專利名稱：左旋二酮的微生物生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是對申請?zhí)枮?0122272.4、申請日為2000年8月1日，發(fā)明名稱為“左旋二酮的微生物生產(chǎn)方法”的申請的分案申請。
本發(fā)明涉及(6R)-2，2，6-三甲基環(huán)己烷-1，4-二酮(以下稱之為左旋二酮)的微生物生產(chǎn)，特別涉及以高產(chǎn)率生產(chǎn)高純度左旋二酮的方法，即用一種特殊的酵母進(jìn)行2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮(以下稱之為酮基異佛爾酮)的催化反應(yīng)。
左旋二酮以前是通過酮基異佛爾酮內(nèi)碳-碳雙鍵的還原進(jìn)行生產(chǎn)的，方法是使所述酮基異佛爾酮與發(fā)面酵母(例如釀酒酵母)接觸，后者起到對映選擇性生物催化劑的作用(《維生素、顏料和生長因子的生物工程》Erick J.Vandamme，p.71，Elsevier Applied Science，London and New York)。不過，發(fā)面酵母不適用于工業(yè)生產(chǎn)，因?yàn)樽笮漠a(chǎn)率太低。
使用發(fā)面酵母的生產(chǎn)方法所面臨的進(jìn)一步問題、以及為了研究出工業(yè)可行的生產(chǎn)方法而必須克服的問題是1)酵母細(xì)胞不能再利用，因?yàn)榻湍傅姆磻?yīng)活性壽命短。
2)復(fù)雜的純化方法是必要的，因?yàn)樵诖呋磻?yīng)后難以從培養(yǎng)溶液中分離酵母。
為了提高從酮基異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的產(chǎn)率，也為了克服其他問題，人們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某些酵母株能夠比以前更有效地從酮基異佛爾酮產(chǎn)生左旋二酮。因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)左旋二酮的方法，其特征在于使酮基異佛爾酮與至少一種酵母接觸，該酵母能夠?qū)⑼惙馉柾D(zhuǎn)化為左旋二酮，該酵母選自魯氏糖酵母(Saccharomyces rouxii)(魯氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces rouxii))、戴耳克氏糖酵母(Saccharomycesdelbrueckii)(單孢糖酵母(Saccharomyces unisporus)、戴耳克氏圓孢酵母(Torulaspora delbrueckii))、魏萊氏糖酵母(Saccharomyces willianus)、拜列氏接合糖酵母(Saccharomyces bailii)和熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，和這些種類的功能等價(jià)物、次代培養(yǎng)物、突變體和變種，接觸是在水、水可混溶性有機(jī)溶劑或水與所述水可混溶性有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行的，其中含有至少一種可同化的碳源，然后在反應(yīng)完成后從反應(yīng)介質(zhì)中分離所得的左旋二酮。
進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過某些工藝并利用適合于所述催化反應(yīng)的這種固定化酵母截留進(jìn)行反應(yīng)的酵母，能夠生產(chǎn)高純度左旋二酮，而產(chǎn)率甚至更高。這代表本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征。
在本發(fā)明方法中作為原料或“底物”使用的酮基異佛爾酮是熟知的底物，其本身通過文獻(xiàn)已知方法能夠容易地合成，例如美國專利3,960,966所報(bào)道的方法。
