專利名稱：使用短dsRNA序列在植物中進(jìn)行有效的基因沉默的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及植物遺傳改造領(lǐng)域，更特別地使用短雙鏈(dsRNA)序列有意識地沉默植物細(xì)胞和植物中一個或更多個基因的表達(dá)。當(dāng)使用具有莖區(qū)長度短于大約200堿基對的dsRNA序列時提供了增加基因沉默有效性的方法和手段。
背景通過靶基因特異性的dsRNA觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄后沉默植物和動物中基因表達(dá)的機(jī)制近年來已成為許多研究的主題，通過轉(zhuǎn)錄編碼dsRNA的嵌合基因外源地或內(nèi)源地提供所述靶基因特異性的dsRNA。自首次在動物和植物中描述該現(xiàn)象以來(Fire等人，1998；Hamilton等人，1998；Waterhouse等人，1998)，已逐漸清楚dsRNA通過具有對dsRNA(例如果蠅中的DICER)優(yōu)先的RNA酶將dsRNA加工成短的、接近21個核苷酸長度的RNA，所述加工的短dsRNA用作向?qū)蛄校蚰軌蚪到馓禺愋詍RNA分子的復(fù)合物提供序列特異性。
高度特異和有效的基因沉默，由與要沉默的基因同源的dsRNA所啟動，很快地將這種方法學(xué)轉(zhuǎn)為變成產(chǎn)生真核生物體的優(yōu)選工具，在所述真核生物體中一個或更多個特異性轉(zhuǎn)錄核酸序列的表達(dá)被降低或失活。為了產(chǎn)生具有優(yōu)選表型的真核生物體可采取降低或失活這類目的基因的表達(dá)(參見例如WO 02/029028，其中使用dsRNA技術(shù)產(chǎn)生了發(fā)育萼片而不發(fā)育花瓣的蕓苔屬(Brassica)植物)。轉(zhuǎn)錄序列表達(dá)的降低或失活也在試圖確定通過基因組測序項目已獲的大量核酸序列功能的實驗研究中起著重要作用。
尤其對于后者，使用短dsRNA序列可能會有利，因為可以很方便地在體外產(chǎn)生這類寡聚核苷酸。在高等動物中，考慮到更大的dsRNA分子似乎會觸發(fā)干擾素應(yīng)答(Elbashir等人，2000)，因而優(yōu)選地使用短dsRNA分子。
直到目前，在真核生物體細(xì)胞內(nèi)抑制性RNA(此處用于描述反義RNA、有義RNA和dsRNA)的產(chǎn)生大多數(shù)是通過識別共同Pol II類型啟動子的DNA依賴性RNA聚合酶II(Pol II)的作用產(chǎn)生的。
在植物中通過RNA聚合酶III產(chǎn)生反義RNA已有描述。
Bourque和Folk(1992)描述了抑制CAT基因的表達(dá)，該CAT基因是通過用包含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報告基因反向序列的DNA共同電穿孔瞬時遞送入植物細(xì)胞中的，所述報告基因融合到缺少終止子的大豆tRNAmet基因中，這樣所述tRNAmet序列通過RNA聚合酶III引起CAT反義序列的轉(zhuǎn)錄。
US 5,354,854描述了一種表達(dá)系統(tǒng)以及在植物中使用該表達(dá)系統(tǒng)抑制基因表達(dá)的方法，所述系統(tǒng)包括來自tRNA基因的組成型啟動子元件和融合到該啟動子元件上的反義鏈DNA，所述反義鏈將通過RNA聚合酶III作用與該啟動子元件共轉(zhuǎn)錄從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。
Yukawa等人于2002年描述了靶向?qū)柜R鈴薯紡錘塊莖病類病毒、啤酒花潛伏類病毒和馬鈴薯病毒S的RNAs保守結(jié)構(gòu)元件或結(jié)構(gòu)域的反義RNA序列(所述結(jié)構(gòu)元件或結(jié)構(gòu)域嵌入在反密碼子區(qū)域或煙草tRNAtyr基因或擬南芥7SL RNA基因的3’端附近)，并且證明了這類嵌合基因在同源植物提取物中的體外轉(zhuǎn)錄。
EP 0 387 755描述并要求保護(hù)任意地以多拷貝存在、包含由聚合酶III轉(zhuǎn)錄的基因片段和編碼抑制性RNA分子的DNA序列的DNA分子，其特征在于其含有聚合酶III轉(zhuǎn)錄所必需的tRNA基因的轉(zhuǎn)錄單位，包括決定tRNA二級結(jié)構(gòu)的序列；編碼抑制性RNA分子的DNA序列排列在所述DNA分子內(nèi)部，使抑制性RNA分子是轉(zhuǎn)錄物的一部分。
近來已經(jīng)對哺乳動物細(xì)胞中小分子干涉性RNAs的表達(dá)進(jìn)行了很好的描述。Paddison等人2002、Sook Lee等人2002、Miyagishi等人2002、Sui等人2002、Brummelkamp等人2002和Paul等人2002都描述了在人或哺乳動物細(xì)胞內(nèi)使用來源于H1-RNA或U6snRNA的RNA聚合酶III特異性啟動子進(jìn)行的小分子干涉性RNA的表達(dá)。
US 6,146,886描述和要求保護(hù)轉(zhuǎn)錄的非天然存在的含有想要的RNA部分的RNA分子，其中所述非天然存在RNA分子包括在所述RNA的3’區(qū)域和5’互補(bǔ)核苷酸之間通過堿基對相互作用形成的分子內(nèi)莖區(qū)，其中所述分子內(nèi)莖區(qū)包括至少8個堿基對；其中所述想要的RNA部分選自反義RNA、引誘RNA、酶促RNA、激動劑RNA和拮抗劑RNA，其中所述RNA分子是通過2型RNA聚合酶III啟動子系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的。
然而現(xiàn)有技術(shù)在植物細(xì)胞中提供用于小分子干涉性dsRNAs高效表達(dá)的方法方面仍有不足。這個問題如下文中所描述的已獲得解決。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了在植物細(xì)胞中降低目的基因表達(dá)的方法，其包括下列步驟(a)給植物細(xì)胞提供嵌合基因，所述嵌合基因包括下列有效連接的DNA片段i)啟動子，所述啟動子是由植物細(xì)胞的DNA依賴性RNA聚合酶III識別的啟動子，其特征在于所述啟動子是包含與DNA依賴性RNA聚合酶III相互作用的所有順式作用啟動子元件的III型(3型)啟動子，優(yōu)選地是3型POL III啟動子，其選自編碼U6snRNA的基因的啟動子、編碼U3snRNA的基因的啟動子、編碼7SL RNA的基因的啟動子，更優(yōu)選的包含啟動子核酸序列的啟動子選自SEQ ID Nr 1、SEQ IDNr 2、SEQ ID Nr 3、SEQ ID Nr 4、SEQ ID Nr 5、SEQ ID Nr 6、SEQID Nr 7或SEQ ID Nr 8所列的核酸序列。
ii)DNA片段，當(dāng)所述DNA片段轉(zhuǎn)錄時，產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子包含有義和反義核苷酸序列，(1)有義核苷酸序列，所述有義核苷酸序列包含與轉(zhuǎn)錄自目的基因的RNA的大約19個連續(xù)核苷酸序列的核苷酸序列大約有90到100％序列一致性的大約19個連續(xù)核苷酸；(2)反義核苷酸序列，所述序列包含與所述有義序列的大約19個連續(xù)核苷酸序列的互補(bǔ)序列有大約90到100％序列一致性的大約19個連續(xù)核苷酸；其中所述有義和反義核苷酸序列能形成大約19-200個核苷酸長度的雙鏈RNA；和iii)寡聚dT片段，所述寡聚dT片段含有至少4個連續(xù)T殘基；并且(b)鑒定植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)與不包含所述嵌合基因的植物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)相比被降低。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含下列有效連接的DNA片段的嵌合基因i)啟動子，所述啟動子是由植物細(xì)胞的DNA依賴性RNA聚合酶III識別的啟動子，其特征在于所述啟動子是包含與DNA依賴性RNA聚合酶III相互作用的所有順式作用啟動子元件的III型啟動子，優(yōu)選地是3型POLIII啟動子，其選自編碼U6snRNA的基因的啟動子、編碼U3snRNA的基因的啟動子、編碼7SL RNA的基因的啟動子，更優(yōu)選的包含啟動子核酸的啟動子選自SEQ ID Nr 1、SEQ ID Nr 2、SEQ IDNr 3、SEQ ID Nr 4、SEQ ID Nr 5、SEQ ID Nr 6、SEQ ID Nr 7或SEQ ID Nr 8所列的核酸序列。
