專利名稱：酶解培養(yǎng)基培養(yǎng)昆蟲病原線蟲的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)昆蟲病原線蟲的酶解培養(yǎng)基的制備方法，具體涉及利用淀粉酶酶解培養(yǎng)基培養(yǎng)昆蟲病原線蟲的方法。
背景技術：
昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic Nematodes)是一類寄生昆蟲的線蟲。斯氏線蟲科(Steinernematidae)和異小桿線蟲科(Heterorhabditidae)線蟲分別與嗜線蟲桿菌(Xenorhabdus)和發(fā)光桿菌(Photorhabdus)共生，線蟲攜帶共生菌進入寄主血腔，并保護共生菌不受寄主免疫反應的影響，共生菌繁殖產(chǎn)生毒素殺死寄主昆蟲，并分解昆蟲組織為線蟲提供發(fā)育繁殖所需營養(yǎng)。此類線蟲具有繁殖力高，世代歷期短，致死昆蟲快，殺蟲譜廣等特點。目前，國外有多家生物公司生產(chǎn)昆蟲病原線蟲，并作為一種生物殺蟲劑以商品形式出售，用于防治多種隱蔽和土棲性害蟲(van Lenteren et al，1996)。昆蟲病原線蟲是一類新型的生物殺蟲劑，其具有對土棲及鉆蛀性害蟲獨特的殺蟲功效，且對人畜、環(huán)境安全無毒的優(yōu)點。目前昆蟲病原線蟲已能夠利用人工培養(yǎng)基規(guī)?；a(chǎn)，作為一種生物殺蟲劑在國際市場上已實現(xiàn)了產(chǎn)品的商品化。
國內(nèi)對昆蟲病原線蟲的離體培養(yǎng)起步于80年代初期。80年代中期引進Bedding(1981)的三維固相培養(yǎng)技術后，人工離體培養(yǎng)線蟲的效率大大提高，并根據(jù)我國國情對線蟲離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基進行了改進，我國目前培養(yǎng)昆蟲病原線蟲所用培養(yǎng)基是經(jīng)過大量篩選工作后確定的以黃豆粉、面粉和豬油為主要成份的廉價培養(yǎng)基，該配方具有原料易得，配制方法簡單等優(yōu)點，但線蟲常常對培養(yǎng)基利用不夠完全，使線蟲不易清洗，收獲線蟲中混有培養(yǎng)基殘渣，影響線蟲產(chǎn)品的質量和貯存。用此培養(yǎng)基培養(yǎng)小卷蛾斯氏線蟲，每80g培養(yǎng)基線蟲產(chǎn)量約為35×106條，培養(yǎng)周期為21天左右，較低的產(chǎn)量和較長的培養(yǎng)周期增加了線蟲的生產(chǎn)成本，盡管其對某些重要農(nóng)林害蟲有很好的控制效果，但與化學農(nóng)藥相比在價格上沒有競爭力，推廣應用有一定難度。如何提高線蟲對培養(yǎng)基的利用率，并進一步提高線蟲產(chǎn)量和縮短培養(yǎng)周期，降低生產(chǎn)成本，成為昆蟲病原線蟲離體培養(yǎng)中急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提出一種利用生物酶酶解培養(yǎng)基用于培養(yǎng)昆蟲病原線蟲的方法，利用淀粉酶酶解培養(yǎng)基培養(yǎng)昆蟲病原線蟲，可提高線蟲產(chǎn)量40％左右，收獲期提前4-6天，線蟲的收獲率和清潔度提高。
本發(fā)明通過以下技術方案達到上述目的，即是在1000克以淀粉為主要成分的培養(yǎng)基中加入0.5ml~1.0ml淀粉酶(120KNU/ml)，混勻后高壓滅菌，用于培養(yǎng)昆蟲病原線蟲。
本發(fā)明祥述如下利用淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和脂肪酶等酶制劑對線蟲培養(yǎng)基進行酶解處理后培養(yǎng)線蟲，以線蟲產(chǎn)量作為評定指標，發(fā)現(xiàn)淀粉酶酶解培養(yǎng)基對提高線蟲產(chǎn)量最有效，產(chǎn)量可提高40％左右。
在淀粉酶酶解培養(yǎng)基上接種代線蟲發(fā)育比率較高，雌成蟲個體較大，雌成蟲產(chǎn)卵量和子代幼蟲量均比對照提高；線蟲在淀粉酶酶解培養(yǎng)基中培養(yǎng)到12天時，產(chǎn)量即達到50×106條/80g培養(yǎng)基，而對照培養(yǎng)基到18天時，才達到其最高產(chǎn)量35×106條/80g培養(yǎng)基，酶解培養(yǎng)基的線蟲產(chǎn)量比未酶解培養(yǎng)基提高40％，收獲期提前4-6天。線蟲一共生菌對酶解培養(yǎng)基中的總糖利用率在接種代線蟲發(fā)育期比對照提高40％，在線蟲產(chǎn)量達到最高時仍比對照高20％。
從淀粉酶酶解培養(yǎng)基中清洗收獲線蟲，線蟲的收獲率和清潔度提高；淀粉酶酶解培養(yǎng)基繁殖的線蟲質量的多項生物學和生化指標檢測結果與對照差異不明顯，說明酶解培養(yǎng)基對線蟲質量沒有影響。
下列實施例是進一步對本發(fā)明的說明，以淀粉酶酶解培養(yǎng)基培養(yǎng)昆蟲病原線蟲-小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsae為例。本方法適用于培養(yǎng)昆蟲病原線蟲-斯氏線蟲科(Steinernematidae)和異小桿線蟲科(Heterorhabditidae)線蟲。
實施例1不同酶制劑酶解培養(yǎng)基對線蟲繁殖量的影響將線蟲培養(yǎng)基各組份(豆粉18％，面粉9％，酵母1％，蛋粉1％，油脂3％，水68％)混合，在高速組織勻漿器中制成勻漿，每處理1000ml，加入碎海綿均勻吸附培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，每瓶裝量為80g，15磅滅菌30分鐘，接入共生細菌培養(yǎng)3天后，接入3齡侵染期線蟲105條。
表1不同酶制劑酶解培養(yǎng)基線蟲繁殖量比較