本方法可以使用任何具有將酮基異佛爾酮轉(zhuǎn)化為左旋二酮的能力、并且屬于魯氏糖酵母(魯氏接合糖酵母)、戴耳克氏糖酵母(單孢糖酵母、戴耳克氏圓孢酵母(Torulaspora delbrueckii))、魏萊氏糖酵母、拜列氏接合糖酵母和熱帶假絲酵母及其功能等價(jià)物、次代培養(yǎng)物、突變體和變種的酵母，優(yōu)選為選自下組已保藏酵母的至少一種魯氏糖酵母(魯氏接合糖酵母)HUT 7191(IFO 0494)，戴耳克氏糖酵母HUT 7116(單孢糖酵母IFO 0298)，戴耳克氏糖酵母(戴耳克氏圓孢酵母(Torulaspora delbrueckii))HUT7102，魏萊氏糖酵母HUT 7106，拜列氏接合糖酵母ATCC 11486和熱帶假絲酵母IFO 1403，及其功能等價(jià)物、次代培養(yǎng)物、突變體和變種。
魯氏糖酵母HUT 7191、戴耳克氏糖酵母HUT 7116和戴耳克氏糖酵母HUT 7102是按照于1987年發(fā)布的HUT目錄列出的。不過，于1999年9月發(fā)布的HUT目錄將這些微生物的第一種和第三種分別重新分類為魯氏接合糖酵母HUT 7191和戴耳克氏圓孢酵母(Torulaspora delbrueckii)HUT7102，不再列出戴耳克氏糖酵母HUT 7116。于1996年發(fā)布的IFO目錄將“HUT 7116”分為單孢糖酵母IFO 0298。
在這些酵母中，魯氏糖酵母(魯氏接合糖酵母)HUT 7191(IFO 0494)是一種最優(yōu)選用于本發(fā)明方法的酵母。
這些優(yōu)選的酵母已經(jīng)保藏在下列至少一個(gè)保藏單位中美國菌種保藏中心(ATCC)，University Boulevard Manassas，VA20100-2209，U.S.A.，HUT培養(yǎng)物保藏中心，Department of Fermentation Technology，HiroshimaUniversity and Institute for Fermentation(IFO)，17-85 Jusohonmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka，Japan。任何人如果需要，都可以從有關(guān)保藏單位得到。
本發(fā)明方法所用酵母可以在用在所述方法之前預(yù)先制備，方法是將酵母在生長基中培養(yǎng)，生長基中含有可同化的碳源、可同化的氮源、無機(jī)鹽等，然后通過離心等常規(guī)方法從培養(yǎng)基中分離酵母細(xì)胞。酵母的培養(yǎng)一般是在20至40℃的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選為25至30℃，在3.0至6.0的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選為4.3至4.7，培養(yǎng)6至48小時(shí)，優(yōu)選為20至30小時(shí)，在需氧條件下進(jìn)行。適合的可同化碳源包括蔗糖、山梨醇、葡萄糖等，其中葡萄糖是優(yōu)選的。適合的可同化的氮源包括硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、氨基酸、玉米漿、麥芽浸膏、麩浸膏、酵母浸膏等。適合的無機(jī)鹽包括硫酸鎂、氯化鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鉀等。
本發(fā)明方法在水、水可混溶性有機(jī)溶劑或水與所述水可混溶性有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行。作為水可混溶性有機(jī)溶劑，適合使用低級(C1-6-)鏈烷醇，尤其是甲醇、乙醇或丙醇。不過，基于經(jīng)濟(jì)和容易操作的原因，水是優(yōu)選使用的溶劑。