ii)DNA片段，當(dāng)所述DNA片段轉(zhuǎn)錄時，產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子包含有義和反義核苷酸序列，(1)有義核酸序列，所述有義核酸序列包含與轉(zhuǎn)錄自目的基因的RNA的大約19個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列大約有90到100％序列一致性的大約19個連續(xù)核苷酸；(2)反義核苷酸序列，所述反義核苷酸序列包含與所述有義序列的大約19個連續(xù)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列有大約90到100％序列一致性的大約19個連續(xù)核苷酸；其中所述有義和反義核苷酸序列能形成大約19-200個核苷酸長度的雙鏈RNA；和iii)寡聚dT片段，所述寡聚dT片段含有至少4個連續(xù)T殘基。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含上述嵌合基因的植物細(xì)胞和植物。
圖表簡述

圖1用示意圖描述了用于產(chǎn)生和操作編碼短dsRNA序列的編碼區(qū)域的便捷克隆策略。
發(fā)明詳述本發(fā)明是基于觀察編碼短dsRNA分子的嵌合基因?qū)е卤扔蓮?qiáng)大的組成型RNA聚合酶II啟動子CaMV 35S驅(qū)動的類似結(jié)構(gòu)更有效的基因沉默，所述dsRNA分子優(yōu)選地是大約20個堿基對(bp)和100bp之間并且在RNA聚合酶III識別的3型啟動子控制之下的分子。
這些3型啟動子具有另外的有利方面與由RNA聚合酶III識別的2型啟動子相反(在現(xiàn)有技術(shù)中已用于指導(dǎo)反義RNA的表達(dá))，所有啟動子所需的順式作用元件都位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的上游區(qū)域。
因而，在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于降低植物細(xì)胞中目的基因表達(dá)的方法，其包括下列步驟a)給植物細(xì)胞提供嵌合基因，所述嵌合基因包括下列有效連接的DNA片段i)啟動子，所述啟動子是由植物細(xì)胞的DNA依賴性RNA聚合酶III識別的啟動子，其特征在于所述啟動子是包含與DNA依賴性RNA聚合酶III相互作用的所有順式作用啟動子元件的3型啟動子；ii)DNA片段，當(dāng)所述DNA片段轉(zhuǎn)錄時，產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子包含有義和反義核苷酸序列，其中(1)有義核苷酸序列，所述有義核苷酸序列包含與轉(zhuǎn)錄自目的基因的RNA的大約19個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列大約有90到100％序列一致性的大約19個連續(xù)核苷酸；(2)反義核苷酸序列，所述反義核苷酸序列包含與所述有義序列的大約19個連續(xù)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列有大約90到100％序列一致性的大約19個連續(xù)核苷酸；其中所述有義和反義核苷酸序列能形成大約19-200個核苷酸長度的雙鏈RNA；和iv)寡聚dT片段，所述寡聚dT片段含有至少4個連續(xù)T殘基；并且(c)鑒定植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)與不包含所述嵌合基因的植物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)相比被降低。
如此處所使用的“DNA依賴性RNA聚合酶III識別的啟動子”是通過RNA聚合酶III的聚合酶作用來指導(dǎo)相關(guān)DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄的啟動子。這些包括編碼5S RNA、tRNA、7SL RNA、U6 snRNA和少量其它小的穩(wěn)定的RNAs的基因，其中許多涉及RNA加工。大多數(shù)由Pol III使用的所述啟動子需要位于+1下游、轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的序列元件。然而少部分polIII的模板不需要任何基因內(nèi)啟動子元件。這些啟動子稱為3型啟動子。換句話說，“3型Pol III啟動子”是那些由RNA聚合酶III識別并且含有在RNA聚合酶III正常轉(zhuǎn)錄區(qū)域上游與RNA聚合酶III相互作用的所有順式作用元件的啟動子。因而這種3型Pol III啟動子可以容易地與異源區(qū)域組合到嵌合基因中，所述異源區(qū)域的轉(zhuǎn)錄是想要的，例如本發(fā)明的dsRNA編碼區(qū)域。
一般地，3型Pol III啟動子包含TATA盒(位于人U6snRNA基因的-25和-30之間)和近側(cè)序列元件(PSE；位于人U6snRNA的-47和-66之間)。其也可以包含遠(yuǎn)側(cè)序列元件(DSE；位于人U6snRNA的-214和-244之間)。
可發(fā)現(xiàn)3型Pol III啟動子例如與編碼7SL RNA、U3snRNA和U6snRNA的基因相聯(lián)系。這類序列已從擬南芥、水稻和蕃茄中分離出來并且這類啟動子的代表序列以SEQ ID No 1-8列于序列表中。
其它有關(guān)3型Pol III啟動子的核苷酸序列可在核苷酸序列數(shù)據(jù)中找到，所述序列出現(xiàn)在下列條目下編碼7SL RNA的擬南芥(A.thaliana)基因AT7SL-1(X72228)、編碼7SL RNA的擬南芥基因AT7SL-2(X72229)、編碼7SL RNA的擬南芥基因AT7SL-3(AJ290403)、啤酒花(Humulus lupulus)H17SL-1基因(AJ236706)、啤酒花H17SL-2基因(AJ236704)、啤酒花H17SL-3基因(AJ236705)、啤酒花H17SL-4基因(AJ236703)、擬南芥U6-1 snRNA基因(X52527)、擬南芥U6-26snRNA基因(X52528)、擬南芥U6-29 snRNA基因(X52529)、擬南芥U6-1 snRNA基因(X52527)、玉蜀黍(Zea mays)U3 snRNA基因(Z29641)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)U6 snRNA基因(Z17301；X60506；S83742)、蕃茄U6小核RNA基因(X51447)、擬南芥U3C snRNA基因(X52630)、擬南芥U3BsnRNA基因(X52629)、水稻(Oryza sativa)U3 snRNA啟動子(X79685)、蕃茄U3小核RNA基因(X14411)、普通小麥(Triticum aestivum)U3 snRNA基因(X63065)、普通小麥U6 snRNA基因(X63066)。
不用說可通過少量實驗從其它蕃茄、水稻或擬南芥物種或從其它植物品種中分離出各種3型Pol III啟動子。例如可使用U6snRNA、U3snRNA或7SL RNA編碼序列(例如由其登錄號確定的上述任何序列的編碼序列和另外的蠶豆(Vicia faba)U6snRNA編碼序列(X04788)、編碼U6snRNA的玉米DNA(X52315)或編碼7SL RNA的玉米DNA(X14661))作為探針分離來自這類植物的基因組克隆文庫，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的上游序列可被分離(優(yōu)選地為所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域上游大約300到400bp區(qū)域)并且作為3型Pol III啟動子使用?？蛇x擇地，可使用基于PCR的技術(shù)例如反向PCR或TAIL-PCR分離基因組序列，包括與已知轉(zhuǎn)錄區(qū)域相鄰的啟動子序列。此外，任何由其登錄號確定的所附的3型Pol III啟動子序列或上述啟動子序列可在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下用作探針或作為產(chǎn)生PCR引物的信息源，以用于從其它植物品種中分離相應(yīng)啟動子序列。
