專利名稱：一種短密青霉菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型微生物及其用途，尤其涉及一種短密青霉菌及其在制備霉酚酸中的應用。
背景技術：
免疫抑制劑在器官移植中用于防治排斥反應，即干擾受體對外來抗原的識別和非自身細胞的清除。1954年，人類第一例同卵雙生子間腎臟移植的手術取得成功以后，至今40多年來醫(yī)學科學在器官移植方面的研究有了很多重大的突破。1978年，環(huán)孢素A(cyclosporine A，CsA)的臨床使用為器官移植開辟了新紀元。大多數(shù)患者腎移植2a存活率已超過80％，而患者生存率也有所提高。近年來，新的免疫抑制劑層出不窮，其中霉酚酸酯就是其中較好的一個。
霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)是青霉屬產(chǎn)生的具有抗代謝的霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)的半合成物，是霉酚酸(MPA)的2-乙基酯類衍生物，脫酯化合形成具有免疫抑制活性的代謝物。MPA是高效、選擇性、非競爭性、可逆性抑制次黃嘌呤脫氫酶阻斷鳥嘌呤核苷酸的起始合成途徑，使鳥嘌呤核苷酸耗盡，進而阻斷DNA的合成。MPA選擇性的作用于T、B淋巴細胞，抑制其增殖。再在動物腎移植實驗及臨床腎移植中已證實霉酚酸酯在對腎移植后排斥反應的預防和難治性排斥的治療中起著重要的作用。
抑制淋巴細胞增殖所需的MPA濃度，對大多數(shù)淋巴細胞無抑制作用，MPA還能通過直接抑制B細胞的增殖來抑制抗體的形成。治療量的MMF并不抑制多糖激活人外周淋巴細胞產(chǎn)生白介素-I，也不抑制有絲分裂原激活的外周淋巴細胞合成白介素-II和其受體表達，這點也不同于環(huán)孢素、FK-506。此外，MPA介導的體外淋巴細胞三磷酸鳥苷的耗竭可抑制甘露糖和巖藻糖轉(zhuǎn)化成糖蛋白。通過這種機制，MPA可降低淋巴細胞和單核細胞在慢性炎癥部位的聚集。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明既是為了提供一種新的高單位的霉酚酸產(chǎn)生菌，及該菌種在制備霉酚酸中的應用。
本發(fā)明采用的技術方案是一種短密青霉菌廣西變種YMS-110，分類命名為Penicilliumbrevicompactum var.YMS-110，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO.M 204096，保藏日期為2004年12月15日。所述的短密青霉菌變種YMS-110的菌種于1993年4月自廣西岑溪土柱山區(qū)土壤樣品分離得到。
所述的短密青霉菌變種YMS-110的菌落特性在PDA上菌絲生長良好，菌落呈灰綠色絮狀，菌落表面有少量放射性褶皺，邊緣匍匐狀，背面黃褐色，分生孢子梗多輪，分枝似帚，帚狀枝分枝多，短而緊密，瓶梗為柱形細胞，向上漸變小，分生孢子呈綠色，直徑為2～3μm，表面光滑，鏈狀排列。
綜上所述，根據(jù)微生物形態(tài)學及國外相關資料的描述，結合YMS-110的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，將YMS-110初步定為Penicilliumbrevicompactum系的一個變種即P.brevicompactum var.
所述的短密青霉菌變種YMS-110可應用于發(fā)酵制備霉酚酸。具體的，是用短密青霉菌變種YMS-110以10～20％接種量，在含有水溶性較強的氮源和碳源培養(yǎng)基中，在25～29℃下、130～200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5～6天，得到所述的霉酚酸。
所述的培養(yǎng)基中有效成分含量如下葡萄糖10％； KH2PO40.3％；MgSO40.2％；甘氨酸 0.7％；L-蛋氨酸 0.025％； FeSO4·7H2O 0.0022％；CuSO4·5H2O0.003％； ZnSO4·5H2O 0.024％；MnSO4·5H2O0.0012％。
本發(fā)明所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110及其應用的有益效果體現(xiàn)在所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110是目前分離到的一種天然高單位的霉酚酸產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良，極具開發(fā)、應用前景。


本發(fā)明所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC NOM 204096，保藏日期為2004年12月15日。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但不能將方案中所涉及的方法及技術參數(shù)理解為對本發(fā)明的限制。
實施例1短密青霉菌變種YMS-110的菌落特征1.材料和方法1.1菌種YMS-1101.2培養(yǎng)基1.2.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)土豆丁200g，用1000ml水煮沸30分鐘，紗布過濾待用。
土豆汁20％
葡萄糖 2％瓊脂 2％pH 自然121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘1.2.2麥芽汁瓊脂將發(fā)酵啤酒的原料(未加酒花)，稀釋至12柏林，加瓊脂15克，溶化后分裝，121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。