本方法一般在20至40℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選為25至30℃。對任何其他反應(yīng)條件的組合來說，技術(shù)人員可以確定最佳的更窄的溫度范圍。pH通常為3.0至6.0，優(yōu)選為4.0至5.0。反應(yīng)通?？梢栽陂_始反應(yīng)后2至40小時(shí)結(jié)束，優(yōu)選在確認(rèn)反應(yīng)介質(zhì)中的酮基異佛爾酮濃度已經(jīng)達(dá)到非常低或接近零值之后，利用一種分析方法進(jìn)行確認(rèn)，例如氣相色譜法。最初的酮基異佛爾酮濃度通常為0.3至2.0重量％，優(yōu)選為0.9至1.0重量％。
作為可同化的碳源，必須存在于反應(yīng)介質(zhì)中，它是酵母從酮基異佛爾酮產(chǎn)生左旋二酮的能源，可以使用蔗糖、山梨醇、葡萄糖等，其中葡萄糖是優(yōu)選的。介質(zhì)中最初的碳源濃度通常為2.0至8.0重量％，優(yōu)選為2.5至3.5重量％。
本發(fā)明方法可以以分批、半連續(xù)或連續(xù)的方式進(jìn)行。在一種具體的實(shí)施方式中，將酵母懸浮在溶劑中，即水、水可混溶性有機(jī)溶劑或二者的混合物，將混懸液加入到反應(yīng)釜中。然后將酮基異佛爾酮和葡萄糖溶于另外的溶劑中，將溶液調(diào)至pH3.0至6.0，優(yōu)選為4.0至5.0，連續(xù)加入到反應(yīng)釜內(nèi)的酵母混懸液中。反應(yīng)介質(zhì)內(nèi)開始換氣后，繼續(xù)向反應(yīng)釜內(nèi)的酵母混懸液中加入酮基異佛爾酮和葡萄糖的溶液，將所得溶液通過過濾從反應(yīng)釜中連續(xù)除去。調(diào)節(jié)加入和除去的速率使之大致相等，以保持反應(yīng)釜內(nèi)的體積相同。催化反應(yīng)一般在20至40℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選為25至30℃。作為調(diào)節(jié)pH的介質(zhì)，適合使用含水的硫酸或氫氧化鈉。酮基異佛爾酮與酵母反應(yīng)的時(shí)間可因主要條件而異。不過，所述時(shí)間可以預(yù)先確定，方法是調(diào)節(jié)進(jìn)料速率和除去速率，使被除去溶液中的酮基異佛爾酮是連續(xù)耗盡的。
在根據(jù)本發(fā)明方法的酮基異佛爾酮與酵母的催化反應(yīng)的一個(gè)方面中，在水或含水溶劑中呈漂浮狀態(tài)的酵母、或呈固定狀態(tài)的酵母可以用于流化床反應(yīng)釜或固定床反應(yīng)釜。不過，即使酵母的活性已經(jīng)降低，也可容易地進(jìn)行固定形式酵母的再活化，利用該酵母可以生產(chǎn)大量左旋二酮，而與它以前反復(fù)用于催化反應(yīng)無關(guān)。因此，利用固定形式的酵母可以提高左旋二酮的生產(chǎn)率。
本發(fā)明方法可以用流化床反應(yīng)釜或固定床反應(yīng)釜進(jìn)行。另外，當(dāng)固定化酵母被用于與酮基異佛爾酮的第一步催化反應(yīng)時(shí)，一般優(yōu)選的是所述固定化酵母的活化在反應(yīng)之前進(jìn)行。進(jìn)行這種活化的方法可以是在適合于酵母生長的條件下，使固定化酵母與適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)基接觸，同時(shí)進(jìn)行通氣和攪拌。
1流化床反應(yīng)釜的使用將酮基異佛爾酮和葡萄糖溶于水或含水溶劑。然后將所得溶液和固定化酵母加入到反應(yīng)釜中。通過換氣和攪拌引發(fā)催化反應(yīng)。酮基異佛爾酮的濃度通常為0.3至2.0重量％，優(yōu)選為0.9至1.0重量％，葡萄糖的濃度通常為2.0至4.0重量％，優(yōu)選為2.5至3.0重量％。催化反應(yīng)可以在20至40℃的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選為25至30℃，在3.0至6.0的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選為4.3至4.7。換氣速率(空氣體積/介質(zhì)體積/分鐘vvm)適宜為0.5至3vvm，優(yōu)選為1至2vvm。反應(yīng)時(shí)間可因條件而異。不過，反應(yīng)通常在反應(yīng)開始后約8至10小時(shí)停止，優(yōu)選在確認(rèn)酮基異佛爾酮的量已經(jīng)耗盡之后。
