專(zhuān)利名稱(chēng)：可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及的是一種可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片。
背景技術(shù)：
自1992年Adam提出表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，EST)概念(Nature，355，642-644)和多種模式生物基因組測(cè)序的完成以及生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的抗蟲(chóng)、抗除草劑基因通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)克隆到相應(yīng)的植物中，并產(chǎn)生了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物，象轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花、油菜和番茄等。但由于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的潛在風(fēng)險(xiǎn)，以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其產(chǎn)品的越境轉(zhuǎn)移等問(wèn)題，各國(guó)相應(yīng)地制訂了轉(zhuǎn)基因食品安全的相關(guān)法律或法規(guī)。為保護(hù)廣大消費(fèi)者的權(quán)益，滿(mǎn)足其選擇權(quán)、知情權(quán)以及出于國(guó)際貿(mào)易的需要，轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)越來(lái)越引起各國(guó)政府和有關(guān)食品監(jiān)督機(jī)構(gòu)的重視。但是由于基因重組技術(shù)的復(fù)雜性和多樣性，給轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)帶來(lái)了很大的困難，因此建立國(guó)際間標(biāo)準(zhǔn)的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，已成為各國(guó)政府和研究者亟待解決的問(wèn)題。
1995年10月Patrick Brown和他的同事(Bio Techniques，19(1995)，442-447)提出了cDNA微陣列技術(shù)，M.Schena(Science 1995；270(5235)，467-470)和D.Shalon(Genome Research 1996；6(7)，639-645)等首次制造了cDNA陣列，隨后這項(xiàng)技術(shù)得到了飛速的發(fā)展。目前DNA芯片因具有強(qiáng)有力性、靈活性、敏感性和相對(duì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)而被應(yīng)用在許多領(lǐng)域，如DNA序列測(cè)定、基因多態(tài)性檢測(cè)、新基因的發(fā)現(xiàn)、疫苗和藥物研究(M.J.Cunningham et al.，J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 2000；44，291-300)、植物的抗逆性研究(P.M.Schenk，et al.，PNAS 2000；9711655-11660)。
用于制備DNA芯片(DNA陣列)的已知方法包括，例如，一種方法，在該方法中在芯片的固相上的預(yù)先確定的位置合成了一種單鏈的DNA，還包括另一種方法，在該方法中在芯片的各項(xiàng)上的預(yù)先確定的位置上定位有一種事先制備的單鏈或者雙鏈DNA。對(duì)于上述的高密度寡核苷酸陣列，需要一種用于高密度固相合成的大型設(shè)備。進(jìn)一步，合成一種該方法的長(zhǎng)核苷酸鏈由于其合成產(chǎn)量而十分困難。對(duì)于具有被定位的雙鏈DNA的樣點(diǎn)陣列，一個(gè)將固定化于DNA芯片的雙鏈DNA變性成為單鏈DNA的步驟是必不可少的，這復(fù)雜化了分析過(guò)程。對(duì)于具有被定位的單鏈DNA的樣點(diǎn)陣列，需要在將其固定化于固相之前從雙鏈DNA制備單鏈DNA，這復(fù)雜化了該芯片的制備過(guò)程。如上所述，傳統(tǒng)的DNA芯片和制備這樣的DNA芯片的傳統(tǒng)方法存在諸多問(wèn)題。
另外，提供在其上排列和固定化有一些含有開(kāi)放讀碼框(此后稱(chēng)為ORF)的DNA以在一種生物體的全基因水平上測(cè)定基因表達(dá)模式或者基因產(chǎn)物的功能的DNA芯片是需要的。但是，排列和固定化有不同鏈長(zhǎng)度的DNA的DNA芯片存在一些問(wèn)題，例如，微弱的雜交信號(hào)以及短DNA的低固定化速度。因此，提供產(chǎn)生高固定化速度和強(qiáng)雜交信號(hào)的DNA芯片是需要的。
