專利名稱：判別探針固定基體變化的方法、探針固定基體和檢測裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到對固定了可與靶物質(zhì)特異結(jié)合的探針的基體中的探針的劣化的程度、包括對探針等進行保護的保護體的變化在內(nèi)的探針固定基體變化的程度進行判別的方法，含有對探針劣化、包括對探針等進行保護的保護體的變化在內(nèi)的探針固定基體的變化進行判定有用的元件的探針固定基體、以及用于對探針劣化、包括對探針等進行保護的保護體的變化在內(nèi)的探針固定基體的變化進行判定的系統(tǒng)等。
背景技術：
作為探針固定基體的一個例子，可舉DNA芯片。所謂DNA芯片是在固相表面使作為探針對基因的表達、變異、多型等進行同時解析非常有用的許多DNA片段或寡核苷酸整齊排列的高密度陣列。例如報道的用光刻蝕法制作的固相寡核苷酸陣列(參照例如美國專利第5688642號說明書)，以及使用噴墨法的固相DNA探針陣列的制作方法(參照例如國際公開第95/25116號公報)。
而靶物質(zhì)的檢測處理工序一般都是為了使用熒光物質(zhì)等標記的靶物質(zhì)與固相探針陣列的探針結(jié)合，進行雜交。雜交是通過使固相探針陣列與溶解了通常靶物質(zhì)的溶液接觸或浸漬，通過加熱處理進行的反應，該濃度和溫度等由于探針與靶物質(zhì)的組合不同而不同。再使用熒光檢測儀等裝置觀察探針與靶物質(zhì)是否結(jié)合。
發(fā)明內(nèi)容
一般來說，DNA等具有被紫外線或熱等分解的性質(zhì)，如果在長時間的來自日光等紫外線照射或高溫下保管，探針劣化，最終失去與靶核酸雜交的功能。而且由于被固定在制作的探針陣列的探針量極微量，對探針量或活性進行非破壞性測定有時是困難的。因此，本發(fā)明提供能夠容易判斷由于紫外線或高溫等各種各樣環(huán)境造成的探針功能消失的方法。
另外，在基體上有時還設置了以保護這些探針等為目的的保護體。然而，該保護體也有可能在上述的要因下發(fā)生變化，所以也提供容易判斷該變化的方法。
即，本發(fā)明作為在基體上固定了可與靶物質(zhì)特異結(jié)合的探針的固定基體，其特征是還設置了對成為上述探針固定基體變化要因的環(huán)境變化進行檢測的元件。
另外，還涉及到由探針固定基體具有的元件對探針固定基體有無變化或變化程度進行判別的方法。
另外還涉及到一種系統(tǒng)，其特征在于具有以下裝置由探針固定基體具有的元件取得環(huán)境變化的量的取得裝置，和根據(jù)通過該取得手段取得的環(huán)境變化判斷探針固定基體有無變化的判斷裝置。
根據(jù)本發(fā)明，通過再設置對使基體上固定了探針的探針固定基體發(fā)生變化的環(huán)境變化進行檢測的元件，可以通過簡便的方法對探針固定基體的變化、即對探針的劣化、保護探針或/和基體的保護體等有無變化或其變化程度或變化的可能性進行判別，使得在制造時、流通時、保管時的品質(zhì)管理或探針功能的確認變得容易。
附圖的簡單說明
圖1是表示UV照射時間和UV標記的G色輝度的圖。
圖2是表示UV標記的G色輝度和熒光強度的關系的圖。
圖3是表示溫度和加熱累計標記的R色輝度的關系的圖。
具體實施例方式
在本發(fā)明中包括對關于固定了可與靶物質(zhì)特異結(jié)合的探針的探針固定基體的性能有無什么變化和其變化程度進行判別的方法以及能夠?qū)嵤┻@樣判斷的方法的探針固定基體、以及利用這些方法對探針固定基體的變化狀況進行計算的系統(tǒng)。所謂探針固定基體的變化包括例如探針的劣化或?qū)μ结樀冗M行保護的保護體的變化等。
用于固定探針的基體只要是對固定探針、使用得到的探針固定基體檢測或分離靶物質(zhì)的操作沒有妨礙的，并沒有特別限定，例如玻璃、樹脂、金屬、中空纖維等，如果舉一個DNA芯片的例子的話，考慮到靶物質(zhì)的檢測和通用性，優(yōu)選玻璃基板或塑料基板，特別優(yōu)選不含有堿性成分等的無堿玻璃基板或石英基板。