*80g培養(yǎng)基中線蟲總量n＝5從表1結果看出，淀粉酶與淀粉酶加糖化酶兩酶解培養(yǎng)基能明顯提高小卷蛾斯氏線蟲的產(chǎn)量，而蛋白酶和脂肪酶處理培養(yǎng)基對線蟲產(chǎn)量無明顯提高作用。線蟲培養(yǎng)8天時，淀粉酶與淀粉酶加糖化酶酶解的培養(yǎng)基線蟲產(chǎn)量比對照培養(yǎng)基有顯著提高，平均每三角瓶線蟲產(chǎn)量分別達到35.28×106、34.11×106；線蟲培養(yǎng)15天時，淀粉酶與淀粉酶加糖化酶兩個處理的線蟲產(chǎn)量最高，分別達到49.18×106、46.88×106，與對照培養(yǎng)基的線蟲產(chǎn)量差異極顯著。
此結果說明采用淀粉酶酶解培養(yǎng)基繁殖線蟲是一項可顯著提高線蟲產(chǎn)量的技術。
實施例2淀粉酶最佳用量的確定從表2看出每1000ml培養(yǎng)基中加入0.5ml以上淀粉酶溶液，在滅菌前期的升溫過程中，培養(yǎng)基中的淀粉即可被完全水解，從節(jié)約酶用量考慮，在1000ml培養(yǎng)基溶液中加入0.5ml淀粉酶為最佳酶用量。
表2淀粉酶最佳用量的確定

