專利名稱：制備低表達(dá)血型抗原紅細(xì)胞的方法及其在血型試劑質(zhì)量控制中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該項(xiàng)發(fā)明涉及血型抗原表達(dá)水平改變的細(xì)胞。特別是，該項(xiàng)發(fā)明涉及到這些細(xì)胞的制備及其在血型試劑的質(zhì)量控制和血液學(xué)、免疫血液學(xué)和免疫學(xué)分析的校正和確認(rèn)。
背景技術(shù)：
血液中心的功能是檢測(cè)血液以準(zhǔn)確判斷個(gè)人的血型。對(duì)于血型的準(zhǔn)確和精確的判斷對(duì)于多項(xiàng)治療是必需的，包括輸血，器官移植和治療新生兒的遺傳性溶血。
例如，一名病人在接受輸血前必需知道其血型。獻(xiàn)血者和受血者的血型的錯(cuò)配將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果，甚至?xí)?dǎo)致受血者的死亡。
在輸血血清學(xué)中，ABO血型分類是紅細(xì)胞血型分類中最重要的一種分類方法。人的血型主要被分成四種血型A，B，AB和O型。每種血型的紅細(xì)胞分別攜帶A抗原，B抗原，A抗原和B抗原，既無(wú)A抗原也無(wú)B抗原。
在每個(gè)人的血液中，存在抗ABO血型抗原或紅細(xì)胞中缺少的抗原的抗體。因此，A型血的人血中含有抗B抗原的抗體，B型血的人血中含有抗A抗原的抗體，O型血的人血中含有抗A抗原和B抗原的抗體，AB型血的人血中既無(wú)抗A抗原的抗體也無(wú)抗B抗原的抗體。
在從獻(xiàn)血者向受血者輸血前，必須進(jìn)行交叉配血。交叉配血是通過(guò)直接檢測(cè)獻(xiàn)血者血液對(duì)受血者血清的排異性，或者是根軍獻(xiàn)血者和受血者血型的記錄進(jìn)行配對(duì)。交叉配血需要保證一種血型的紅細(xì)胞不能供給對(duì)該血型的抗原可以產(chǎn)生抗體的個(gè)人。
從歷史上看，直接測(cè)試獻(xiàn)血者紅細(xì)胞對(duì)受血者血清排異性的交叉配血可以檢測(cè)出微弱亞型的錯(cuò)誤測(cè)定和試圖給不相容的受體輸血之間的不相容性。然而，現(xiàn)在直接測(cè)試的交叉配血方法在大部分血液中心很少用到，取而代之的是依賴于血型的正確記錄。
在血型血清學(xué)中，紅細(xì)胞的測(cè)定是采用含有針對(duì)特異抗原的抗體的試劑(正向分組)，測(cè)定血清對(duì)表達(dá)已知抗原的紅細(xì)胞的排異性(反向分組)。
從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，單克隆抗體(Mabs)已經(jīng)被用于血型測(cè)定試劑中。與傳統(tǒng)的多克隆抗血清相比，單克隆試劑提供了更高的特異性，更加一致的反應(yīng)性，而且大部分情況下可以提高靈敏度。
血型試劑的質(zhì)量控制對(duì)于血型測(cè)定的準(zhǔn)確性和可信性是必須的。血型試劑會(huì)在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中出現(xiàn)特異性和/或靈敏性的降低，或者是在制備和使用過(guò)程中造成的污染。
在人類中，有各種表達(dá)低水平A抗原和/或B抗原的ABO亞型。各亞型中抗原的表達(dá)水平差異很大，通常如果沒(méi)有廣泛的分析不易查明。大多數(shù)A型血和稀有的A亞型的抗原水平通常在以下范圍內(nèi)是可以被接受的(每個(gè)紅細(xì)胞的抗原分子數(shù))A1，8×105到1.2×106；A2，1.5×105到4×105；A3，4×104到1.2×105；Ax，7×103到104；Aend，2×103到3×103；Am，102到2×103；Ael，102到1.5×103.
B亞型也有相應(yīng)的抗原表達(dá)水平。血型試劑應(yīng)該能夠檢測(cè)所有臨床上顯著的ABO亞型。
從質(zhì)量控制的目標(biāo)出發(fā)，血型試劑用來(lái)測(cè)定紅細(xì)胞。因此抗原水平表達(dá)低的紅細(xì)胞更適合用作“質(zhì)量控制細(xì)胞”(或者“標(biāo)準(zhǔn)試劑”)。
抗原表達(dá)水平低的紅細(xì)胞適合用于血型測(cè)定分析，因?yàn)檫@種紅細(xì)胞可以提供更多多克隆抗體試劑可能行為的信息。
這些紅細(xì)胞可以用作質(zhì)量控制細(xì)胞，用來(lái)測(cè)定試劑的變化，這種變化會(huì)導(dǎo)致不能檢測(cè)表達(dá)低水平抗原的血液亞型的紅細(xì)胞，例如A2型的紅細(xì)胞表達(dá)抗原的水平處于趨向于可接受范圍的低端，從而導(dǎo)致血型檢測(cè)的錯(cuò)誤發(fā)生。
這些紅細(xì)胞還可以用來(lái)校正和確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)，以保證所有臨床意義的ABO血型和亞型可以被檢測(cè)。
實(shí)際上，用表達(dá)低水平A抗原和/或B抗原的天然的ABO亞型的紅細(xì)胞作為質(zhì)量控制細(xì)胞是很困難的。人群中具有這樣表型的比例很低。例如據(jù)估計(jì)，Ax血型的個(gè)人是A型血個(gè)人數(shù)量的0.003％。其他亞型的在人群中的比例還要低。
在那些不表達(dá)低水平抗原的細(xì)胞中，血型測(cè)定試劑是這樣評(píng)價(jià)的測(cè)定對(duì)正常細(xì)胞的排異性。(這包括使用表達(dá)相對(duì)高水平抗原的紅細(xì)胞，但這一方法缺乏靈敏度)；或稀釋血型測(cè)定試劑。(這包括稀釋血型測(cè)定試劑和測(cè)定其對(duì)正常細(xì)胞的排異性)。
很多實(shí)驗(yàn)室僅依賴于對(duì)測(cè)定試劑供應(yīng)商的質(zhì)量控制。
血型測(cè)定試劑的評(píng)價(jià)普遍是采用血型測(cè)定試劑稀釋的方法。然而，實(shí)驗(yàn)室只能以每周或每月為周期分批檢測(cè)血型測(cè)定試劑。
稀釋血型測(cè)定試劑和檢測(cè)對(duì)正常細(xì)胞的排異性的方法并不可靠。正常細(xì)胞表達(dá)高水平的抗原，例如，每個(gè)紅細(xì)胞的抗原分子數(shù)大于1.5×105。當(dāng)檢測(cè)血型測(cè)定試劑時(shí)，這些試劑被稀釋至較低的稀釋度，仍可以與紅細(xì)胞作用，從而產(chǎn)生血清陽(yáng)性的結(jié)果。用外推法處理這些結(jié)果以判斷正常稀釋度下的抗原表達(dá)水平。