為了在催化反應(yīng)完成后分離左旋二酮，從反應(yīng)釜中僅除去所得溶液，然后用水或含水溶劑洗滌固定化酵母。然后通過常規(guī)方法可以從合并后的溶液與洗液中分離左旋二酮。用洗滌溶劑洗滌，固定化酵母能夠被再次活化，在后面的催化反應(yīng)中可反復(fù)使用。
2固定床反應(yīng)釜的使用將固定化酵母置于反應(yīng)釜中。將酮基異佛爾酮和葡萄糖溶于水或含水溶劑中，將溶液的pH調(diào)為3.0至6.0，優(yōu)選為5.0。酮基異佛爾酮的濃度通常為0.3至2.0重量％，優(yōu)選為0.9至1.0重量％，葡萄糖的濃度通常為2.0至4.0重量％，優(yōu)選為2.5至3.0重量％。將所得溶液加入到反應(yīng)釜中，與固定化酵母反應(yīng)。催化反應(yīng)適合在20至40℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選為25至30℃。反應(yīng)時(shí)間可因條件而異。不過，反應(yīng)通常在反應(yīng)開始后約24至48小時(shí)停止，優(yōu)選在確認(rèn)酮基異佛爾酮的量已經(jīng)耗盡之后。催化反應(yīng)終止后的過程與上述情況相同，只是其中所用的是流化床反應(yīng)釜而已。
固定酵母的方法是已知的例如參見W.M.Fogarty等《微生物酶與生物工程》第2版，Elsevier Applied Science，pp.373-394(1983)或日本專利公報(bào)61265/1994。
用于截留法固定酵母的載體實(shí)例包括(i)大分子多糖凝膠，例如藻酸鈉、角叉菜膠鉀、明膠和瓊脂，是從天然產(chǎn)物提取的；(ii)殼聚糖珠粒，由來源于天然產(chǎn)物的大分子多糖組成；(iii)陶瓷珠粒；和(iv)疏水性可光致交聯(lián)的樹脂，每分子含有至少兩個(gè)不飽和烯鍵，經(jīng)過照射發(fā)生聚合。
在上述載體中，經(jīng)過照射發(fā)生聚合的疏水性可光致交聯(lián)的樹脂、即上述第iv種，是最優(yōu)選使用的。
疏水性可光致交聯(lián)的樹脂包括(iv，a)由聚丙二醇與(甲基)丙烯酸之間的反應(yīng)形成的尿烷加合物，(iv，b)由聚乙二醇與(甲基)丙烯酸之間的反應(yīng)形成的尿烷加合物，(iv，c)聚乙烯醇，和(iv，d)尿烷加合物(iv，a)與(iv，b)的混合物。
該疏水性可光致交聯(lián)的樹脂是商業(yè)上可得到的，例如“BEL ENTG-3800”， 來自Kansai Paint Co.，Ltd.，Hyogo-ken，Japan。
利用上述照射聚合的疏水性可光致交聯(lián)的樹脂作為載體固定酵母的方法實(shí)例包括下列步驟制備下列(a)、(b)、(c)和(d)的液態(tài)混合物(a)疏水性可光致交聯(lián)的樹脂，(b)光聚合引發(fā)劑，例如苯偶姻、丙酮、苯偶姻甲醚、萘酚或2-羥基-2-甲基苯基乙基酮(C6H5COC(CH3)2OH)，(c)用以稀釋疏水性可光致交聯(lián)的樹脂的溶劑，例如石油醚、苯、己烷、乙二醇或甲醛，和(d)酵母，將所述含有組分(a)、(b)、(c)和(d)的混合物滴注到含水溶劑中，其中含有一種洗滌劑，例如月桂基硫酸鈉或甘油脂肪酸酯，以形成固體珠粒，在該階段珠粒的直徑通常約為0.1至5mm，優(yōu)選約為0.5至3.0mm，不過也可以有所不同，用波長約250至600nm的射線照射珠粒2至5分鐘。
原始液態(tài)混合物中各組分的重量比、即(a)∶(b)∶(c)∶(d)通常分別為100∶0.1-5∶10-200∶0.001-50，但是并不限于此。