在生物學(xué)領(lǐng)域中所涉及的基因芯片技術(shù)，是一種同時(shí)將大量的探針?lè)肿庸潭ǖ焦滔嘀С治锷?，借助核酸分子雜交配對(duì)的特性對(duì)DNA樣品的效率信息進(jìn)行高效的解讀和分析的方法。這類(lèi)技術(shù)在對(duì)基因表達(dá)譜的分析、突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因測(cè)序和基因組文庫(kù)作圖等方面已有應(yīng)用的報(bào)道。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)將外源基因?qū)胩烊晦r(nóng)作物遺傳基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)其原有基因進(jìn)行改造，以期得到能增加營(yíng)養(yǎng)成分含量、提高抗逆性等改良和優(yōu)化性狀的農(nóng)作物新品種，并進(jìn)而提高以其為原料的食品在相應(yīng)方面的品質(zhì)和/或功能，目前已在進(jìn)行廣泛的研究和應(yīng)用。與此同時(shí)，對(duì)這類(lèi)通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到的植物和/或以其為原料的食品的使用安全性問(wèn)題也日益引起了人們的關(guān)注。因此，如何通過(guò)植物檢疫的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行判斷和鑒定的問(wèn)題，也相應(yīng)提出并正在研究和探索之中。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是提供一種可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片。
它是在平面型支撐載體的平面上被覆有帶正電荷材料的膜，在該膜層的表面設(shè)有點(diǎn)陣，在點(diǎn)陣上排布有如下供轉(zhuǎn)基因植物判斷用的外源基因探針1)35S啟動(dòng)子，2)FMV35S啟動(dòng)子，3)Nos終止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。
所說(shuō)的點(diǎn)陣為排布的凹窩狀結(jié)構(gòu)，點(diǎn)陣之間保持有空間間隔，所說(shuō)的各供轉(zhuǎn)基因植物判斷用的外源基因探針?lè)謩e被覆于各凹窩狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。帶正電荷材料的膜層為聚賴(lài)氨酸材料或氨基硅烷材料膜層。平面型支撐載體為玻片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)1)本實(shí)用新型能夠同時(shí)檢測(cè)包括1)35S啟動(dòng)子，2)FMV35S啟動(dòng)子，3)Nos終止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段的一個(gè)或幾個(gè)基因。2)本實(shí)用新型采用長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸的單鏈寡核苷酸進(jìn)行點(diǎn)制19種外源基因探針的，同時(shí)每種外源基因設(shè)置三種濃度，每種濃度重復(fù)點(diǎn)制三次，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。


圖1是本實(shí)用新型可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片的一種結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本實(shí)用新型可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片圖1的方陣結(jié)構(gòu)放大示意圖。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片，其結(jié)構(gòu)是在平面型支撐載體的平面上被覆有帶正電荷材料的膜層，在該膜層的表面以點(diǎn)陣方式排布有轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)用的外源基因探針。其中所說(shuō)的該平面型支撐載體，可以采用目前同類(lèi)技術(shù)中已有使用的玻璃片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜等材料制成的片狀支持基體中的一種。該平面型支撐載體上被覆的帶正電荷材料的膜層，可以為聚賴(lài)氨酸材料或氨基硅烷材料等膜層中的一種。以點(diǎn)陣方式排布于該膜層表面處的供轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品用的外源基因探針，可以采用平面附著的方式位于所說(shuō)的該帶正電荷的材料膜層的表面，也可以使所說(shuō)的帶正電荷材料的每次表面具有按點(diǎn)陣形式排布的凹窩狀結(jié)構(gòu)，所說(shuō)的各供轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)用的外源基因探針以被覆于各凹窩狀結(jié)構(gòu)內(nèi)凹表面的形式，或者以其它需要或適當(dāng)?shù)男问椒謩e位于各凹窩狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。根據(jù)使用目的和/或領(lǐng)域的不同，所說(shuō)的以點(diǎn)陣方式排布的供轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)用的外源基因探針可以集中于所說(shuō)的帶正電荷材料膜層的一個(gè)區(qū)域內(nèi)，也可以使各點(diǎn)陣方式排布的供轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)用的外源基因探針為分布在所說(shuō)的該帶正電荷材料膜層表面處保持有空間間隔距離的復(fù)數(shù)個(gè)區(qū)域內(nèi)的形式。
