專(zhuān)利名稱(chēng)：液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法和檢測(cè)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠以高靈敏度迅速而容易地檢測(cè)那些采用通常的ATP法難以對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)的固體食品、牛奶、乳制品等，含有大量游離ATP(體細(xì)胞ATP)的食品、水、化妝品等液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法和檢測(cè)裝置。
背景技術(shù)：
食品等中的微生物的檢測(cè)一般采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂平板法，但該方法直到能夠檢測(cè)為止需要24～48小時(shí)的所謂的較長(zhǎng)的時(shí)間，因而發(fā)生微生物污染時(shí)，無(wú)法采取迅速的對(duì)策。此外，作為更簡(jiǎn)便而迅速的微生物檢出方法，已知有使用光度計(jì)測(cè)定發(fā)光量來(lái)檢測(cè)微生物中的三磷酸腺苷(ATP)的量，從而計(jì)算出微生物數(shù)的生物發(fā)光法(ATP法)。但是，該方法對(duì)于微生物數(shù)少的檢體液的情況，例如，微生物數(shù)103～104個(gè)/ml以下在光度計(jì)的檢測(cè)限以下就無(wú)法被檢出。
另一方面，幾乎所有的食品都含有非微生物來(lái)源的游離ATP，該游離ATP濃度很多情況會(huì)比來(lái)自微生物的ATP濃度高好幾個(gè)數(shù)量級(jí)，如果不預(yù)先排除這一障礙，具有出現(xiàn)無(wú)法正確檢測(cè)微生物中的ATP的問(wèn)題。為解決這些問(wèn)題，提出了過(guò)濾檢體液或使用作為ATP分解酶的三磷酸腺苷雙磷酸酶等預(yù)先將非微生物來(lái)源的游離ATP分解后再使用ATP法的方法。
但是為了使游離ATP在短時(shí)間內(nèi)分解，檢測(cè)試樣中的ATP分解酶的濃度必須充分高，該分解酶的濃度過(guò)高時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生后續(xù)工序中抑制來(lái)自所提取的微生物的ATP的發(fā)光，檢測(cè)濃度顯著下降的問(wèn)題。
此外，也提出了過(guò)濾檢體液，在過(guò)濾材料上捕捉其中含有的微生物，洗流過(guò)濾材料和附著在過(guò)濾材料上的微生物的ATP分解試劑以提甲亞砜的滅菌蒸餾水。
DMSO作為溶菌劑很優(yōu)異，但滅菌蒸餾水中的DMSO的含有率過(guò)少，溶菌作用(ATP提取作用)也會(huì)急劇下降，且含有率過(guò)低會(huì)使發(fā)光量下降影響檢測(cè)。為此，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)作為溶菌劑使用含有約15容量％～約20容量％的DMSO的滅菌蒸餾水時(shí)能夠得到充分的溶菌作用，且不會(huì)降低發(fā)光量，在此認(rèn)知基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
這樣，制成一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，它能夠容易且迅速地從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，且無(wú)需熟練也可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求15的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為，作為過(guò)濾促進(jìn)劑使用乙二胺四乙酸(EDTA)的堿金屬鹽，反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸(CyDTA)的堿金屬鹽，乙二醇醚二胺四乙酸(GEDTA)的堿金屬鹽，二乙撐三胺五乙酸(DTPA)的堿金屬鹽，或氨基三乙酸(NTA)的堿金屬鹽。這里，作為堿金屬優(yōu)選鈉或鉀。
這些過(guò)濾促進(jìn)劑是一般作為螯合劑使用的化合物，但與凝集劑聯(lián)合使用時(shí)，一般為牛奶等液體試樣中含有的礦物質(zhì)如使鈣形成螯合物(水溶性)容易過(guò)濾。上述的過(guò)濾促進(jìn)劑的添加量根據(jù)使用的過(guò)濾促進(jìn)劑或液體試樣的種類(lèi)而不同，不能一概而論，一般來(lái)講每1ml液體試樣1mg～20mg就足夠了，當(dāng)過(guò)濾促進(jìn)劑為EDTA的鈉鹽時(shí)，每1ml市售牛奶1mg～20mg就足夠了。
權(quán)利要求16的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法或檢測(cè)裝為，固體試樣或高粘性試樣與凝集劑混合前添加滅菌蒸餾水后，進(jìn)行均化制成液體試樣。
本發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法不僅可應(yīng)用于象牛奶等這類(lèi)的最初就是液體的試樣，也可用于象食肉等的固體試樣中的微生物量的檢測(cè)。其時(shí)，添加滅菌蒸餾水后，進(jìn)行均化制成液體試樣。取微生物中的ATP的方法。但是該方法僅限用于容易過(guò)濾的食品試樣(醇飲料或調(diào)味料汁等)，像市售牛奶或乳制品那樣的、含有大量蛋白質(zhì)或脂質(zhì)、無(wú)脂肪固體成分的濁度高的試樣，由于過(guò)濾困難而不適用此法。
也提出了稀釋處理這種難以過(guò)濾的乳制品試樣，檢測(cè)其稀釋液中的微生物ATP的方法。在該方法中，采取試樣0.1ml，向其中加入處理液0.1ml，稀釋液0.7ml，ATP消除劑0.1ml進(jìn)行混合，從此混合物1.0ml中分取0.1ml到檢測(cè)試管放置30分鐘，然后添加發(fā)光試劑0.1ml，用光度計(jì)測(cè)定發(fā)光量。這種方法中，由于是檢測(cè)0.01ml的所謂極微量的試樣中的微生物ATP，發(fā)光量也極少。因此，如果試劑空白值不是比通常的發(fā)光量(RLU)50以下的低值，就無(wú)法得到正確的檢測(cè)結(jié)果。因此出現(xiàn)需要檢查所使用的處理液、稀釋液、提取劑、高靈敏度發(fā)光試劑有無(wú)污染等諸多問(wèn)題。
于是，本發(fā)明人在專(zhuān)利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了以下方法，即，將食品試樣與磷酸系凝集劑和乙二胺四乙酸鹽等過(guò)濾促進(jìn)劑混合，通過(guò)重力進(jìn)行自然過(guò)濾后，將濾液用膜濾器減壓過(guò)濾，捕捉濃縮濾膜上的試樣中的微生物，用洗滌液洗滌濾膜上的非微生物來(lái)源的游離ATP，將其除去后，向微生物中加入ATP提取試劑(溶菌劑)，向提取液中加入發(fā)光試劑，通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)生的發(fā)光量檢測(cè)食品中的微生物的方法。該方法能夠比以往的方法更顯著容易、迅速且高靈敏度地檢測(cè)微生物。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1特開(kāi)2003-284589號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題但是，上述專(zhuān)利文獻(xiàn)1所公開(kāi)的方法中，由于使用了磷酸系凝集劑，若非熟練技術(shù)人員，有時(shí)在凝集反應(yīng)時(shí)使蛋白質(zhì)和微生物無(wú)差別地凝集，造成了試樣中的微生物的損失，并且，提取ATP時(shí)磷酸系凝集劑覆蓋住了微生物而使溶菌劑難以奏效，必須使用大量洗滌液來(lái)清洗，這有可能成為檢查結(jié)果不穩(wěn)定的主要原因。
因而，本發(fā)明的課題是提供一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法及檢測(cè)裝置，它可以除去游離的ATP，容易而迅速地從捕捉的微生物中提取ATP并檢測(cè)所提取的ATP，完全無(wú)需用洗滌液清洗，或無(wú)需用大量洗滌液清洗，試樣中的微生物的損失少，而且無(wú)需熟練，可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
解決課題的手段權(quán)利要求1的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒具備以下構(gòu)成采集液體試樣的第1注射器，在上述第1注射器中使上述液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑，配有捕捉上述凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞并透過(guò)游離ATP(三磷酸腺苷)微生物的1次膜濾器并能安裝在上述第1注射器上的1次過(guò)濾器，配有捕捉上述微生物并透過(guò)上述游離ATP的2次膜濾器并能夠安裝在上述1次過(guò)濾器上的2次過(guò)濾器，能夠安裝在上述2次過(guò)濾器的前端的第2注射器，用于清洗上述2次膜濾器的洗滌液，溶解被上述2次膜濾器捕捉到的上述微生物并使ATP溶出的溶菌劑，收集上述溶出的ATP和溶菌劑的檢測(cè)用試管，和使上述溶出的ATP發(fā)光的發(fā)光試劑。