此處使用的“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”意思是指當(dāng)探針和靶序列之間至少有95％和優(yōu)選地至少97％的序列一致性時，雜交通常會發(fā)生。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子是在含有50％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鹽(pH 7.6)、5XDenhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml變性的、剪切過的載體DNA例如硅魚精子DNA的溶液中孵育過夜，接著在接近65℃下在0.1xSSC中洗滌雜交支持膜。其它雜交和洗滌條件是眾所周知的并且例舉于Sambrook等人的Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor，NY(1989)，特別是第11章中。
盡管3型Pol III啟動子不要求位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的順式作用元件，但是很明顯通常位于轉(zhuǎn)錄起始位置下游的序列仍可包含在本發(fā)明的嵌合構(gòu)建體中。
還觀察到最初分離自單子葉植物的3型Pol III啟動子在雙子葉和單子葉植物細(xì)胞和植物中的使用都獲得好的效果，然而最初分離自雙子葉植物的3型Pol III啟動子只能在雙子葉植物細(xì)胞和植物中有效使用。此外，當(dāng)使用包含來自相同或關(guān)系密切的品種的3型Pol III啟動子的嵌合基因時已獲得最有效的基因沉默。
如此處所使用的，“目的基因”可以是任何目的核酸，所述核酸易于轉(zhuǎn)錄(或復(fù)制)成RNA分子，并且易于轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RNA降解。這些包括但不限于轉(zhuǎn)基因、內(nèi)源基因和被轉(zhuǎn)錄的病毒序列。同時顯而易見的是，對于本發(fā)明方法，不需要知道目的基因的核酸序列。事實上，直接獲得小片段并在3型Pol III啟動子控制下將其以反向重復(fù)方向有效連接是可能的。
如上面所指出，轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域應(yīng)該能編碼包含有義和反義核苷酸區(qū)域的RNA分子，其中所述有義核苷酸序列包含大約19個連續(xù)核苷酸，所述19個連續(xù)核苷酸與轉(zhuǎn)錄自目的基因的RNA的大約19個連續(xù)核苷酸的核酸序列有大約90到100％的序列一致性，并且其中所述反義核苷酸序列包含大約19個連續(xù)核苷酸，所述19個連續(xù)核苷酸與所述有義序列的大約19個連續(xù)核苷酸的核酸的互補(bǔ)序列有大約90到100％的序列一致性。所述有義和反義核苷酸序列應(yīng)該能形成大約19到200個核苷酸特別是大約21到90或100個、或更優(yōu)選地是長度大約是40個到大約50個核苷酸的雙鏈RNA。然而，dsRNA的莖區(qū)長度也可以是大約30、大約60、大約70或大約80個核苷酸。很明顯，如果dsRNA區(qū)域大于19個核苷酸，時只需至少有一個大約19個核苷酸的雙鏈區(qū)域(由此在有義和反義區(qū)域之間可能允許大約一個錯配)，所述雙鏈區(qū)域的有義鏈與靶核酸或目的基因的19個連續(xù)核苷酸是“一致的”(允許一個錯配)。
就本發(fā)明的目的來說，兩個相關(guān)核酸序列的“序列一致性”(以百分比表示)是指在兩個最優(yōu)比對的序列中具有一致殘基位點的數(shù)目除以比較位點的數(shù)目(x100)。缺口，即在比對中存在于一個序列上但不存在于另一個序列上的殘基位點，被認(rèn)為是非一致殘基位點。使用Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)進(jìn)行所述兩個序列的比對。使用標(biāo)準(zhǔn)軟件程序，例如作為Wsconsin Package10.1版本(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，USA)一部分的GAP，通過使用缺口產(chǎn)生罰分為50和缺口延伸罰分為3的默認(rèn)分值矩陣，可便利地進(jìn)行計算機(jī)輔助的序列比對，轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域可包含范圍從3到大約100個核苷酸或更特殊地從大約6到大約40個核苷酸的核苷酸片段，所述片段位于有義和反義編碼核苷酸區(qū)域之間，并且與所述靶基因的核苷酸序列無關(guān)(所謂的間隔區(qū)域)。
通過在克隆過程中在短的反義和有義片段之間使用填充DNA序列(可在之后除去)可便利地構(gòu)建本發(fā)明的嵌合基因，所述嵌合基因包含具有短的反義和有義片段的可轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)域。為達(dá)到此目的，所述填充片段裝配有限制性酶(例如用以容易地除去填充序列和重連(自身連接)克隆載體的稀有切割限制性酶)的識別位點，由此所述短的有義和反義區(qū)域被相互拉近。如圖1所概述的，可通過使用包含所述有義或反義序列和對應(yīng)于部分填充DNA序列的寡核苷酸引物便利地構(gòu)建包含短的有義序列、短的與所述有義序列互補(bǔ)的反義序列和填充DNA序列的DNA片段。
上述“寡聚dT片段“是作為RNA聚合酶III活性終止子的連續(xù)T殘基片段。其應(yīng)當(dāng)包含至少4個T殘基，但很明顯可包含更多T殘基。
通過使用在本領(lǐng)域內(nèi)可獲得的任何DNA轉(zhuǎn)化方法可將本發(fā)明的嵌合基因?qū)胫参锛?xì)胞中從而為植物細(xì)胞提供所述嵌合基因并且可產(chǎn)生瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，所述方法包括但不限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微粒轟擊、原生質(zhì)體或植物組織直接吸入DNA(通過電穿孔、PEG介導(dǎo)的吸收等)。也可通過使用能在植物細(xì)胞中復(fù)制的病毒載體將所述嵌合基因提供給所述植物細(xì)胞。也可以通過親本植物雜交將嵌合基因提供給植物細(xì)胞，其中至少一個親本包含本發(fā)明的嵌合基因。
如此處所使用的，“降低目的基因的表達(dá)”是指在本發(fā)明dsRNA或嵌合基因存在的情況下植物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)與在本發(fā)明dsRNA或嵌合基因不存在情況下目的基因的表達(dá)進(jìn)行比較。因而在本發(fā)明嵌合RNA存在的情況下所述表達(dá)應(yīng)該低于在缺少其時的表達(dá)，例如只有在沒有所述嵌合RNA存在時表達(dá)量的約75％或50％或10％或大約5％。為了所有實用目的，可通過提供嵌合RNA或編碼這種RNA的嵌合基因以完全抑制所述表達(dá)。
目的基因表達(dá)的降低可通過如下指標(biāo)進(jìn)行檢測所述基因(或其部分)在轉(zhuǎn)錄上的降低、所述基因(或其部分)在翻譯上的降低或被轉(zhuǎn)錄RNA(s)或被翻譯多肽的存在對植物細(xì)胞或植物影響的降低，并且所述基因表達(dá)的降低最終將導(dǎo)致表型特征的改變。很清楚目的基因表達(dá)上的降低可伴隨著或與另外基因表達(dá)上的增加有關(guān)。盡管dsRNA的主要作用是轉(zhuǎn)錄后降解特定RNA，但dsRNA在轉(zhuǎn)錄過程中的作用已有描述。這類另外的作用也有助于dsRNA介導(dǎo)降低目的基因的表達(dá)。