這一方法除了耗費(fèi)時(shí)間這一缺點(diǎn)之外，該方法還作了以下的假定血型測(cè)定試劑預(yù)測(cè)的靈敏度可以擴(kuò)大至測(cè)定表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞。除非血型測(cè)定試劑的真正的靈敏度剛好下降到測(cè)定一些ABO亞型所需的閾值，否則試劑的變質(zhì)無(wú)法被檢測(cè)到。測(cè)定這種程度的試劑的變質(zhì)只可能出現(xiàn)在更進(jìn)一步耗時(shí)的稀釋實(shí)驗(yàn)的完成。
應(yīng)該指出的是，多克隆抗體試劑經(jīng)常是雙克隆和具有特異性能的特點(diǎn)。眾所周知，在測(cè)定ABO亞型方面，某些克隆比其他的更好。因此，試劑經(jīng)常以混合物的形式出現(xiàn)。當(dāng)血型測(cè)定試劑被稀釋時(shí)，其內(nèi)在的行為特點(diǎn)將不起作用。
當(dāng)缺少可信的血型測(cè)定試劑時(shí)，實(shí)驗(yàn)室常依賴于制造商的說(shuō)明書(shū)和試劑的以往的表現(xiàn)。
當(dāng)缺少可靠的血型測(cè)定試劑的質(zhì)量控制時(shí)，血型測(cè)定是用變質(zhì)的試劑，而且臨床上顯著區(qū)別的亞型可能會(huì)被錯(cuò)誤的測(cè)定。這種試劑變質(zhì)時(shí)，無(wú)法檢測(cè)抗原表達(dá)水平位于可接受范圍低端的亞型的紅細(xì)胞。
如果用于輸血，這種血液將導(dǎo)致或輕或重的輸血反應(yīng)，包括受血者可能出現(xiàn)死亡。
顯而易見(jiàn)，需要一種可信的表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞作為質(zhì)量控制細(xì)胞。血型測(cè)定試劑的可靠的質(zhì)量控制和測(cè)定系統(tǒng)的校正以保證準(zhǔn)確和標(biāo)準(zhǔn)化的判斷血型，對(duì)于使受血者的危險(xiǎn)性降低至最小程度是必須的。
缺乏大量輸血經(jīng)驗(yàn)的多技能的技術(shù)人員更加需要這種方法?？煽康臏y(cè)定可信度的增加比對(duì)于測(cè)定試劑過(guò)往表現(xiàn)的了解更重要。
這一發(fā)明的目的是提供用于血型測(cè)定試劑質(zhì)量控制和測(cè)定系統(tǒng)的校正和確認(rèn)的紅細(xì)胞，或者是至少為公眾提供一個(gè)有用的選擇。
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發(fā)明內(nèi)容
這項(xiàng)發(fā)明包括以下方面首先，本項(xiàng)發(fā)明提供了表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，這種紅細(xì)胞抗原表達(dá)水平低，實(shí)質(zhì)上等同于天然產(chǎn)生ABO血型和亞型的紅細(xì)胞。
這種表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞是在體外制備的。
這種紅細(xì)胞的抗原水平的降低實(shí)質(zhì)上更加等同于血清學(xué)上獲得的抗原表達(dá)少于5×105拷貝數(shù)的紅細(xì)胞，可以達(dá)到獲得的抗原表達(dá)少于1×105拷貝數(shù)的紅細(xì)胞，最好可以達(dá)到獲得的抗原表達(dá)少于2×104拷貝數(shù)的紅細(xì)胞。
表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞實(shí)質(zhì)上更加等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，在血清學(xué)結(jié)果中，其每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)大于1×102拷貝數(shù)，最好每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)大于1×103拷貝數(shù)。
免疫優(yōu)勢(shì)抗原紅細(xì)胞的糖鏈連接方式，是α連接的N-乙酰半乳糖胺或α連接的半乳糖連接到H抗原。
血型抗原最好是A抗原或B抗原。
當(dāng)采用凝集實(shí)驗(yàn)分析紅細(xì)胞時(shí)，抗原表達(dá)水平的降低相應(yīng)于凝集分值降低2～3個(gè)單位。
酶學(xué)上抗原水平的降低是通過(guò)使用至少一種優(yōu)勢(shì)免疫糖修飾酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的。酶學(xué)上更好的抗原水平的降低是通過(guò)能夠在1-3位連接處使鍵斷裂的酶。酶學(xué)上更好的抗原水平的降低是通過(guò)使用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同時(shí)使用這兩種酶。
低水平的抗原表達(dá)更加等同于凝集分值的降低，實(shí)質(zhì)上等同于測(cè)定天然紅細(xì)胞的弱表達(dá)ABO血型或亞型在凝集實(shí)驗(yàn)中的凝集分值。
紅細(xì)胞最好是人類的紅細(xì)胞。
紅細(xì)胞最好處于懸浮狀態(tài)。
懸浮液中最好包含細(xì)胞防腐劑，比如CelpresolTM。
懸浮液中最好包含可以提供額外的控制指標(biāo)，如臨床上顯著意義的抗體。
這項(xiàng)發(fā)明的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在，該項(xiàng)發(fā)明提供了一種酶學(xué)上低水平抗原表達(dá)的紅細(xì)胞的懸浮液，這種低水平的抗原表達(dá)實(shí)質(zhì)上等同于自然存在的紅細(xì)胞的表型。而且抗原表達(dá)的水平實(shí)質(zhì)上更加等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
紅細(xì)胞被用作質(zhì)量控制細(xì)胞。
懸浮液作為質(zhì)量控制試劑控制血型測(cè)定試劑的質(zhì)量和/或?qū)y(cè)試系統(tǒng)的校正和確證。
第二方面，這項(xiàng)發(fā)明提供了一種制備表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞的方法，步驟包括將至少一種優(yōu)勢(shì)免疫的糖修飾酶與初始抗原表達(dá)水平的紅細(xì)胞放入溶液中行成混合物；將混合物置于足以減少抗原表達(dá)水平的溫度下以降低抗原表達(dá)水平；處理該懸浮液，以阻止更進(jìn)一步抗原表達(dá)水平的降低。