由于目前在植物轉(zhuǎn)化方面通常采用的一種方法，是以根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒作載體，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙子葉植物，如大豆、棉花、番茄等農(nóng)作物。另一種方法是直接采用質(zhì)粒載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化單子葉植物，如玉米、水稻等糧食作物。無(wú)論采用哪種方法，植物轉(zhuǎn)化載體必須包含選擇標(biāo)記基因，如氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。報(bào)告基因，如GUS基因、GFP基因等，以及適用于植物的基因啟動(dòng)子，如植物病毒35S RNA基因的啟動(dòng)子等基本要素，這些序列隨同被轉(zhuǎn)化、整合到轉(zhuǎn)基因植株的染色體上。由于在植物轉(zhuǎn)化中所用的標(biāo)記基因數(shù)目有限，且都已成為一些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，故而通過(guò)檢測(cè)在植株中是否存在有這些外來(lái)的基因序列(DNA序列)，原則上也就能鑒定該植株是天然的，還是轉(zhuǎn)基因植株。因此，在上述的用于轉(zhuǎn)基因鑒定的基因檢測(cè)芯片中，所說(shuō)的供轉(zhuǎn)基因植物判斷用的外源基因探針可以包括氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、GUS基因、綠色熒光素基因(GFS)、35SRNA啟動(dòng)子DNA序列、根癌農(nóng)桿菌Nos基因終止子DNA序列等。這些基因可廣泛應(yīng)用于水稻、大豆、煙草、番茄、棉花等轉(zhuǎn)基因植物。使用本實(shí)用新型上述結(jié)構(gòu)形式的基因檢測(cè)芯片可以實(shí)現(xiàn)對(duì)上述多種轉(zhuǎn)基因的外源性基因作出快速、準(zhǔn)確和定性的判斷分析。
如圖1所示的可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片中，在常用的玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜的平面型支撐載體1的平面上，被覆有帶正電荷材料的膜層2、該帶正電荷材料的膜層可以為聚賴(lài)氨酸材料或氨基硅烷材料膜層中的一種。在該膜層2的表面上以平面附著的點(diǎn)陣方式排布有供多種轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行判斷用的外源基因探針，這些探針包括1)35S啟動(dòng)子，2)FMV35S啟動(dòng)子，3)Nos終止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因。該點(diǎn)陣方式排布是每個(gè)外源基因探針集中于該帶正電荷材料膜層2表面處的一個(gè)區(qū)域內(nèi)的形式。也可以將多個(gè)以點(diǎn)陣方式排布的外源基因探針?lè)謩e以保持有空間間隔距離的的形式分布在該帶正電荷材料膜層2的表面處復(fù)數(shù)個(gè)不同區(qū)域內(nèi)的形式。
圖2所示的可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片在結(jié)構(gòu)是圖1的一個(gè)方陣的結(jié)構(gòu)放大示意圖，所說(shuō)的該帶正電荷材料的膜層2的表面處具有按點(diǎn)陣形式排布的凹窩狀結(jié)構(gòu)4，所說(shuō)的供轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)用的各外源基因探針?lè)謩e以被覆于相應(yīng)各凹窩狀結(jié)構(gòu)4內(nèi)凹表面處的形式，或以其它所需要或適當(dāng)?shù)姆绞皆O(shè)置位于各凹窩狀結(jié)構(gòu)4內(nèi)。每個(gè)外源基因探針以三種不同的濃度點(diǎn)制，每種濃度重復(fù)3或多次。
具體制備方法
(一)可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片的制備將預(yù)先合成好的單鏈寡核苷酸片段(長(zhǎng)度大于50bp)(由上海生工生物工程公司合成)稀釋成濃度為0.2μg/μl，按照實(shí)驗(yàn)要求將各種濃度、各種不同基因的單鏈寡核苷酸片段排列于96孔PCR板中，用于生物芯片的點(diǎn)制；這些基因包括1)35S啟動(dòng)子，2)FMV-35S啟動(dòng)子，3)Nos終止子，4)NPT II基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因。該19個(gè)基因均在互聯(lián)網(wǎng)上公開(kāi)，詳見(jiàn)http//www/ncbi.nlm.nih.gov。生物芯片由arrayer(Genomic Solution，USA)機(jī)器手，使用直徑為0.4mm的96針點(diǎn)制，生物芯片載體為尼龍膜(Millipore NylonN+)，所有的點(diǎn)點(diǎn)制為36×24的一級(jí)方陣，每種基因的三種不同濃度在3×3的二級(jí)陣中平行三次重復(fù)以驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性。