權(quán)利要求2的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒為在權(quán)利要求1的構(gòu)成中還具備用于測(cè)定發(fā)光量的光度計(jì)，和用于使上述檢測(cè)用試管的前端能夠到達(dá)上述光度計(jì)的發(fā)光檢測(cè)部而安裝在上述檢測(cè)用試管上的連接器。
權(quán)利要求3的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒為在權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的構(gòu)成中還配備有用于使過(guò)濾在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的過(guò)濾促進(jìn)劑，或使用預(yù)先混入了上述過(guò)濾促進(jìn)劑的物質(zhì)作為上述凝集劑。
權(quán)利要求4的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒為在權(quán)利要求1至權(quán)利要求3中任一項(xiàng)的構(gòu)成中，上述1次膜濾器和上述2次膜濾器分別組裝入上述1次過(guò)濾器和上述2次過(guò)濾器成為一體并在使用完畢后被棄去。
權(quán)利要求5的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法包括將液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑混合的工序，用1次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾以捕捉上述凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞并透過(guò)游離ATP(三磷酸腺苷)和微生物的工序，將濾液用具有比上述1次膜濾器更小孔徑的能捕捉上述微生物并透過(guò)上述游離ATP的2次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾使液體試樣中的微生物在2次膜濾器的濾膜上被捕捉濃縮的工序，和向該微生物中加入溶菌劑、向提取液中添加發(fā)光試劑，測(cè)定產(chǎn)生的發(fā)光量的工序。
權(quán)利要求6的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法為在權(quán)利要求5的構(gòu)成中，在將上述液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑進(jìn)行混合的工序后，或在同一工序中同時(shí)追加加入用于使過(guò)濾在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的過(guò)濾促進(jìn)劑的工序。
權(quán)利要求7的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置如下所述將液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑混合，用1次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾來(lái)捕捉上述凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞并透過(guò)游離ATP(三磷酸腺苷)和微生物，將濾液用具有比上述1次膜濾器更小孔徑的能捕捉上述微生物并透過(guò)上述游離ATP的2次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾使液體試樣中的微生物在2次膜濾器的濾膜上被捕捉濃縮，向該微生物中加入溶菌劑、向提取液中添加發(fā)光試劑，測(cè)定產(chǎn)生的發(fā)光量。
權(quán)利要求8的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置如下所述在權(quán)利要求7的構(gòu)成中，在將上述液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑進(jìn)行混合后或同時(shí)加入用于使過(guò)濾在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的過(guò)濾促進(jìn)劑。
權(quán)利要求9的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法或液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置為在權(quán)利要求1至權(quán)利要求4中任一項(xiàng)或權(quán)利要求5或權(quán)利要求6或權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的構(gòu)成中，上述凝集劑使用乙醇等脂肪醇，苯甲酸、水楊酸等羧酸，或殼聚糖，低聚殼聚糖。
權(quán)利要求10的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為在權(quán)利要求1至權(quán)利要求9中任一項(xiàng)的構(gòu)成中，上述1次膜濾器使用孔徑約1μm～約10μm的過(guò)濾材料。
權(quán)利要求11的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為在權(quán)利要求1至權(quán)利要求10中任一項(xiàng)的構(gòu)成中，上述2次膜濾器使用具有孔徑約0.1μm～約0.5μm的微細(xì)孔的多孔性高分子膜。
權(quán)利要求12的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為在權(quán)利要求11的構(gòu)成中，上述多孔性高分子膜由聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、乙酸纖維素、親水性聚丙烯、尼龍、親水性聚醚砜、或親水性硼硅酸玻璃纖維中的任意高分子構(gòu)成。
權(quán)利要求13的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為在權(quán)利要求1至權(quán)利要求12中任一項(xiàng)的構(gòu)成中，上述溶菌劑為含有二甲亞砜的滅菌蒸餾水。
權(quán)利要求14的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為在權(quán)利要求13的構(gòu)成中，上述溶菌劑為含有約15容量％～約20容量％的二甲亞砜的滅菌蒸餾水。
權(quán)利要求15的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為在權(quán)利要求3至權(quán)利要求14中任一項(xiàng)的構(gòu)成中，上述過(guò)濾促進(jìn)劑使用乙二胺四乙酸的堿金屬鹽，反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸的堿金屬鹽，乙二醇醚二胺四乙酸的堿金屬鹽，二乙撐三胺五乙酸的堿金屬鹽，或氨基三乙酸的堿金屬鹽。
權(quán)利要求16的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為在權(quán)利要求5至權(quán)利要求15中任一項(xiàng)的構(gòu)成中，將固體試樣或高粘性試樣在與上述凝集劑混合前添加滅菌蒸餾水后進(jìn)行均化制成上述液體試樣。
發(fā)明效果權(quán)利要求1的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒具備以下構(gòu)成采集液體試樣的第1注射器，在上述第1注射器中使上述液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑，配有能捕捉上述凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞并透過(guò)游離ATP(三磷酸腺苷)和微生物的1次膜濾器并能安裝在上述第1注射器前端的1次過(guò)濾器，配有能捕捉上述微生物并透過(guò)上述游離ATP的2次膜濾器并能夠安裝在上述1次過(guò)濾器前端的2次過(guò)濾器，能夠安裝在上述2次過(guò)濾器的前端的第2注射器，用于清洗上述2次膜濾器的洗滌液，溶解被上述2次膜濾器捕捉到的微生物并使ATP溶出的溶菌劑，收集上述溶出的ATP和溶菌劑的檢測(cè)用試管，和使上述溶出的ATP發(fā)光的發(fā)光試劑。
