAA GAG AAG GTG TCC TCA GAG CCT CCC CCT CTC TCC TTG GCC2161641E E E K VS S E P P P L S L A 6552162 GGC CCA CAC CCT GGA ATG GGA GAC GCA TCG AAT CAC ATG GGA CAG2206656 G P H P G M G D A S N H M G Q 6702207 ATG TAA AAG GGT CCA AGT TGC CAC ATT GCT TCA TTA AAA CAA GAG2251671 M *2252 ACC ACT TCC TTA ACA GCT GTA TTA TCT TAA ACC CAC ATA AAC ACT22962297 TCT CCT TAA CCC CCA TTT TTG TAA TAT AAG ACA AGT CTG AGT AGT23412342 TAT GAA TCG CAG ACG CAA GAG GTT TCA GCA TTC CCA ATT ATC AAA23862387 AAA AAA AAA 239權利要求
1.本發(fā)明涉及一個結(jié)合白細胞介素2受體α(IL-2Rα)基因負調(diào)控元件(NRE)三聯(lián)體序列的人類蛋白cDNA克隆pTCF4L。
2.根據(jù)權利要求1所述之pTCF4L質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒包含的cDNA具有完整的開放閱讀框架，其cDNA編碼區(qū)2395bp，可編碼671個氨基酸殘基；推導序列顯示該編碼蛋白屬于E蛋白家族，其中第567-645位氨基酸含有典型的DNA結(jié)合結(jié)構域bHLH；并發(fā)現(xiàn)第546-549位氨基酸RSRS為該編碼蛋白所特有，可能與SR蛋白家族相關。
3.根據(jù)權利要求1、2所述之pTCF4L質(zhì)粒，其特征在于Jurkat細胞中含有能與該質(zhì)粒的cDNA片段雜交的mRNA。
4.根據(jù)權利要求1、2、3、所述之pTCF4L質(zhì)粒，其特征在于轉(zhuǎn)染了該質(zhì)粒的酵母裂解液能與IL-2Rα基因NRE三聯(lián)體序列特異性結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個結(jié)合白細胞介素2受體α(IL－2Rα)基因負調(diào)控元件(NRE)三聯(lián)體序列的人類蛋白cDNA克隆pTCF4L。內(nèi)容包括應用酵母單雜交體系，從HTLV－I轉(zhuǎn)化的人T細胞MATCHMAKER cDNA文庫中獲得了一個結(jié)合IL－2Rα基因NRE三聯(lián)體的質(zhì)粒pTCF4L；核酸雜交分析表明，人Jurkat細胞中存在能與該質(zhì)粒雜交的mRNA；EMSA實驗分析顯示，轉(zhuǎn)染了該質(zhì)粒的酵母裂解物能與IL－2Rα基因NRE核心序列三聯(lián)體特異結(jié)合；經(jīng)DNA序列測定和網(wǎng)絡生物資源BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒包含的cDNA具有完整的開放閱讀框架。
文檔編號C12N15/11GK1782089SQ20041009177
公開日2006年6月7日 申請日期2004年11月29日 優(yōu)先權日2004年11月29日
發(fā)明者陸瑜, 沈珝琲, 吳寧華 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所