專利名稱：動物細胞的微型化培養(yǎng)器的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種動物細胞的微型化培養(yǎng)器。
背景技術：
現(xiàn)有的藥物藥理毒理研究基于動物模型、體外原代細胞模型和連續(xù)細胞系模型三種。動物模型有實驗周期長，效率低，個體差異大導致結果偏差過大，不利于動物保護等缺點，而不可消除種屬差異，是動物模型致命的弱點。連續(xù)細胞系雖然培養(yǎng)方式簡單，效率高成本低，但連續(xù)細胞系與原代培養(yǎng)細胞在結構和功能上仍有較大差別，并不能完全體現(xiàn)藥物在人體或動物體內的代謝和毒性作用。
目前，國內外研究者開始重視體外原代細胞模型在藥物研究上的應用。它所需細胞量少，可能從根本上消除種屬差異和個體差異，干擾因素小，所得的結果重復性好。用于藥物研究的體外細胞模型主要有孔板培養(yǎng)和平皿培養(yǎng)等，此種二維的方式雖然操作簡單，但保持細胞活性時間短，細胞功能易喪失，不能很好的模擬體內細胞的結構和功能，這些缺陷使其應用受到了限制。而三維培養(yǎng)方式，如中空纖維生物人工肝反應器，雖能較長時間保持細胞功能，模擬肝臟環(huán)境，但結構復雜，需要有多路供氧和培養(yǎng)基循環(huán)，體積龐大，成本也相當高，顯然不適用于需要小型化的藥物代謝研究和高通量的藥物篩選。
同時，實驗室研究細胞培養(yǎng)條件和生產細胞代謝產物，需要一種小型化，適合進行條件實驗、優(yōu)化、篩選的裝置。而工業(yè)生產用的大型中空纖維反應器顯然無法滿足這個要求。如果能找到一種既操作簡單，又容易放大的培養(yǎng)方式，對于動物細胞工業(yè)化生產的前期研究有一定的意義。

發(fā)明內容
為了克服現(xiàn)有的藥物研究模型的不足，從生物人工肝反應器和人工器官得到啟發(fā)，本實用新型的目的在于提供一種動物細胞的微型化培養(yǎng)器，大大簡化了一般反應器所需的結構和操作，以三維培養(yǎng)的方式達到仿生學效果，并能長期維持動物細胞功能。
本實用新型解決其技術問題所采用的技術方案是包括硅膠管，硅膠塞，1根以上的中空纖維絲；中空纖維絲裝在硅膠管中，硅膠管兩頭用硅膠塞封口。
所說的硅膠管和硅膠塞材料為傳氧硅膠材料。
所說的中空纖維絲的材料是其截留分子量在100KDa～1000KDa的聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈或聚乙烯；中空纖維絲中空纖維絲為1-100根。
所說的微型化培養(yǎng)器的體積為0.1ml-10ml。
本實用新型具有的有益的效果是能對動物細胞進行長期三維培養(yǎng)，保持了動物細胞的生物活性，一是作為藥物代謝和藥理毒理的研究的動物肝細胞體外模型，二是用于細胞培養(yǎng)條件和產物生產的實驗室研究。并且可作為動物細胞培養(yǎng)條件研究的載體，為工業(yè)化生產奠定基礎。


圖1是本實用新型的結構示意圖；圖2是實施例3的白蛋白和尿素產量曲線。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本實用新型作進一步說明。
如附圖1所示，本實用新型包括硅膠管1，硅膠塞2，1根以上的中空纖維絲3；中空纖維絲3裝在硅膠管1中，硅膠管1兩頭用硅膠塞2封口。
具體實施例1(微型化培養(yǎng)器和平皿培養(yǎng)的比較)硅膠管1長13cm，內徑0.8cm，外徑1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚丙烯腈材質，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量為1000KDa。
將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
將同批大鼠肝細胞按0.8×106cells/ml接入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，在鋪有鼠尾膠原的平皿培養(yǎng)。培養(yǎng)條件與上述相同。
待平皿中細胞貼壁后(12-18h)，在微型化培養(yǎng)器和平皿中分別加入含待測藥物10mM醋氨酚培養(yǎng)基和不含藥物培養(yǎng)基(作為空白對照)。其后每60h更換新的培養(yǎng)基。
各重復三組，測定肝功能指標尿素和白蛋白，觀察細胞形態(tài)。
結果如下表1所示。
表1

由上表可見，大鼠肝細胞在微型化培養(yǎng)器內的存活狀態(tài)比平皿單層培養(yǎng)良好，且微型化培養(yǎng)器組對肝毒性藥物醋氨酚的反應比平皿組更顯著，說明了微型化培養(yǎng)器比平皿更適用于藥物毒性研究。
一般多孔板常被用做細胞體外的載體，而多孔板培養(yǎng)與平皿培養(yǎng)都是二維的單層培養(yǎng)方式，有很多的共同點。因此，實驗發(fā)現(xiàn)微型化培養(yǎng)器培養(yǎng)細胞比平皿更優(yōu)越，也可說明本實用新型與多孔板的差異。
具體實施例2(微型化培養(yǎng)器用于藥物代謝的研究)硅膠管1長13cm，內徑0.8cm，1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚砜材質，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量為1000KDa。
將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
將同批大鼠肝細胞按0.8×106cells/ml接入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，在鋪有鼠尾膠原的平皿培養(yǎng)。培養(yǎng)條件與上述相同。
培養(yǎng)60h后，各組加入約40uM的非那西丁溶液，經(jīng)過3h的藥物代謝，HPLC法測定非那西丁和代謝產物醋氨酚的含量。結果如表2所示表2