至于將探針固定在基體上的方法已知有各種各樣的方法。詳細講，有通過在基體上合成探針將探針固定在基體上的方法，以及通過點或印等將預先準備的探針負載到基體上的固定方法。
作為在基體上進行探針合成的固定方法，已知例如美國專利第51438545號公報記載的那樣，通過活化劑將保護基從在基體上選擇的區(qū)域除去，通過反復操作使具有可除去保護基的單體與上述區(qū)域結(jié)合，在基體上合成具有各種序列的聚合物的方法。
而作為通過將預先準備的探針負載到基體上進行固定的方法，已知有例如特開平8-23975號公報記載的那樣，通過使基體和由具有可搭載到該基體上的碳化二亞胺基的高分子化合物構(gòu)成的固定用的材料與具有與碳化二亞胺基反應性的生物學上的活性物質(zhì)接觸進行固定的方法。另外就象特開平8-334509號公報記載的那樣，已知在具有生物學活性的物質(zhì)的檢測中，使用在具有碳化二亞胺化合物上借助于碳化二亞胺基進行固定化的探針進行檢測的方法。
另外，在特開2001-178442號公報中報道了在液相中通過使在末端含有巰基的DNA片段、含有與巰基反應可形成共價鍵的反應性置換基的鏈狀分子其一端被固定在表面的固相載體接觸，在DNA片段和鏈狀分子之間形成共價鍵使得DNA片段固定在固相載體表面的固定方法，作為含有與巰基反應可形成共價鍵的反應性置換基，具體來說如含有從馬來酰亞胺基、α，β-不飽和羰基、α-鹵代羰基、鹵化烷基、氮丙啶基以及二硫化物基選擇出來的基團的置換基。
探針的固定方法已知僅上述那樣的DNA片斷的固定方法就有很多，在本發(fā)明中對探針的種類和其固定方法并沒有特別限定。
探針固定基體的探針雖然因其種類不同而有差異，但一般來說受到溫度或紫外線、氧等影響，作為探針的功能就可能喪失。以下將該現(xiàn)象稱為劣化。對該劣化的程度進行判別或計測的簡便方法到目前為止還沒有。因此，本發(fā)明通過將檢測這些劣化的要因的元件搭載到基體上，在使用這些探針固定基體前對成為該劣化要因的因子會達到什么樣的程度進行判斷，測定探針劣化的程度。作為探針劣化的因子如受到紫外線的照射或結(jié)露、溫度變化、氧化以及pH變化等，但并不限定于這些。
所謂檢測劣化要因的元件，例如當要因為紫外線時，就象特開2001-281052號公報中公開的那樣，將伴隨著加熱引起色變化而可復原到氧化型的2聚合醌化合物作為通過紫外線的照射脫色為還原基的紫外線檢測材料配合在聚烯烴系樹脂的材料、以及就象特公平3-19536公開的那樣，作為以低聚合度的聚氯乙烯和有色染料或無色染料作為必需成分的溶液狀組成物，由于紫外線照射可引起上述有色染料或無色染料明顯的色彩變化及色濃度變化為特征的紫外線檢測材料、市售的紫外線檢測材料(如商品名“紫外線標記”、日油技研工業(yè)株式會社生產(chǎn))等。
另外由于探針的種類不同，紫外線影響的程度也不同，所以要對元件形成材料的靈敏度進行調(diào)整，最好選擇對使用的探針最適合的材料，本發(fā)明對這些材料靈敏度或紫外線檢測材料的種類并沒有限定。
對于溫度變化的情況，優(yōu)選受到溫度的影響色彩或色濃度變化的溫度表示材料。作為具體使用的材料如通過非結(jié)晶-結(jié)晶或相分離-非相分離的リタイラブリ系的電子供給性呈色性化合物(例如，無色金胺類、二芳基苯并呋喃酮類聚芳基原醇類、酰基金胺類、羅丹明B內(nèi)酰胺類、二氫吲哚類、螺吡喃類、熒烷類、花青苷色素類、結(jié)晶紫等電子供給性有機物等)、電子受體性化合物(例如酚類、酚金屬鹽類、羧酸金屬鹽類、磺酸、磺酸鹽、磷酸鹽、磷酸金屬鹽類、酸性磷酸酯、酸性磷酸酯金屬鹽類、亞磷酸鹽、亞磷酸類、亞磷酸金屬鹽類等氧化物等)那樣的化合物。另外更具體的就象特開平11-140339號公報公開的那樣，在支持體上設置含有無色或淡色的堿性染料和呈色劑以及含有熱可融性物質(zhì)的層的不可逆型示溫材料中，以作為堿性染料用3-(1-n-辛基-2-甲基吲哚-3-基)-3-(4-二乙基氨基-2-乙氧基苯基)-4-アザピタリド或3，3-二(1-n-辛基-2-甲基吲哚-3-基)フタリド，作為熱可融性物質(zhì)如含有1，2-二苯氧基乙烷和/或草酸二芐酯為特征的不可逆示溫材料或市售的示溫材料(例如商品名“熱敏油漆”、“サ-モラベル”、“サ-モシ-ト”、“サ-モテ-プ”、都是日油技研工業(yè)株式會社生產(chǎn))等。