這樣，通過(guò)以在第1注射器的前端安裝1次過(guò)濾器，并在1次過(guò)濾器的前端安裝2次過(guò)濾器的狀態(tài)，在第1注射器中用凝集劑使液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集后從第1注射器中擠出液體試樣，使凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞(內(nèi)含ATP)被1次膜濾器捕捉，游離ATP透過(guò)1次膜濾器、2次膜濾器并從2次過(guò)濾器的前端被排出，只有微生物被2次膜濾器捕捉。此時(shí)，只取下2次過(guò)濾器，安裝在新的第1注射器或第2注射器的前端，押出洗滌液，充分洗滌2次膜濾器后，將溶菌劑吸入到第2注射器內(nèi)，將2次過(guò)濾器安裝在第2注射器的前端，注入溶菌劑使之反應(yīng)，溶解2次膜濾器捕捉到的微生物并使內(nèi)部的ATP溶出。
將如此僅提取出了來(lái)自微生物的ATP的試樣液收集到檢測(cè)用試管中加入發(fā)光試劑，測(cè)定發(fā)光量。由此，能夠在極短時(shí)間內(nèi)正確地檢測(cè)出液體試樣中的微生物量。并且由于微生物的損失少，因而能夠得到可靠性顯著高的檢查結(jié)果。并且，由于將這些必要的器具和試劑變成為試劑盒，裝入專(zhuān)用容器搬運(yùn)，即使在牧場(chǎng)或工廠(chǎng)、食品加工現(xiàn)場(chǎng)、化妝品開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)等也能夠在短時(shí)間內(nèi)容易地檢測(cè)微生物的量。
由此得到一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒，它能夠容易且迅速地除去游離ATP，從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，完全無(wú)需用洗滌液清洗或無(wú)需用大量洗滌液清洗，試樣中的微生物的損失少，且無(wú)需熟練也可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求2的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒為在權(quán)利要求1的構(gòu)成中還具備用于測(cè)定發(fā)光量的光度計(jì)，和用于使上述檢測(cè)用試管的前端能夠到達(dá)上述光度計(jì)的發(fā)光檢測(cè)部而安裝在上述檢測(cè)用試管上的連接器。
光度計(jì)為無(wú)需熟練、任何人在任何地方均可以容易且正確地測(cè)定發(fā)光量的檢測(cè)儀器，為使上述檢測(cè)用試管的前端能夠到達(dá)上述光度計(jì)的發(fā)光檢測(cè)部必須在上述檢測(cè)用試管上安裝連接器。通過(guò)向權(quán)利要求1的構(gòu)成中再加入上述裝置，就能夠在極短時(shí)間內(nèi)正確地檢測(cè)液體試樣中的微生物量。且微生物的損失少，就可以得到可靠性顯著高的檢查結(jié)果。并且，由于將這些必要的器具和試劑變成為試劑盒，裝入專(zhuān)用容器搬運(yùn)，即使在牧場(chǎng)或工、食品加工現(xiàn)場(chǎng)、化妝品開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)等也能夠在短時(shí)間內(nèi)容易地檢測(cè)微生物的量。
由此得到一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒，它能夠容易且迅速地除去游離ATP，從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，且無(wú)需熟練也可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求3的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒為在權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的構(gòu)成中還配備有用于使過(guò)濾在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的過(guò)濾促進(jìn)劑，或使用預(yù)先混入上述過(guò)濾促進(jìn)劑的物質(zhì)作為上述凝集劑。這里，過(guò)濾促進(jìn)劑可使用乙二胺四乙酸(EDTA)的鈉鹽等。通過(guò)用凝集劑使第1注射器中的液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集后，或與凝集劑同時(shí)加入過(guò)濾促進(jìn)劑，通過(guò)1次過(guò)濾器和2次過(guò)濾器即使是初學(xué)者也能在短時(shí)間內(nèi)順利地進(jìn)行過(guò)濾處理，且在極短時(shí)間內(nèi)正確地檢測(cè)出液體試樣中的微生物量。而且微生物的損失少，能夠得到可靠性顯著高的檢查結(jié)果。并且，由于將這些必要的器具和試劑變成為試劑盒，裝入專(zhuān)用容器搬運(yùn)，即使在牧場(chǎng)或工廠(chǎng)、食品加工現(xiàn)場(chǎng)、化妝品開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)等也能夠在短時(shí)間內(nèi)容易地檢測(cè)微生物的量。
由此獲得一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒，它能夠容易且迅速地除去游離ATP，從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，且無(wú)需熟練也可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求4的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒為上述1次膜濾器和上述2次膜濾器分別組裝入入上述1次過(guò)濾器和上述2次過(guò)濾器成為一體并在使用完畢后被棄去的試劑盒。這樣一來(lái)，節(jié)省了濾膜安裝在過(guò)濾器上或從過(guò)濾器上取下的繁瑣，可以更迅速地進(jìn)行檢測(cè)。并且，通過(guò)一次性使用隨后棄取，可以提高測(cè)定精度從而進(jìn)行可靠性高的測(cè)定。
從而制成一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒，它能夠容易且迅速地除去游離ATP，從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，完全無(wú)需用洗滌液清洗或無(wú)需用大量洗滌液清洗，試樣中的微生物的損失少，且無(wú)需熟練也可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求5的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法包括將液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑混合的工序，用1次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾以捕捉上述凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞并透過(guò)游離ATP(三磷酸腺苷)和微生物的工序，將濾液用具有比上述1次膜濾器更小孔徑的能捕捉上述微生物并透過(guò)上述游離ATP的2次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾使液體試樣中的微生物在2次膜濾器的濾膜上被捕捉濃縮的工序，和向該微生物中加入溶菌劑、向提取液中添加發(fā)光試劑，測(cè)定產(chǎn)生的發(fā)光量的工序。
因此，通過(guò)用凝集劑使液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集后用1次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾，再將濾液用2次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾，使凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞(內(nèi)含ATP)被1次膜濾器捕捉，游離ATP透過(guò)1次膜濾器、2次膜濾器被排出，只有微生物被2次膜濾器捕捉。此時(shí)，加入溶菌劑溶解被2次膜濾器捕捉到的微生物并使內(nèi)部的ATP溶出，添加發(fā)光試劑，通過(guò)測(cè)定產(chǎn)生的發(fā)光量能夠在極短時(shí)間內(nèi)正確地檢測(cè)液體試樣中的微生物量。且微生物的損失少，因而能夠得到可靠性顯著高的檢查結(jié)果。
此外，考慮到非微生物來(lái)源的游離ATP或其它的發(fā)光物質(zhì)以影響檢測(cè)的程度附著在2次膜濾器上的情況等，根據(jù)需要，也可以在加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾后加入用少量洗滌液清洗2次膜濾器。