通過(guò)周期性取樣和測(cè)定混合物判斷抗原表達(dá)水平的降低。
通過(guò)凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)混合物的抗原表達(dá)水平。
在凝集實(shí)驗(yàn)中測(cè)定紅細(xì)胞時(shí)，當(dāng)抗原表達(dá)水平的降低相應(yīng)于凝集分值降低2～3個(gè)單位時(shí)，處理懸浮液以阻止抗原表達(dá)水平的降低。
紅細(xì)胞的起始抗原表達(dá)水平等于血清學(xué)檢查中，每個(gè)紅細(xì)胞抗原表達(dá)數(shù)量大于5×105拷貝數(shù)。
表達(dá)抗原的紅細(xì)胞所在溶液中含有至少一種優(yōu)勢(shì)免疫的糖修飾酶的是A型紅細(xì)胞。
表達(dá)抗原的紅細(xì)胞所在溶液中含有至少一種優(yōu)勢(shì)免疫的糖修飾酶的是B型紅細(xì)胞。
表達(dá)抗原的紅細(xì)胞所在溶液中含有至少一種優(yōu)勢(shì)免疫的糖修飾酶的是AB型紅細(xì)胞。
通過(guò)清洗紅細(xì)胞去除免疫優(yōu)勢(shì)的糖修飾酶以阻止抗原水平的過(guò)度降低。
抗原表達(dá)水平的降低實(shí)質(zhì)上等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，在血清學(xué)檢查中，其每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)少于5×105拷貝數(shù)，最好每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)少于1×105拷貝數(shù)，最好每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)少于2×104拷貝數(shù)。
表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，在血清學(xué)結(jié)果中，其每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)大于1×102拷貝數(shù)，最好每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)大于1×103拷貝數(shù)。
免疫優(yōu)勢(shì)抗原紅細(xì)胞的糖鏈連接方式，是α連接的N-乙酰半乳糖胺或α連接的半乳糖連接到H抗原。
血型抗原最好是A抗原或B抗原。
所用的酶至少一種是優(yōu)勢(shì)免疫糖修飾酶。該酶能夠在α1-3位連接處使鍵斷裂。最好使用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同時(shí)使用這兩種酶。
抗原表達(dá)水平的降低更加等同于凝集分值的降低，實(shí)質(zhì)上等同于在同一凝集實(shí)驗(yàn)中測(cè)定天然紅細(xì)胞的弱表達(dá)ABO亞型在凝集實(shí)驗(yàn)中的凝集分值。
紅細(xì)胞最好是人類的紅細(xì)胞。
第三方面，該發(fā)明提供了由發(fā)明的第二方面所提供的酶學(xué)上表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞的制備方法。
第四方面，該法面提供了血型測(cè)定試劑的質(zhì)量控制的方法，包括將血型測(cè)定試劑與根據(jù)第一方面和第三方面制備的紅細(xì)胞懸浮液進(jìn)行反應(yīng)；測(cè)定凝集值。
凝集值的測(cè)定是通過(guò)觀察凝集的數(shù)量。
這個(gè)方法對(duì)于血型測(cè)定試劑的一系列的稀釋度都是可以重復(fù)的。
可以選擇的是，這個(gè)過(guò)程可以包括一步判斷紅細(xì)胞抗原表達(dá)水平的步驟，也就是通過(guò)參考已知的紅細(xì)胞的抗原表達(dá)水平。表達(dá)已知抗原水平的紅細(xì)胞可以通過(guò)國(guó)際專利應(yīng)用PCT/NZ02/00219中所描述的方法進(jìn)行制備。
第五方面，這項(xiàng)發(fā)明提供了一個(gè)由兩種或多種紅細(xì)胞懸浮液的試劑盒，這種紅細(xì)胞的制備參見(jiàn)發(fā)明的第一方面和第三方面。
這個(gè)試劑盒包含對(duì)表達(dá)A型和B型紅細(xì)胞靈敏度的控制，紅細(xì)胞的制備參見(jiàn)發(fā)明的第一方面和第三方面。懸浮液中包含細(xì)胞防腐劑，比如CelpresolTM。懸浮液中包含可以提供額外的控制指標(biāo)，如臨床上顯著意義的抗體。
可供選擇的是，試劑盒中包含靈敏度控制的試劑，包括表達(dá)Rh DCce(Rlr)和Rh ce(rr)抗原的紅細(xì)胞。
下面將詳細(xì)介紹這項(xiàng)發(fā)明。
發(fā)明詳述A抗原的優(yōu)勢(shì)免疫的糖是一個(gè)α連接的N-乙酰半乳糖胺。B抗原的優(yōu)勢(shì)免疫的糖是一個(gè)α連接的半乳糖。優(yōu)勢(shì)免疫的糖連接到H抗原。
優(yōu)勢(shì)免疫的糖的通過(guò)酶的去除和修飾會(huì)導(dǎo)致原始抗原性的丟失。因此，A，B或AB血型的紅細(xì)胞的A抗原和B抗原的表達(dá)水平可以被酶降低。
抗原的酶解消化是基于以下標(biāo)準(zhǔn)，酶(糖苷酶)能夠在紅細(xì)胞膜上特異降解糖類抗原，而不會(huì)破壞非目標(biāo)結(jié)構(gòu)，例如非靶位連接的蛋白質(zhì)和糖類。
酶的變性以前被用來(lái)去除紅細(xì)胞中的ABO血型抗原，從而將A型細(xì)胞和B型細(xì)胞轉(zhuǎn)化成O型細(xì)胞。研究者用高濃度的酶可以去除大部分甚至全部的紅細(xì)胞抗原。
在輸血時(shí)，這些去除抗原的細(xì)胞能夠用作通用的鮮血單位(Davis1997；Goldstein 1989；Hobbs 1996；Hoskins 1995；Lenny 1991a；Zhu 1996)?！叭コ乖难痹谂R床輸血中試驗(yàn)成功，盡管現(xiàn)在并沒(méi)有常規(guī)應(yīng)用(Goldstein 1982；Lenny 1991b；Lenny 1994)。
這些作者描述的方法沒(méi)有提供表達(dá)減少但又有限的抗原水平的紅細(xì)胞，這種抗原的表達(dá)水平處于或高于臨床上顯著性的閾值。實(shí)際上，這些方法試圖提供不表達(dá)抗原的紅細(xì)胞，或至少不超過(guò)臨床顯著性閾值數(shù)量抗原的紅細(xì)胞。
根據(jù)這項(xiàng)發(fā)明，表達(dá)低水平A抗原或/和B抗原的紅細(xì)胞是在體外制備的。在A抗原或/和B抗原表達(dá)水平方面，制備的紅細(xì)胞在血清學(xué)檢查中等于天然存在的ABO亞型的紅細(xì)胞。