另外，由于探針種類不同，溫度影響的程度也不一樣，所以最好是對靈敏度進行調(diào)整，選擇對使用的探針最適合的檢測材料，本發(fā)明對這些材料靈敏度或示溫材料的種類并沒有限定。
另外通過使用特性不同的多個示溫材料，也可以追蹤更詳細的溫度變化過程。
由于探針不同，也存在與大氣中的氧反應被氧化的探針。有關這樣的探針，氧檢測材料是有效的。例如，已知通過亞甲基藍等特定色素和作為用于還原該色素的還原劑的葡萄糖等組合檢測氧存在的氧檢測材料(參照特開昭53-120493號公報和特開昭56-60349號公報)等。
為了彌補葡萄糖對熱和光不穩(wěn)定等缺點，就象特開2000-39429號公報公開的那樣，報道了以含有從半胱氨酸、其鹽、酯以及N-?；苌镞x擇出來的至少一種和噻啶類和/或靛藍為特征的氧檢測材料。
另外，在特開昭56-210564號公報中報道了使用二(水楊醛)亞烴基二亞胺鈷(II)或其衍生物的氧顯示器，在特開昭64-10172號公報中報道了由高分子胺鈷絡合物的涂膜和熱可塑性塑料皮膜層構(gòu)成的氧顯示板。
而這里給出的氧檢測材料最好使用根據(jù)探針的種類等對靈敏度進行調(diào)整后的材料，但其種類并沒有限定。
對于由開封包裝的瞬間和制作探針固定基體的瞬間造成劣化的探針，時間顯示器是有效的。舉一個例子，如特開平11-14616號公報報道的特征如下的時間顯示器在基體的一面或兩面層疊含有通過與氧反應迅速變色的化合物的變色層，在該變色層上再層疊氧氣透過率0.1～3000ml/m2·24hr·atm·25℃·100％RH的氧氣透過抑制層。
另外在特開平6-18676號公報中揭示了使對熱可塑性樹脂和具有揮散性的電子受體性有機化合物和難揮散性的電子供給性發(fā)色性有機化合物進行溶融混勻構(gòu)成的組成物形成比表面積為連續(xù)的或非連續(xù)的不同形狀構(gòu)成的時間顯示器。
另外在特開平10-293183號公報中公開了特征如下的時間顯示器由充填在容器內(nèi)的空間部分的、由于與大氣接觸被延遲的具有形狀恢復性的發(fā)泡體或?qū)盈B體形成的。
而這里給出的時間顯示器最好使用根據(jù)探針的種類等對靈敏度進行調(diào)整后的材料，但其種類并沒有限定。
對于由于pH造成劣化的探針的情況，有添付濕的pH試紙的方法、對于探針固定基體被保存在液體中的情況，有預先使酚磺酞溶解等的pH指示劑等方法。
最好設置以防止探針的劣化為目的的保護體。舉一個DNA芯片的例子，通過在探針固定面設置聚乙烯醇(以下略稱為PVA)膜等探針的保護膜可以抑制探針的劣化。特別是PVA膜被含有進行雜交時的靶物質(zhì)的溶液溶解，可以不知不覺地使用PVA膜。然而，如果將具有該PVA膜的DNA芯片置于高溫下，可知PVA硬化變得難于溶解。如果PVA沒有溶解，由于以后的雜交反應不能正常進行，就妨礙檢查了。
而當保護體是紫外線吸收體等保護探針避免劣化要因的物質(zhì)時，當暴露于過度的劣化要因時，保護體劣化，保護能力下降。在這樣的情況下由于擔心探針也劣化，所以需要對保護體的變化進行檢測。
因此本發(fā)明的另一個目的是通過在基體上搭載檢測這些保護體變化的要因的元件，在使用這些探針固定基體前對成為該保護體變化要因的因子達到什么樣程度進行判斷，判斷該基體能否可以正常使用。作為保護體變化的因子例如紫外線照射或結(jié)露、溫度變化、氧化以及pH變化等，但不限定于這些。
象上述那樣引起探針劣化和包括保護體的變化在內(nèi)的探針固定基體的變化的要因各種各樣。在本發(fā)明中不限于對其中的一個要因進行檢測，還可以在基體上設置多個元件。
另外對這些探針劣化的要因或包括保護體的變化在內(nèi)的探針固定基體的變化的要因進行檢測的元件優(yōu)選是能夠檢測其變化過程那樣的不可逆的元件，通過這樣設計，可以對一直到使用探針固定基體之前的該固定基體的狀態(tài)進行判斷。