1.2.3酵母麥芽汁瓊脂酵母膏 3.0g葡萄糖 10.0g麥芽汁 3.0g蒸餾水 1000g蛋白胨 5.0g瓊脂 20.0g121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘1.2.4察氏瓊脂蔗糖 30gNaNO333gMgSO4·7H2O0.5gKCl 0.5gFeSO4·5H2O0.01gK2HPO41g瓊脂 15g蒸餾水1000ml
121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘1.3方法將菌株按下列方法分別置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、麥芽汁瓊脂、酵母麥芽汁瓊脂、察氏瓊脂上培養(yǎng)，觀察該種菌株的特性①載片培養(yǎng)菌株接種在載片中央的小塊培養(yǎng)基上，加上蓋玻片，28℃培養(yǎng)15天觀察結果。
②插片培養(yǎng)將蓋玻片插入已接種的培養(yǎng)基里，28℃培養(yǎng)20天觀察結果。
③培養(yǎng)物觀察肉眼或借助放大鏡及低倍鏡觀察菌落特征，用高倍鏡及電子顯微鏡觀察個體形態(tài)特征。
1.4結果描述1.4.1菌落特征YMS-110在PDA上菌絲生長良好，菌落呈灰綠色絮狀，菌落表面有少量放射性褶皺，邊緣匍匐狀，背面黃褐色，7天菌落直徑為7mm。分生孢子梗多輪，分枝似帚，帚狀枝分枝多，短而緊密。瓶梗為柱形細胞，向上漸變小。分生孢子呈綠色，直徑為2～3μm，表面光滑，鏈狀排列。
1.4.2 YMS-110在其他培養(yǎng)基上的菌落特征(見表1)表1YMS-110在其他培養(yǎng)基上的菌落特征
1.5結論根據(jù)微生物形態(tài)學及國外相關資料的描述，結合YMS-110的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，將YMS-110初步定為Penicillium brevicompactum系的一個變種即P.brevicompactum var.
實施例2發(fā)酵培養(yǎng)制備霉酚酸2.1種子庫菌種培養(yǎng)及保存培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂(PDA)土豆丁200g，用1000ml水煮沸30分鐘，紗布過濾待用。
土豆汁20％葡萄糖2％瓊脂 2％pH 自然培養(yǎng)溫度27℃～28℃培養(yǎng)時間10天保存方法培養(yǎng)10天的斜面孢子加入30％甘油，洗下孢子，將孢子懸液分裝在10ml試管中，-70℃保存。
2.2搖瓶種子培養(yǎng)
2.2.1培養(yǎng)基葡萄糖 1％酵母浸出粉 0.1％麥芽浸出粉 0.1％蛋白胨 0.2％pH 6.5培養(yǎng)溫度27℃～28℃培養(yǎng)時間2天裝量500ml三角瓶裝上述培養(yǎng)基100ml接種量2％搖床轉(zhuǎn)速220～240rpm2.2.2種子質(zhì)量指標菌濃15～20％鏡檢無雜菌，染色較深且均勻，菌絲粗壯，有結球現(xiàn)象。
2.3種子罐種子培養(yǎng)基2.3.1培養(yǎng)基葡萄糖 1％酵母浸出粉 0.1％麥芽浸出粉 0.1％蛋白胨 0.2％pH 6.5裝量150L種子罐內(nèi)裝培養(yǎng)基50L培養(yǎng)溫度28±0.5℃培養(yǎng)時間48～76小時空氣流量1∶0.5(v/v/m)接種量2％轉(zhuǎn)速150rpm2.3.2移種指標菌濃15～20％(3000rpm)，鏡檢菌絲粗壯，染色較深，有結球現(xiàn)象。
2.4發(fā)酵培養(yǎng)2.4.1發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 10％KH2PO40.3％MgSO40.2％甘氨酸 0.7％L-蛋氨酸0.025％FeSO4·7H2O 0.0022％CuSO4·5H2O 0.003％ZnSO4·5H2O 0.024％MnSO4·5H2O 0.0012％2.4.2發(fā)酵條件及參數(shù)指標裝量1000L發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基500L接種量10～20％空氣流量1∶1(v/v/m)培養(yǎng)溫度28±0.5℃培養(yǎng)時間5～6天轉(zhuǎn)速150rpm
放罐指標pH上升，氨基氮上升，鏡檢菌絲有自溶現(xiàn)象。
發(fā)酵單位參數(shù)2.55噸發(fā)酵罐試驗參照上述發(fā)酵條件和工藝，在5噸發(fā)酵罐、10噸發(fā)酵罐、20噸發(fā)酵罐進行多批發(fā)酵試驗，發(fā)酵單位平均為1000μg/ml，提取總收率為35％左右，各批生產(chǎn)制得霉酚酸樣品均符合華東醫(yī)藥企業(yè)內(nèi)部霉酚酸質(zhì)量標準(見附件)。
2.6發(fā)酵液中霉酚酸的檢測2.6.1色譜條件高效液相色譜(中國藥典2000年版二部附錄VD)測定；色譜柱Diamonsil(鉆石)C8 5μm 250(or150)×4.6mm流動相乙腈∶磷酸緩沖液(1∶1)檢測波長249nm流速1.0ml/min進樣量20μl磷酸緩沖液配制將1gNaH2PO4溶于1L雙蒸水中，用濃H3PO4調(diào)pH至3.0。
以霉酚酸峰值計算理論塔板數(shù)應不低于3000。
2.6.2檢測方法取10ml發(fā)酵液于250ml三角瓶中，再加入40ml乙醇，220rpm振蕩30min。離心后，取上清，然后用移液槍取1ml濾液于1ml離心管中，以12000r/min離心10分鐘，取上清作為供試液；另取霉酚酸對照品適量配置成濃度為500μg/ml的標準溶液，分別取供試液和標準溶液注入色譜柱，量取峰面積，按照外標法計算即得發(fā)酵液霉酚酸的量。
2.7結論發(fā)酵過程是霉酚酸生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，其發(fā)酵水平與工藝優(yōu)劣直接相關，經(jīng)過搖瓶和發(fā)酵罐(5噸)發(fā)酵工藝的研究，基本確定了發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件。我們又在10噸、20噸發(fā)酵罐中進行放大試驗，其產(chǎn)抗能力基本穩(wěn)定。從而進一步確定和驗證了發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及條件。由于種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基均選擇水溶性較強的氮源和碳源，故對霉酚酸的提取分離幫助很大。