*- 淀粉水解不完全；+ 淀粉水解完全實施例3淀粉酶酶解培養(yǎng)基對接種代線蟲生長、發(fā)育和繁殖的影響表3結果顯示，在淀粉酶酶解培養(yǎng)基中，接種代線蟲的生長發(fā)育和繁殖都顯著高于對照培養(yǎng)基。在淀粉酶酶解培養(yǎng)基中接種代侵染期線蟲有98.2％的個體發(fā)育為成蟲，而對照培養(yǎng)基僅為89.4％，兩者之間差異顯著，說明淀粉酶酶解培養(yǎng)基中易被線蟲利用營養(yǎng)物的增加使更多的接種線蟲發(fā)育為成蟲；淀粉酶酶解培養(yǎng)基接種代雌成蟲平均長度為5686.66微米，對照培養(yǎng)基的雌成蟲長度為5188.89微米，兩者之間差異顯著，說明酶解培養(yǎng)基能夠提供較多的營養(yǎng)使雌成蟲發(fā)育的更好，長的更大，增加其抱卵量。在淀粉酶酶解培養(yǎng)基上接種代雌成蟲平均繁殖量為619.67，對照為571.17，兩者之間差異顯著，說明淀粉酶酶解培養(yǎng)基能獲得較高的線蟲產(chǎn)量，是由于接種代線蟲發(fā)育充分，繁殖力高所至。
表3淀粉酶酶解培養(yǎng)基對接種代線蟲生長發(fā)育的影響

實施例4淀粉酶酶解培養(yǎng)基對線蟲總量動態(tài)變化的影響表4線蟲總量動態(tài)表明在淀粉酶酶解培養(yǎng)基上線蟲發(fā)育的所有階段其總量均高于未酶解培養(yǎng)基。在淀粉酶酶解培養(yǎng)基中第8天子一代線蟲的產(chǎn)量為37.75×106/80g培養(yǎng)基，12天時為49.23×106條，14天時為50.01×106條，即在12天時達到其最高產(chǎn)量；在對照培養(yǎng)基第8天時子一代線蟲總量為23.26×106條，18天時才達到其最高產(chǎn)量為35.63×106條。在淀粉酶酶解培養(yǎng)基中線蟲的產(chǎn)量明顯高于對照培養(yǎng)基，且達到最高產(chǎn)量的時間提前4天。淀粉酶酶解培養(yǎng)基子一代的線蟲總量比對照提高了37.12％，最高產(chǎn)量比對照提高了40.36％，此結果進一步證明接種代線蟲的發(fā)育繁殖量對最終產(chǎn)量的決定性影響。
表4淀粉酶酶解培養(yǎng)基對線蟲總量動態(tài)變化的影響

實施例5淀粉酶酶解培養(yǎng)基對線蟲培養(yǎng)過程中總糖代謝的影響表5可看出共生菌和線蟲在淀粉酶酶解培養(yǎng)基中的總糖代謝速度比對照培養(yǎng)基快，總糖利用率高。當線蟲接入2天后，淀粉酶酶解培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中總糖利用率分別為50.44％和9.43％，處理高于對照41.01％，說明淀粉酶酶解培養(yǎng)基為接種代線蟲的發(fā)育提高了較多低分子的糖，可被線蟲迅速利用，而在對照培養(yǎng)基中，由于共生細菌不能水解淀粉，而線蟲的淀粉酶活性又較低，使糖的利用速度較慢；線蟲接入8天后，子一代線蟲大量形成，淀粉酶酶解培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基總糖利用率分別為62.94％和40.13％，處理比對照高22.81％；在線蟲總量達到最高點時，即淀粉酶酶解培養(yǎng)基中線蟲培養(yǎng)14天，對照培養(yǎng)基中線蟲培養(yǎng)18天，淀粉酶酶解培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中總糖利用率分別為76.97％和56.80％，處理仍比對照高20.17％；說明在對照培養(yǎng)基中未被利用的糖類物質較多，用碘—碘化鉀試劑檢測對照培養(yǎng)基中仍有淀粉存在。
表5線蟲-共生菌培養(yǎng)過程中的總糖利用率比較