另外，這些元件的形狀可以是密封條(シ一ル)狀、帶狀、薄片狀、墨水狀、糊狀、板狀、棒狀或粒狀等形狀，沒有限制。另外即使是由于熱等要因等形狀發(fā)生變化的也可以。如果考慮到通用性，優(yōu)選將墨水狀的元件涂布到基體上的方法、或?qū)⒚芊鈼l狀元件貼到基體上的方法。
可以通過噴墨法向基體上涂布。特別是用熱噴法涂布上述的リタイラブリ系的電子供給性呈色性化合物時，通過加熱頭的加熱將該化合物加熱到熔點以上，急冷時變成無色，被固定在基體上。能夠?qū)崿F(xiàn)在該體系的玻璃轉(zhuǎn)變點以上漸漸發(fā)色的構(gòu)成。
另外，溫度與發(fā)色的時間可以通過可逆劑等的濃度進行控制。
另外為了節(jié)省下面搭載的時間，也可以對預先在高分子的基體上混勻了這些元件的基體進行探針固定。
關于搭載檢測變化要因的元件的場所，只要是不妨礙作為探針的功能，以及在使用時不妨礙其使用的場所，并沒有特別限定，例如在對探針的劣化狀況進行判斷時，最好是搭載在探針的附近，為了避開探針固定基體的固定探針的部分，最好是直接搭載在基體上。另外，即使不能直接搭載在探針固定基體上，也可以搭載到包裝等。
另外還有將糊狀或墨水狀的元件與探針混合后進行固定的方法，或與保護體混合后設置的方法。
另外，通過用粘接力低的粘接劑粘接上述密封條狀的元件，做成容易從基體剝離的構(gòu)成、或能夠通過水溶性水洗容易除去，或使用時可除去的元件構(gòu)成也比較好。
通過目視或讀取裝置等對那樣搭載的檢測探針固定基體的變化的要因的元件的變化(例如色變化或形狀變化)進行檢查，當存在變化時可以對探針的劣化或作為保護體的功能喪失等的可能性進行簡便判斷。
通過預先對檢測這些探針的劣化的要因的元件的變化量和探針的劣化的程度進行實測，做成標準曲線，將實際檢測劣化的要因的元件的變化量與該標準曲線進行比較，也可以定量求出探針的劣化的程度。
通過能夠自動進行判斷的自動化，可應用于探針劣化判斷系統(tǒng)中。即本發(fā)明的探針劣化判斷系統(tǒng)可以由探針固定基體具有的元件取得有關該探針固定基體的環(huán)境變化的信息的裝置，和根據(jù)通過該取得裝置取得的信息判定探針固定基體有無變化和量的裝置構(gòu)成?；蛘撸景l(fā)明的探針劣化判斷系統(tǒng)也可以由用于從探針固定基體含有的元件讀取環(huán)境變化的讀取裝置和對由通過該讀取裝置讀取的變化計算探針劣化的程度的計算裝置構(gòu)成。例如，就象下面敘述的實施例所表示的那樣，作為元件使用能夠通過以色表示變化的元件，通過作為讀取裝置的掃描器(分色器)讀取，將色成分分解為RGB各256種階調(diào)，以R成分和G成分等的規(guī)定色成分強度表示，對這樣得到的色成分強度與預先設定的基準值進行比較，判斷探針有無劣化，或?qū)λǖ纳煞值膹姸群吞结樍踊某潭鹊年P系進行預先設定，可以構(gòu)成能夠由實際得到的色成分的強度計算探針劣化的程度的系統(tǒng)。與該預先設定的基準值的比較或探針的劣化程度的計算可以通過設定在計算機中的程序進行。
另外本發(fā)明的這一保護體變化判斷系統(tǒng)可以由探針固定基體具有的元件取得有關該探針固定基體的環(huán)境變化的信息的裝置，和根據(jù)通過該取得裝置取得的信息判定探針固定基體有無變化和量的裝置構(gòu)成?；蛘?，本發(fā)明的這一保護體變化判斷系統(tǒng)也可以由用于從探針固定基體含有的元件讀取環(huán)境變化的讀取裝置和對由通過該讀取裝置讀取的變化計算探針劣化的程度的計算裝置構(gòu)成。例如，可以使用與上述的探針劣化判斷系統(tǒng)同樣的方法。
這些系統(tǒng)通過例如設置在使靶物質(zhì)與固定在基體上的探針反應的反應裝置上，對于劣化狀況激烈的情況或保護體變化，其功能喪失的情況等使反應裝置的錯誤表示部表示錯誤信號后使反應不能進行，也可以防止誤診。另外，對于引起探針劣化的情況，為了使靈敏度提高也可以使反應時間延長，或變更反應溫度等反應條件。