附件霉酚酸企業(yè)內(nèi)部標準霉酚酸Mycophenolic Acid C17H20O6320.341本品為(E)-6-(1，3-二氫-4-羥基-7-甲基-3-氧-5-異苯并呋喃)-4-乙烯酸。按干燥品計算，含C17H20O6不得少于95.0％。
性狀本品為白色、類白色粉末，幾乎不溶于冷水，易溶于乙酸乙酯、乙醇，中等程度溶于乙醚、氯仿，難溶于苯、甲苯。
熔點本品的熔點為140-143℃鑒別在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應與霉酚酸對照品峰的保留時間一致。
檢查干燥失重取本品，105℃烘干至恒重，減失重量不得超過1.0％。
熾灼殘渣取本品1.0g，依法檢查(中國藥典2000年版附錄VIII N)，殘留不超過0.1％。
有關物質(zhì) 取本品適量，加流動相溶解制成每1ml含1mg的供試品。另取本品適量，加含量測定項下的流動相制成每1ml含20μg的溶液，制成對照溶液。照含量測定項下的方法試驗，取對照溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)靈敏度，使主成分色譜峰高為記錄儀滿量程的10％至15％。再取對照品溶液與供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，供試品溶液如顯示雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照品溶液的主峰面積。
含量測定照高效液相色譜法(國藥典2000年版附錄V D)測定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用辛基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-磷酸緩沖液(1∶1)為流動相；檢測波長為249nm。理論塔板數(shù)按霉酚酸峰計算，應不低于3000。
測定法取本品約25mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取霉酚酸對照品適量，同法測定。按外標法以峰面積計算。
貯藏遮光，密封保存。
權利要求
1.一種短密青霉菌廣西變種YMS-110，分類命名為Penicilliumbrevicompactum var.YMS-110，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NOM 204096，保藏日期為2004年12月15日。
2.如權利要求1所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110，其特征在于所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110在PDA上菌絲生長良好，菌落呈灰綠色絮狀，菌落表面有少量放射性褶皺，邊緣匍匐狀，背面黃褐色，分生孢子梗多輪，分枝似帚，帚狀枝分枝多，短而緊密，瓶梗為柱形細胞，向上漸變小，分生孢子呈綠色，直徑為2～3μm，表面光滑，鏈狀排列。
3.短密青霉菌廣西變種YMS-110在發(fā)酵制備霉酚酸中的應用。
4.如權利要求3所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110在發(fā)酵制備霉酚酸中的應用，其特征在于所述的應用是用短密青霉菌廣西變種YMS-110以10～20％接種量，在含有水溶性較強的氮源和碳源培養(yǎng)基中，在25～29℃下、130～200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5～6天，得到所述的霉酚酸。
5.如權利要求3所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110在發(fā)酵制備霉酚酸中的應用，其特征在于所述的培養(yǎng)基中有效成分含量如下葡萄糖 10％KH2PO40.3％MgSO40.2％甘氨酸 0.7％L-蛋氨酸 0.025％FeSO4·7H2O 0.0022％CuSO45H2O 0.003％ZnSO45H2O 0.024％MnSO45H2O 0.0012％
全文摘要
本發(fā)明涉及一種短密青霉菌廣西變種YMS－110，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NOM 204096，保藏日期為2004年12月15日。分類命名Penicillium brevicompactum var.YMS－110。根據(jù)微生物形態(tài)學及國外相關資料的描述，結合YMS－110的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，將YMS－110初步定為Penicilliumbrevicompactum系的一個變種即P.brevicompactumvar.本發(fā)明還提供了短密青霉菌廣西變種YMS－110在發(fā)酵制備霉酚酸中的應用。本發(fā)明所述的短密青霉菌廣西變種YMS－110是目前分離到的一種天然高單位的霉酚酸產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良，極具開發(fā)、應用前景。
文檔編號C12P17/02GK1796538SQ20041009910
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月28日 優(yōu)先權日2004年12月28日
發(fā)明者朱健, 高興蓉, 陳曉霞, 朱亮 申請人:杭州華東醫(yī)藥集團生物工程研究所有限公司