本發(fā)明的其它實施方案涉及此處描述的嵌合基因以及含有本發(fā)明嵌合基因的植物、植物細(xì)胞、植物組織或種子。
提供含有本發(fā)明嵌合基因的植物細(xì)胞和植物也是本發(fā)明的目的。通過傳統(tǒng)育種方法產(chǎn)生的含有本發(fā)明所述嵌合基因的配子、種子、胚(合子的或體細(xì)胞的)、植物后代或雜種也都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
相信此處描述的方法和手段適用于所有雙子葉和單子葉植物細(xì)胞和植物，包括但不限于棉花、蕓苔屬蔬菜、油菜(oilseed rape)、小麥、玉米(corn)或玉米(maize)、大麥、向日葵、水稻、燕麥、甘蔗、大豆、蔬菜(包括菊苣、萵苣、蕃茄)、煙草、馬鈴薯、甜菜、木瓜、菠蘿、芒果、擬南芥，還包括用于園藝、花卉栽培或森林的植物。
下列非限定實施例描述了用于降低植物細(xì)胞目的基因表達(dá)的嵌合基因的構(gòu)建和這類基因的應(yīng)用，所述目的基因表達(dá)的降低是由于小dsRNA造成的。
除非在實施例中另外說明，所有重組DNA技術(shù)都根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，所述標(biāo)準(zhǔn)方法描述于Sambrook等人(1989)的Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY和Ausubel等人(1994)的Current Protocols in MolecularBiology，Current Protocols，USA的第1卷和第2卷。用于植物分子研究工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于由R.D.D.Croy編著的、由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications，UK聯(lián)合出版的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)。其它用于標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)的參考資料包括Sambrook和Russell(2001)的Molecular CloningA LaboratoryManual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，和Brown(1998)的Molecular Biology LabFax的第I和II卷，第二版，Academic Press(UK)。用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法可在Dieffenbach和Dveksler(1995)的PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press和在McPherson等人(2000)的PCR-BasicsFrom Background to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany中找到。
在整個說明書和實施例中，參考下列序列SEQ ID No.1擬南芥變種Landsberg erecta的7SL-2基因的啟動子序列，后接位于寡聚dT片段前的單一限制性位點。
SEQ ID No.2擬南芥變種Landsberg erecta 7SL-2基因的啟動子序列，其包括轉(zhuǎn)錄起始位點下游的86個堿基，后接位于寡聚dT片段前的單一限制性位點。
SEQ ID No.3擬南芥變種Landsberg erecta U3B snRNA基因的啟動子序列，后接位于寡聚dT片段前的單一限制性位點。
SEQ ID No.4擬南芥變種Landsberg erecta的U3B snRNA基因的啟動子序列，其包括轉(zhuǎn)錄起始位點下游的136個堿基，后接位于寡聚dT片段前的單一限制性位點。
SEQ ID No.5擬南芥變種Landsberg erecta的U6-26 snRNA基因的啟動子序列，其包括轉(zhuǎn)錄起始位點下游的3個堿基，后接位于寡聚dT片段前的單一限制性位點。
SEQ ID No.6擬南芥變種Landsberg erecta U6-26 snRNA基因的啟動子序列，其包括轉(zhuǎn)錄起始位點下游的20個堿基，后接位于寡聚dT片段前的單一限制性位點。
SEQ ID No.7水稻(Oryza sativa Indica IR36)U3 snRNA基因的啟動子序列，后接位于寡聚dT片段前的單一限制性位點。
SEQ ID No.8番茄(具有小葫蘆形黃色果實的園藝品種)U3snRNA基因的啟動子序列，后接位于寡聚dT片段前的單一限制性位點。
SEQ ID No.9用于沉默GUS基因(GUShp94)表達(dá)的94bp的dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.10用于沉默GUS基因(GUShp41)表達(dá)的41bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.11用于沉默GUS基因(GUShp21)表達(dá)的21bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.12源自PHYB(PHYB5hp-42)-upper鏈5’末端的用于沉默PHYB基因表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.13源自PHYB(PHYB5hp-42)-lower鏈5’末端的用于沉默PHYB基因表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.14源自PHYB(PHYB5hp21)-upper鏈5’末端的用于沉默PHYB基因表達(dá)的21bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.15源自PHYB(PHYB5hp21)-lower鏈5’末端的用于沉默PHYB基因表達(dá)的21bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.16源自PHYB(PHYBChp42)-upper鏈中間部分的用于沉默PHYB基因表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.17源自PHYB(PHYBChp42)-lower鏈中間部分的用于沉默PHYB基因表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.18源自PHYB(PHYBChp21)-upper鏈中間部分的用于沉默PHYB基因表達(dá)的21bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.19源自PHYB(PHYBChp21)-lower鏈中間部分的用于沉默PHYB基因表達(dá)的21bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.20源自PHYB(PHYB3hp42)-upper鏈中3’末端的用于沉默PHYB基因表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.21源自PHYB(PHYB3hp42)-lower鏈中3’末端的用于沉默PHYB基因表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.22源自PHYB(PHYB3hp21)-upper鏈中3’末端的用于沉默PHYB基因表達(dá)的21bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.23源自PHYB(PHYB3hp21)-lower鏈中3’末端的用于沉默PHYB基因表達(dá)的21bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.24用于沉默PDS基因(PDS42)-upper鏈表