另外，也可以將這些系統(tǒng)設置在對與固定于基體上的探針反應的靶物質(zhì)的有無或其量進行測定的測定裝置中。例如，也可以預先做成探針劣化與靶物質(zhì)的測定量(例如為了容易檢測對靶物質(zhì)用熒光物質(zhì)標記，測定其熒光強度的情況，其熒光強度)的關系的標準曲線，對實際測定的靶物質(zhì)的測定量和探針的劣化狀況進行測定，用探針的劣化狀況校正靶物質(zhì)的測定量。
以下用實施例對本發(fā)明進行更詳細說明。
實施例[實施例1]紫外線引起的探針劣化的判別(1)基體的制作將玻璃基板在預先將載玻片加溫到60℃的1mol/l氫氧化鈉水溶液中浸泡10分鐘。在流動的純水中充分洗涮，將載玻片附著的氫氧化鈉通過水洗除去。充分洗涮后，將載玻片浸漬在純水中，進行10分鐘的超聲清洗。超聲清洗后，于純水流水中充分洗涮，將附著在載玻片上的粒子通過水洗除去。然后對該載玻片進行旋轉(zhuǎn)干燥。
將氨基硅烷偶聯(lián)劑(商品名KBM-603；信越化學工業(yè)公司生產(chǎn))溶解使終濃度為1重量％，攪拌30分鐘，將載玻片在該水溶液中浸漬30分鐘后取出，用水清洗，放到烘箱中于120℃下干燥1小時。
接著，稱量2.7mg的N-馬來酸酐縮亞胺己酰氧琥珀酰亞胺(同仁化學研究所制造；以下簡稱EMCS)，準備在二甲亞砜(DMSO)/乙醇的1∶1溶液中溶解EMCS使最終濃度為0.3mg/ml的溶液。在室溫將硅烷偶聯(lián)(バ一ク)處理過的導入了氨基的石英玻璃基板在EMCS溶液浸漬2小時，在表面導入馬來酸酐縮亞胺基。EMCS溶解處理之后，將基板按DMSO/乙醇混合溶液、乙醇的順序進行洗滌，在氮氣氛中使其干燥。
(2)探針的合成在本實施例中探針可以使用具有與要檢測的靶核酸全部互補的堿基序列，通過與靶核酸的堿基序列特異雜交(雜交反應)對靶核酸進行檢測的單鏈核酸。可以使用DNA自動合成儀合成由序列編號1的序列構(gòu)成的單鏈核酸。而在用DNA自動合成儀合成時，在該單鏈DNA末端導入了巰基修飾物(Thiol-Modifier)(Glen Research公司生產(chǎn))。然后進行通常的脫保護，回收DNA，通過高效液相層析進行純化，用于以下實驗。
5′HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3′(序列編號1)。
(3)探針的固定將上述(2)合成的DNA片段(序列編號1)溶解于含有7.5重量％甘油、7.5重量％尿素、7.5重量％硫二甘醇、1重量％乙炔醇(商品名アセチレノ-ルE100；川研フアインケミカル公司生產(chǎn))的水溶液，使吸光度為0.6OD。另外將寡核苷酸溶解于1ml，在1cm光路長的杯中260nm的吸光度為1的量作為1OD。
用泡沫噴射打印機(商品名BJ-F850；通過將佳能公司生產(chǎn)的機器改造為可以向平板印刷，BJ頭與載玻片的間隔約1mm、吐出量約4pl)將含有該DNA片段的水溶液點印在用上述(1)方法制作的載玻片上，制作DNA芯片。此時通過15倍的放大鏡觀測不到衛(wèi)星點(來自液體彈到固相表面時的飛沫的點)。
將點印了含有探針的溶液的載玻片于室溫下放置10分鐘，先用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗，然后用純水清洗，進行旋轉(zhuǎn)干燥。
(4)紫外線檢測材料的搭載將UV標記S帶(日油技研工業(yè)株式會社生產(chǎn))貼附到上述(3)制作的DNA芯片的沒有固定探針的部分。該UV標記S帶雖然是白色，但如果受到紫外線照射，就可以不可逆地變色為赤色(粉紅色)，是在約250mJ/cm2下變色程度飽和的物質(zhì)。
(5)紫外線的照射對上述(4)搭載了紫外線檢測材料的DNA芯片照射紫外線，達到約5mJ/cm2。