消化作用的條件，例如處理的時(shí)間、溫度、酶活性和紅細(xì)胞與酶的比例，在控制抗原表達(dá)水平的減少方面是可以調(diào)節(jié)的。細(xì)胞膜上抗原的酶解消化時(shí)間也依賴于酶溶液的相對(duì)濃度和細(xì)胞上抗原初始的表達(dá)水平。
酶濃度的改變可以用作控制抗原的表達(dá)水平。如果想得到弱表達(dá)A抗原或B抗原的細(xì)胞，可以使用高濃度的酶。如果需要強(qiáng)凝集的細(xì)胞，可以使用低濃度的酶。
醫(yī)用輸血中所用到的典型的質(zhì)量控制細(xì)胞由A型或B型細(xì)胞制備，這種條件下酶將去除A抗原和/或B抗原，從而在抗原測(cè)定分析中得到特定的反應(yīng)分?jǐn)?shù)。這項(xiàng)分析將包括板，試管，凝膠卡，和微型板方法，和任何手工或自動(dòng)化的使用凝集的平臺(tái)，或任何其他的檢測(cè)抗原的方法(例如酶聯(lián)免疫，流式細(xì)胞儀等)。
傳統(tǒng)方法獲得紅細(xì)胞在血清學(xué)檢測(cè)中，凝集分析的結(jié)果接近于2+。實(shí)際的血清學(xué)結(jié)果需要依賴于所用分析系統(tǒng)的靈敏度，例如板與自動(dòng)化方法的靈敏度是不同的。
消化的過(guò)程可以通過(guò)定期取樣和分析凝集系統(tǒng)的表現(xiàn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。一旦消化的條件依賴于實(shí)驗(yàn)比例的大量的表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，就可以制備可供作為質(zhì)量控制的細(xì)胞。
凝集實(shí)驗(yàn)是測(cè)定抗原的一種方法。細(xì)胞間抗體的交聯(lián)形成的紅細(xì)胞結(jié)塊稱為凝集。凝集可以通過(guò)觀察(用眼睛)或用血型分析儀自動(dòng)化技術(shù)檢測(cè)。增強(qiáng)對(duì)凝集的觀察可以通過(guò)使用特定的酶或放射活性或熒光標(biāo)記技術(shù)。
根據(jù)以下方案對(duì)手動(dòng)的凝集反應(yīng)進(jìn)行計(jì)分

對(duì)凝集水平的評(píng)價(jià)可以通過(guò)直接觀察凝集或通過(guò)使用誘導(dǎo)凝集的方法產(chǎn)生非直接的凝集進(jìn)行評(píng)價(jià)，例如增強(qiáng)效應(yīng)或使用抗球蛋白分子。
表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，在血清學(xué)上實(shí)質(zhì)上等同于天然產(chǎn)生ABO血型和亞型的紅細(xì)胞，作為質(zhì)量控制細(xì)胞具有特別的優(yōu)勢(shì)和優(yōu)點(diǎn)。
如果需要，質(zhì)量控制細(xì)胞的實(shí)際抗原表達(dá)水平(每個(gè)紅細(xì)胞上的抗原分子數(shù))可以通過(guò)參考已知抗原表達(dá)水平的紅細(xì)胞。這些被參考的紅細(xì)胞可以是自然存在的弱表達(dá)抗原的ABO亞型或表達(dá)已知抗原水平的紅細(xì)胞，可以通過(guò)國(guó)際專利應(yīng)用PCT/NZ02/00219中所描述的方法進(jìn)行制備。
應(yīng)該說(shuō)明的是，并不需要知道質(zhì)量控制細(xì)胞的實(shí)際抗原表達(dá)水平。質(zhì)量控制細(xì)胞被用來(lái)評(píng)價(jià)和檢測(cè)血型測(cè)定試劑的發(fā)生的質(zhì)量上的變化。質(zhì)量控制細(xì)胞抗原表達(dá)水平低且有限才是重要之處。
可以制備具有不同抗原表達(dá)水平的質(zhì)量控制細(xì)胞。一套質(zhì)量控制細(xì)胞的抗原表達(dá)水平可以通過(guò)選擇臨床上顯著性閾值，在此閾值測(cè)定抗原的失敗將會(huì)導(dǎo)致臨床上明顯的輸血反應(yīng)。另一套質(zhì)量控制細(xì)胞的抗原表達(dá)水平可以通過(guò)選擇有足夠把握測(cè)定弱亞型的紅細(xì)胞。
上述提到的質(zhì)量控制細(xì)胞可以通過(guò)控制靈敏度在一定范圍內(nèi)，從而確證ABO血型測(cè)定的準(zhǔn)確性。這些靈敏度控制細(xì)胞也可以用在校正高度靈敏的機(jī)器或在流式細(xì)胞儀測(cè)定抗原定量曲線時(shí)使用。這可以保證ABO血型供給的安全性。
這項(xiàng)發(fā)明使得質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化和全球一致性。這項(xiàng)發(fā)明使得可以對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室和不同方法學(xué)的結(jié)果進(jìn)行比較。將質(zhì)量控制細(xì)胞包含在輸血血清學(xué)質(zhì)量保證計(jì)劃，可以建立的ABO血型測(cè)定的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
這項(xiàng)發(fā)明中，包含在試劑盒中的的質(zhì)量控制細(xì)胞可以用來(lái)確證血型測(cè)定中A型血(弱)和B型血(弱)的表型。這一試劑盒可以包括質(zhì)量控制細(xì)胞，用來(lái)確證對(duì)Rh DCce(Rlr)和Rh ce(rr)表型的血型測(cè)定結(jié)果。這一試劑盒能夠保證ABO和RhD血型測(cè)定試劑能夠進(jìn)行質(zhì)量控制。包含表達(dá)一定范圍抗原水平的質(zhì)量控制細(xì)胞的其他試劑盒對(duì)于一些專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室是很有益處的。
在制備質(zhì)量控制細(xì)胞的懸浮液時(shí)，重懸的液體可能含有臨床上有顯著意義的抗體。因此，應(yīng)該引入額外的質(zhì)量控制特征，例如共存的抗體對(duì)照。
提供以下的定義和解釋輔助理解這項(xiàng)發(fā)明的權(quán)利要求的描述和要求范圍。
“臨床顯著閾值”是當(dāng)紅細(xì)胞的抗原表達(dá)水平低于此標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，如果進(jìn)行輸血，抗原檢測(cè)的失敗在臨床上無(wú)顯著性。
