專利名稱：草甘膦耐受性甜菜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及草甘膦耐受性甜菜植株，植物材料和種子。
背景技術(shù)：
甜菜(Beta vulgaris)在許多國(guó)家中被作為商業(yè)農(nóng)作物而栽種，其總產(chǎn)量超過240百萬公噸。
N-(膦?；谆?甘氨酸(通常被稱為草甘膦(Glyphosat))是一種廣譜除草劑，由于其高效，具有生物可降解性和對(duì)動(dòng)物與人類的低毒性故被廣泛使用。草甘膦抑制莽草酸途徑，該途徑導(dǎo)致包括氨基酸類和維生素類的芳香化合物的合成。具體而言，草甘膦通過抑制酶5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基莽草酸合酶(EPSP合酶或EPSPS)，抑制磷酸烯醇丙酮酸和3-磷酸基莽草酸反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?-烯醇丙酮酰-3-磷酸基莽草酸。當(dāng)用草甘膦處理常規(guī)植物的時(shí)候，植物不能產(chǎn)生生長(zhǎng)和生存所需的芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸和酪氨酸)。EPSPS存在于所有植物，細(xì)菌，和真菌中。它不存在于不能自身合成芳香族氨基酸的動(dòng)物中。因?yàn)榉枷阕灏被岬纳锖铣赏緩讲淮嬖谟诓溉閯?dòng)物、禽類或水生生命形式中，故即使草甘膦對(duì)這些有機(jī)體存在任何毒性，其毒性也是很少量的。EPSPS酶天然地存在于植物和微生物來源的食物中。
草甘膦是除草劑(諸如美國(guó)Monsanto公司生產(chǎn)的Roundup)中的有效成分。典型地，其以水溶性鹽諸如銨鹽、烷基胺鹽、堿金屬鹽或三甲基锍(trimethylsulfonium)鹽進(jìn)行配制。最通常的制劑之一是草甘膦的異丙胺鹽，其是Roundup除草劑中使用的形式。
已經(jīng)證明通過在植物的基因組中插入產(chǎn)生草甘膦耐受性EPSP合酶(例如來自農(nóng)桿菌屬樣品(Agrobacterium sp.)菌株CP4 AcO的CP4-EPSPS)的能力可以生產(chǎn)草甘膦耐受性植物。
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將編碼草甘膦耐受性EPSPS(例如CP4-EPSPS)的基因?qū)胫参锏幕蚪M中可以生產(chǎn)草甘膦耐受性甜菜植株。WO 99/23232中已經(jīng)公開了所述甜菜植株，其表達(dá)CP4-EPSPS。然而，由采用CP4-EPSPS基因以該方式轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所生長(zhǎng)的甜菜植株，在其性狀上存在很大差異，這是由于如下事實(shí)，即基因被插入在植物基因組中的隨機(jī)位置上。特定轉(zhuǎn)基因插入至染色體上特定位置通常被稱為“事件(event)”。術(shù)語“事件”也用來區(qū)分遺傳工程化農(nóng)作物品種。合乎需要的事件是非常稀少的。由于轉(zhuǎn)基因被插入到具有生長(zhǎng)重要性的植物基因中，導(dǎo)致基因斷裂和不表達(dá)，或轉(zhuǎn)基因插入到不能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)或使其表達(dá)非常低的染色體部分中，因此絕大多數(shù)的事件是會(huì)被廢棄的。因?yàn)檫@個(gè)原因，為了識(shí)別特征在于導(dǎo)入基因充分表達(dá)的事件，就需要篩選大量的事件。這個(gè)過程非常費(fèi)時(shí)而且成本高昂，而且其絕非可以保證能夠發(fā)現(xiàn)具有滿意性質(zhì)的植株。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供甜菜植株，其表現(xiàn)出對(duì)抗草甘膦的高水平耐受性，但不具有在其他重要農(nóng)學(xué)性質(zhì)諸如生長(zhǎng)、產(chǎn)量、品質(zhì)、病原抗性等方面上的缺點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的草甘膦耐受性甜菜植株的特征在于a)甜菜植株獲自保藏于NCIMB，Aberdeen(蘇格蘭，英國(guó))，保藏號(hào)為NCIMB 41158或NCIMB 41159的種子，和/或b)采用含有SEQ ID NO1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增630-700bp，優(yōu)選664bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQ ID NO3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增3500-3900bp，優(yōu)選3706bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQ ID NO7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增270-300bp，優(yōu)選288bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQ ID NO9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增710-790bp，優(yōu)選751bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQ ID NO14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株的基因組DNA中擴(kuò)增990-1100bp，優(yōu)選1042bp的DNA片段。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是用于擴(kuò)增核酸分子的眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見，例如US 4,683,202)。
根據(jù)本發(fā)明的甜菜植株(以下稱為“事件H7-1”)表現(xiàn)出對(duì)草甘膦除草劑高度耐受。此外，事件H7-1的生長(zhǎng)性狀和其他重要農(nóng)學(xué)性質(zhì)未受轉(zhuǎn)化過程影響。事件H7-1表達(dá)高水平的農(nóng)桿菌-CP4-EPSPS-基因，該基因被穩(wěn)定地?fù)饺胫参锘蚪M中，且其為植物提供草甘膦耐受性。植物通過采用二元載體PV-BVGT08的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行制備。該載體在左和右邊界區(qū)(“Border”區(qū))之間包含下列序列編碼區(qū)，其由來自擬南芥EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列(稱為ctp2)組成，該編碼序列與CP4-EPSPS編碼序列結(jié)合，且處于玄參花葉病毒啟動(dòng)子(pFMV)和來自豌豆的E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列的調(diào)控下。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，3706bp、664bp、288bp、751bp和1042bp DNA片段分別顯示出與SEQ ID NO6、SEQ ID NO13、SEQ IDNO11、SEQ ID NO12或SEQ ID NO17的核苷酸序列至少95％，優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選至少99.9％的同一性。例如，95％同一性意指特定序列95％的核苷酸與對(duì)比序列相同。為此目的，序列可采用BLAST程序(例如可獲自http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html)進(jìn)行排列和對(duì)比。最優(yōu)選地，3706bp DNA片段含有SEQ ID NO6的核苷酸序列，664bp DNA片段含有SEQ ID NO13的核苷酸序列，288bp DNA片段含有SEQ ID NO11的核苷酸序列，751bp DNA片段含有SEQ ID NO12的核苷酸序列，和/或1042bp DNA片段含有SEQ IDNO17的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及保藏于NCIMB，Aberdeen(蘇格蘭，英國(guó))，保藏號(hào)為NCIMB 41158或NCIMB 41159的種子。所述種子可被用于獲得草甘膦耐受性的甜菜植株。種子可被鋸開且成長(zhǎng)的植物將具有草甘膦耐受性。
本發(fā)明還涉及草甘膦耐受性的甜菜植株的細(xì)胞、組織或部分。
本發(fā)明另一方面是草甘膦耐受性甜菜植株的鑒定方法，其特征在于，該方法包含以下步驟a)采用含有SEQ ID NO1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增630-700bp，優(yōu)選664bp的DNA片段，和/或b)采用含有SEQ ID NO3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增3500-3900bp，優(yōu)選3706bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQ ID NO7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增270-300bp，優(yōu)選288bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQ ID NO9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增710-790bp，優(yōu)選751bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQ ID NO14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株的基因組DNA中擴(kuò)增990-1100bp，優(yōu)選1042bp的DNA片段。
該方法提供了采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因草甘膦耐受性甜菜植株的檢測(cè)。
本發(fā)明還涉及用于鑒定轉(zhuǎn)基因草甘膦耐受性甜菜植株或其細(xì)胞、組織或部分的試劑盒。試劑盒包括至少一個(gè)引物對(duì)，該引物對(duì)含有用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的第一引物和第二引物，其可以特異地識(shí)別事件H7-1，其細(xì)胞、組織或部分。
優(yōu)選地，第一引物含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO7或SEQ IDNO9或SEQ ID NO14的核苷酸序列，第二引物優(yōu)選含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO8或SEQ ID NO10或SEQ ID NO16的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，第一引物和第二引物各識(shí)別形成SEQ ID NO5核苷酸序列的部分的核苷酸序列。