(6)封閉·雜交反應使牛血清清蛋白溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中，達到1.0重量％，將上述(5)照射了紫外線的DNA芯片和上述(4)制作的DNA芯片(沒有照射紫外線的DNA芯片)都于室溫下在上述溶液中浸漬2小時，進行封閉反應。
使羅丹明結(jié)合在具有與序列編號1互補的核酸序列的DNA片段的5’末端，合成標記的DNA片段，然后使他溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使終濃度達到50nM。將進行了封閉處理的DNA芯片浸漬于含有該標記的DNA片段的溶液中，于45℃下放置2小時。然后用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗未反應的DNA片段，再用純水進行清洗。
(7)結(jié)果對進行了雜交的DNA芯片用熒光掃描器(商品名GenePix4000B；Axon Instruments Inc.生產(chǎn))進行波長532nm的熒光觀測。結(jié)果觀測到各個點大致為圓形，其直徑為55μm。當用PMT400V、激光功率100％進行測定時，起因于進行UV照射的DNA芯片的序列編號1的探針的點中心附近的熒光強度為6335，而起因于沒有進行照射的DNA芯片的序列編號1的探針的點中心附近的熒光強度為21676。而點周圍的背景的熒光強度在進行UV照射時為270，沒有進行UV照射時為383。按照上述作法由熒光強度可以判斷由于UV照射引起的探針的劣化。
另外，在進行雜交反應前，貼附在沒有照射UV的DNA芯片的UV標記是白色，照射了UV的DNA芯片的UV標記變色成淺粉紅色。由此可以證明當UV標記變色時可以判斷UV引起了探針的劣化，通過目視也可以判斷該劣化。表1歸納了有無UV照射的熒光強度的比較結(jié)果。
表1
紫外線引起的探針劣化的判定(1)DNA芯片的制作采用與實施例1同樣的方法制作需要的DNA芯片數(shù)。
(2)紫外線檢測材料的搭載將UV標記S帶(日油技研工業(yè)株式會社生產(chǎn))貼附到制作的DNA芯片的沒有固定探針的部分。
(3)紫外線的照射對上述(2)搭載了紫外線檢測材料的DNA芯片于直至10秒鐘的不同時間照射紫外線，約5mJ/cm2。另外也準備沒有進行照射的樣品。
(4)標準曲線1的制作用掃描器(佳能公司生產(chǎn)，N-1240U)對各個UV標記進行掃描，將色成分分解為RGB各256種階調(diào)，對G成分和UV照射時間作圖。結(jié)果如圖1所示。就象圖1所表示的那樣，UV照射時間和UV標記的G色成分的輝度的關系直線減少。
(5)標準曲線2的制作采用與實施例1同樣的方法對DNA芯片進行封閉反應和雜交反應，再與同實施例1同樣的條件下進行熒光強度的測定。結(jié)果如表2所示。
表2
由(4)做成的G成分和UV照射時間的關系曲線(標準曲線1)和(5)做成的熒光強度和照射時間的關系可以做成G成分和熒光強度的關系的曲線。結(jié)果如圖2所示。
(6)探針劣化程度的計算對上述(2)所示的紫外線檢測材料搭載的DNA芯片照射3秒鐘紫外線，與上述(4)同樣測定UV標記的G成分，結(jié)果為181。由圖2的標準曲線得到該DNA芯片的熒光強度的期望值約為11000，探針劣化度約為50％。
(7)結(jié)果采用與實施例1同樣的方法對在上述(6)中進行3秒鐘UV照射的DNA芯片進行封閉反應和雜交反應，再用與實施例1同樣的方法進行熒光強度測定。測定的熒光強度為11121。由該結(jié)果可以證明可以由UV標記的G色成分的輝度(UV照射量)計算探針的劣化程度。
溫度引起的探針劣化的判定(1)DNA芯片的制作采用與實施例1同樣的方法制作需要的DNA芯片數(shù)。
(2)溫度檢測材料的搭載將加熱累計標記KS90-20(日油技研工業(yè)株式會社生產(chǎn))貼附到制作的DNA芯片的沒有固定探針的部分。該加熱累計標記KS90-20雖然是白色，但如果受到紫外線照射，就可以不可逆地變色為茶色，在約80℃下加熱約30分鐘，在約90℃下加熱20分鐘或在約100℃下加熱7分鐘左右該變色飽和。