“優(yōu)勢(shì)免疫糖修飾酶”是指這些酶能夠修改A抗原或B抗原的抗原決定簇，從而導(dǎo)致抗原表達(dá)水平的降低。例如優(yōu)勢(shì)免疫糖修飾酶包括α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶。
“酶學(xué)上抗原表達(dá)水平的降低”是指通過(guò)酶消化細(xì)胞表面的抗原，體外得到的抗原表達(dá)水平。
“抗原表達(dá)”是指細(xì)胞表面出現(xiàn)的抗原，“抗原表達(dá)水平”是指細(xì)胞表面出現(xiàn)的抗原數(shù)量。
“質(zhì)量控制細(xì)胞”是指表達(dá)抗原的細(xì)胞，典型的是紅細(xì)胞，用來(lái)評(píng)價(jià)血型測(cè)定試劑的質(zhì)量和對(duì)測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行校正和確證。這項(xiàng)發(fā)明的質(zhì)量控制細(xì)胞的例子是例1，2和3中描述的酶修飾的細(xì)胞。
在上述敘述中出現(xiàn)的抗原水平“實(shí)質(zhì)上等同于”是指這一抗原表達(dá)的水平將在血清學(xué)分析中提供實(shí)質(zhì)上同樣的結(jié)果。
抗原表達(dá)水平是通過(guò)每個(gè)紅細(xì)胞的抗原拷貝數(shù)定義的，抗原表達(dá)水平處于可接受的水平是指已知ABO亞型的抗原表達(dá)水平，或者該抗原表達(dá)水平能夠提供血清學(xué)上已知ABO亞型的相同的結(jié)果。
抗原表達(dá)水平的“高”和“低”是用來(lái)區(qū)別普通ABO亞型如A1和不常見(jiàn)的弱抗原表達(dá)的ABO亞型。
具體實(shí)施例方式
下面將通過(guò)具體實(shí)施例闡明本項(xiàng)發(fā)明。
實(shí)施例1α-半乳糖苷酶作用的B抗原表達(dá)水平的降低綠咖啡豆中提取到的10個(gè)單位的α-半乳糖苷酶從Glyko(Cat.No.X-5001)購(gòu)買(mǎi)。
AB血型的100微升的紅細(xì)胞用磷酸緩沖液(PBS)清洗三次。
對(duì)照反應(yīng)(ctrl)50微升包裹的紅細(xì)胞加入到40微升100mM的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液和22.5微升的500mM中的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中。
酶促反應(yīng)(enz)50微升包裹的細(xì)胞加入到含有40微升的4個(gè)單位的α-半乳糖苷酶的100mM pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液和22.5微升的500mM中的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中。
混合物在37℃水浴中反應(yīng)，并不時(shí)進(jìn)行混合。該反應(yīng)結(jié)束時(shí)間分別是6小時(shí)和9小時(shí)，中止的方法是去除相當(dāng)于15微升包裹的紅細(xì)胞，用含有1％牛血清白蛋白的磷酸緩沖液清洗細(xì)胞三次。
15微升包裹的紅細(xì)胞重懸在1毫升的Celstab(細(xì)胞防腐溶液)，用來(lái)評(píng)價(jià)血型測(cè)定試劑(抗血清)的稀釋度。
對(duì)照反應(yīng)或酶反應(yīng)中清洗的細(xì)胞重懸在0.8％的Celstab(Diamed)。50微升0.8％的懸浮液轉(zhuǎn)移到Diamed卡，分別加入以1∶4，1∶32和1∶512稀釋的50微升抗B的血型測(cè)定試劑(抗血清)。
將混合物反應(yīng)5分鐘，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將Diamed卡在Diamed免疫離心機(jī)中離心10分鐘。
根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)對(duì)凝集反應(yīng)進(jìn)行打分。
表1稀釋的抗B血型測(cè)定試劑(Alba clone，蘇格蘭)測(cè)定α-半乳糖苷酶修飾(酶促)和未修飾(對(duì)照)組對(duì)AB型紅細(xì)胞的凝集結(jié)果。

實(shí)施例2α-N-乙酰半乳糖胺酶作用的A抗原表達(dá)水平的降低α-N-乙酰半乳糖胺酶(Cat.No.X-5001)從Glyco公司購(gòu)買(mǎi)。
AB血型的100微升的紅細(xì)胞用磷酸緩沖液(PBS)清洗三次。
對(duì)照反應(yīng)(ctrl)6微升包裹的紅細(xì)胞加入到100微升100mM的pH4的檸檬酸鹽緩沖液和26.5微升的500mM中的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中。
酶促反應(yīng)(enz)6微升包裹的細(xì)胞加入到含有100微升的100個(gè)毫單位(mU)的α-N-乙酰半乳糖胺酶的100mM pH4的檸檬酸鹽緩沖液和26.5微升的500mM中的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中。
混合物在37℃水浴中反應(yīng)，并不時(shí)進(jìn)行混合。該反應(yīng)結(jié)束時(shí)間分別是6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)，中止的方法是取出相當(dāng)于2微升包裹的紅細(xì)胞，加入到100微升CelStab試劑中，成為0.8％的懸浮液。(為避免細(xì)胞損失，無(wú)須用磷酸緩沖液清洗細(xì)胞。)懸浮液用來(lái)評(píng)價(jià)用來(lái)評(píng)價(jià)血型測(cè)定試劑(抗血清)的稀釋度。
50微升懸浮液轉(zhuǎn)移到Diamed卡，分別加入以1∶32和1∶256稀釋的50微升抗A的血型測(cè)定試劑(Alba clone，蘇格蘭)。
將混合物反應(yīng)5分鐘，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將Diamed卡在Diamed血庫(kù)離心機(jī)中離心10分鐘。
根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)對(duì)凝集反應(yīng)進(jìn)行打分。
表1稀釋的抗A血型測(cè)定試劑(Alba clone，蘇格蘭)測(cè)定α-N-乙酰半乳糖胺酶修飾(酶促)和未修飾(對(duì)照)組對(duì)AB型紅細(xì)胞的凝集結(jié)果。