下列附圖用于說明本發(fā)明。其顯示了


圖1二元載體和PV-BVGT08的圖譜圖2通過PCR分析鑒定H7-1。分析來自18個(gè)植物的DNA樣品。陰性對(duì)照＝來自非轉(zhuǎn)化甜菜的DNA；陽(yáng)性對(duì)照＝來自H7-1原始轉(zhuǎn)化體的DNA。
圖3通過多重PCR和在轉(zhuǎn)基因事件H7-1和非轉(zhuǎn)基因植株之間的區(qū)別來鑒定事件H7-1。分析來自54個(gè)植物的DNA探針。
圖4pFMV-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3’-插入片段，其具有限制性內(nèi)切酶HindIII、XbaI、ClaI、PstI和BamHI的剪切位點(diǎn)。
圖5事件H7-1的插入片段/拷貝數(shù)分析。采用PstI、HindIII、XbaI、ClaI和BamHI(泳道3-7)酶切10μg H7-1基因組DNA，用于Southern印跡分析。用BamHI酶切作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)化基因組DNA(泳道8)。用BamHI酶切作為陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)粒PV-BVGT08。泳道2和9表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。印跡采用32P-標(biāo)記的CP4-EPSPS編碼區(qū)作為探針。該探針是涵蓋堿基對(duì)447-1055的CP4-EPSPS基因的內(nèi)部序列。
圖6事件H7-1的Southern印跡分析，用來評(píng)估ctp2-CP4-EPSPS編碼區(qū)的完整性。用XbaI和HindIII/BamHI酶切10μg與PV-BVGT08混合的H7-1基因組DNA，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA。印跡采用32P-標(biāo)記的CP4-EPSPS-PCR片段作為探針。
圖7事件H7-1的Southern印跡分析，用來評(píng)估啟動(dòng)子區(qū)完整性。用HindIII，XbaI和SacI/XhoI酶切10μg與PV-BVGT08混和的H7-1基因組DNA，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA。印跡采用32P-標(biāo)記的啟動(dòng)子片段(HindIII)(＝PV-BVGT08序列，Bp 7972-8583)或完整的啟動(dòng)子-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3’-盒(PmeI/XhoI)(＝PV-BVGT08序列，Bp 7935-2389)作為探針。
圖8事件H7-1的Southern印跡分析，用來評(píng)估多腺苷酸化(Poly-A-)區(qū)域完整性。用EcoRI/PstI，XbaI，HindIII和PstI酶切10μg與PV-BVGT08混和的H7-1基因組DNA，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA。印跡采用32P-標(biāo)記的Poly-A-片段(BamHI/XhoI)(＝PV-BVGT08序列，Bp 1702-2389)作為探針。
圖9作為評(píng)估事件H7-1中“主鏈”載體DNA缺失的探針使用的片段。
圖10事件H7-1的Southern印跡分析，用來評(píng)估事件H7-1中“主鏈”DNA的缺失。用XbaI酶切10μg與PV-BVGT08混和的H7-1基因組DNA，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA。印跡采用包含PV-BVGT08(探針1-4)的整個(gè)“主鏈”的32P-標(biāo)記片段作為探針。
圖11PCR片段與左邊界區(qū)(left border，LB)上PV-BVGT08序列之間的對(duì)比。
圖12PCR片段與右邊界區(qū)(right border，RB)上PV-BVGT08序列之間的對(duì)比。
圖13插入片段右接頭外的基因組DNA的分析。將大約50ng的H7-1基因組DNA、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA或水用于PCR反應(yīng)，PCR采用P1(其中兩個(gè)引物位于插入片段外)和P3(其中一個(gè)引物位于插入片段內(nèi)，而另一引物位于插入片段外)的引物組合。
圖14插入片段左接頭外的基因組DNA的分析。將大約50ng的H7-1基因組DNA、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA和水用于PCR反應(yīng)，PCR采用P2(其中兩個(gè)引物位于插入片段外)和P4(其中一個(gè)引物位于插入片段內(nèi)，而另一引物位于插入片段外)的引物組合。
圖15H7-1種子批的子代圖譜。
圖16事件H7-1的Southern印跡分析，用來評(píng)估插入的DNA是否被穩(wěn)定地整合至基因組內(nèi)。用BamHI，XbaI和HindIII酶切10μgH7-1基因組DNA(最初的轉(zhuǎn)化體H7-1-1995和三個(gè)子代，H7-1-1996至1998)和來自不同來源的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA。印跡用PV-BVGT08(＝Bp 447-1555)的32P-標(biāo)記CP4-EPSPS探針進(jìn)行檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
參照以下實(shí)施例(僅以例舉說明的方式)進(jìn)一步解釋本發(fā)明。
以下是所使用的縮寫的列表～ 大約℃ 攝氏度bidest 雙蒸無菌水bp 堿基對(duì)CTAB 溴化十六烷基三甲基銨DNA脫氧核糖核酸
E.coli 大腸桿菌EDTA乙二胺四乙酸Fig.圖h 小時(shí)HCl 鹽酸kb 千堿基對(duì)kg 公斤M，mM， 摩爾，毫摩爾min 分鐘Na2HPO4/NaH2PO4磷酸鈉NaCl氯化鈉NaOH氫氧化鈉nt 核苷酸PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Pmol皮摩爾RNase 核糖核酸核酸酶rpm 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)RR Roundup ReadyRT 室溫SDS 十二烷基硫酸鈉sec 秒SEVAG 氯仿∶異戊醇(24∶1)SSC 標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽鹽水TE 三-EDTA緩沖液TRIS三(羥甲基)氨基甲烷實(shí)施例1事件H7-1的鑒定甜菜(Beta vulgaris)基因型3S0057已在遺傳上進(jìn)行修飾以便表達(dá)CP4-5-烯醇-丙酮酰-莽草酸-3-磷酸鹽合酶或CP4-EPSPS，其提供了對(duì)除草劑草甘膦的耐受性，且也可被用作可選擇的標(biāo)記。該轉(zhuǎn)基因品系通過采用二元載體PV-BVGT08的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)來制備。用于甜菜轉(zhuǎn)化的載體的T-DNA在左和右邊界區(qū)之間包含以下序列編碼區(qū)，其由來自擬南芥EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列(稱為ctp2)組成，該編碼序列與CP4-EPSPS編碼序列結(jié)合，且處于35S玄參花葉病毒啟動(dòng)子(pFMV)和來自豌豆的rbcS-E9-基因的3’轉(zhuǎn)錄終止序列的調(diào)控下。
采用以下方法I.DNA提取方法1收集新鮮葉子或其它組織(20-100mg在1.5ml反應(yīng)管中)，加入400μl提取緩沖液(如下)。用小研杵研碎組織。將混合物渦旋5秒，然后在室溫下孵育30分鐘至60分鐘。隨后以13,000rpm實(shí)施離心步驟1分鐘。將包含DNA的上清液注入新1.5ml反應(yīng)管內(nèi)，與120μl異丙醇混合?；旌衔镌谑覝叵路跤?分鐘。加入乙醇后形成DNA沉淀。13,000rpm離心5分鐘后，緩慢傾出乙醇。使樣品風(fēng)干。將片狀沉淀物再溶于400μl H2O或TE緩沖液(如下)中。
提取緩沖液(100ml)20ml 1M Tris(pH7.5)5ml 5M NaCl5ml 0.5M EDTA2.5ml20％SDS67.5ml H2OTE緩沖液10mM Tris-HCl(pH8.0)1mM EDTA。
方法2在1.5ml Eppendorf管內(nèi)收集新鮮植物材料(20-100mg)，加入500μlCTAB緩沖液(65℃)(如下)。混合物在65℃孵育1-1.5小時(shí)，隨后離心5秒。加入5μlRNase A(10mg/ml)?；旌衔镌?7℃孵育30分鐘，隨后離心5秒。加入200μl SEVAG。混合并在13,000rpm離心10分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml反應(yīng)管中。1體積異丙醇(約400μl)與上清液小心混合。之后13,000rpm離心10分鐘。加入600μl 70％乙醇。通過反轉(zhuǎn)管數(shù)次來洗滌片狀沉淀物?；旌衔镌僖淮卧?3,000rpm離心2分鐘。小心地傾出乙醇。將管在干凈的紙上倒置并引流。樣品風(fēng)干15分鐘。片狀沉淀物再溶于50μl H2O中(如下)。
CTAB緩沖液1.4M NaCl20mM EDTA100mM Tris-HCl2％(w/v) CTABSEVAG氯仿∶異戊醇(24∶1)RNase-緩沖液10mM Tris，15mM NaCl，pH7.5RNase A10mg RNase/ml RNase-緩沖液(5ml bidest+50mg RNase A，等份于1.5ml反應(yīng)管中，100℃煮沸反應(yīng)管30分鐘，在-20℃貯存)通常使用方法1。用這種方法可每天提取大量DNA樣品而且DNA的品質(zhì)是可接受的。當(dāng)葉子材料較老或如果存在DNA品質(zhì)問題的時(shí)候使用方法2。方法2較為復(fù)雜，需要更多時(shí)間，且所得DNA產(chǎn)量較低，但其具有較高的品質(zhì)。
通常，不進(jìn)行DNA定量，通常在PCR反應(yīng)中使用0.5-1μl提取的DNA溶液。
II.PCR反應(yīng)對(duì)于PCR反應(yīng)，制備緩沖液+dNTP的10x緩沖液混合物。步驟如下
母液體積 10x PCR反應(yīng)最終濃度緩沖液濃度1M Tris-HCl，pH8,3 100μl 0,1M10mM Tris-HCl，pH8,31M KCl 500μl 0,5M50mM KCl100mM dATP 20μl2mM 0,2mM dATP100mM dCTP 20μl2mM 0,2mM dCTP100mM dTTP 20μl2mM 0,2mM dTTP100mM dGTP 20μl2mM 0,2mM dGTP100mM MgCl2150μl 15mM1,5mM MgCl2HPLC-水 170μl共計(jì)1000μlPCR反應(yīng)(25μl)DNA 0.5μl引物1 1μl(20pmol)引物2 1μl(20pmol)Taq聚合酶1 0.2μl(1U，獲自O(shè)ncor AppligeneS.A.，Heidelberg，德國(guó))緩沖液10x濃度 2.5μl水 18.8μlIII.通過PCR鑒定H7-1通過采用事件特異引物的PCR實(shí)行H7-1的鑒定上游引物(SEQ ID NO1)H7-207U305′TTA ATT TTT GCA GGC GAT GGT GGC TGT TAT 3′下游引物(SEQ ID NO2)H7-841L305′CAT ACG CAT TAG TGA GTG GGC TGT CAG GAC 3′上游引物位于插入片段之外，是甜菜基因組DNA的一部分。下游引物位于插入的CP4-EPSPS基因內(nèi)。