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.25用于沉默PDS基因(PDS42)-lower鏈表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.26用于沉默PDS基因(PDS21)-upper鏈表達(dá)的21bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.27用于沉默PDS基因(PDS21)-lower鏈表達(dá)的21bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.28用于沉默GUS基因(GUS-A)表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.29用于沉默GUS基因(GUS-B)表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.30用于沉默GUS基因(GUS-C)表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.31用于沉默EIN(EIN-A)表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.32用于沉默EIN(EIN-B)表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
SEQ ID No.33用于沉默EIN(EIN-C)表達(dá)的42bp dsRNA編碼區(qū)域的序列。
實施例實施例1.構(gòu)建3型Pol III啟動子-寡聚dT片段盒3型Pol III啟動子經(jīng)PCR擴(kuò)增從擬南芥、水稻或蕃茄7SL、U3snRNA或U6snRNA基因中分離出來，所述PCR擴(kuò)增以這樣的方式設(shè)計a)所得片段兩翼是在所述擴(kuò)增片段內(nèi)不存在的限制性酶切識別位點；b)所述啟動子片段之后連接單一限制性酶切位點(SalI、XhoI或PvuI)，之后接著是c)作為Pol III終止子的poly(T)序列(具有7-9個T殘基)。
在某些克隆的啟動子片段中，轉(zhuǎn)錄起始位點下游編碼區(qū)域的額外序列被保留，以考察小RNAs編碼區(qū)域內(nèi)的保守基序?qū)D(zhuǎn)錄和/或基因沉默的可能影響。將所得的片段(展示于SEQ IDs No 1到8)克隆入中間克隆載體(參見表1)內(nèi)。有義、反義或反向重復(fù)序列可容易地插入3型Pol III啟動子和poly T片段之間的單一限制酶切位點。
表1.克隆的Pol III啟動子-終子止盒*
**該數(shù)目表示來自小RNA基因編碼區(qū)域的序列。
***所述給定的大小包括限制性位點和加入到PCR引物中的寡聚(dT)s。
實施例2.對抗GUS報告基因(煙草(Nicotiana tabacum))的基因沉默構(gòu)建體中Pol III啟動子的檢驗。
為了檢驗這些用于沉默的Pol III啟動子，合成GUS反向重復(fù)序列(SEQ ID No 9)，所述序列包含186bp有義GUS序列(GUS編碼序列的nt.690-875)，所述186bp有義GUS序列在3’末端與所述186bp片段的前94bp(GUS編碼序列的nt.690-783)的反義形式融合。這個i/r序列兩翼連接兩個SalI位點和兩個PvuI位點，因而可作為SalI或PvuI片段克隆入Pol III啟動子載體中。使用所述i/rGUS序列(GUShp94)(參見表2)將所有描述于表1中的Pol III啟動子用于制備構(gòu)建體。除了所述GUShp94序列，也可通過使用更小的i/rGUS序列例如GUShp41a(被9bp非GUS序列隔開的莖區(qū)41bp；SEQ ID No 10)和GUShp21(被6bp非GUS序列隔開的莖區(qū)21bp，SEQ ID No 11)(表2)將AtU3B+136啟動子(SEQID No 4.)和CaMV35S啟動子用于制備構(gòu)建體。
表2.在煙草中檢驗的構(gòu)建體簡述
將這些構(gòu)建體導(dǎo)入用于植物轉(zhuǎn)化的雙元載體pART27或pWBVec4a。兩個表達(dá)GUS的不同轉(zhuǎn)基因煙草系用所有這些構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。所述構(gòu)建體也包括由35S啟動子(在pART7中)驅(qū)動GUShp94序列的對照構(gòu)建體。
測定來自生根培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化煙草幼苗的葉組織的GUS活性(熒光MUG測定)并且將結(jié)果概述于表3中。
結(jié)果顯示在煙草中具有AtU3(pMBW468)、At7SL(pMBW470)、At7SL+86(pMBW472)、AtU3+3(pMBW476)、AtU3+20(pMBW477)和TomU3(pLMW64)啟動子的GUShp94構(gòu)建體全都激活了GUS基因的沉默。AtU3、AtU6+20和TomU3構(gòu)建體表現(xiàn)得比其它構(gòu)建體更好。AtU3+136構(gòu)建體(pMBW466)在煙草中似乎不產(chǎn)生顯著的GUS沉默。還有OsU3構(gòu)建體(pWBW473)表現(xiàn)出只賦予低水平的GUS沉默。在煙草中Pol III啟動子構(gòu)建體pLMW58(AtU3+136-GUShp41a)產(chǎn)生了顯著水平的GUS沉默而35S構(gòu)建體pLMW53(35S-GUShp41a)沒有，表明Pol III啟動子在驅(qū)動小發(fā)夾RNA的表達(dá)方面比Pol II啟動子更有效。
表3.用列于表2中的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的煙草葉組織的MUG測定(5μg蛋白)
實施例3.對抗GUS報告基因(擬南芥)的基因沉默構(gòu)建體中Pol III啟動子的檢驗。
產(chǎn)生如實施例2中類似的構(gòu)建體并克隆入pWBVec4(參見表4)，并且用于轉(zhuǎn)化表達(dá)CaMV35S-GUS基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥系。
表4.在擬南芥中檢驗的構(gòu)建體概述
測定來自顯示對選擇性試劑PPT呈高水平抗性的T1代植株的葉片組織的GUS活性。所述MUG測定數(shù)據(jù)概述于表5。
對于GUShp94序列，盡管TomU3和AtU6+20表現(xiàn)更加一致和提供更好的沉默，所有U3和U6啟動子驅(qū)動的構(gòu)建體使GUS沉默。所述2個At7SL啟動子構(gòu)建體并不表現(xiàn)使GUS顯著沉默，盡管少數(shù)株系顯示中度沉默(可能是T-DNA插入鄰近于內(nèi)源啟動子的緣故)。
對于GUShp41序列，AtU3+136構(gòu)建體在GUS沉默的程度方面表現(xiàn)得比35S構(gòu)建體更好，再次表明在植物中Pol III啟動子在驅(qū)動小發(fā)夾RNA的表達(dá)方面比Pol II啟動子更有效。
表5.用列于表4中的構(gòu)建體超級轉(zhuǎn)化的擬南芥葉組織的MUG測定(5μg蛋白)
實施例4.對抗GUS報告基因(水稻)的基因沉默構(gòu)建體中Pol III啟動子的檢驗。
將構(gòu)建體pMBW479、pMBW481、pMBW485、pMBW486和pLMW62(參見表4)超級轉(zhuǎn)化到表達(dá)Ubil-GUS-nos基因的水稻中。GUS染色顯示只有pMBW485(OsU3-GUShp94)和pMBW479(35S-GUShp94)使固有的GUS基因產(chǎn)生顯著沉默。這些結(jié)果表明雙子葉的3型Pol III啟動子在單子葉植物中不起作用。
實施例5.對抗擬南芥內(nèi)源基因的基因沉默構(gòu)建體中Pol III啟動子的檢驗。
擬南芥U6-26構(gòu)建體包含從-446到+3bp(SEQ ID 5)的啟動子和通過PCR在所述片段各端創(chuàng)建XhoI位點時加上的添加序列。這些用來將所述PCR產(chǎn)物克隆入pGEM衍生質(zhì)粒的SalI位點。用NotI將所述插入片段切下并且插入到用于植物轉(zhuǎn)化的pART27雙元載體。也用PCR將SalI位點整合到所述啟動子和終止序列(T8)之間以插入寡核苷酸序列。