由此實(shí)現(xiàn)一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法，它能夠容易且迅速地除去游離ATP，從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，完全無(wú)需用洗滌液清洗或無(wú)需用大量洗滌液清洗，試樣中的微生物的損失少，且無(wú)需熟練也可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求6的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法為在將上述液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑進(jìn)行混合的工序后，或中同時(shí)追加加入用于使過(guò)濾在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的過(guò)濾促進(jìn)劑的工序。即，作為凝集劑也可以使用預(yù)先添加了過(guò)濾促進(jìn)劑的物質(zhì)。這樣得到一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法，通過(guò)用凝集劑使液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集后或同時(shí)加入過(guò)濾促進(jìn)劑，采用1次膜濾器的加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾和采用2次膜濾器的加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾均可以在短時(shí)間內(nèi)順利地進(jìn)行，因此能夠在更短時(shí)間內(nèi)高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求7的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置如下所述將液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑混合，用1次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾來(lái)捕捉凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞并透過(guò)游離ATP和微生物，將濾液用具有比上述1次膜濾器更小孔徑的能捕捉微生物并透過(guò)游離ATP的2次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾使液體試樣中的微生物在2次膜濾器的濾膜上被捕捉濃縮，向該微生物中加入溶菌劑、向提取液中添加發(fā)光試劑，測(cè)定產(chǎn)生的發(fā)光量。
這樣，通過(guò)用凝集劑使液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集后用1次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾，再將濾液用2次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾，使凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞(內(nèi)含ATP)被1次膜濾器捕捉，游離ATP透過(guò)1次膜濾器、2次膜濾器被排出，只有微生物被2次膜濾器捕捉。此時(shí)，加入溶菌劑溶解被2次膜濾器捕捉到的微生物并使內(nèi)部的ATP溶出，添加發(fā)光試劑，通過(guò)測(cè)定產(chǎn)生的發(fā)光量就能夠在極短時(shí)間內(nèi)正確地檢測(cè)液體試樣中的微生物量。且微生物的損失少，因而能夠得到可靠性顯著高的檢查結(jié)果。
此外，考慮到非微生物來(lái)源的游離ATP或其它的發(fā)光物質(zhì)以影響檢測(cè)的程度附著在2次膜濾器上的情況等，根據(jù)需要，也可以在加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾后加入用少量洗滌液清洗2次膜濾器。
由此，得到一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置，它能夠容易且迅速地除去游離ATP，從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，完全無(wú)需用洗滌液清洗或無(wú)需用大量洗滌液清洗，試樣中的微生物的損失少，且無(wú)需熟練也可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求8的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置為在將上述液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑進(jìn)行混合后或同時(shí)加入用于使過(guò)濾在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的過(guò)濾促進(jìn)劑的裝置。即，作為凝集劑也可以使用預(yù)先添加過(guò)濾促進(jìn)劑的物質(zhì)。由此得到一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置，它通過(guò)在用凝集劑使液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集后或同時(shí)加入過(guò)濾促進(jìn)劑，使用1次膜濾器進(jìn)行的加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾以及用2次膜濾器進(jìn)行的加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾都能在短時(shí)間內(nèi)順利地進(jìn)行，因而能在更短的時(shí)間內(nèi)高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)出液體試樣中的微生物。
權(quán)利要求9的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為，作為凝集劑使用乙醇等脂肪醇，苯甲酸、水楊酸等羧酸，或殼聚糖，低聚殼聚糖。這些凝集劑僅選擇性使液體試樣中的蛋白質(zhì)凝固，此時(shí)微生物并不會(huì)凝固在其中，因而在檢測(cè)中能夠抑制微生物的損失使損失減少，并能夠在極短時(shí)間內(nèi)正確地檢測(cè)出液體試樣中的微生物量。
這樣，制成一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，它能夠容易且迅速地除去游離ATP，從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，完全無(wú)需用洗滌液清洗或無(wú)需用大量洗滌液清洗，試樣中的微生物的損失少，且無(wú)需熟練也可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求10的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為，作為1次膜濾器使用孔徑約1μm～約10μm的過(guò)濾材料。因而能夠確實(shí)地捕捉凝固的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞，且使微生物和游離ATP確實(shí)地透過(guò)，并能夠高精度地進(jìn)行微生物量的檢測(cè)。
權(quán)利要求11的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為，2次膜濾器是具有孔徑約0.1μm～約0.5μm的微細(xì)孔的多孔性高分子膜。因此，能只確實(shí)地捕捉微生物，且使游離ATP確實(shí)地透過(guò)，并能夠高精度地進(jìn)行微生物量的檢測(cè)。
權(quán)利要求12的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為，多孔性高分子膜是由聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、乙酸纖維素、親水性聚丙烯、尼龍、親水性聚醚砜、或親水性硼硅酸玻璃纖維中的任何高分子構(gòu)成的。
這些高分子構(gòu)成的多孔性高分子膜能只確實(shí)地捕捉微生物，且使游離ATP確實(shí)地透過(guò)，能夠高精度地進(jìn)行微生物量的檢測(cè)。
權(quán)利要求13的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置為，溶菌劑是含有二甲亞砜(以下也稱(chēng)“DMSO”)的滅菌蒸餾水。