PCR條件
94℃ 4min 步驟195℃ 30sec步驟2a55℃ 30sec步驟2b72℃ 2min 步驟2c72℃ 5min 步驟34℃ 過夜 步驟4反應(yīng)結(jié)束重復(fù)步驟2a-c 34次。
預(yù)期的PCR產(chǎn)物是664bp的DNA片段(SEQ ID NO13，見圖2)。
IV.通過多重PCR鑒定H7-1對(duì)于非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株(無論是純合的或是雜合的)的辨別，使用三種不同的引物實(shí)施多重PCR。使用下列引物H72(SEQ ID NO14)5′GCTCTGACACAACCGGTAAATGCATTGGCC 3′H7S2(SEQ ID NO15)5′GACCCATAGTTTGATTTTAAGCACGACATG 3′H7R2(SEQ ID NO16)5′GCAGATTCTGCTAACTTGCGCCATCGGAG 3′PCR條件94℃ 2min 步驟194℃ 1sec 步驟2a60℃ 45sec 步驟2b72℃ 90sec 步驟2c72℃ 5min 步驟34℃ 過夜步驟4反應(yīng)結(jié)束步驟2a-c 重復(fù)34次。
非轉(zhuǎn)基因植株僅顯現(xiàn)一段約350bp的PCR片段。純合的轉(zhuǎn)基因植株顯現(xiàn)一段約1.042kb的片段。雜合的植物顯現(xiàn)兩個(gè)片段(見圖3)。
實(shí)施例2事件H7-1的特征化實(shí)施分子分析來對(duì)H7-1中存在的整合的DNA進(jìn)行特征化。具體而言，測(cè)定插入片段數(shù)目(甜菜基因組內(nèi)整合位點(diǎn)的數(shù)目)，拷貝數(shù)(一個(gè)基因座內(nèi)DNA片段的數(shù)目)，插入的編碼區(qū)的完整性及其調(diào)控元件，pFMV啟動(dòng)子和E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列，用于轉(zhuǎn)化的載體“主鏈”序列的缺失和插入片段的穩(wěn)定遺傳性。此外，鑒定側(cè)接于DNA插入片段的序列。
通過使用Southern印跡，PCR和反向PCR技術(shù)對(duì)甜菜轉(zhuǎn)化事件H7-1的插入的DNA進(jìn)行特征描述。其中包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照(PV-BVGT08，非轉(zhuǎn)基因植株DNA)，并且用與試樣(H7-1)同樣的方法處理。
從1997年種植的事件H7-1植物批號(hào)74903H中分離DNA。還從1995年原始轉(zhuǎn)化體H7-1/3S0057(＝6401VH)和1996年，1997年和1998年生產(chǎn)的三個(gè)其它子代(H7-1/64801H，H7-1/74922H和H7-1/83002S)中分離DNA。
非轉(zhuǎn)基因甜菜品系3S0057作為對(duì)照。此外，甜菜品系5R7150，8K1180和6S0085用作陰性對(duì)照。該品系是用于培育傳統(tǒng)的甜菜的普通非轉(zhuǎn)基因品系。
參照物與用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒PV-BVGT08相對(duì)應(yīng)。將質(zhì)粒DNA和來自對(duì)照甜菜品系的DNA混合在一起，用限制性內(nèi)切酶酶切，并與試樣平行在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離。質(zhì)?？勺鳛轭A(yù)期片段的分子量標(biāo)記并可作為陽(yáng)性雜交對(duì)照。以代表低于1拷貝的分析元件的濃度，將質(zhì)粒DNA與基因組植物DNA混合，以便證實(shí)Southern印跡法的敏感性(～10μg基因組DNA和～28pg PV-BVGT08-DNA)。使用分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物RAOULTM(ONCOR/Appligene，貨號(hào)#160673)估測(cè)分子大小。
DNA分離用研缽和研杵將來自事件H7-1的批號(hào)74903H的植物組織(1-3g濕重)在液氮中磨為細(xì)粉。粉末轉(zhuǎn)移到50ml Oakridge管，然后加入7.5ml預(yù)熱(60℃)的CTAB緩沖液(2％CTAB，100mM Tris-HCl，20mM EDTA pH8.0，1.4M NaCl和0.2％巰基乙醇)。采用間歇攪拌將樣品在65℃孵育大約30分鐘。在樣品中加入等體積(8ml)的RT氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)混合物。將混懸液反轉(zhuǎn)混和，然后離心(10min，9000rpm)使兩相分離。水相轉(zhuǎn)移到新50ml Oakridge管，然后加入5ml異丙醇使DNA沉淀。離心(2min，9000rpm)得到片狀沉淀的DNA并棄去上清液。沉淀的DNA用76％乙醇和10mM乙酸銨的洗滌溶液孵育大約20分鐘。在離心分離和傾析上清液后，真空干燥DNA并將其再溶于TE中，pH8.0 4℃過夜。
作為可選方法，通過獲自Qiagen(Düsseldorf，德國(guó)，貨號(hào)#68163)的DNeasy Plant Maxi Kit分離DNA。根據(jù)廠商說明實(shí)施DNA分離。
作為其它的可選方法，通過獲自Qiagen(Düsseldorf，德國(guó)，貨號(hào)#69103)的DNeasy Plant Mini Kits分離DNA。根據(jù)廠商說明實(shí)施DNA分離。
DNA定量和限制性內(nèi)切酶酶切采用LKB Biochrom UV/可視分光光度計(jì)(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))實(shí)施DNA定量，或可選地，在瓊脂糖凝膠電泳后通過用RFLPscan程序(MWG-Biotech，Ebersberg，德國(guó))掃描DNA，完成DNA定量。采用獲自Gibco/Life Technologies (Karlsruhe，德國(guó))(貨號(hào)#10496-016)的High DNA Mass Ladder作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Boehringer Mannheim(Mannheim，德國(guó))、Stratagene(Amsterdam，Niederlande)或New England Biolabs(Frankfurt，德國(guó))并且根據(jù)廠商手冊(cè)進(jìn)行使用。
DNA探針制備從E.coli培養(yǎng)物中分離PV-BVGT08 DNA。通過采用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切，然后用瓊脂糖凝膠電泳或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分離，制備與CP4-EPSPS編碼區(qū)，35S啟動(dòng)子，E9-3’-poly-A-區(qū)，35S-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3’-盒和“主鏈”區(qū)同源的探針模板。產(chǎn)物用BIO 101(La Jolla，CA)的Gene Clean II試劑盒純化。采用Amersham-Pharmacia Biotech Europe(Freiburg，德國(guó))的MegaprimeTMDNA標(biāo)記系統(tǒng)實(shí)施用32P-dCTP或32P-dATP對(duì)探針(25pg)的標(biāo)記。
Southern印跡分析限制性內(nèi)切酶處理的DNA的樣品用瓊脂糖凝膠電泳在～35伏特分離～15小時(shí)。凝膠成像后，在0.25M HCl-溶液中浸泡凝膠15分鐘使DNA脫嘌呤，凝膠在0.5M NaOH，1.5M NaCl的變性溶液中持續(xù)輕柔攪拌孵育30分鐘使DNA變性，最后通過在若干體積的2M NaCl和1M Tris-HCl，pH5.5的溶液中浸泡2小時(shí)使DNA中和。采用獲自Stratagene的Pressure Blotter，根據(jù)廠商手冊(cè)，將獲自瓊脂糖凝膠的DNA轉(zhuǎn)移至Hybond-NTM尼龍膜(Amersham Pharmacia BiotechEurope，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。在將濾器置于2xSSPE(20xSSPE3.6MNaCl，20mM EDTA，0.2M NaH2PO4/Na2HPO4pH7.4)中浸泡15分鐘后，通過紫外線(Transilluminator Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))照射1分鐘以及在真空干燥箱中80℃烘烤1小時(shí)從而將DNA固定于膜上。在50％甲酰胺，5xSSC，0.1％月桂酰肌氨酸，0.02％SDS和2％封閉劑(Boehringer Mannheim，德國(guó)，貨號(hào)#1096176)的水溶液中將印跡預(yù)雜交4小時(shí)。與放射標(biāo)記的探針的雜交在新鮮的預(yù)雜交溶液中于42℃經(jīng)過16-18小時(shí)而完成。在雜交后，膜在2xSSC中于42℃洗滌5分鐘，在2xSSC，1％SDS中于65℃洗滌20分鐘，然后在0.2xSSC，0.1％SDS中于68℃洗滌15分鐘，洗兩次。通過采用Biomax-MSTM膠片連同Kodak Biomax MSTM增感屏對(duì)印跡曝光從而獲得印跡的放射自顯影圖像。
側(cè)翼5’和3’基因組序列的鑒定采用反向PCR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因-和植株基因組DNA之間的接頭。按照上面描述純化基因組DNA。大約1μg的DNA在分離的反應(yīng)中被限制性核酸酶TaqI、AluI、NdeIII或RsaI酶切。使用T4-連接酶將酶切的DNA片段再過夜連接，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用獲自NBI(National Biosciences，Inc.，Plymouth，Michigan)的引物分析軟件OLIGO獲得多種反引物組合。
該反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的片段用凝膠電泳分離，從凝膠上切取，然后采用Gene Clean IITM試劑盒純化。使用來自Invitrogen(Groningen，Niederlande)的TOPOTMTA cloning試劑盒將純化的片段克隆至載體pCR2.1。將插入片段提交給MWG-Biotech(Ebersberg，德國(guó))進(jìn)行測(cè)序。用Mac MollyTetra DNA分析軟件(SoftGene GmbH，Bochold，德國(guó))實(shí)施對(duì)所得序列數(shù)據(jù)的分析。
PCR分析采用DNAeasy Plant Mini試劑盒(Qiagen，Düsseldorf，德國(guó))，根據(jù)廠商說明，制備基因組DNA。將大約50ng的基因組DNA用于PCR。反應(yīng)設(shè)置為95℃30秒，55℃30秒，和72℃2分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。在PTC200循環(huán)儀(Biozym，Oldendorf，德國(guó))中完成PCR。