參與本發(fā)明方法的催化反應(yīng)所得左旋二酮的純化方法實(shí)例包括下列步驟將所得溶液與洗液的混合物過濾或離心，除去固體雜質(zhì)和酵母細(xì)胞，使所得濾液與吸附樹脂接觸，例如疏水性樹脂，用一種親水性有機(jī)溶劑從樹脂上洗脫所吸附的左旋二酮，該洗脫溶劑例如低級醇，如甲醇或乙醇，或丙酮。
利用這樣一種方法能夠得到高純度的左旋二酮。
所述疏水性樹脂的實(shí)例為改性交聯(lián)聚苯乙烯(SP-207)和交聯(lián)聚苯乙烯(SP-800和SP-850)(Mitsubishi Chemical Co.，Tokyo，Japan)。在這些樹脂中，SP-850是最優(yōu)選的，因?yàn)槊繂挝惑w積對左旋二酮的吸附能力極高。疏水性吸附樹脂與體積10至20倍于樹脂的溶液接觸，使溶劑中的左旋二酮能夠被有效地吸附在該疏水性樹脂上。在進(jìn)行洗脫步驟時(shí)，優(yōu)選的是使用兩倍體積于樹脂的甲醇作為洗脫溶劑。收集洗脫液，濃縮，然后冷卻所得濃洗脫液，使從疏水性吸附樹脂上洗脫下來的左旋二酮結(jié)晶。然后通過過濾或離心，可以以這種高產(chǎn)率方式分離得到左旋二酮晶體。
利用本發(fā)明的方法，能夠生產(chǎn)純度超過99％的左旋二酮，回收率為70至80％。
下列實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1酵母的篩選將商業(yè)上可得到的發(fā)面酵母(可從Oriental Yeast Co.，Ltd.，Tokyo，Japan得到；用于對比)和從公共保藏單位(ATCC、HUT或IFO)得到的酵母分別在含有葡萄糖、蛋白胨和酵母浸膏的培養(yǎng)基中在30℃下培養(yǎng)45小時(shí)，然后離心收集培養(yǎng)物中的酵母細(xì)胞。
啤酒糖酵母ATCC 7754(也用于對比)，魯氏糖酵母(魯氏接合糖酵母)HUT 7191(IFO 0494)，戴耳克氏糖酵母HUT 7116(單孢糖酵母IFO 0298)，戴耳克氏糖酵母(戴耳克氏圓孢酵母(Torulaspora delbrueckii))HUT7102，魏萊氏糖酵母HUT 7106，拜列氏接合糖酵母ATCC 11486，熱帶假絲酵母IFO 1403。
在每種情況下，將所收集的酵母細(xì)胞懸浮在離子交換水中，濃度為80g/l，將含水介質(zhì)的pH調(diào)為4.2。在單獨(dú)的操作中，將酮基異佛爾酮和葡萄糖溶于離子交換水中，濃度均為17g/l，將含水介質(zhì)的pH調(diào)為4.2。將酵母懸液與含有異佛爾酮和葡萄糖的水溶液混合，體積比為1∶1，然后在30℃下進(jìn)行反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)完成后，用氣相色譜法分析七種情況下的左旋二酮濃度，由此計(jì)算每單位酵母的左旋二酮生產(chǎn)率，進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果如表1所示。
從結(jié)果可明顯看出，本發(fā)明所用每種酵母的左旋二酮生產(chǎn)率都比發(fā)面酵母(8.8)和啤酒糖酵母ATCC 7754(9.8)高(≥10.5，高達(dá)25.7)。
實(shí)施例2利用固定化酵母進(jìn)行催化反應(yīng)使用攪拌發(fā)酵器，將魯氏糖酵母(魯氏接合糖酵母)HUT 7191(IFO 0494)和發(fā)面酵母在30℃下培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)基含有給定重量百分比的酵母浸膏(0.5％)、蛋白胨(1.0％)、葡萄糖(2.0％)、KH2PO4(0.5％)和MgSO4(0.2％)。在培養(yǎng)開始后的約12小時(shí)生長階段內(nèi)，葡萄糖被酵母細(xì)胞耗盡，然后以恒定速率加入葡萄糖。離心從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，然后懸浮在離子交換水中，濃度為100g/l。預(yù)先制備含有200ppm對苯醌的可光致交聯(lián)的樹脂(ENTG-3800)混合物，在室溫下貯藏一周以上備用。將樹脂與對苯醌的混合物、藻酸鈣溶液(1.8重量％)、細(xì)胞懸液和2-羥基-2-甲基苯基乙基酮分別以55.5∶22.2∶22.2∶0.1的重量比混合。將混合物通過注射器針頭滴注到氯化鈣溶液(3.0重量％)中，以形成直徑3mm的固體珠粒。從氯化鈣溶液中分離珠粒，立即用紫外線(360nm)照射3分鐘。照射后，珠粒用離子交換水洗滌。從而完成固定化酵母的制備。