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)作為溶菌劑使用表面活性劑系的化合物通過(guò)2次膜濾器時(shí)會(huì)發(fā)泡，不能順利進(jìn)行，使用有機(jī)溶劑系的化合物，尤其是DMSO的滅菌蒸餾水溶液時(shí)，可毫無(wú)問(wèn)題的作為溶菌劑使用，在此認(rèn)知基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
這樣，制成一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，它能夠容易且迅速地從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，且無(wú)需熟練也可以在食品生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)或化妝品等開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)檢查的、高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。
權(quán)利要求14的發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝為，溶菌劑是含有約15容量％～約20容量％的二由此制成了檢測(cè)固體試樣中的微生物量也能應(yīng)用的能夠液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置。


圖1表示本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒的立體圖。
圖2(a)、(b)表示本發(fā)明實(shí)施方式1和實(shí)施方式2的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法的檢測(cè)原理的模式圖。
圖3(a)、(b)、(c)、(D)、(e)、(f)表示本發(fā)明實(shí)施方式1和實(shí)施方式2的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法的步驟說(shuō)明圖。
圖4為液體試樣是市售牛奶時(shí)，本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法中實(shí)施例1的檢測(cè)結(jié)果與比較例1相比較的示意圖。
圖5為液體試樣是市售牛奶時(shí)，本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法中實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果示意圖。
圖6為液體試樣是擠出的生奶時(shí)，本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法中實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果示意圖。
符號(hào)說(shuō)明1 液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒2 第1注射器3 凝集劑5 1次過(guò)濾器5a 1次膜濾器6 2次過(guò)濾器6a 2次膜濾器7 第2注射器8 洗滌液9 溶菌劑
10 檢測(cè)用試管11 發(fā)光試劑12 連接器13 光度計(jì)BC 體細(xì)胞FA 游離ATPGPR 凝集的蛋白質(zhì)LS 液體試樣MO 微生物PR 蛋白質(zhì)具體實(shí)施方式
以下參照

本發(fā)明實(shí)施方式。
實(shí)施方式1首先，參照?qǐng)D1至圖6說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施方式1所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法、檢測(cè)裝置。圖1表示本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒的立體圖。圖2(a)，(b)表示本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置的檢測(cè)原理模式圖。圖3(a)，(b)，(c)，(D)，(e)，(f)表示本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法的步驟說(shuō)明圖。圖4為液體試樣是市售牛奶時(shí)，本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法中實(shí)施例1的檢測(cè)結(jié)果與比較例1相比較的示意圖。圖5為液體試樣是市售牛奶時(shí)，本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法中實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果示意圖。圖6為液體試樣是擠出的生奶時(shí)，本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法中實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果示意圖。
本發(fā)明中作為液體試樣沒(méi)有特殊限制，可列舉出食品中的牛奶或各種乳制品，蛋白質(zhì)含量高的豆乳等，除此以外還可使用化妝品或水本身作為試樣。并且固體試樣或高粘度的試樣在添加滅菌蒸餾水后，經(jīng)均化可作為液體試樣。
如圖1所示，本實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒1具備塑料制第1注射器2(容量3ml)、瓶裝凝集劑3、收裝1次膜濾器的聚丙烯制1次過(guò)濾器5，收裝2次膜濾器的聚丙烯制2次過(guò)濾器6、塑料制第2注射器7(容量1ml)、瓶裝洗滌液8、瓶裝溶菌劑9、塑料制檢測(cè)用試管10、裝入容器的發(fā)光試劑溶解液11a和瓶裝發(fā)光試劑粉末11b構(gòu)成的發(fā)光試劑11、檢測(cè)時(shí)安裝在檢測(cè)用試管10上的連接器12、以及裝入安裝了帶有連接器12的檢測(cè)用試管10的園筒部的測(cè)定發(fā)光量的光度計(jì)13。
然后，參照?qǐng)D2說(shuō)明有關(guān)使用液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒1的本實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法的檢測(cè)原理。如圖2(a)所示，在牛奶等液體試樣LS中除存在微生物MO外還混有游離ATP、FA、體細(xì)胞BC(內(nèi)含ATP)、蛋白質(zhì)PR等。因而如果不將這些物質(zhì)從液體試樣LS中除去，就不能正確地檢測(cè)微生物MO的混入量。因此通過(guò)將僅使蛋白質(zhì)PR凝集的凝集劑與液體試樣LS混合發(fā)生反應(yīng)，成為凝集的蛋白質(zhì)GPR。
這里，作為僅使蛋白質(zhì)PR凝集的凝集劑，有乙醇等脂肪醇，苯甲酸、水楊酸等羧酸，還有殼聚糖，低聚殼聚糖等。這些凝集劑能夠使蛋白質(zhì)PR凝集，而此時(shí)微生物MO不會(huì)與之一起凝集，因此微生物MO的損失少。
因此，如圖2(b)所示，通過(guò)使液體試樣LS從連接1次過(guò)濾器5和2次過(guò)濾器6的裝置中流過(guò)，在捕捉凝集的蛋白質(zhì)GPR和體細(xì)胞BC并使游離ATP、FA和微生物MO透過(guò)的1次膜濾器5a中，凝集的蛋白質(zhì)GPR和體細(xì)胞BC被捕捉而除去，在捕捉微生物MO使游離ATP、FA透過(guò)的2次膜濾器6a中微生物MO被捕捉，游離ATP、FA透過(guò)而被排出除去。然后，從2次膜濾器6a中取出微生物MO內(nèi)的ATP加入發(fā)光試劑，通過(guò)測(cè)定發(fā)光量能夠高精度地檢測(cè)最初的液體試樣LS中含有的微生物MO的量。
這里，1次膜濾器5a優(yōu)選使用孔徑約1μm～約10μm的濾膜。作為濾膜可使用例如，使用硼硅酸玻璃作為初濾膜的親水性聚醚砜(2片為1個(gè)濾膜)、在聚酯無(wú)紡布上涂覆乙酸纖維素的濾膜、親水性硼硅酸玻璃纖維、尼龍、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、乙酸纖維素、纖維素混合酯等。由于濾膜的孔徑一定、壓力強(qiáng)，通過(guò)使用濾膜作為1次膜濾器5a，能夠穩(wěn)定地進(jìn)行檢查。
此外，作為2次膜濾器6a的濾膜孔徑約0.1μm～約0.5μm，優(yōu)選使用具有孔徑約0.2μm～約0.45μm的微細(xì)孔的多孔性高分子膜。作為多孔性高分子膜可以使用PTFE、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、乙酸纖維素、親水性聚丙烯、尼龍、親水性聚醚砜、或親水性硼硅酸玻璃纖維等高分子構(gòu)成的分離膜。