(3)加熱將上述(2)搭載的溫度檢測材料的該DNA芯片分別于50℃、70℃、90℃的清潔的烘箱中加熱20分鐘。
用掃描器(佳能公司生產(chǎn)，N-1240U)對在(2)中貼附的加熱累計標記進行掃描，將加熱累計標記的色成分分解為RGB各256種階調(diào)，表3給出了R成分和加熱溫度。圖3給出了加熱溫度、加熱累計標記與R成分的關系。由該結(jié)果可知在20分鐘的加熱時間下，當超過70℃時R成分輝度急劇減少。
(4)封閉·雜交反應采用與實施例1同樣的方法對進行加熱處理的DNA芯片和沒有進行加熱處理的DNA芯片分別進行封閉反應和雜交反應。
(5)熒光測定用熒光掃描器(商品名GenePix4000B；Axon Instruments Inc.生產(chǎn))對進行了雜交的DNA芯片進行波長532nm的熒光觀測。結(jié)果觀測到各個點大致為圓形，其直徑為55μm。當用PMT400V、激光功率100％進行測定時的熒光強度如表3所示。
表3
(6)不良基準的做成如果將20％以上劣化的芯片定為不良，由表3可知，如果R成分不到200，探針的劣化超過20％。將該值作為不良基準。
(7)樣品制作將加熱累計標記KS90-20貼附到用先前的方法做成的DNA芯片上，于90℃下加熱3分鐘。用掃描器對該加熱累計標記進行掃描，將加熱累計標記的色成分分解為RGB各256種階調(diào)，對R成分進行測定。結(jié)果為204，由于是比先前的不良基準還高的值，所以推測探針的劣化程度在20％(良品)以下。
(8)結(jié)果采用與先前同樣的方法對于90℃下加熱3分鐘的DNA芯片進行封閉反應和雜交反應，用熒光掃描器進行波長532nm的熒光觀測。當用PMT400V、激光功率100％測定時的熒光強度為17985，探針劣化程度為13％，確認為良品。
由以上結(jié)果可以確認無論加熱時間不同，還是實際上沒有進行雜交反應，通過使用加熱累計標記都可以判別探針的劣化程度。
溫度引起保護體變化的判定(1)DNA芯片的制作采用與實施例1同樣的方法制作需要的DNA芯片數(shù)。
(2)聚乙烯醇的溶解和向探針固定載體的附著(保護體的形成)各秤量5g的PVA103(株式會社クラレ公司生產(chǎn)的聚乙烯醇，硬化度98.0-99.0mol％、聚合度約300)，邊攪拌邊將PVA103加入到含有純水495g的燒杯中，使其分散于純水中。然后通過1小時溫育，加熱到80～90℃，進行溶解，制備濃度1.0重量％的PVA水溶液。放冷后，確認沒有不溶物，進行過濾，制備PVA水溶液。過濾使用0.22μm的濾膜。
將做成的DNA芯片于PVA水溶液中浸漬30秒鐘，取出進行自然干燥。但不限定于這樣的鍍法，也可以運用旋轉(zhuǎn)鍍法、滾鍍法等。另外通過噴墨法、點法等也可以使PVA只附著在探針固定載體的探針固定的部分。
(3)溫度檢測材料的搭載將加熱累計標記KS90-20(日油技研工業(yè)株式會社生產(chǎn))貼附到制作的DNA芯片的沒有固定探針的部分。該加熱累計標記KS90-20雖然是白色，但如果加熱，就可以不可逆地變色為茶色，在約80℃下加熱30分鐘、在90℃下加熱20分鐘或在約100℃下加熱7分鐘左右該變色飽和。
(4)保護膜的膜厚測定用橢圓應力測定計(堀場ジヨバンイボン公司生產(chǎn)UVISEL)測定做成的DNA芯片的膜厚。其結(jié)果為203。
(5)加熱將形成保護層的DNA芯片于80℃下放置5小時，然后回到室溫。溫度檢測材料完全變色為茶色。
(5)保護膜的溶解使實施加熱處理的DNA芯片和沒有實施加熱處理的DNA芯片于1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中各浸漬10分鐘，然后用純水洗凈，通過旋轉(zhuǎn)干燥使其干燥。
(6)保護膜的膜厚測定用橢圓應力測定計測定實施了加熱處理的DNA芯片的膜厚。其結(jié)果為153。沒有進行加熱處理的DNA芯片不能檢測膜厚。由此可知由于加熱，保護體硬化，保護膜沒有溶解，預料不能進行雜交反應。