通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
1.插入片段數(shù)量對(duì)H7-1評(píng)估插入片段數(shù)量，轉(zhuǎn)基因DNA進(jìn)入甜菜基因組的整合位點(diǎn)數(shù)量。為了測(cè)定插入片段數(shù)量，用限制性內(nèi)切酶HindIII，XbaI和BamHI酶切基因組DNA。作為陰性對(duì)照的來自未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物的DNA(表示相同遺傳背景)用Hind III酶切。采用轉(zhuǎn)化載體DNA(PV-BVGT08)作為陽(yáng)性對(duì)照。
XbaI和BamHI在PV-BVGT08中僅剪切一次且不在使用的標(biāo)記CP4-EPSPS探針內(nèi)剪切(見圖4)。HindIII在PV-BVGT08中剪切三次，但所有三個(gè)位置均位于探針的外面且在同側(cè)上，5’(相對(duì)于探針)。因此，各酶會(huì)釋放出單個(gè)DNA片段，該片段可與CP4-EPSPS探針雜交，并可包含插入的DNA和鄰近的基因組植物DNA的部分。檢測(cè)到的片段數(shù)量表明在事件中存在的插入片段的數(shù)量。結(jié)果如圖5所示。
分別使用酶HindIII、XbaI或BamHI酶切后，僅發(fā)現(xiàn)單個(gè)雜交片段。來自HindIII消化(泳道4)的5.2kb片段，來自XbaI消化(泳道5)的4kb片段和來自BamHI消化(泳道7)的大約11kb片段顯示出轉(zhuǎn)化體H7-1表現(xiàn)單個(gè)整合事件(圖4)。泳道1中的強(qiáng)信號(hào)表示線性化PV-BVGT08質(zhì)粒。其它的微弱信號(hào)涉及少量未經(jīng)酶切的PV-BVGT08或涉及非特異性背景雜交信號(hào)。
2.拷貝數(shù)理論上，一個(gè)整合位點(diǎn)可由大于一個(gè)拷貝的插入的DNA組成。但是由于前述限制性分析的片段大小，故上述情況是不可能的。如果H7-1中存在大于一個(gè)拷貝的插入的DNA，則其它的片段則會(huì)被檢測(cè)到。這也可通過用限制性內(nèi)切酶PstI酶切進(jìn)行證實(shí)。PstI在左和右邊界序列中剪切兩次。限制性酶切部位之一位于CP4-EPSPS編碼區(qū)內(nèi)，因此在酶切后，可以預(yù)期兩個(gè)與CP4-EPSPS探針雜交的片段。預(yù)期片段之一與約1.2kb的內(nèi)部片段相對(duì)應(yīng)。第二個(gè)片段應(yīng)是邊界片段。而且，如果存在大于一個(gè)拷貝，其它的片段應(yīng)該是可檢測(cè)的。但是結(jié)果顯示PstI按預(yù)期的那樣剪切DNA。檢測(cè)到1.2kb的內(nèi)部片段和僅一個(gè)約4.9kb的其它片段(圖5泳道3，圖4)。
用ClaI剪切DNA作為附加的內(nèi)部對(duì)照(圖5泳道6，圖4)。與預(yù)期中一樣，2.4kb的單個(gè)片段雜交，這是因?yàn)镃laI在所用的CP4-EPSPS片段的左手側(cè)和右手側(cè)外部剪切兩次。這一結(jié)果也是整合的DNA片段完整性的證明并且與以下給出的結(jié)果一致。
質(zhì)粒PV-BVGT08(PV-BVGT08＝8590bp)與CP4-EPSPS片段的雜交產(chǎn)生8.6kb信號(hào)(圖5，泳道1)，如所預(yù)期的那樣。第二條較小的非常微弱的帶是由于PV-BVGT08的不完全限制性。
概括而言，試驗(yàn)顯示出轉(zhuǎn)化的甜菜品系H7-1含有在植物基因組中的PV-BVGT08的T-DNA單拷貝整合。
3.編碼區(qū)的完整性通過用酶HindIII酶切P-FMV，HindIII加BamHI酶切ctp2-CP4-EPSPS和EcoRI加PstI酶切E9-3’-非翻譯區(qū)來測(cè)定具有各個(gè)元件的CP4-EPSPS基因盒的完整性(就各元件而言，為P-FMV啟動(dòng)子，ctp2-CP4-EPSPS編碼區(qū)和E9-3’-非翻譯區(qū)))。采用SacI加XhoI酶切P-FMV-ctp2-CP4-EPSPS區(qū)域和E9-3’-區(qū)域來實(shí)施附加試驗(yàn)。采用相同的酶酶切與非轉(zhuǎn)基因甜菜DNA混合的質(zhì)粒DNA和單獨(dú)的非轉(zhuǎn)基因甜菜DNA，分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
這些酶在預(yù)期的DNA插入片段內(nèi)，在左和右T-DNA邊界之間，剪切(見質(zhì)粒圖譜，圖1中)，所以，如果相應(yīng)元件是完整的，則H7-1 DNA和PV-BVGT08 DNA中的雜交片段大小應(yīng)相同。
用XbaI酶切DNA作為另外的對(duì)照。XbaI在啟動(dòng)子和ctp2-CP4-EPSPS編碼區(qū)之間剪切一次。因此，可以預(yù)期含有PV-BVGT08 DNA的8.6kb片段，而在H7-1的情況下為與PV-BVGT08片段相比在大小上不同的邊界片段。結(jié)果如圖6，7和8所示。
圖6用HindIII和BamHI的酶切釋放出CP4-EPSPS基因，用PCR產(chǎn)生的CP4-EPSPS片段探測(cè)印跡。陰性對(duì)照(泳道6)未顯示任何雜交帶。來自事件H7-1的基因組DNA和與非轉(zhuǎn)基因DNA混和的質(zhì)粒PV-BVGT08兩者都產(chǎn)生大約1.7kb片段，這與預(yù)期大小相符。用XbaI的酶切產(chǎn)生預(yù)期的線性化PV-BVGT08的8.6kb片段。對(duì)于事件H7-1，酶切產(chǎn)生大約4.0kb的邊界片段(同樣參見圖4和5)。同樣，陰性對(duì)照未顯示任何信號(hào)。
圖7用HindIII的酶切釋放出玄參花葉病毒啟動(dòng)子，用PCR產(chǎn)生的啟動(dòng)子片段探測(cè)印跡。陰性對(duì)照(泳道5)未顯示任何雜交信號(hào)。來自事件H7-1的基因組DNA和與非轉(zhuǎn)基因DNA混和的質(zhì)粒PV-BVGT08兩者都產(chǎn)生大小約0.6kb的雜交片段。該片段符合啟動(dòng)子的預(yù)期大小(泳道4和6)。
用XbaI的酶切產(chǎn)生預(yù)期的線性化PV-BVGT08的8.6kb片段和來自事件H7-1的大約1.3kb大小的左邊界片段(泳道1和3)。該1.3kb片段也是對(duì)事件H7-1僅包含轉(zhuǎn)基因的單拷貝的附加證明。同樣，陰性對(duì)照(泳道2)未顯示任何信號(hào)。
用SacI/XhoI的酶切釋放出啟動(dòng)子聯(lián)同CP4-EPSPS編碼區(qū)和poly-A-區(qū)。與完整的啟動(dòng)子-ctp2-CP4-EPSPS-多腺苷酸化信號(hào)盒(PmeI/XhoI片段)雜交產(chǎn)生預(yù)期的2.3kb啟動(dòng)子-ctp2-CP4-EPSPS和0.7kb多腺苷酸化信號(hào)片段，此兩者均含有與非轉(zhuǎn)基因DNA混和的PV-BVGT08 DNA和H7-1的基因組DNA(泳道9和11)。
圖8用PstI和EcoRI的酶切釋放出E9-3’多腺苷酸化信號(hào)，用多腺苷酸化信號(hào)片段探測(cè)印跡。陰性對(duì)照(泳道3)未顯示任何雜交帶。與非轉(zhuǎn)基因DNA混合的質(zhì)粒PV-BVGT08和來自事件H7-1的基因組DNA兩者都產(chǎn)生大約0.6kb大小的片段，這與預(yù)期大小相符。用XbaI的酶切產(chǎn)生預(yù)期的線性化PV-BVGT08的8.6kb片段和含有事件H7-1的大約4.0kb大小的邊界片段。
用PstI的酶切釋放出E9-3’多腺苷酸化信號(hào)聯(lián)同0.5kb的CP4-EPSPS編碼區(qū)的3’部分。產(chǎn)生的1.2kb片段可按預(yù)期的用基因組H7-1DNA和PV-BVGT08 DNA進(jìn)行檢測(cè)。
用HindIII的酶切得到線性化PV-BVGT08減去啟動(dòng)子片段的8.0kb片段(泳道13)和含有H7-1的5.2kb邊界片段(泳道11)。來自HindIII酶切的單個(gè)5.2kb片段和來自XbaI酶切的單個(gè)4.0kb片段也是對(duì)事件H7-1僅包含一個(gè)拷貝插入的DNA的附加證明。同樣，陰性對(duì)照未顯示任何信號(hào)。
概括而言，印跡結(jié)果證明了，轉(zhuǎn)化的DNA的所有元件是完整的，且事件H7-1包含單個(gè)完整的CTP2-CP4-EPSPS編碼區(qū)和其調(diào)控元件，pFMV啟動(dòng)子和E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列。
4.用于檢測(cè)“主鏈”片段的分析Ti-質(zhì)?！爸麈湣眳^(qū)的定義是與左和右邊界序列接界的T-DNA的外部區(qū)域，其由用于細(xì)菌復(fù)制和細(xì)菌選擇的起始基因和選擇基因組成，而且其在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化時(shí)，通常不被轉(zhuǎn)移至植物基因組。為了確定在事件H7-1中不存在“主鏈”載體DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaI酶切來自H7-1的基因組DNA，來自未轉(zhuǎn)化對(duì)照的基因組DNA，和與PV-BVGT08 DNA混和的來自H7-1的基因組DNA，然后用三個(gè)重疊的由PCR產(chǎn)生的探針進(jìn)行檢測(cè)，所述探針包括完整主鏈序列。第四個(gè)探針具有在一個(gè)片段中的完整“主鏈”。
所用探針表示“主鏈”序列(見圖9)1bp2730-53702bp5278-64193bp6302-78514bp2730-7851圖10顯示Southern印跡分析的結(jié)果。泳道6，10，14和18用完整“主鏈”的“主鏈”片段探測(cè)酶切的H7-1的基因組DNA，其未顯示任何雜交帶。僅泳道4，8，12，16和20與PV-BVGT08 DNA混和的H7-1的基因組DNA顯示8.6kb的帶，如預(yù)期的那樣。條帶表示線性化PV-BVGT08 DNA。
泳道2和4H7-1基因組DNA和與PV-BVGT08混和且與CP4-EPSPS片段雜交的H7-1基因組DNA顯示出雜交信號(hào)。泳道2中4kb的帶表示右邊界片段，泳道4的兩條帶也表示4.0kb長(zhǎng)的右邊界片段和8.6kb大小的線性化PV-BVGT08質(zhì)粒。兩條帶具有相同的強(qiáng)度。這清楚地顯示出加入的PV-BVGT08 DNA的濃度與H7-1DNA中CP4-EPSPS元件的濃度相當(dāng)。使用的質(zhì)粒DNA的濃度等于0.5拷貝。如果H7-1基因組中存在整合的“主鏈”序列，則可檢測(cè)到明顯的信號(hào)。
這些結(jié)果證明了H7-1不包含任何用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的可檢測(cè)“主鏈”序列。該結(jié)果也得到5’和3’基因組側(cè)翼區(qū)分析數(shù)據(jù)的支持(如下)。
5.側(cè)翼5’和3’基因組序列的鑒定農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通常導(dǎo)致左和右邊界之間的所有序列整合至植物基因組中。整合質(zhì)粒DNA的5’和3’末端應(yīng)分別位于左或右邊界序列內(nèi)或與之鄰近。因此可用反向PCR技術(shù)識(shí)別該區(qū)域。對(duì)克隆的PCR產(chǎn)物測(cè)序，然后將序列數(shù)據(jù)與PV-BVGT08序列比較。