靶向兩個基因八氫蕃茄紅素去飽和酶(PDS沉默產(chǎn)生光漂白表型)和植物光敏色素B(PHYB沉默導(dǎo)致在白光下下胚軸延長)。對于PDS來說，單個靶區(qū)域被選擇，對于PHYB來說，三個分別來自5’UTR，在植物光敏色素之間保守的編碼區(qū)域的區(qū)域和3′UTR的區(qū)域被使用。對每一個靶區(qū)域使用兩個寡核苷酸，一個用于產(chǎn)生21bp長的雙鏈部分，另一個用于產(chǎn)生42bp雙鏈部分。將雙鏈寡核苷酸變成2個單鏈(upper和loWer)并且復(fù)性形成雙鏈DNA片段。在5’和3’末端帶有突出端序列以產(chǎn)生SalI相容性末端。用于PHYB構(gòu)建體的寡核苷酸序列在序列表中以SEQ ID 12到23表示，用于PDS構(gòu)建體的寡核苷酸以SEQ ID 24到27表示。
PDShp42構(gòu)建體在大多數(shù)檢測的植株中產(chǎn)生了表型。所述結(jié)果概述于表6中。
表6.PDS分值(顯示表型的T1代幼苗數(shù)目)
具有在35S啟動子控制下的dsRNA編碼區(qū)域PDS42的構(gòu)建體插入導(dǎo)致比具有在U6啟動子控制下的dsRNA編碼區(qū)域PDS42的構(gòu)建體產(chǎn)生更多的沒有沉默表型的植株，并且具有表型的植株只顯示微弱漂白的子葉表型和未漂白的葉子。
對于PHYB沉默實驗，使用PHYBC42dsRNA編碼區(qū)域獲得最滿意的沉默結(jié)果，其中大多數(shù)植株顯示比對照更長。大多數(shù)其它構(gòu)建體不顯示表型或只有一或二株植株顯示表型，這表明目的序列的選擇可能很重要。
測量白光培養(yǎng)植物的下胚軸并歸入5mm類別的組群。從表7中的數(shù)據(jù)概述來看，似乎U6啟動子驅(qū)動的構(gòu)建體比CaMV35S啟動子驅(qū)動的構(gòu)建體更加有效，但結(jié)果不如上述PDS基因沉默實驗明顯。
表7.PHYB的沉默
因而，從實驗中可得出下列結(jié)論1.3型Pol III啟動子可用以在植物細(xì)胞中有效地驅(qū)動dsRNA分子的表達(dá)。
2.AtU6啟動子表現(xiàn)為最有效的受檢驗的啟動子。
3.單子葉Pol III啟動子在單子葉和雙子葉植物中都具有功能，但雙子葉啟動子在單子葉植物中似乎不具功能。
4.III型Pol III啟動子在用相對較短的發(fā)夾型序列進(jìn)行基因沉默上表現(xiàn)比CaMV35S啟動子更有效。
實施例6.用小發(fā)夾RNA編碼構(gòu)建體進(jìn)行的額外實驗通過使用如圖1中概述的克隆策略，制備如在圖7中概述的20種新的小發(fā)夾構(gòu)建體。預(yù)計來自所有這些構(gòu)建體的小hpRNAs包含42bpdsRNA莖(對應(yīng)于靶基因序列)和9-nt的環(huán)(非靶序列)。選擇對應(yīng)于EIN2(描述于SEQ ID 31到33)或GUS(描述于SEQ ID 28到30)不同區(qū)域的三個靶序列。這些構(gòu)建體已被用于轉(zhuǎn)化煙草以估量其誘導(dǎo)對應(yīng)的內(nèi)源(EIN2)或報告(GUS)基因沉默的功效。
測定煙草苗的GUS表達(dá)，并將結(jié)果顯示于表8中。
結(jié)果顯示1)大部分小GUS發(fā)夾構(gòu)建體賦予良好的GUS沉默；并且2)Pol III啟動子驅(qū)動的構(gòu)建體pLMW164和pLMW165導(dǎo)致比35S啟動子驅(qū)動的構(gòu)建體pLMW155產(chǎn)生更加一致的GUS沉默。
表7.額外小發(fā)夾RNA編碼構(gòu)建體概述
表8假定轉(zhuǎn)化的煙草苗的GUS活性
測定的煙草組織主要是葉片，所述葉片來自生長在加有潮霉素(通常用于嚴(yán)格篩選)的培養(yǎng)基上小的再生苗。
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<223>擬南芥變種Landsberg erecta 7SL-2基因的啟動子序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>XhoI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(322)<223>PolIII啟動子區(qū)域<220>
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<221>misc_feature
<222>(323)..(328)<223>SalI限制性位點<400>1ctcgagatgt tgttgttacc agaaagtaaa taaatgttca atctctgatg ttctcaagta 60agtgagtttt attgggaata atattaactc atgttcttct gcatttgatt cctttgccgc120tctcttcttc tatcttaaat ctgtgtatac tatttcacta ttgggctttt tattagtcta180taatgggact caaaataagg ctttggccca catcaaaaag ataagtcaca aatcaaaact240aaattcagag tcttttctcc cacatcggtc actgtactca ttttgtgttt gtttatatat300tacacgaacc gatctttgtt acgtcgactt tttttctcga g341<210>2<211>429<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擬南芥變種Landsberg erecta 7SL-2基因的啟動子序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點下游的86個堿基<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>XhoI限制性位點
<220>
<221>misc_feature<222>(424)..(429)<223>XhoI限制性位點<220>
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<221>misc_feature<222>(7)..(408)<223>PolIII啟動子區(qū)域.
<400>2ctcgagatgt tgttgttacc agaaagtaaa taaatgttca atctctgatg ttctcaagta60agtgagtttt attgggaata atattaactt atgttcttct tgcatttgat ttctttgccg 120
ctctcttctt ctatcttaaa tctgtgtata ctatttcact attgggcttt ttattagtct180ataatgggac tcaaaataag gctttggccc acatcaaaaa gataagtcac aaatcaaaac240taaattcaga gtcttttctc ccacatcggt cactgtactc ttttgtgttt gtttatatat300tacacgaacc gatctttggt acgtcgagct aagtaacatg agcttgtaac ccatgtgggg360acattaagat ggtggaacac tggctcgggt ccacgggccg gttctgttgt cgactttttt420tttctcgag429<210>3<211>334<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擬南芥變種Landsberg erecta的U3 snRNA的啟動子序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>EcoRI限制性位點<220>
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<220>