實施例6不同處理培養(yǎng)基線蟲收獲率比較從表6結果可知，浸泡10分鐘至120分鐘的8個取樣時間的線蟲收獲率，淀粉酶酶解培養(yǎng)基均高于對照培養(yǎng)基。浸泡60分鐘，淀粉酶酶解培養(yǎng)基線蟲的收獲率即達91.65％，對照僅為77.02％；浸泡120分鐘后，淀粉酶酶解培養(yǎng)基線蟲的收獲率為96.54％，對照為88.91％，兩者之間差異顯著。說明淀粉酶酶解培養(yǎng)基生產(chǎn)線蟲，不僅提高線蟲產(chǎn)量和縮短培養(yǎng)時間，在收獲時間上較對照縮短了一半，提高了線蟲收獲的效率。
表6不同處理培養(yǎng)基線蟲收獲率比較

實施例7淀粉酶酶解培養(yǎng)基生產(chǎn)線蟲質量的生物學指標測定表7結果表明淀粉酶酶解培養(yǎng)基所培養(yǎng)的線蟲其帶鞘率、帶菌率、侵染力和抗干燥能力等多項生物學指標與對照培養(yǎng)基無顯著差異。由此結果可知，用淀粉酶酶解培養(yǎng)基生產(chǎn)線蟲不僅可提高線蟲產(chǎn)量，同時也能保證線蟲的質量。
表7淀粉酶酶解培養(yǎng)基生產(chǎn)線蟲質量的生物學指標測定

*以線蟲的存活率表示實施例8淀粉酶酶解培養(yǎng)基生產(chǎn)線蟲質量的生理生化指標測定表8、9結果顯示淀粉酶酶解培養(yǎng)基培養(yǎng)的侵染期線蟲的干重、體內(nèi)糖原、脂肪含量和體內(nèi)脂肪酸相對含量等指標與對照培養(yǎng)基無差異。此結果從理化指標方面進一步確定了淀粉酶酶解培養(yǎng)基生產(chǎn)線蟲質量的可靠性。
表8淀粉酶酶解培養(yǎng)基生產(chǎn)線蟲質量的生理生化指標測定

表9淀粉酶酶解培養(yǎng)基生產(chǎn)線蟲脂肪酸相對含量的比較

權利要求
1.培養(yǎng)昆蟲病原線蟲酶解培養(yǎng)基的制備方法，其特征是在培養(yǎng)基中加入消化酶，對基本培養(yǎng)基進行預消化；
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于用淀粉酶將以淀粉為主的培養(yǎng)基成分酶解后制成淀粉酶酶解培養(yǎng)基；
3.根據(jù)權利要求1、2所述的方法，其特征是在1000克以淀粉為主要成分的培養(yǎng)基中加入0.5-1.0ml淀粉酶(120KNU/ml)；
4.根據(jù)權利要求1、2、3、所述的培養(yǎng)基，其特征是用于培養(yǎng)昆蟲病原線蟲——斯氏線蟲科(Steinernematidae)和異小桿線蟲科(Heterorhabditidae)線蟲。
全文摘要
本發(fā)明涉及用酶解培養(yǎng)基培養(yǎng)昆蟲病原線蟲的方法。本發(fā)明的淀粉酶酶解培養(yǎng)基是在1000克以淀粉為主要成分的培養(yǎng)基中加入0.5－1.0ml淀粉酶(120KNU/ml)，混勻后高壓滅菌，用于培養(yǎng)昆蟲病原線蟲。用本發(fā)明研制的淀粉酶酶解培養(yǎng)基培養(yǎng)昆蟲病原線蟲，和原培養(yǎng)基相比產(chǎn)量提高40％左右，收獲期提前4－6天，線蟲的收獲率和清潔度提高。
文檔編號C12N1/10GK1778888SQ20041009604
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月26日 優(yōu)先權日2004年11月26日
發(fā)明者楊懷文, 劉崢, 簡恒, 楊秀芬, 陳松筆, 袁京京 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所