圖11顯示來自克隆的反向PCR片段的序列(D1U.RPT)(＝基因組H7-1，上游序列)的排列，該序列通過用于左邊界區(qū)域分析的引物獲得，與PV-BVGT08序列(下游序列)的比對(duì)。兩序列的比較顯示同源性恰在邊界序列內(nèi)終止。
圖12顯示來自克隆的反向PCR片段的序列(B3UNI.RPT)(＝基因組H7-1，上游序列)的排列，該序列通過用于右邊界區(qū)域分析的引物獲得，與PV-BVGT08序列(下游序列)的比對(duì)。兩序列的比較顯示同源性在邊界序列前18個(gè)核苷酸已經(jīng)停止。
總的來說，這清楚地顯示出，Ti-質(zhì)粒PV-BVGT08的左和右邊界之間的序列被正確地整合。序列在邊界之內(nèi)或緊接邊界之前停止。這些數(shù)據(jù)支持“主鏈”分析的結(jié)果，即沒有邊界區(qū)之外的“主鏈”序列被整合至H7-1基因組內(nèi)。
為確定甜菜事件H7-1中插入片段的右和左側(cè)上側(cè)翼序列是否為完整的植物基因組序列，采用引物組合P1，P2，P3和P4實(shí)施反向PCR分析。
引物組合P1和P2的引物位于插入片段外。如果位于事件H7-1中的插入片段基因座的DNA與未轉(zhuǎn)化對(duì)照的DNA相同，則PCR將產(chǎn)生兩個(gè)PCR片段，該片段表示來自兩個(gè)引物組合的合成。引物組合P3和P4的引物按如下方式設(shè)計(jì)，即使得各引物之一位于CP4-EPSPS插入片段內(nèi)而另一引物位于插入片段外(在植物基因組DNA內(nèi))。由此PCR應(yīng)僅產(chǎn)生來自事件H7-1的DNA的片段。
來自反向PCR技術(shù)的序列數(shù)據(jù)聯(lián)合來自PV-BVGT08載體的數(shù)據(jù)，可產(chǎn)生包含H7-1插入片段(PV-BVGT08序列)，右和左接頭區(qū)和其它甜菜基因組DNA(SEQ ID NO5)的序列。
對(duì)于鑒別轉(zhuǎn)基因至植物基因組DNA接頭(事件特異性的鑒別)和對(duì)于插入片段左和右側(cè)的基因組DNA區(qū)域，使用以下引物組合P1組合(用于分析右邊界區(qū)外基因組DNA的引物，SEQ IDNO18，SEQ ID NO19)上游引物5′CGG TAA ATG CAT TGG CCT TTG TT下游引物5′CAC CCA GAT CCC AAT AAA ACC GTA AT預(yù)期PCR產(chǎn)物241bpP2組合(用于分析左邊界區(qū)外基因組DNA的引物，SEQ IDNO20，SEQ ID NO21)上游引物5′AAA TGG TTG TAG ATA AAT AAG GAA ATC A下游引物5′ACA TGT TTG AGC ACT CTT CTT GT預(yù)期PCR產(chǎn)物377bpP3組合(用于分析轉(zhuǎn)基因至植物基因組DNA接頭的引物，SEQ IDNO7，SEQ ID NO8)上游引物5′ATG CAT TGG CCT TTG TTT TTG AT下游引物5′TGT CGT TTC CCG CCT TCA G預(yù)期PCR產(chǎn)物288bp(SEQ ID NO11)P4組合(用于分析轉(zhuǎn)基因至植物基因組DNA接頭的引物，SEQ IDNO9，SEQ ID NO10)上游引物5′CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TGA AT下游引物5′AGT TAA CTT TCC ACT TAT CGG GGC ACT G預(yù)期PCR產(chǎn)物751bp(SEQ ID NO12)采用事件H7-1 DNA和來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏腄NA的PCR試驗(yàn)(采用引物組合P3，其具有位于H7-1插入片段內(nèi)部的一個(gè)引物)可產(chǎn)生僅含事件H7-1 DNA的片段。相反，采用引物組合P1(與插入片段外部序列同源)的PCR試驗(yàn)可產(chǎn)生同時(shí)含有事件H7-1和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA的片段。這些結(jié)果見圖13。
該結(jié)果表明緊接插入片段右接頭的序列存在于轉(zhuǎn)基因事件H7-1DNA中和來自非轉(zhuǎn)基因植株的DNA中?？梢缘贸鋈缦陆Y(jié)論，即事件H7-1插入片段外的該DNA是非轉(zhuǎn)基因基因組DNA。
采用事件H7-1 DNA和來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏腄NA，以及使用引物組合P4(其含有一個(gè)位于CP4-EPSPS插入片段內(nèi)的引物)所實(shí)施的PCR試驗(yàn)產(chǎn)生僅含事件H7-1 DNA的片段。相反，使用引物組合P2(與插入片段外部序列同源)的PCR試驗(yàn)產(chǎn)生同時(shí)含有有事件H7-1的DNA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA的片段。(圖14)。
該結(jié)果表明緊接插入片段左接頭的序列存在于轉(zhuǎn)基因事件H7-1的DNA中和來自非轉(zhuǎn)基因植株的DNA中。可以得出如下結(jié)論，即事件H7-1外的DNA是非轉(zhuǎn)基因基因組DNA。
概括而言，可以描述如下，即甜菜事件H7-1插入片段外部的序列與非轉(zhuǎn)基因植株中存在的序列相同?？梢缘贸鋈缦陆Y(jié)論，這些序列是用于轉(zhuǎn)化的親本品系和其它常規(guī)甜菜品系中存在的植物基因組序列。
6.子代穩(wěn)定性為了證明整合DNA的穩(wěn)定性，將原始轉(zhuǎn)化事件H7-1和通過與非轉(zhuǎn)基甜菜品系自花傳粉得到的該品系的三個(gè)子代(64801H，74922H和83002S；見圖15)進(jìn)行比較。最初轉(zhuǎn)化品系和子代產(chǎn)于1995年，1996年，1997年和1998年。
四個(gè)不同的非轉(zhuǎn)基因甜菜品系(3S0057，5R7150，8K1180，6S0085)作為對(duì)照進(jìn)行分析。分別用XbaI，HindIII和BamHI酶切所有DNA，然后與標(biāo)記的CP4-EPSPS片段雜交。為了證明T-DNA被穩(wěn)定地整合至植物基因組中，采用相同限制性內(nèi)切酶酶切的H7-1子代的所有泳道應(yīng)表現(xiàn)為準(zhǔn)確相同大小的條帶。
來自H7-1子代的DNA泳道3-6顯示出預(yù)期片段用BamHI酶切的DNA為大約11kb的條帶，用XbaI酶切產(chǎn)生4.0kb的片段而HindIII限制性酶切產(chǎn)生5.2kb的條帶。來自相同限制性酶切但來自不同年份的所有條帶在其大小上相同。所有非轉(zhuǎn)基因品系未顯示任何信號(hào)(圖16)。
這些結(jié)果證明了引入的序列被穩(wěn)定地整合至基因組DNA中并被穩(wěn)定地遺傳。
序列記錄-自由文本SEQ ID5<223>用側(cè)翼3′-和5′-序列插入的DNASEQ ID6<223>PCR-產(chǎn)物
SEQ ID11<223>PCR-產(chǎn)物SEQ ID12<223>PCR-產(chǎn)物SEQ ID13<223>PCR-產(chǎn)物SEQ ID17<223>PCR-產(chǎn)物序列表<110>KWS SAAT AG<120>草甘膦耐受性甜菜<130>PCT 0079<150>EP03003866.5<151>2003-02-20<150>US10/376763<151>2003-02-28<160>21<170>專利版本3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ttaatttttg caggcgatgg tggctgttat 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2catacgcatt agtgagtggg ctgtcaggac 30<210>3<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3atgttatctt taccacagtt 20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gtccctaaat gaaatacgta aaac 24<210>5<211>3778<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用3’和5’側(cè)翼序列插入的DNA<400>5ctcgagcggc cgccagtgtg atggatatct gcagaattcg cccttatgtt atctttacca 60cagtttgttg ctctgacaca accggtaaat gcattggcct ttgtttttga tggcatcaac120tttggagcat ctgattttgc atattcagcc ttttccatgg taattctttt acaagaattt180tcattctttc ttaagtataa acacttagct tgggacaaac ttctgatcct atttcttaat240ttttgcaggt gatggtggct gttatgagca ttttgtgttt gatgtttctt tcttctcatt300acggttttat tgggatctgg gtggctctaa ctatttacat gagcctccgc gcgtttgctg360aaggcgggaa acgacaatct gatccccatc aagcttgagc tcaggattta gcagcattcc420
agattgggtt caatcaacaa ggtacgagcc atatcacttt attcaaattg gtatcgccaa480aaccaagaag gaactcccat cctcaaaggt ttgtaaggaa gaattctcag tccaaagcct540caacaaggtc agggtacaga gtctccaaac cattagccaa aagctacagg agatcaatga600agaatcttca atcaaagtaa actactgttc cagcacatgc atcatggtca gtaagtttca660gaaaaagaca tccaccgaag acttaaagtt agtgggcatc tttgaaagta atcttgtcaa720catcgagcag ctggcttgtg gggaccagac aaaaaaggaa tggtgcagaa ttgttaggcg780cacctaccaa aagcatcttt gcctttattg caaagataaa gcagattcct ctagtacaag840tggggaacaa aataacgtgg aaaagagctg tcctgacagc ccactcacta atgcgtatga900cgaacgcagt gacgaccaca aaagaattcc ctctatataa gaaggcattc attcccattt960gaaggatcat cagatactca accaatcctt ctagaagatc taagcttatc gataagcttg 1020atgtaattgg aggaagatca aaattttcaa tccccattct tcgattgctt caattgaagt 1080ttctccgatg gcgcaagtta gcagaatctg caatggtgtg cagaacccat ctcttatctc 1140caatctctcg aaatccagtc aacgcaaatc tcccttatcg gtttctctga agacgcagca 1200gcatccacga gcttatccga tttcgtcgtc gtggggattg aagaagagtg ggatgacgtt 1260aattggctct gagcttcgtc ctcttaaggt catgtcttct gtttccacgg cgtgcatgct 1320tcacggtgca agcagccgtc cagcaactgc tcgtaagtcc tctggtcttt ctggaaccgt 1380ccgtattcca ggtgacaagt ctatctccca caggtccttc atgtttggag gtctcgctag 1440cggtgaaacc cgtatcaccg gtcttttgga aggtgaagat gttatcaaca ctggtaaggc 1500tatgcaagct atgggtgcca gaatccgtaa ggaaggtgat acttggatca ttgatggtgt 1560tggtaacggt ggactccttg ctcctgaggc tcctctcgat ttcggtaacg ctgcaactgg 1620ttgccgtttg actatgggtc ttgttggtgt ttacgatttc gatagcactt tcattggtga 1680cgcttctctc actaagcgtc caatgggtcg tgtgttgaac ccacttcgcg aaatgggtgt 1740