(二)分子雜交及信號(hào)檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增產(chǎn)物約5μg 100℃煮沸5min進(jìn)行變性后，直接放入冰上冷卻3-5min，以備探針雜交用；將檢測(cè)用生物芯片用0.25M的磷酸緩沖液(pH7.2)進(jìn)行潤(rùn)濕后，加入預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，1mmol/L EDTA，pH8.0，7％SDS，1％BSA)，60℃進(jìn)行預(yù)雜交1-2小時(shí)；接著加入制備好的5μg變性探針DNA(該探針未進(jìn)行任何標(biāo)記，如同位素、生物素等)，60℃進(jìn)行雜交10-12小時(shí)；用洗膜液I(2×SSC(0.3mol/L NaCl，0.03mol/L檸檬酸鈉，pH7.0)，0.1％SDS)洗滌2次，每次20min；用洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)洗滌15min；將芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液(10mmo/L Tris.Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))中染色5-10min；用TE緩沖液漂洗5-10min，重復(fù)2次；在254nm紫外光下或熒光顯微鏡下進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。
權(quán)利要求1.一種可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片，其特征在于，在平面型支撐載體(1)的平面上被覆有帶正電荷材料的膜(2)，在該膜層的表面設(shè)有點(diǎn)陣(3)，在點(diǎn)陣(3)上排布有如下供轉(zhuǎn)基因植物判斷用的外源基因探針1)35S啟動(dòng)子，2)FMV35S啟動(dòng)子，3)Nos終止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。
2.如權(quán)利要求1所述的一種可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片，其特征在于所說(shuō)的點(diǎn)陣(3)為排布的凹窩狀結(jié)構(gòu)(4)，點(diǎn)陣(3)之間保持有空間間隔，所說(shuō)的各供轉(zhuǎn)基因植物判斷用的外源基因探針?lè)謩e被覆于各凹窩狀結(jié)構(gòu)(4)內(nèi)。
3.如權(quán)利要求1所述的一種可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片，其特征在于所說(shuō)的帶正電荷材料的膜層(2)為聚賴(lài)氨酸材料或氨基硅烷材料膜層。
4.如權(quán)利要求1所述的一種可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片，其特征在于所說(shuō)的平面型支撐載體(1)為玻片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
專(zhuān)利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的基因芯片。它是在平面型支撐載體的平面上被覆有帶正電荷材料的膜層，在該膜層的表面以點(diǎn)陣方式排布有供轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)用的外源基因探針，這些外源基因探針包括1)35S啟動(dòng)子，2)FMV－35S啟動(dòng)子，3)Nos終止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4－EPSPS基因，8)35s－CTP2，9)CP4－EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因。該實(shí)用新型使用方便，操作簡(jiǎn)單，具有快速、特異、敏感、準(zhǔn)確、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，因而具鑒別診斷價(jià)值，且便于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK2782697SQ20042011435
公開(kāi)日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者李德葆, 駱紅梅, 戴承恩, 姜玉新, 董海濤 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)