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gcaacattgg tcacgatcgt ttttttttga attc334<210>4<211>467<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擬南芥變種Landsberg erecta的U3 snRNA基因的啟動子序列，包括轉(zhuǎn)錄啟始位點下游的136個堿基<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>EcoRI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(446)<223>Pol III啟動子區(qū)域<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擬南芥變種Landsberg erecta的U6 snRNA基因的啟動子序列，包括轉(zhuǎn)錄啟始位點下游的3個堿基<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>XhoI限制性位點<220>
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<220>
<223>擬南芥變種Landsberg erecta的U3 snRNA基因的啟動子序列，包括轉(zhuǎn)錄啟始位點下游的20個堿基<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>XhoI限制性位點<220>
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<221>misc_feature<222>(475)..(482)<223>Poly T片段
<220>
<221>misc_feature<222>(483)..(488)<223>XhoI限制性位點<400>6ctcgagcttc gttgaacaac ggaaactcga cttgccttcc gcacaataca tcatttcttc 60ttagcttttt ttcttcttct tcgttcatac agtttttttt tgtttatcag cttacatttt120cttgaaccgt agctttcgtt ttcttctttt taactttcca ttcggagttt ttgtatcttg180tttcatagtt tgtcccagga ttagaatgat taggcatcga accttcaaga atttgattga240ataaaacatc ttcattctta agatatgaag ataatcttca aaaggcccct gggaatctga300aagaagagaa gcaggcccat ttatatggga aagaacaata gtatttctta tataggccca360tttaagttga aaacaatctt caaaagtccc acatcgctta gataagaaaa cgaagctgag420tttatataca gctagagtcg aagtagtgat tgtcccttcg gggacatccg atcgtttttt480ttctcgag 488<210>7<211>405<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>水稻(0ryza sativa Indica IR36)的U3 snRNA的啟動子序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>EcoRI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(384)<223>Pol III啟動子區(qū)域<220>
<221>misc_feature<222>(385)..(390)<223>PvuI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(391)..(399)<223>poly T片段<220>
<221>misc_feature
<222>(400)..(405)<223>EcoRI限制性位點<400>7gaattcaagg gatctttaaa catacgaaca gatcacttaa agttcttctg aagcaactta 60aagttatcag gcatgcatgg atcttggagg aatcagatgt gcagtcaggg accatagcac120aggacaggcg tcttctactg gtgctaccag caaatgctgg aagccgggaa cactgggtac180gttggaaacc acgtgatgtg gagtaagata aactgtagga gaaaagcatt tcgtagtggg240ccatgaagcc tttcaggaca tgtattgcag tatgggccgg cccattacgc aattggacga300caacaaagac tagtattagt accacctcgg ctatccacat agatcaaagc tggtttaaaa360gagttgtgca gatgatccgt ggcacgatcg tttttttttg aattc405<210>8<211>442<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>番茄(具有小葫蘆形黃色果實的園藝品種)U3 snRNA的啟動子序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>EcoRI限制性位點
<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(421)<223>Pol III啟動子區(qū)域<220>
<221>misc_feature<222>(422)..(427)<223>PvuI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(428)..(436)<223>Poly T片段<220>
<221>misc_feature<222>(437)..(442)<223>EcoRI限制性位點<400>8gaattctgag agcattgtgt ggcgttcctc tgaattactt actgtcactt tgattggagc60
cattattttc agactctact gaagattgaa ttgaatgaga aactatgaaa ctttacaagt120gaattattat ggagttcatg gcaactgcta tggagttttt cctactggga attggaacgg180tttctacgaa attaactgtc cacacgttaa aaatataaat taatgcgtaa ttgttatttt240ttctataaca aataaaaaac tgaaatacga cataaatttt attactttaa ttgcacttta300gccttagaga tattgcgttg tagtcggcgt aggtgtgtca ggggccaata tattgttccc360acatcggcag tgcagcacat aaactctagc gttataagaa tctatccact atcaacggtc420acgatcgttt ttttttgaat tc 442<210>9<211>295<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于GUS基因沉默表達(dá)的94bp的dsRNA編碼區(qū)域序列(GUShp94)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>SalI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(11)
<223>PvuI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(100)<223>GUS序列(有義)<220>
<221>misc_feature<222>(101)..(195)<223>間隔物序列<220>
<221>misc_feature<222>(190)..(195)<223>BamHI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(196)..(284)<223>GUS序列(反義)
<220>