gcaggtgaag tctgaagacg gtgatcgtct tccagttacc ttgcgtggac caaagactcc1800aacgccaatc acctacaggg tacctatggc ttccgctcaa gtgaagtccg ctgttctgct1860tgctggtctc aacaccccag gtatcaccac tgttatcgag ccaatcatga ctcgtgacca1920cactgaaaag atgcttcaag gttttggtgc taaccttacc gttgagactg atgctgacgg1980tgtgcgtacc atccgtcttg aaggtcgtgg taagctcacc ggtcaagtga ttgatgttcc2040aggtgatcca tcctctactg ctttcccatt ggttgctgcc ttgcttgttc caggttccga2100cgtcaccatc cttaacgttt tgatgaaccc aacccgtact ggtctcatct tgactctgca2160ggaaatgggt gccgacatcg aagtgatcaa cccacgtctt gctggtggag aagacgtggc2220tgacttgcgt gttcgttctt ctactttgaa gggtgttact gttccagaag accgtgctcc2280ttctatgat cgacgagtatc caattctcgc tgttgcagct gcattcgctg aaggtgctac2340cgttatgaac ggtttggaag aactccgtgt taaggaaagc gaccgtcttt ctgctgtcgc2400aaacggtctc aagctcaacg gtgttgattg cgatgaaggt gagacttctc tcgtcgtgcg2460tggtcgtcct gacggtaagg gtctcggtaa cgcttctgga gcagctgtcg ctacccacct2520cgatcaccgt atcgctatga gcttcctcgt tatgggtctc gtttctgaaa accctgttac2580tgttgatgat gctactatga tcgctactag cttcccagag ttcatggatt tgatggctgg2640tcttggagct aagatcgaac tctccgacac taaggctgct tgatgagctc aagaattcga2700gctcggtacc ggatcctcta gctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc2760gtcaagttca atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gtttgagtat2820tatggcattg ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt2880ttttattcgg ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa2940tgatatggtc cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg3000tgtgttgaat ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc3060
aaatcgtggc ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca 3120ttatgcttat tcactaggca acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac 3180tgaatacaag tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt 3240ccagaatcct tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg 3300tagttgagta tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat 3360gcatcaatcg acctgcagcc actcgaagcg gccgccactc gagtggtggc cgcatcgatc 3420gtgaagtttc tcatctaagc ccccatttgg acgtgaatgt agacacgtcg aaataaagat 3480ttccgaatta gaataatttg tttattgctt tcgcctataa atacgacgga tcgtaatttg 3540tcgttttatc aaaatgtact ttcattttat aataacgctg cggacatcta catttttgaa 3600ttgaaaaaaa ttggtaatta ctctttcttt ttctccatat tgaccatcat actcattgct 3660gatccatgta gatttcccgg acatgaagcc atttacaatt gaatatatcc taagtaaaac 3720ctcataggtt ttacgtattt catttaggga caagggcgaa ttccagcaca ctggcggc3778<210>6<211>3706<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR產(chǎn)物<400>6atgttatctt taccacagtt tgttgctctg acacaaccgg taaatgcatt ggcctttgtt 60tttgatggca tcaactttgg agcatctgat tttgcatatt cagccttttc catggtaatt120cttttacaag aattttcatt ctttcttaag tataaacact tagcttggga caaacttctg180atcctatttc ttaatttttg caggtgatgg tggctgttat gagcattttg tgtttgatgt240ttctttcttc tcattacggt tttattggga tctgggtggc tctaactatt tacatgagcc300
tccgcgcgtt tgctgaaggc gggaaacgac aatctgatcc ccatcaagct tgagctcagg360atttagcagc attccagatt gggttcaatc aacaaggtac gagccatatc actttattca420aattggtatc gccaaaacca agaaggaact cccatcctca aaggtttgta aggaagaatt480ctcagtccaa agcctcaaca aggtcagggt acagagtctc caaaccatta gccaaaagct540acaggagatc aatgaagaat cttcaatcaa agtaaactac tgttccagca catgcatcat600ggtcagtaag tttcagaaaa agacatccac cgaagactta aagttagtgg gcatctttga660aagtaatctt gtcaacatcg agcagctggc ttgtggggac cagacaaaaa aggaatggtg720cagaattgtt aggcgcacct accaaaagca tctttgcctt tattgcaaag ataaagcaga780ttcctctagt acaagtgggg aacaaaataa cgtggaaaag agctgtcctg acagcccact840cactaatgcg tatgacgaac gcagtgacga ccacaaaaga attccctcta tataagaagg900cattcattcc catttgaagg atcatcagat actcaaccaa tccttctaga agatctaagc960ttatcgataa gcttgatgta attggaggaa gatcaaaatt ttcaatcccc attcttcgat 1020tgcttcaatt gaagtttctc cgatggcgca agttagcaga atctgcaatg gtgtgcagaa 1080cccatctctt atctccaatc tctcgaaatc cagtcaacgc aaatctccct tatcggtttc 1140tctgaagacg cagcagcatc cacgagctta tccgatttcg tcgtcgtggg gattgaagaa 1200gagtgggatg acgttaattg gctctgagct tcgtcctctt aaggtcatgt cttctgtttc 1260cacggcgtgc atgcttcacg gtgcaagcag ccgtccagca actgctcgta agtcctctgg 1320tctttctgga accgtccgta ttccaggtga caagtctatc tcccacaggt ccttcatgtt 1380tggaggtctc gctagcggtg aaacccgtat caccggtctt ttggaaggtg aagatgttat 1440caacactggt aaggctatgc aagctatggg tgccagaatc cgtaaggaag gtgatacttg 1500gatcattgat ggtgttggta acggtggact ccttgctcct gaggctcctc tcgatttcgg 1560taacgctgca actggttgcc gtttgactat gggtcttgtt ggtgtttacg atttcgatag 1620