nc表示測(cè)試中不能看見(jiàn)細(xì)胞在例1和例2中，細(xì)胞提供了血清學(xué)上弱的凝集值。在這兩個(gè)例子中，酶修飾的細(xì)胞對(duì)于抗體滴度減小的檢測(cè)更加敏感，例如當(dāng)用酶修飾的細(xì)胞檢測(cè)稀釋的血型測(cè)定試劑時(shí)得到了較低的凝集分值。
這些細(xì)胞適合于用作對(duì)血清學(xué)的血型分析和血型測(cè)定試劑的評(píng)價(jià)質(zhì)量控制細(xì)胞。使用酶修飾的細(xì)胞對(duì)于檢測(cè)抗體滴度的減少更加具有鑒別力。
盡管酶修飾細(xì)胞的抗原表達(dá)的實(shí)際水平是未知的，如果需要可以通過(guò)抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。然而，技術(shù)人員對(duì)血型測(cè)定試劑的質(zhì)量變異的更加靈敏檢測(cè)的能力，不需要知道酶修飾細(xì)胞上抗原表達(dá)的實(shí)際水平。
由于初始抗原來(lái)源不同(由不同個(gè)體提供)，因此實(shí)驗(yàn)條件會(huì)有細(xì)小的差別，盡管反應(yīng)時(shí)間、酶濃度和/或溫度的不同，也可以獲得提供類似結(jié)果的作為質(zhì)量控制細(xì)胞的酶修飾細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，獲得需要反應(yīng)分?jǐn)?shù)的細(xì)胞，反應(yīng)停止后就得到了所制備的質(zhì)量控制細(xì)胞。
實(shí)施例3從咖啡豆中制備α-半乳糖苷酶的方法。
α-半乳糖苷酶是根據(jù)Courtois和Petek的方法從綠咖啡豆(中果咖啡)中提取到的。(Courtois，J.E.and Petek，J.，α-Galactosidase from CoffeeBeans，(1996)Methods of Enzymology，8565-571)。
提取到的酶濃縮到離心超濾裝置(Millipore)在檸檬酸鹽磷酸緩沖液(100mM，pH6.0)中透析。酶粗提物的活性無(wú)需測(cè)定?？偟鞍踪|(zhì)濃度是96mg/ml。
降低B抗原表達(dá)的酶學(xué)方法對(duì)照反應(yīng)(ctrl)AB血型的經(jīng)過(guò)清洗、包裹的紅細(xì)胞(300微升)加入到裝有檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液(500微升，100mM，pH6.0和200微升，500mM，pH6.0)的Eppendorf離心管中。
酶促反應(yīng)(enz)AB血型的經(jīng)過(guò)清洗、包裹的紅細(xì)胞(300微升)加入到裝有α-半乳糖苷酶的檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液(500微升，100mM，pH6.0)和檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液(200微升，500mM，pH6.0)的Eppendorf離心管中。
混合物在37℃水浴中反應(yīng)24小時(shí)，并不時(shí)通過(guò)振搖進(jìn)行混合。
酶處理的紅細(xì)胞用含有1％牛血清白蛋白的磷酸緩沖液清洗三次。然后將經(jīng)過(guò)清洗、包裹的紅細(xì)胞以0.9％的比例懸浮在Celstab細(xì)胞防腐劑的溶液中，用來(lái)加入到Diamed凝膠卡和手工的試管血清學(xué)檢測(cè)。
細(xì)胞懸浮液(50微升，Cellstab中紅細(xì)胞濃度為0.9％)和血型測(cè)定試劑(抗體)的稀釋液(50微升)被用吸管加入到Diamed卡上，作用5分鐘，然后在Diamed離心機(jī)中離心10分鐘，記錄結(jié)果。
細(xì)胞懸浮液(25-40微升，Cellstab中紅細(xì)胞濃度為0.9％)和抗體試劑稀釋液(25微升)在玻璃血清試管中進(jìn)行反應(yīng)，然后在免疫離心機(jī)中離心15秒，記錄結(jié)果。
血型測(cè)定試劑的質(zhì)量控制商品化的抗B(單克隆和一個(gè)多克隆人)試劑由過(guò)去儲(chǔ)存的抗體試劑提供。這些儲(chǔ)存的試劑通過(guò)單批次的酶修飾細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，而這些細(xì)胞實(shí)際的抗原表達(dá)水平是未知的。
選擇血型測(cè)定試劑是因?yàn)檫@些試劑是過(guò)期的，因此可能已經(jīng)發(fā)生了變質(zhì)，而且測(cè)定效果受損。這些試劑的稀釋液也被選擇進(jìn)行評(píng)估。用編碼代替了制造商的名稱。作為反應(yīng)條件的一個(gè)功能的血型測(cè)定試劑的表現(xiàn)與評(píng)估的供應(yīng)商相反。
血型測(cè)定試劑的變質(zhì)可以被酶修飾細(xì)胞所檢測(cè)到。變質(zhì)是顯著的，因?yàn)楸M管血型測(cè)定試劑的稀釋液在用表達(dá)高水平抗原(對(duì)照反應(yīng))的細(xì)胞時(shí)可以獲得顯著的凝集分值，當(dāng)用表達(dá)低水平抗原的質(zhì)量控制細(xì)胞(酶促反應(yīng))進(jìn)行測(cè)定時(shí)，這些同樣的試劑不能提供顯著性的凝集分值。
可以推斷的是，當(dāng)用試劑檢測(cè)未處理的對(duì)照細(xì)胞(活性好)產(chǎn)生強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果，而用酶修飾細(xì)胞(推斷這些質(zhì)量控制細(xì)胞在檢測(cè)質(zhì)量不好的試劑)產(chǎn)生弱的或陰性的反應(yīng)結(jié)果。盡管在用未修飾的細(xì)胞無(wú)法檢測(cè)抗血清是否顯著丟失活性，后面的表格突出列出以下例子。
如前所述，無(wú)需判斷酶修飾細(xì)胞抗原表達(dá)的實(shí)際水平。實(shí)際上，可以根據(jù)使用者的要求選擇抗原表達(dá)的水平。那些不同的表達(dá)水平是通過(guò)控制酶促反應(yīng)獲得的。







n.d.表示未做。
在前面的描述中，已經(jīng)有參考文獻(xiàn)提及那些已知等價(jià)物的整體物或化合物，然后，在這里把這些等價(jià)物混合在一起，就如同分別對(duì)其進(jìn)行闡明。