(7)封閉·雜交反應采用與實施例1同樣的方法對進行加熱處理的DNA芯片和沒有進行加熱處理的DNA芯片分別進行封閉反應和雜交反應。
(8)熒光測定對進行了雜交的DNA芯片用熒光掃描器(商品名GenePix4000B；Axon Instruments Inc.生產(chǎn))進行波長532nm的熒光觀測。進行加熱處理的DNA芯片沒有觀測到熒光。而沒有進行加熱處理的DNA芯片各個點大致為圓形，其直徑為55μm。當用PMT400V、激光功率100％測定時的熒光強度為20139。
由以上結(jié)果可以確認即使實際上不進行雜交反應，由對保護體的變化有無劣化進行判別的元件也可以判別保護體的變化。
雖然通過利用紫外線、溫度產(chǎn)生的外部因子的實施例對本發(fā)明的效果進行了說明，但就象根據(jù)本發(fā)明的宗旨在說明書中所述的那樣，對于其他外部因子也可以通過使用同樣的手法對探針的劣化程度進行簡便判斷。
序列表<110>佳能株式會社<120>判別探針固定基體變化的方法、探針固定基體和檢測裝置<130>10003471CN01<150>JP2003-387003<151>2003-11-17<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工<220>
<223>被固定在基體上的測試核酸<400>1actggccgtc gttttaca 18
權利要求
1.一種探針固定基體，是在基體上固定了可與靶物質(zhì)特異結(jié)合的探針的固定基體，其特征是還設置了對成為上述探針固定基體變化要因的環(huán)境變化進行檢測的元件。
2.權利要求1所述的探針固定基體，其特征是上述元件隨著環(huán)境變化而進行不可逆變化。
3.權利要求2所述的探針固定基體，其特征是上述元件可對溫度變化、紫外線照射、氧化、pH的變化、保存時間和結(jié)露中的至少一個要因進行檢測。
4.權利要求2至3中任一項所述的探針固定基體，其特征是上述元件具有密封條狀、帶狀、薄片狀、墨水狀、糊狀、板狀、棒狀或粒狀形狀。
5.權利要求4所述的探針固定基體，其特征是從上述元件計算出環(huán)境變化量，可以對探針的劣化程度或/和保護體變化的程度進行定量。
6.權利要求5所述的探針固定基體，其中含有多個探針。
7.權利要求6所述探針固定基體，其中探針是DNA片段。
8.一種由權利要求1所述的探針固定基體具有的元件對探針固定基體的有無變化進行判別的方法。
9.權利要求8所述的方法，其特征是上述探針固定基體的變化是探針的劣化或/和保護體的變化。
10.一種系統(tǒng)，其特征是具有以下裝置由權利要求1所述探針固定基體具有的元件取得有關該探針固定基體的環(huán)境變化信息的裝置，和根據(jù)通過該取得手段取得的信息判定探針固定基體有無變化或量的裝置。
11.權利要求10所述的系統(tǒng)，其特征是上述探針固定基體的變化是探針的劣化或/和保護體的變化。
12.一種反應裝置，是使上述探針和靶物質(zhì)反應的反應裝置，其特征是備有權利要求11所述的系統(tǒng)。
13.一種檢測裝置，是用于檢測有無與上述探針反應的靶物質(zhì)或靶物質(zhì)的量的檢測裝置，其特征是備有權利要求11所述的系統(tǒng)。
14.權利要求13所述的檢測裝置，其特征是根據(jù)探針劣化狀況，使用預先做成的標準曲線，對與上述探針固定載體反應的靶物質(zhì)的量或/和有無進行檢測的結(jié)果進行校正。
15.一種探針固定基體，是在基體上固定了可與靶物質(zhì)特異結(jié)合的探針的固定基體，其特征是還設置了溫度表示材料。
全文摘要
本發(fā)明通過搭載對引起固相探針陣列等中的探針劣化的因子的有無或引起保護體變化的因子的有無進行判別的元件，讀出該元件的變化，可以判斷探針劣化的程度或保護體變化的程度。
文檔編號C12Q1/68GK1637154SQ200410092670
公開日2005年7月13日 申請日期2004年11月16日 優(yōu)先權日2003年11月17日
發(fā)明者石橋亨 申請人:佳能株式會社