cactttcatt ggtgacgctt ctctcactaa gcgtccaatg ggtcgtgtgt tgaacccact1680tcgcgaaatg ggtgtgcagg tgaagtctga agacggtgat cgtcttccag ttaccttgcg1740tggaccaaag actccaacgc caatcaccta cagggtacct atggcttccg ctcaagtgaa1800gtccgctgtt ctgcttgctg gtctcaacac cccaggtatc accactgtta tcgagccaat1860catgactcgt gaccacactg aaaagatgct tcaaggtttt ggtgctaacc ttaccgttga1920gactgatgct gacggtgtgc gtaccatccg tcttgaaggt cgtggtaagc tcaccggtca1980agtgattgat gttccaggtg atccatcctc tactgctttc ccattggttg ctgccttgct2040tgttccaggt tccgacgtca ccatccttaa cgttttgatg aacccaaccc gtactggtct2100catcttgact ctgcaggaaa tgggtgccga catcgaagtg atcaacccac gtcttgctgg2160tggagaagac gtggctgact tgcgtgttcg ttcttctact ttgaagggtg ttactgttcc2220agaagaccgt gctccttcta tgatcgacga gtatccaatt ctcgctgttg cagctgcatt2280cgctgaaggt gctaccgtta tgaacggttt ggaagaactc cgtgttaagg aaagcgaccg2340tctttctgct gtcgcaaacg gtctcaagct caacggtgtt gattgcgatg aaggtgagac2400ttctctcgtc gtgcgtggtc gtcctgacgg taagggtctc ggtaacgctt ctggagcagc2460tgtcgctacc cacctcgatc accgtatcgc tatgagcttc ctcgttatgg gtctcgtttc2520tgaaaaccct gttactgttg atgatgctac tatgatcgct actagcttcc cagagttcat2580ggatttgatg gctggtcttg gagctaagat cgaactctcc gacactaagg ctgcttgatg2640agctcaagaa ttcgagctcg gtaccggatc ctctagctag agctttcgtt cgtatcatcg2700gtttcgacaa cgttcgtcaa gttcaatgca tcagtttcat tgcgcacaca ccagaatcct2760actgagtttg agtattatgg cattgggaaa actgtttttc ttgtaccatt tgttgtgctt2820gtaatttact gtgtttttta ttcggttttc gctatcgaac tgtgaaatgg aaatggatgg2880agaagagtta atgaatgata tggtcctttt gttcattctc aaattaatat tatttgtttt2940
ttctcttatt tgttgtgtgt tgaatttgaa attataagag atatgcaaac attttgtttt 3000gagtaaaaat gtgtcaaatc gtggcctcta atgaccgaag ttaatatgag gagtaaaaca 3060cttgtagttg taccattatg cttattcact aggcaacaaa tatattttca gacctagaaa 3120agctgcaaat gttactgaat acaagtatgt cctcttgtgt tttagacatt tatgaacttt 3180cctttatgta attttccaga atccttgtca gattctaatc attgctttat aattatagtt 3240atactcatgg atttgtagtt gagtatgaaa atatttttta atgcatttta tgacttgcca 3300attgattgac aacatgcatc aatcgacctg cagccactcg aagcggccgc cactcgagtg 3360gtggccgcat cgatcgtgaa gtttctcatc taagccccca tttggacgtg aatgtagaca 3420cgtcgaaata aagatttccg aattagaata atttgtttat tgctttcgcc tataaatacg 3480acggatcgta atttgtcgtt ttatcaaaat gtactttcat tttataataa cgctgcggac 3540atctacattt ttgaattgaa aaaaattggt aattactctt tctttttctc catattgacc 3600atcatactca ttgctgatcc atgtagattt cccggacatg aagccattta caattgaata 3660tatcctaagt aaaacctcat aggttttacg tatttcattt agggac 3706<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7atgcattggc ctttgt tttt gat 23<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>8tgtcgtttcc cgccttcag 19<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9cgctgcggac atctacattt ttgaat 26<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10agttaacttt ccacttatcg gggcactg 28<210>11<211>288<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR產(chǎn)物<400>11atgcattggc ctttgttttt gatggcatca actttggagc atctgatttt gcatattcag60ccttttccat ggtaattctt ttacaagaat tttcattctt tcttaagtat aaacacttag 120
cttgggacaa acttctgatc ctatttctta atttttgcag gcgatggtgg ctgttatgag180cattttgtgt ttgatgtttc tctcttctca ttacggtttt attgggatct gggtggctct240aactatttac atgagcctcc gcgcgtttgc tgaaggcggg aaacgaca 288<210>12<211>751<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR產(chǎn)物<400>12cgctgcggac atctacattt ttgaattgaa aaaaaattgg taattactct ttctttttct 60ccatattgac catcatactc attgctgatc catgtagatt tcccggacat gaagccattt120acaattgaat atatcctaag taaaacctca taggttttac gtatttcatt tagggactaa180aatggtttag gataattact ttagctaaca taagataata aataaataaa taaataaaaa240taaaatggtt gtagataaat aaggaaatca ataatgaata tgagtgtgag tgataggacg300ggaatgggaa acttttacac tactttaacg ctattgaacg agtatgagta tgttataaac360gtaaaatgtt ttatgtgtta gacaatggcc tcaagtgaaa gtgaccctat taatggagga420aatgcaaacc acgagtctga ggtcacgctc gaagaaatga gggcaaggat cgacgcattg480cgtagcgacc ctgtttttgg agatgccacg ggagatgcta gtgataaccg aatggattta540atgaggttga tgatgatgga gcttttacaa ggaaatcgac aaaggcctag aactgaacaa600gaagagtgct caaacatgtt caagaggttt tcggctcata agcccccaac ttatgatgga660aagccagacc ccactgagtt tgaagaatgg ctcaacggca tggaaaaatt gttcgatgcc720acccagtgcc ccgataagtg gaaagttaac t 751
<210>13<211>664<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR產(chǎn)物<400>13ttaatttttg caggcgatgg tggctgttat gagcattttg tgtttgatgt ttctctcttc 60tcattacggt tttattggga tctgggtggc tctaactatt tacatgagcc tccgcgcgtt120tgctgaaggc gggaaacgac aatctgatcc ccatcaagct tgagctcagg atttagcagc180attccagatt gggttcaatc aacaaggtac gagccatatc actttattca aattggtatc240gccaaaacca agaaggaact cccatcctca aaggtttgta aggaagaatt ctcagtccaa300agcctcaaca aggtcagggt acagagtctc caaaccatta gccaaaagct acaggagatc360aatgaagaat cttcaatcaa agtaaactac tgttccagca catgcatcat ggtcagtaag420tttcagaaaa agacatccac cgaagactta aagttagtgg gcatctttga aagtaatctt480gtcaacatcg agcagctggc ttgtggggac cagacaaaaa aggaatggtg cagaattgtt540aggcgcacct accaaaagca tctttgcctt tattgcaaag ataaagcaga ttcctctagt600acaagtgggg aacaaaataa cgtggaaaag agctgtcctg acagcccact cactaatgcg660tatg 664<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14gctctgacac aaccggtaaa tgcattggcc 30
<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15gacccatagt ttgattttaa gcacgacatg 30<210>16<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16gcagattctg ctaacttgcg ccatcggag 29<210>17<211>1042<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR產(chǎn)物<220>
<221>misc_特征<223>PCR產(chǎn)物<400>17gctctgacac aaccggtaaa tgcattggcc tttgtttttg atggcatcaa ctttggagca 60tctgattttg catattcagc cttttccatg gtaattcttt tacaagaatt ttcattcttt120