特別指出的是，發(fā)明者的意圖是除酶以外的生物催化劑可以同樣發(fā)展成為和前文所述的優(yōu)勢(shì)免疫糖修飾酶具有同樣活性盡管這項(xiàng)發(fā)明通過(guò)實(shí)施例和其有關(guān)的可能的具體操作了描述，值得注意的是，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍前提下可以改進(jìn)和/或修改本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.作為質(zhì)量控制細(xì)胞的表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1中的表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞實(shí)質(zhì)上等同于天然產(chǎn)生ABO血型和亞型的紅細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，其每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)少于5×105拷貝數(shù)。
4.權(quán)利要求3中的表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，其每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)少于1×105拷貝數(shù)。
5.權(quán)利要求4中的表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，其每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)少于2×104拷貝數(shù)。
6.權(quán)利要求1中的表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞實(shí)質(zhì)上等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
7.權(quán)利要求1到權(quán)利要求6中的表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，其每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)大于1×102拷貝數(shù)。
8.權(quán)利要求7中的表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞，其每個(gè)紅細(xì)胞中的抗原數(shù)大于1×103拷貝數(shù)。
9.權(quán)利要求1到權(quán)利要求8中的任何免疫優(yōu)勢(shì)抗原紅細(xì)胞的糖鏈連接方式，是α連接的N-乙酰半乳糖胺連接到H抗原。
10.權(quán)利要求1到權(quán)利要求8中的任何免疫優(yōu)勢(shì)抗原紅細(xì)胞的糖鏈連接方式，是α連接的半乳糖連接到H抗原。
11.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10中紅細(xì)胞的抗原是血型抗原。
12.權(quán)利要求9中紅細(xì)胞的抗原是A抗原。
13.權(quán)利要求10中紅細(xì)胞的抗原是B抗原。
14.當(dāng)采用凝集實(shí)驗(yàn)分析紅細(xì)胞時(shí)，權(quán)利要求1到權(quán)利要求13中的紅細(xì)胞的抗原表達(dá)水平的降低相應(yīng)于凝集分值降低2～3個(gè)單位。
15.權(quán)利要求1至權(quán)利要求14任何一項(xiàng)中所提到的紅細(xì)胞酶促抗原表達(dá)水平的降低是通過(guò)使用至少一種優(yōu)勢(shì)免疫糖修飾化酶。
16.權(quán)利要求15中所提到的紅細(xì)胞抗原水平降低的酶促反應(yīng)是通過(guò)酶促作用斷裂α1-3鏈完成的。
17.權(quán)利要求15中所提到的紅細(xì)胞抗原水平降低的酶促反應(yīng)是通過(guò)使用α-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同時(shí)使用這兩種酶完成的。
18.權(quán)利要求1至權(quán)利要求17任何一項(xiàng)中所提到的紅細(xì)胞抗原水平的符合凝集分值的減少，實(shí)質(zhì)上等同于在同一凝集分析實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的天然存在的表達(dá)低水平抗原的ABO血型或亞型的紅細(xì)胞。
19.權(quán)利要求1至權(quán)利要求18任何一項(xiàng)中所提到的紅細(xì)胞是人類的紅細(xì)胞。
20.權(quán)利要求1至權(quán)利要求19任何一項(xiàng)中所提到的紅細(xì)胞是懸浮液的形式。
21.權(quán)利要求20中提到的懸浮液包含有細(xì)胞防腐劑，例如Celpressol。
22.權(quán)利要求20或權(quán)利要求21中所提到的懸浮液所含有的成分可以提供額外的質(zhì)量控制特性。
23.權(quán)利要求22中所提到的懸浮液中的成分是臨床上顯著意義的抗體。
24.權(quán)利要求20至權(quán)利要求23任何一項(xiàng)中所提到的懸浮液用途為血型測(cè)定試劑質(zhì)量控制和/或測(cè)定系統(tǒng)的校正和確證。
25.制備表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞的方法的步驟包括將至少一種優(yōu)勢(shì)免疫的糖修飾酶與初始抗原表達(dá)水平的紅細(xì)胞放入溶液中行成混合物；將混合物置于足以減少抗原表達(dá)水平的溫度下以降低抗原表達(dá)水平；處理該懸浮液，以阻止更進(jìn)一步抗原表達(dá)水平的降低。
26.權(quán)利要求25中抗原表達(dá)水平的降低是由定期采樣和測(cè)定混合物判斷的。
27.權(quán)利要求26中的測(cè)定方法是凝集實(shí)驗(yàn)。
28.權(quán)利要求27中的懸浮液在抗原表達(dá)水平的降低相應(yīng)于凝集分值降低2～3個(gè)單位時(shí)，進(jìn)行處理以阻止抗原表達(dá)水平的進(jìn)一步降低。
29.權(quán)利要求25至權(quán)利要求28任何一項(xiàng)所提到的方法中，紅細(xì)胞的起始抗原表達(dá)水平為血清學(xué)檢查中，每個(gè)紅細(xì)胞抗原表達(dá)數(shù)量大于5×105拷貝數(shù)。
30.權(quán)利要求25至權(quán)利要求29任何一項(xiàng)所提到的方法中，表達(dá)抗原的紅細(xì)胞所在溶液中含有至少一種優(yōu)勢(shì)免疫的糖修飾酶的是A型紅細(xì)胞。