在反應(yīng)的每種情況中都使用帶有緩沖板的垂直延長的泡罩塔反應(yīng)釜(5升)。反應(yīng)釜內(nèi)裝800g分別固定化的酵母。加入3.5倍固定化酵母體積的溶液，溶液含有酵母浸膏(0.1％)、葡萄糖(2.0％)、KH2PO4(0.2％)和MgSO47H2O(0.1％)，以7.0升/分鐘的速率開始換氣，以活化酵母。固定化酵母和活化溶液的溫度保持在30℃，在活化過程中加入氫氧化鈉水溶液使pH保持在4.5。24小時(shí)后活化完成，從反應(yīng)釜中僅除去活化溶液。然后，向反應(yīng)釜中加入35g酮基異佛爾酮和75g葡萄糖，加入離子交換水至體積為3.5升。以7.0升/分鐘的速率開始換氣，引發(fā)催化反應(yīng)。固定化酵母和反應(yīng)混合物的溫度保持在30℃，在發(fā)酵過程中加入4.5N氫氧化鈉溶液使pH保持在4.5。


圖1用固定化魯氏糖酵母(魯氏接合糖酵母)HUT 7191顯示反應(yīng)溶液中酮基異佛爾酮和左旋二酮濃度改變的時(shí)間過程。
一旦反應(yīng)完成，除去反應(yīng)溶液，向其中加入酮基異佛爾酮和葡萄糖，再一次進(jìn)行催化反應(yīng)。反應(yīng)以相同方式重復(fù)10次，即進(jìn)行10個(gè)反應(yīng)循環(huán)。
作為對比，圖2在上述相同條件下用發(fā)面酵母顯示反應(yīng)溶液中酮基異佛爾酮和左旋二酮的濃度變化。
隨后，在完成每次重復(fù)反應(yīng)后，從反應(yīng)釜中除去反應(yīng)溶液，向其中加入3.5倍固定化酵母體積的水，以7.0升/分鐘的速率進(jìn)行換氣10分鐘，以洗滌固定化酵母。然后萃取洗滌溶液，再向反應(yīng)釜中加入酮基異佛爾酮和葡萄糖，再次進(jìn)行催化反應(yīng)。催化反應(yīng)和固定化酵母的洗滌以相同方式重復(fù)進(jìn)行10次(10個(gè)循環(huán))。
圖3用魯氏糖酵母(魯氏接合糖酵母)HUT 7191顯示左旋二酮經(jīng)過連續(xù)發(fā)酵恢復(fù)為酮基異佛爾酮的變化，包括或不包括洗滌過程。
實(shí)施例3左旋二酮的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)魯氏糖酵母(魯氏接合糖酵母)HUT 7191(IFO 0494)，通過實(shí)施例2所述相同方法制備大量固定化酵母。
催化反應(yīng)使用帶有緩沖板(1m3)的垂直延長的泡罩塔反應(yīng)釜。反應(yīng)釜內(nèi)裝230g預(yù)先制備的固定化酵母。向其中加入3.5倍固定化酵母體積的溶液，溶液含有給定重量百分比的酵母浸膏(0.1％)、葡萄糖(2.0％)、KH2PO4(0.2％)和MgSO47H2O(0.1％)，以0.4Nm3/分鐘的速率開始換氣，以活化酵母。固定化酵母和活化溶液的溫度保持在30℃，在活化過程中加入氫氧化鈉水溶液使pH保持在4.5。24小時(shí)后活化完成，從反應(yīng)釜中除去活化溶液。然后，向反應(yīng)釜中加入9kg酮基異佛爾酮和30kg葡萄糖，加入離子交換水至體積為1000升。以0.4Nm3/分鐘的速率開始換氣，引發(fā)催化反應(yīng)。固定化酵母和溶液的溫度保持在30℃，在反應(yīng)過程中加入氫氧化鈉溶液使pH保持在4.5。