cttaagtata aacacttagc ttgggacaaa cttctgatcc tatttcttaa tttttgcagg180cgatggtggc tgttatgagc attttgtgtt tgatgtttct ctcttctcat tacggtttta240ttgggatctg ggtggctcta actatttaca tgagcctccg cgcgtttgct gaaggcggga300aacgacaatc tgatccccat caagcttgag ctcaggattt agcagcattc cagattgggt360tcaatcaaca aggtacgagc catatcactt tattcaaatt ggtatcgcca aaaccaagaa420ggaactccca tcctcaaagg tttgtaagga agaattctca gtccaaagcc tcaacaaggt480cagggtacag agtctccaaa ccattagcca aaagctacag gagatcaatg aagaatcttc540aatcaaagta aactactgtt ccagcacatg catcatggtc agtaagtttc agaaaaagac600atccaccgaa gacttaaagt tagtgggcat ctttgaaagt aatcttgtca acatcgagca660gctggcttgt ggggaccaga caaaaaagga atggtgcaga attgttaggc gcacctacca720aaagcatctt tgcctttatt gcaaagataa agcagattcc tctagtacaa gtggggaaca780aaataacgtg gaaaagagct gtcctgacag cccactcact aatgcgtatg acgaacgcag840tgacgaccac aaaagaattc cctctatata agaaggcatt cattcccatt tgaaggatca900tcagatactg aaccaatcct tctagaagat ctaagcttat cgataagctt gatgtaattg960gaggaagatc aaaattttca atccccattc ttcgattgct tcaattgaag tttctccgat 1020ggcgcaagtt agcagaatct gc1042<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18cggtaaatgc attggccttt gtt 23
<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19cacccagatc ccaataaaac cgtaat26<210>20<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20aaatggttgt agataaataa ggaaatca 28<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21acatgtttga gcactcttct tgt 2權(quán)利要求
1.草甘膦耐受性甜菜植株，其特征在于a)甜菜植株獲自保藏于NCIMB，Aberdeen(蘇格蘭，英國(guó))保藏號(hào)為NCIMB 41158或NCIMB 41159的種子，和/或b)采用含有SEQ ID NO1核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增630-700bp，優(yōu)選664bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQ ID NO3核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增3500-3900bp，優(yōu)選3706bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQ ID NO7核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增270-300bp，優(yōu)選288bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQ ID NO9核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增710-790bp，優(yōu)選751bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQ ID NO14核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株的基因組DNA中擴(kuò)增990-1100bp，優(yōu)選1042bp的DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株，其特征在于，所述3706bp DNA片段含有SEQ ID NO6核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ IDNO6核苷酸序列至少95％，優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選至少99.9％的同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株，其特征在于，所述664bp DNA片段含有SEQ ID NO13核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ IDNO13核苷酸序列至少95％，優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選至少99.9％的同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株，其特征在于，所述288bp DNA片段含有SEQ ID NO11核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ IDNO11核苷酸序列至少95％，優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選至少99.9％的同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株，其特征在于，所述751bp DNA片段含有SEQ ID NO12核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ IDNO12核苷酸序列至少95％，優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選至少99.9％的同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株，其特征在于，所述1042bp DNA片段含有SEQ ID NO17核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ IDNO17核苷酸序列至少95％，優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選至少99.9％的同一性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的植株的種子。
8.來自根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的植株的細(xì)胞、組織或部分。
9.保藏于NCIMB，保藏號(hào)為NCIMB 41158或NCIMB 41159的種子。
10.從根據(jù)權(quán)利要求9的種子獲得的植株或其部分。
11.草甘膦耐受性甜菜植株的鑒定方法，其特征在于，該方法包含以下步驟a)采用含有SEQ ID NO1核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增630-700bp，優(yōu)選664bp的DNA片段，和/或b)采用含有SEQ ID NO3核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增3500-3900bp，優(yōu)選3706bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQ ID NO7核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增270-300bp，優(yōu)選288bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQ ID NO9核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴(kuò)增710-790bp，優(yōu)選751bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQ ID NO14核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、的基因組DNA中擴(kuò)增990-1100bp，優(yōu)選1042bp的DNA片段。
12.用于鑒定轉(zhuǎn)基因草甘膦耐受性甜菜植株、其細(xì)胞、組織或部分的試劑盒，其包含至少一個(gè)引物對(duì)，所述引物對(duì)含有用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的第一引物和第二引物，其中第一引物識(shí)別摻入至所述植株基因組的外源DNA內(nèi)的序列，第二引物識(shí)別所述DNA的3’或5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，由此所述植株是根據(jù)權(quán)利要求1-6或10之一的植株。
13.用于鑒定轉(zhuǎn)基因草甘膦耐受性甜菜植株、其細(xì)胞、組織或部分的試劑盒，其包含至少一個(gè)引物對(duì)，所述引物對(duì)含有用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的第一引物和第二引物，其中第一引物識(shí)別摻入至所述植株基因組的外源DNA內(nèi)的序列，第二引物識(shí)別所述DNA的3’或5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，其特征在于a)第一引物含有SEQ ID NO1核苷酸序列和第二引物含有SEQID NO2核苷酸序列，和/或b)第一引物含有SEQ ID NO7核苷酸序列和第二引物含有SEQID NO8核苷酸序列，和/或c)第一引物含有SEQ ID NO9核苷酸序列和第二引物含有SEQID NO10核苷酸序列，和/或d)第一引物含有SEQ ID NO14核苷酸序列和第二引物含有SEQ ID NO16核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的試劑盒，其特征在于，第一引物和第二引物識(shí)別形成SEQ ID NO5核苷酸序列的部分的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及草甘膦耐受性甜菜植株，植株材料和種子。本發(fā)明的目標(biāo)是制備轉(zhuǎn)基因甜菜植株的事件，所述甜菜植株具有對(duì)草甘膦的高度耐受性并且保持在生長(zhǎng)，產(chǎn)量，品質(zhì)和病原抗性等方面的其他重要農(nóng)學(xué)性質(zhì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1751126SQ200480004680
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月20日
發(fā)明者J·克勞斯, E·紹爾布雷, R·內(nèi)爾斯, A·羅克, R·延森 申請(qǐng)人:Kws薩特股份公司