采用上述濾膜過(guò)濾時(shí)，微生物MO在膜濾器6a上被捕捉、濃縮。對(duì)于該膜濾器6a和微生物MO來(lái)說(shuō)，由于有時(shí)有非微生物MO來(lái)源的游離ATP、FA或發(fā)光物質(zhì)附著，可根據(jù)需要將它們用洗滌液清洗除去。作為洗滌液可使用例如含60容量％～100容量％的乙醇的滅菌蒸餾水溶液或含1容量％～8容量％的DMSO(更優(yōu)選4容量％～5容量％)的滅菌蒸餾水溶液等。
然后，應(yīng)用本檢測(cè)原理，參照?qǐng)D3說(shuō)明本實(shí)施方式1的利用液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒1的微生物的檢測(cè)方法的具體步驟。首先，如圖3(a)所示，預(yù)先將規(guī)定量(2.1ml)的凝集劑3吸入到第1注射器2(容量3ml)，向試樣杯14中加入液體試樣LS再用第1注射器2吸入規(guī)定量(0.7ml)，再裝入空氣，用指壓第1注射器2的前端攪拌5秒鐘左右。凝集劑3的種類(lèi)和添加量根據(jù)液體試樣LS的種類(lèi)而不同，例如，液體試樣為市售牛奶的情況，添加相對(duì)于牛奶0.7ml的2.1ml比例的羧酸系凝集劑(苯甲酸等)時(shí)，凝集反應(yīng)迅速進(jìn)行。
然后，如圖3(b)所示，攪拌后立即在第1注射器2的前端安裝連接1次過(guò)濾器5和2次過(guò)濾器6的裝置，緩慢地壓住第1注射器2的注射器芯過(guò)濾該混合液15。過(guò)濾后，取下第1注射器2，馬上吸入空氣，再次通過(guò)將其安裝連接1次過(guò)濾器5和2次過(guò)濾器6的裝置送入空氣，完全過(guò)濾濾膜內(nèi)的試樣。此時(shí)，如上所述，出現(xiàn)圖2(b)所示的現(xiàn)象。
若能全量過(guò)濾，僅取下2次過(guò)濾器6，如圖3(c)所示，用第2注射器7預(yù)先吸入洗滌液8，在第2注射器7的前端安裝2次過(guò)濾器6、擠壓第2注射器7的注射器芯，用洗滌液8清洗2次過(guò)濾器6。過(guò)濾后，取下第2注射器7，馬上吸入空氣，通過(guò)再次通過(guò)將其安裝在2次過(guò)濾器6上送入空氣，完全除去2次過(guò)濾器6內(nèi)的洗滌液8。如果殘留有洗滌液8，會(huì)使下一步的溶菌處理不完全而必須引起注意。
然后，如圖3(d)所示，用第2注射器7預(yù)先吸入規(guī)定量(0.2ml)的溶菌劑9，安裝2次過(guò)濾器6，將第2注射器7上下倒置，從下面向2次過(guò)濾器6內(nèi)送入溶菌劑9，在2次過(guò)濾器6內(nèi)裝滿(mǎn)溶菌劑9。接著，旋轉(zhuǎn)2次過(guò)濾器6或?qū)ζ湟贿呡p輕振動(dòng)一邊以不充滿(mǎn)溶菌劑9而向2次膜濾器6a流入的狀態(tài)反應(yīng)約30秒鐘。反應(yīng)后，如圖3(e)所示，通過(guò)擠出反應(yīng)液16到檢測(cè)用試管10中，并將2次膜濾器6a上殘留的反應(yīng)液16也用空氣擠出，使反應(yīng)液完全收集在檢測(cè)用試管10中。
然后，如圖3(f)所示，預(yù)先將發(fā)光試劑粉末11b加入發(fā)光試劑溶解液11a，再加入調(diào)制好的規(guī)定量(0.1ml)的發(fā)光試劑11，安裝好連接器12輕輕攪拌后，立即用光度計(jì)13測(cè)定發(fā)光量。發(fā)光試劑沒(méi)有特殊限制，通常使用蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素。
(實(shí)施例1)然后，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法的實(shí)施例1具體說(shuō)明本發(fā)明。
用于本實(shí)施例1和比較例的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液為含有酵母提取物0.5％，胨1.5％，氯化鈉0.5％，磷酸氫鉀0.5％的溶液，發(fā)光試劑為以蟲(chóng)熒光素、蟲(chóng)熒光素酶和醋酸鎂為主成分溶解在Tricine緩沖液的物質(zhì)。
向20ml的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中加入少量生奶，對(duì)培養(yǎng)的物質(zhì)進(jìn)行離心分離，棄去培養(yǎng)液，向沉淀菌中加入確認(rèn)為無(wú)菌的市售牛奶20ml劇烈攪拌。再將其用同樣的市售牛奶分5步進(jìn)行稀釋?zhuān)运鼈冏鳛樵嚇印?br> 作為膜濾器使用直徑47mm、孔徑10μm的1次膜濾器(材質(zhì)聚酯無(wú)紡布上涂覆有乙酸纖維素的濾膜)和直徑25mm、孔徑0.5μm的作為2次膜濾器的濾膜(材質(zhì)聚四氟乙烯)，分別用Lure接頭連接濾器蓋者。
使用10ml容量的注射器吸取試樣3ml，再直接加入作為凝集劑的7ml的99.5％的乙醇，立即劇烈混合約10秒鐘，用上述膜濾器過(guò)濾。此時(shí)，試樣中的蛋白質(zhì)等被1次膜濾器捕捉，微生物主要收集在2次膜濾器上，游離ATP作為濾液被排出。然后，打開(kāi)濾器蓋取出2次膜濾器，將其移入檢測(cè)用試管，加入0.2ml的20％DMSO溶液放置1分鐘后，加入發(fā)光試劑0.1ml用光度計(jì)測(cè)定發(fā)光量(RLU)。
另外，用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法培養(yǎng)被分步稀釋的上述各試樣，檢測(cè)微生物數(shù)。檢測(cè)所得微生物數(shù)和發(fā)光量的關(guān)系如圖4所示。橫軸表示菌數(shù)(cfu/ml)，縱軸表示發(fā)光量(RLU)，均為對(duì)數(shù)軸。從此圖中可知，通過(guò)本實(shí)施例1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法，發(fā)光量(ATP濃度)和菌數(shù)在104個(gè)/ml以上時(shí)具有良好的比例關(guān)系。
作為比較例，向0.1ml各試樣中加入0.2ml的20％的DMSO溶液放置1分鐘，然后添加0.1ml發(fā)光試劑，用光度計(jì)測(cè)定發(fā)光量。
菌數(shù)和檢測(cè)的發(fā)光量(ATP濃度)的關(guān)系如圖4所示，用白色的方塊作圖表示。此時(shí)，菌數(shù)和發(fā)光量之間無(wú)相關(guān)關(guān)系。
從而通過(guò)本實(shí)施例1，它能夠在簡(jiǎn)單操作下容易且迅速地除去游離ATP，從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，此時(shí)，完全無(wú)需用洗滌液清洗或無(wú)需用大量洗滌液清洗，且微生物的損失少，能夠得到可靠性顯著高的檢查結(jié)果。另外，本實(shí)施例1也可適用于濃度高的牛奶、乳制品或固體食品。可以在直到低濃度良好地測(cè)定含大量的蛋白質(zhì)或礦物質(zhì)而難于過(guò)濾的豆乳等食品中來(lái)自微生物的ATP。并且，在本實(shí)施例1中，由于1次膜濾器和2次膜濾器二者均使用了濾膜，因此能夠進(jìn)行穩(wěn)定的檢查，無(wú)需光度計(jì)以外的特別裝置或技術(shù)，無(wú)需熟練也可以在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢查。
(實(shí)施例2)然后，參照?qǐng)D1至圖3，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法的實(shí)施例2，具體說(shuō)明本發(fā)明。本實(shí)施例2中使用上述的本實(shí)施方式1中的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒1，檢測(cè)微生物。
本實(shí)施例2所用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液為含有酵母提取物0.5％，胨1.5％，氯化鈉0.5％，磷酸氫鉀0.5％的物質(zhì)，發(fā)光試劑11為將以蟲(chóng)熒光素、蟲(chóng)熒光素酶和醋酸鎂為主成分的粉末11b溶解在Tricine緩沖液11a中的物質(zhì)。
向20ml的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中加入少量生奶，對(duì)培養(yǎng)的物質(zhì)進(jìn)行離心分離，棄去培養(yǎng)液，向沉淀菌中加入確認(rèn)為無(wú)菌的市售牛奶20ml劇烈攪拌。再將其用同樣的市售牛奶分5步進(jìn)行稀釋?zhuān)运鼈冏鳛橐后w試樣LS。并且，同樣地向其中加入在牧場(chǎng)采集的擠出的生奶20ml劇烈攪拌，再用同樣的生奶進(jìn)行多步的稀釋?zhuān)惨运鼈冏鳛橐后w試樣LS。
首先，如圖3(a)所示，預(yù)先用第1注射器2(容量3ml)吸入作為凝集劑的2.1ml苯甲酸3，向試樣杯14中裝入液體試樣LS，用第1注射器2吸收0.7ml，再向其中裝入空氣，用手指擠壓第1注射器2的前端攪拌5秒鐘左右。接著，如圖3(b)所示，攪拌后立即在第1注射器2的前端安裝連接有1次過(guò)濾器5和2次過(guò)濾器6的裝置，緩慢地?cái)D壓第1注射器2的注射器芯過(guò)濾該混合液15。過(guò)濾后，取下第1注射器2，馬上吸入空氣，通過(guò)再次安裝連接了1次過(guò)濾器5和2次過(guò)濾器6的裝置送入空氣，使膜濾器內(nèi)的試樣全部被過(guò)濾。