一旦酮基異佛爾酮的量已被耗盡，反應(yīng)即完成，從反應(yīng)釜中除去所得溶液。然后向反應(yīng)釜中加入3.5倍固定化酵母體積的水，以0.4Nm3/分鐘的速率進(jìn)行換氣15分鐘，以洗滌固定化酵母。排放洗滌溶液后，向反應(yīng)釜中加入等量上述酮基異佛爾酮和葡萄糖，再次進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間通常約為8小時(shí)，不過如果發(fā)酵連續(xù)進(jìn)行超過20次，酵母的生產(chǎn)活性將下降，反應(yīng)時(shí)間將超過10小時(shí)，導(dǎo)致生產(chǎn)效率降低。因此，利用上述相同方法每20次進(jìn)行固定化酵母的活化。結(jié)果，盡管固定化酵母已經(jīng)反復(fù)用于催化反應(yīng)100次，酵母的活性也沒有下降。
進(jìn)行左旋二酮的純化方法是，用所得溶液與所萃取的洗滌溶液的混合物結(jié)晶左旋二酮。所得混合物用超濾法過濾，過濾面積為5m2。流速設(shè)為250升/小時(shí)。以200升/小時(shí)速率將濾液上200升柱子，柱子裝有150升疏水性吸附樹脂SEPABEADS SP-850(Mitsubishi Chemical Co.，Tokyo，Japan)，以吸附左旋二酮、酮基異佛爾酮和副產(chǎn)物，例如actinol。一次吸附操作使用3000升濾液。將在柱子內(nèi)吸附了左旋二酮、酮基異佛爾酮和副產(chǎn)物的樹脂加熱至50℃，以200升/小時(shí)速率向柱子中加入預(yù)加熱至50℃的甲醇溶液，以洗脫左旋二酮、酮基異佛爾酮和副產(chǎn)物。一次洗脫操作使用200升甲醇。將含有左旋二酮、酮基異佛爾酮和副產(chǎn)物的甲醇溶液用濃縮器在60℃減壓下濃縮6倍。將含有左旋二酮、酮基異佛爾酮和副產(chǎn)物的濃縮液冷卻至5℃，在該溫度下保持12小時(shí)以上，以結(jié)晶左旋二酮。將殘留的酮基異佛爾酮和副產(chǎn)物溶于甲醇。過濾收集所結(jié)晶的左旋二酮，用甲醇洗滌，以除去表面的酮基異佛爾酮和副產(chǎn)物，然后干燥。從而完成生產(chǎn)過程，得到純度超過99％的左旋二酮晶體。
利用上述方法，重復(fù)生產(chǎn)左旋二酮的反應(yīng)100次。生產(chǎn)了約500kg左旋二酮，總產(chǎn)率基于所用酮基異佛爾酮來說，約為70％，純度超過99％。
實(shí)施例4固定化形式酵母的左旋二酮生產(chǎn)率的評價(jià)進(jìn)行發(fā)面酵母與魯氏糖酵母(魯氏接合糖酵母)HUT 7191(IFO 0494)的左旋二酮生產(chǎn)率對比，后者在自由細(xì)胞條件下具有非常高的生產(chǎn)左旋二酮的能力，其中兩種酵母都處于固定化狀態(tài)。
測量固定化酵母的活性的方法如下利用實(shí)施例1所述相同方法制備固定化酵母，進(jìn)行活化。將酮基異佛爾酮和葡萄糖溶于離子交換水，最終濃度分別為10g/l和50g/l，pH調(diào)為4.5。將固定化酵母(30g)懸浮在提前制備的酮基異佛爾酮和葡萄糖混合物(30ml)中，在30℃下引發(fā)反應(yīng)。當(dāng)酮基異佛爾酮已被耗盡時(shí)，反應(yīng)完成。用氣相色譜法分析反應(yīng)溶液中的左旋二酮濃度，然后從這些結(jié)果評價(jià)每種酵母的左旋二酮生產(chǎn)率(g左旋二酮/kg酵母/小時(shí))，如下所示
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)(6R)-2，2，6-三甲基環(huán)己烷-1，4-二酮的方法，其特征在于使2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮與至少一種酵母接觸，該酵母能夠?qū)?