由上表可見，大鼠肝細胞在微型化培養(yǎng)器內代謝非那西丁的能力高于平皿培養(yǎng)細胞，說明細胞色素P450活性比平皿單層培養(yǎng)良好，因此微型化培養(yǎng)器比平皿更適用于藥物代謝研究。
具體實施例3(微型化培養(yǎng)器用于藥物肝毒性的研究)硅膠管1長13cm，內徑0.8cm，外徑1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚砜材質，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量為1000KDa。
將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
培養(yǎng)12-18h后，各組分別換入含藥物濃度為利福平10mg/ml，異煙肼15mg/ml的培養(yǎng)基和不含藥物的培養(yǎng)基，每24h取樣一次，每60h換培養(yǎng)基一次。重復三次，測定樣品的尿素和白蛋白產量。結果如附圖2所示，白蛋白生成量隨時間變化曲線(左)，尿素產量隨時間變化曲線(右)。
由圖可見，該濃度的利福平和異煙肼作用下，白蛋白和尿素的產量均低于空白對照組，因此藥物對大鼠肝細胞有損傷作用，從而導致細胞肝功能的部分喪失。說明了本實用新型用于肝毒性藥物研究的可行性。
具體實施例4(微型化培養(yǎng)器用于連續(xù)細胞株的培養(yǎng))硅膠管1長13cm，內徑0.8cm，1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚丙烯材質，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量分別為30KD和100KD。
將小鼠成纖維細胞L929按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入如上所述的兩種中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管身1，加入5ml含10％小牛血清1640培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
L929細胞在截留分子量100KD的微型化培養(yǎng)器內的生長情況(細胞增殖數(shù)量)優(yōu)于相同材質的截留分子量30KD。從而篩選得到100KD聚砜中空纖維絲適合用于細胞培養(yǎng)。
具體實施例5(微型化培養(yǎng)器用于保肝藥物的篩選)硅膠管1長13cm，內徑0.8cm，外徑1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚砜材質，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量為1000KDa。
將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
培養(yǎng)12-18h后，各組分別換入含藥物濃度為10mM醋氨酚培養(yǎng)基、10mM醋氨酚+4mM谷胱甘肽、10mM醋氨酚+4mM N-乙酰半胱氨酸、10mM醋氨酚+4mM半胱氨酸和不含藥物培養(yǎng)基(作為空白對照)。
24h后觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)10mM醋氨酚+4mM谷胱甘肽組的細胞活率較高。即從三種待選的保肝藥物中篩選得到谷胱甘肽對醋氨酚的藥物性肝損有保護作用。這是本實用新型用于保肝藥物篩選的一例。
權利要求1.一種動物細胞的微型化培養(yǎng)器，其特征在于包括硅膠管(1)，硅膠塞(2)，1根以上的中空纖維絲(3)；中空纖維絲(3)裝在硅膠管(1)中，硅膠管(1)兩頭用硅膠塞(2)封口。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種動物細胞的微型化培養(yǎng)器，其特征在于所說的硅膠管(1)和硅膠塞(2)材料為傳氧硅膠材料。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種動物細胞的微型化培養(yǎng)器，其特征在于所說的中空纖維絲的材料是其截留分子量在100KDa-1000KDa的聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈或聚乙烯；中空纖維絲(3)為1-100根。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種動物細胞的微型化培養(yǎng)器，其特征在于所說的微型化培養(yǎng)器的體積為0.1ml-10ml。
專利摘要本實用新型公開了一種動物細胞的微型化培養(yǎng)器，它是由透氣硅膠材料的硅膠管，透氣硅膠塞和中空纖維絲組成。將細胞用膠原凝膠包埋在中空纖維絲內，因動物細胞的征微化培養(yǎng)器有適合細胞生存的傳氧和傳質能力，保持了細胞的藥物代謝等功能。它結合了孔板的微型化優(yōu)勢和人工肝反應器的三維仿生培養(yǎng)優(yōu)勢，保持了動物細胞的生物活性，一是作為藥物代謝和藥理毒理的研究的動物肝細胞體外模型，二是用于細胞培養(yǎng)條件和產物生產的實驗室研究。并且可作為動物細胞培養(yǎng)條件研究的載體，為工業(yè)化生產奠定基礎。
文檔編號C12M3/00GK2760041SQ200420081459

公開日2006年2月22日 申請日期2004年8月1日 優(yōu)先權日2004年8月1日
發(fā)明者孟琴, 沈沖 申請人:浙江大學