若能全部被過(guò)濾，只取下2次過(guò)濾器6，如圖3(c)所示，用第2注射器7預(yù)先吸入作為洗滌液的60容量％乙醇的滅菌蒸餾水溶液8，在第2注射器7的前端安裝2次過(guò)濾器6，擠壓第2注射器7的注射器芯，用洗滌液8清洗2次過(guò)濾器6。過(guò)濾后，取下第2注射器7，馬上吸入空氣，通過(guò)將其再次安裝在2次過(guò)濾器6上送入空氣，將2次過(guò)濾器6內(nèi)的洗滌液8完全除去。
此外，在本實(shí)施例2中，說(shuō)明了關(guān)于使用乙醇60容量％溶液作為洗滌液8的例子，另外也可以使用1容量％～8容量％的DMSO的滅菌蒸餾水溶液，更優(yōu)選使用4容量％～5容量％的DMSO的滅菌蒸餾水溶液等作為洗滌液8。
然后，如圖3(d)所示，預(yù)先用第2注射器7吸入0.2ml作為溶菌劑的20容量％的DMSO溶液9，安裝2次過(guò)濾器6，將第2注射器7上下倒置由下面向2次過(guò)濾器6內(nèi)送入溶菌劑9，將溶菌劑9裝滿(mǎn)至2次過(guò)濾器6內(nèi)。接著，旋轉(zhuǎn)2次過(guò)濾器6或?qū)ζ湟贿呡p輕振動(dòng)一邊以不充滿(mǎn)溶菌劑9而向2次膜濾器6a流入的狀態(tài)反應(yīng)約30秒鐘，如圖3(e)所示，押出反應(yīng)液16至檢測(cè)用試管10，通過(guò)將2次膜濾器6a中殘留的反應(yīng)液16也用空氣擠出，可以完全將反應(yīng)液收集到檢測(cè)用試管10中。
接著，如圖3(f)所示，加入預(yù)先調(diào)制好的0.1ml發(fā)光試劑11，安裝上連接器12輕輕攪拌后，立即用光度計(jì)13測(cè)定發(fā)光量。另外，用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法培養(yǎng)分步稀釋的上述各試樣，檢測(cè)微生物數(shù)。檢測(cè)所得微生物數(shù)和發(fā)光量的關(guān)系，市售牛奶的情況如圖5所示，生奶的情況如圖6所示。此外，生奶與市售牛奶不同，為非無(wú)菌物，因此在空白狀態(tài)下也能發(fā)光。圖6表示以減去該空白發(fā)光量的值作為發(fā)光量。橫軸表示菌數(shù)(cfu/ml)，縱軸表示發(fā)光量(RLU)，均為對(duì)數(shù)軸。由此圖可知，通過(guò)本實(shí)施例2的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法，發(fā)光量(ATP濃度)和菌數(shù)在104個(gè)/ml以上時(shí)具有良好的比例關(guān)系。
從而通過(guò)本實(shí)施例2的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法本實(shí)施例1，它能夠在簡(jiǎn)單操作下容易且迅速地除去游離ATP，從捕捉到的微生物中提取ATP和檢測(cè)提取所得ATP，此時(shí)，完全無(wú)需用洗滌液清洗或無(wú)需用大量洗滌液清洗，且微生物的損失少，能夠得到可靠性顯著高的檢查結(jié)果。此外，本實(shí)施例2所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法也適用于濁度高的牛奶和乳制品試樣或固體食品，并能夠在直至低濃度下也良好地檢測(cè)出來(lái)自含有大量蛋白質(zhì)或礦物質(zhì)的過(guò)濾困難的豆乳等食品中的微生物的ATP。并且，本實(shí)施例2中，由于1次膜濾器和2次膜濾器二者均裝在盒子中可以使用完后扔掉，因此能夠進(jìn)行穩(wěn)定的檢查，無(wú)需光度計(jì)以外的特別裝置或技術(shù)，無(wú)需熟練也可以在牧場(chǎng)或工廠(chǎng)等現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢查。
實(shí)施方式2然后，參考圖1至圖3說(shuō)明關(guān)于本發(fā)明實(shí)施方式2的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法、檢測(cè)裝置。本實(shí)施方式2所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒為，向圖1所示的實(shí)施方式1的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒中再追加過(guò)濾促進(jìn)劑的裝置。本實(shí)施方式2時(shí)用乙二胺四乙酸(EDTA)的鈉鹽作為過(guò)濾促進(jìn)劑。此外，也可以向如圖1所示的檢測(cè)試劑盒1的瓶裝凝集劑3中以規(guī)定比例預(yù)先混合EDTA的鈉鹽。EDTA的鈉鹽一般為作為螯合劑使用的化合物，與凝集劑聯(lián)合使用時(shí)，牛奶等液體試樣中含有的礦物質(zhì)如鈣成為螯合物(水溶性)，容易過(guò)濾。
因此，本實(shí)施方式2的微生物的檢測(cè)方法的檢測(cè)原理如圖2所示，水溶性的螯合化合物與游離ATP、FA一起透過(guò)2次膜濾器6a被排除出系統(tǒng)外。因此，液體試樣的過(guò)濾變得更加容易，檢測(cè)時(shí)間也短縮了。
然后，應(yīng)用該檢測(cè)原理，參照?qǐng)D3說(shuō)明本實(shí)施方式2的利用液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒的微生物的檢測(cè)方法的具體步驟。首先，如圖3(a)所示，預(yù)先將凝集劑3和作為過(guò)濾促進(jìn)劑的EDTA的鈉鹽的混合劑以規(guī)定量2.1ml吸入到第1注射器2(容量3ml)中，向試樣杯14中加入液體試樣LS再用笫1注射器2吸入規(guī)定量(0.7ml)，再裝入空氣，用指壓第1注射器2的前端攪拌5秒鐘左右。凝集劑3的種類(lèi)和添加量根據(jù)液體試樣LS的種類(lèi)而不同，例如，液體試樣為市售牛奶的情況，添加相對(duì)于牛奶0.7ml的2.1ml比例的羧酸系凝集劑(苯甲酸等)時(shí)，凝集反應(yīng)迅速進(jìn)行。
或者，也可采用下述方法，即，只吸入規(guī)定量(2.1ml)的凝集劑3，再吸入液體試樣LS攪拌后，立即加入作為過(guò)濾促進(jìn)劑EDTA的鈉鹽，再用指壓第1注射器2的前端攪拌5秒鐘左右。接著，如圖3(b)所示，攪拌后立即在第1注射器2的前端安裝連接有1次過(guò)濾器5和2次過(guò)濾器6的裝置，緩慢地?cái)D壓第1注射器2的注射器芯過(guò)濾該混合液15。過(guò)濾后，取下第1注射器2，馬上吸入空氣，通過(guò)再次將其安裝在連接有1次過(guò)濾器5和2次過(guò)濾器6的裝置送入空氣，使膜濾器內(nèi)的試樣全部被過(guò)濾。此時(shí)，如上所述，出現(xiàn)圖2(b)所示的現(xiàn)象。
若能全量過(guò)濾，只取下2次過(guò)濾器6，如圖3(c)所示，預(yù)先用第2注射器7吸入洗滌液8，在第2注射器7的前端安裝2次過(guò)濾器6擠壓第2注射器7的注射器芯，用洗滌液8清洗2次過(guò)濾器6。過(guò)濾后，取下第2注射器7，馬上吸入空氣，通過(guò)再次將其安裝在2次過(guò)濾器6上送入空氣，將2次過(guò)濾器6內(nèi)的洗滌液8完全除去。若洗滌液8殘留，后續(xù)的溶菌處理將進(jìn)行不完全須加以注意。
然后，如圖3(d)所示，預(yù)先用第2注射器7吸入規(guī)定量(0.2ml)的溶菌劑9，安裝2次過(guò)濾器6，將第2注射器7上下倒置從下面向2次過(guò)濾器6內(nèi)送入溶菌劑9，用溶菌劑9裝滿(mǎn)2次過(guò)濾器6。接著，旋轉(zhuǎn)2次過(guò)濾器6或?qū)ζ湟贿呡p輕振動(dòng)一邊以不充滿(mǎn)溶菌劑9而向2次膜濾器6a流入的狀態(tài)反應(yīng)約30秒鐘。反應(yīng)后，如圖3(e)所示，通過(guò)押出反應(yīng)液16至檢測(cè)用試管10中，并將2次膜濾器6a上殘留的反應(yīng)液16也用空氣擠出，使反應(yīng)液完全收集在檢測(cè)用試管10中。
接著，如圖3(f)所示，預(yù)先向發(fā)光試劑粉末11b中加入發(fā)光試劑溶解液11a，再加入調(diào)制好的規(guī)定量(0.1ml)的發(fā)光試劑11，安裝連接器12輕輕攪拌后，立即用光度計(jì)13測(cè)定發(fā)光量。發(fā)光試劑沒(méi)有特殊限制，通常使用蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素。
此外，關(guān)于如上所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法所用的檢測(cè)裝置，在上述各實(shí)施方式中，說(shuō)明了使用檢測(cè)試劑盒1或向檢測(cè)試劑盒1中追加過(guò)濾促進(jìn)劑的檢測(cè)試劑盒，采用人工檢測(cè)的例子。但該裝置也能制成幾乎不用人工的自動(dòng)檢測(cè)裝置。