31.權(quán)利要求25至權(quán)利要求29任何一項(xiàng)所提到的方法中，表達(dá)抗原的紅細(xì)胞所在溶液中含有至少一種優(yōu)勢(shì)免疫的糖修飾酶的是B型紅細(xì)胞。
32.權(quán)利要求25至權(quán)利要求29任何一項(xiàng)所提到的方法中，表達(dá)抗原的紅細(xì)胞所在溶液中含有至少一種優(yōu)勢(shì)免疫的糖修飾酶的是AB型紅細(xì)胞。
33.權(quán)利要求25至權(quán)利要求32任何一項(xiàng)所提到的方法中，通過(guò)清洗紅細(xì)胞去除免疫優(yōu)勢(shì)的糖修飾化酶。
34.權(quán)利要求25至權(quán)利要求32任何一項(xiàng)所提到的方法中，通過(guò)加入優(yōu)勢(shì)免疫糖修飾化酶中止反應(yīng)。
35.權(quán)利要求25至權(quán)利要求32任何一項(xiàng)所提到的方法中，通過(guò)加入優(yōu)勢(shì)免疫糖修飾化酶的競(jìng)爭(zhēng)性的底物中止反應(yīng)。
36.權(quán)利要求25至權(quán)利要求35任何一項(xiàng)所提到的方法中，抗原表達(dá)水平的降低實(shí)質(zhì)上等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
37.權(quán)利要求25至權(quán)利要求35任何一項(xiàng)所提到的方法中，抗原表達(dá)水平的減少應(yīng)小于5×105拷貝數(shù)。
38.權(quán)利要求37中所提到的方法中，每個(gè)紅細(xì)胞抗原表達(dá)水平的減少應(yīng)小于105拷貝數(shù)。
39.權(quán)利要求38中所提到的方法中，每個(gè)紅細(xì)胞抗原表達(dá)水平的減少最好小于2×104拷貝數(shù)。
40.權(quán)利要求25至權(quán)利要求39任何一項(xiàng)所提到的方法中，每個(gè)紅細(xì)胞抗原表達(dá)水平的減少應(yīng)大于102拷貝數(shù)。
41.權(quán)利要求40中所提到的方法中，每個(gè)紅細(xì)胞抗原表達(dá)水平的減少應(yīng)大于103拷貝數(shù)。
42.權(quán)利要求25至權(quán)利要求30以及權(quán)利要求32至權(quán)利要求41任何一項(xiàng)所提到的方法中中，免疫優(yōu)勢(shì)抗原紅細(xì)胞的糖鏈連接方式，是α連接的N-乙酰半乳糖胺連接到H抗原。
43.權(quán)利要求25至權(quán)利要求29以及權(quán)利要求31至權(quán)利要求41任何一項(xiàng)所提到的方法中，免疫優(yōu)勢(shì)抗原紅細(xì)胞的糖鏈連接方式，是α連接的半乳糖連接到H抗原。
44.權(quán)利要求42或權(quán)利要求43所提到的方法中，抗原是血型抗原。
45.權(quán)利要求42所提到的方法中，抗原是A抗原。
46.權(quán)利要求43所提到的方法中，抗原是B抗原。
47.權(quán)利要求25至權(quán)利要求46任何一項(xiàng)所提到的方法中，酶在α1-3位斷鏈。
48.權(quán)利要求25至權(quán)利要求46任何一項(xiàng)所提到的方法中，使用的酶是α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同時(shí)使用這兩種酶。
49.權(quán)利要求25至權(quán)利要求48任何一項(xiàng)所提到的方法中，抗原表達(dá)水平的降低等同于凝集分值的降低，實(shí)質(zhì)上等同于在同一凝集實(shí)驗(yàn)中表達(dá)低水平抗原的天然存在的紅細(xì)胞的ABO亞型在凝集實(shí)驗(yàn)中的凝集分值。
50.權(quán)利要求25至權(quán)利要求49任何一項(xiàng)所提到的方法中，用的是人的紅細(xì)胞。
51.表達(dá)低水平抗原的紅細(xì)胞是根據(jù)權(quán)利要求25至權(quán)利要求50制備的。
52.紅細(xì)胞懸浮液是根據(jù)權(quán)利要求51制備的。
53.根據(jù)權(quán)利要求52制備的懸浮液包含有細(xì)胞防腐劑，例如Celpressol。
54.根據(jù)權(quán)利要求51或權(quán)利要求52制備的懸浮液包含有可以提供額外控制特性的物質(zhì)。
55.權(quán)利要求54所提到的懸浮液中的組成還包括臨床上顯著意義的抗體。
56.血型測(cè)定試劑的質(zhì)量控制方法包括a.將根據(jù)權(quán)利要求20至權(quán)利要求24或權(quán)利要求52至權(quán)利要求55任何一項(xiàng)所制備的懸浮液與血型測(cè)定試劑進(jìn)行反應(yīng)；b.評(píng)價(jià)凝集的程度。
57.權(quán)利要求56所提到的方法中，凝集值的測(cè)定是通過(guò)觀察凝集的數(shù)量。
58.權(quán)利要求56或權(quán)利要求57所提到的方法，對(duì)于血型測(cè)定試劑的一定范圍內(nèi)的的稀釋度都是可以重復(fù)的。
59.根據(jù)權(quán)利要求20至權(quán)利要求24或權(quán)利要求52至權(quán)利要求55所制備的試劑盒中含有兩種或更多的懸浮液。
60.根據(jù)權(quán)利要求59制備的試劑盒包含表達(dá)A抗原和/或B抗原紅細(xì)胞的懸浮液。
61.根據(jù)權(quán)利要求59或權(quán)利要求60制備的試劑盒中，紅細(xì)胞的抗原表達(dá)水平實(shí)質(zhì)上等同于臨床上顯著的閾值。
62.根據(jù)權(quán)利要求59至權(quán)利要求61制備的試劑盒中，包含表達(dá)RhDCce(Rlr)和Rhce(rr)抗原的紅細(xì)胞。
全文摘要
采用至少一個(gè)優(yōu)勢(shì)免疫糖修飾化酶制備低表達(dá)血型抗原的紅細(xì)胞的方法，如N－乙酰半乳糖胺酶或α－半乳糖苷酶。應(yīng)用本方法制備的紅細(xì)胞所表達(dá)的抗原實(shí)質(zhì)上只達(dá)到臨床上所能檢測(cè)到的抗原水平的閾值。應(yīng)用本方法所制備的紅細(xì)胞可以應(yīng)用于血型試劑的質(zhì)量控制和測(cè)試系統(tǒng)的校正，從而精確和標(biāo)準(zhǔn)化地判斷血型。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1751130SQ200480004362
公開(kāi)日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月17日
發(fā)明者斯蒂芬·邁克爾·亨利, 麗莎·格威妮絲·吉利佛 申請(qǐng)人:科威精密有限公司