，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮轉(zhuǎn)化為(6R)-2，2，6-三甲基環(huán)己烷-1，4-二酮，選自戴耳克氏糖酵母(單孢糖酵母、戴耳克氏圓孢酵母)、魏萊氏糖酵母、拜列氏接合糖酵母和熱帶假絲酵母，和這些種類的功能等價(jià)物、次代培養(yǎng)物、突變體和變種，接觸是在水、水可混溶性有機(jī)溶劑或水與所述水可混溶性有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行的，其中含有至少一種可同化的碳源，然后在反應(yīng)完成后從反應(yīng)介質(zhì)中分離所得(6R)-2，2，6-三甲基環(huán)己烷-1，4-二酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于該酵母選自戴耳克氏糖酵母HUT 7116(單孢糖酵母IFO 0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳克氏圓孢酵母)HUT7102、魏萊氏糖酵母HUT 7106、拜列氏接合糖酵母ATCC 11486和熱帶假絲酵母IFO 1403，及其功能等價(jià)物、次代培養(yǎng)物、突變體和變種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)的方法，其特征在于所用酵母在用于該方法之前預(yù)先通過在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)行制備，培養(yǎng)基含有一種可同化的碳源、一種可同化的氮源、無機(jī)鹽等，然后從培養(yǎng)基中分離酵母細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)的方法，其特征在于在該方法中用于生產(chǎn)(6R)-2，2，6-三甲基環(huán)己烷-1，4-二酮的酵母是通過截留法得到的固定化酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于得到該固定化酵母的截留法使用的是疏水性可光致交聯(lián)的樹脂作為載體，該樹脂每分子具有至少兩個(gè)不飽和烯鍵，通過照射發(fā)生聚合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)的方法，其特征在于2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮與該酵母的接觸是在20至40℃的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選為25至30℃，在3.0至6.0的pH下，優(yōu)選為4.0至5.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任意一項(xiàng)的方法，其特征在于它是利用流化床反應(yīng)釜或固定床反應(yīng)釜進(jìn)行的。
全文摘要
生產(chǎn)(6R)－2，2，6－三甲基環(huán)己烷－1，4－二酮(左旋二酮)的方法，包括使2，6，6－三甲基－2－環(huán)己烯－1，4－二酮與至少一種能夠?qū)?，6，6－三甲基－2－環(huán)己烯－1，4－二酮轉(zhuǎn)化為(6R)－2，2，6－三甲基環(huán)己烷－1，4－二酮的酵母接觸，該酵母選自說明書所述的種類。接觸是在水、水可混溶性有機(jī)溶劑或水與所述水可混溶性有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行的，其中含有至少一種可同化的碳源。在反應(yīng)完成后從反應(yīng)介質(zhì)中分離所得(6R)－2，2，6－三甲基環(huán)己烷－1，4－二酮。左旋二酮是一種有用的中間體，用于類胡蘿卜素、特別是(3R，3’R)－玉米黃質(zhì)的制備。
文檔編號C12P41/00GK1661025SQ200410102099
公開日2005年8月31日 申請日期2000年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月2日
發(fā)明者福岡正束, 平賀光暉, 關(guān)原達(dá) 申請人:Dsm Ip資產(chǎn)公司