本發(fā)明的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置的其它部分的構(gòu)成、形狀、材質(zhì)、大小、數(shù)量、連接關(guān)系等以及本發(fā)明所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法的其它工序并不限定于上述各實(shí)施方式。
權(quán)利要求
1.一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，具備以下構(gòu)成采集液體試樣的第1注射器，在上述第1注射器中使上述液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑，配有能捕捉上述凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞并可透過(guò)游離ATP(三磷酸腺苷)和微生物的1次膜濾器并可安裝在上述第1注射器上的1次過(guò)濾器，配有能捕捉上述微生物并可透過(guò)上述游離ATP的2次膜濾器并可安裝在上述1次過(guò)濾器上的2次過(guò)濾器，能夠安裝在上述2次過(guò)濾器的前端的第2注射器，用于清洗上述2次膜濾器的洗滌液，溶解被上述2次膜濾器捕捉到的上述微生物并使ATP溶出的溶菌劑，同時(shí)收集上述溶出的ATP和溶菌劑的檢測(cè)用試管，和使上述溶出的ATP發(fā)光的發(fā)光試劑。
2.權(quán)利要求1所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還具備用于測(cè)定發(fā)光量的光度計(jì)，和用于使上述檢測(cè)用試管的前端能夠到達(dá)上述光度計(jì)的發(fā)光檢測(cè)部而安裝在上述檢測(cè)用試管上的連接器。
3.權(quán)利要求1或2所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還具備用于使過(guò)濾在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的過(guò)濾促進(jìn)劑，或使用預(yù)先混入上述過(guò)濾促進(jìn)劑的物質(zhì)作為上述凝集劑。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，上述1次膜濾器和上述2次膜濾器分別安裝入上述1次過(guò)濾器和上述2次過(guò)濾器成為一體并在使用完畢后被棄去。
5.一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法，其特征在于包括將液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑混合的工序，加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾以用1次膜濾器捕捉上述凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞并透過(guò)游離ATP(三磷酸腺苷)和微生物的工序，將濾液用具有比上述1次膜濾器更小孔徑的能捕捉上述微生物并透過(guò)上述游離ATP的2次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾使液體試樣中的微生物在2次膜濾器的濾膜上被捕捉濃縮的工序，和向該微生物中加入溶菌劑、向提取液中添加發(fā)光試劑，測(cè)定產(chǎn)生的發(fā)光量的工序。
6.權(quán)利要求5所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法，其特征在于，在將上述液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑進(jìn)行混合的工序后，或在同一工序中同時(shí)追加加入用于使過(guò)濾在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的過(guò)濾促進(jìn)劑的工序。
7.一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置，其特征在于將液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑混合，加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾用1次膜濾器來(lái)捕捉上述凝集的蛋白質(zhì)和體細(xì)胞并透過(guò)游離ATP(三磷酸腺苷)和微生物，將濾液用具有比上述1次膜濾器更小孔徑的能捕捉上述微生物并可透過(guò)上述游離ATP的2次膜濾器加壓過(guò)濾或減壓過(guò)濾使液體試樣中的微生物在2次膜濾器的濾膜上被捕捉濃縮，向該微生物中加入溶菌劑、向提取液中添加發(fā)光試劑，測(cè)定產(chǎn)生的發(fā)光量。
8.權(quán)利要求7所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置，其特征在于，在將上述液體試樣與使該液體試樣中的蛋白質(zhì)凝集的凝集劑進(jìn)行混合后或同時(shí)加入用于使過(guò)濾在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的過(guò)濾促進(jìn)劑。
9.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或權(quán)利要求5或6所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法或權(quán)利要求7或8所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)裝置，其特征在于，上述凝集劑使用乙醇等脂肪醇，苯甲酸、水楊酸等羧酸，或殼聚糖，低聚殼聚糖。
10.權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，其特征在于，上述1次膜濾器使用孔徑約1μm～約10μm的過(guò)濾材料。
11.權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，其特征在于，上述2次膜濾器為具有孔徑約0.1μm～約0.5μm的微細(xì)孔的多孔性高分子膜。
12.權(quán)利要求11所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，其特征在于，上述多孔性高分子膜由聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、乙酸纖維素、親水性聚丙烯、尼龍、親水性聚醚砜、或親水性硼硅酸玻璃纖維中的任何高分子構(gòu)成。
13.權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，其特征在于，上述溶菌劑為含有二甲亞砜的滅菌蒸餾水。
14.權(quán)利要求13所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，其特征在于，上述溶菌劑為含有約15容量％～約20容量％的二甲亞砜的滅菌蒸餾水。
15.權(quán)利要求3～14中任一項(xiàng)所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，其特征在于，上述過(guò)濾促進(jìn)劑使用乙二胺四乙酸的堿金屬鹽、反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸的堿金屬鹽、乙二醇醚二胺四乙酸的堿金屬鹽、二乙撐三胺五乙酸的堿金屬鹽、或氨基三乙酸的堿金屬鹽。
16.權(quán)利要求5～15中任一項(xiàng)所述的液體試樣中的微生物的檢測(cè)方法或檢測(cè)裝置，其特征在于，將固體試樣或高粘性試樣在與上述凝集劑混合前添加滅菌蒸餾水后進(jìn)行均化制成上述液體試樣。
全文摘要
本發(fā)明提供一種液體試樣中的微生物的檢測(cè)試劑盒，它能夠除去游離的ATP、容易而迅速地從捕捉的微生物中提取ATP并檢測(cè)提取所得ATP，微生物損失少且無(wú)需熟練也能高靈敏度地穩(wěn)定地檢測(cè)試樣中的微生物。預(yù)先在第1注射器2中吸入凝集劑3，再吸入液體試樣LS進(jìn)行攪拌，然后立即在其前端安裝1次過(guò)濾器5和2次過(guò)濾器6，過(guò)濾該混合液15，只取下2次過(guò)濾器6，預(yù)先用第2注射器7吸入洗滌液8清洗2次過(guò)濾器6。然后，用溶菌劑9裝滿(mǎn)2次過(guò)濾器6，反應(yīng)約30秒鐘，將反應(yīng)液16擠出到檢測(cè)用試管10，加入預(yù)先調(diào)制好的發(fā)光試劑(11a+11b)，安裝連接器12輕輕攪拌，立即用光度計(jì)測(cè)定發(fā)光量。
文檔編號(hào)C12Q1/66GK1871338SQ20048000098
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月30日
發(fā)明者田中孝二郎 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Dml