<221>misc_feature<222>(285)..(290)<223>PvuI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(290)..(295)<223>SalI限制性位點<400>9gtcgacgatc gcagcgtaat gctctacacc acgccgaaca cctgggtgga cgatatcacc 60gtggtgacgc atgtcgcgca agactgtaac cacgcgtctg ttgactggca ggtggtggcc120aatggtgatg tcagcgttga actgcgtgat gcggatcaac aggtggttgc aactggacaa180ggcactagcg ggatccagac gcgtggttac agtcttgcgc gacatgcgtc accacggtga240tatcgtccac ccaggtgttc ggcgtggtgt agagcattac gctgcgatcg tcgac 295<210>10<211>93<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于GUS基因沉默表達(dá)的41bp的dsRNA編碼區(qū)域序列(GUShp41)
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>SalI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(42)<223>GUS序列(有義)<220>
<221>misc_feature<222>(43)..(51)<223>間隔物序列<220>
<221>misc_feature<222>(52)..(87)<223>GUS序列(反義)<220>
<221>misc_feature
<222>(88)..(93)<223>Sal I限制性位點<400>10gtcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aatgcgagaa cttcatcaat60caccacgatg ccatgttcat ctgcccagtc gac 93<210>11<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于GUS基因沉默表達(dá)的21bp的dsRNA編碼區(qū)序列(GUShp21)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>SalI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(22)<223>GUS序列(有義)
<220>
<221>misc_feature<222>(23)..(28)<223>間隔物序列<220>
<221>misc_feature<222>(29)..(44)<223>GUS序列(反義)<220>
<221>misc_feature<222>(45)..(50)<223>Sal I限制性位點<400>11gtcgactggg cagatgaaca tgtacgatca tgttcatctg cccagtcgac 50<210>12<211>94<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的42bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYB5hp42)-upper鏈5’末端<400>12tcgacggagt cgggggtagt ggcggtggcc gtggcggtgg ccgtggagga ggccacggcc60accgccacgg ccaccgccac tacccccgac tccg94<210>13<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的42bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYB5hp42)-upper鏈5’末端<400>13tcgacggagt cgggggtagt ggcggtggcc gtggcggtgg ccgtggcctc ctccacggcc60accgccacgg ccaccgccac tacccccgac tccg94<210>14<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的21bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYB5hp21)-upper鏈5’末端<400>14tcgacggagt cgggggtagt ggcggaggag gccgccacta cccccgactc cg 52<210>15<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的21bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYBChp21)-lower鏈5’末端<400>15tcgacggagt cgggggtagt ggcggcctcc tccgccacta cccccgactc cg 52<210>16<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的42bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYBChp42)-upper鏈中部<400>16tcgatggatg gtgtggttca gccatgtagg gatatggcgg gggaacagga gggttccccc 60gccatatccc tacatggctg aaccacacca tcca 94<210>17
<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的42bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYBChp42)-lower鏈的中部<400>17tcgatggatg gtgtggttca gccatgtagg gatatggcgg gggaaccctc ctgttccccc60gccatatccc tacatggctg aaccacacca tcca94<210>18<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的21bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYBChp21)-upper鏈中部<400>18tcgatggatg gtgtggttca gccataggag gatggctgaa ccacacctcc aa52<210>19<211>52<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的21bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYBChp21)-lower鏈中部<400>19tcgatggatg gtgtggttca gccatcctcc tatggctgaa ccacaccatc ca 52<210>20<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的42bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYB3hp42)-upper鏈的3’端<400>20tcgacattgt caactgctag tggaagtggt gacatgatgc tgatgaagga ggtcatcagc 60atcatgtcac cacttccact agcagttgac aatg 94<210>21<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的42bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYB3hp42)-lower鏈的3’端<400>21tcgacattgt caactgctag tggaagtggt gacatgatgc tgatgacctc cttcatcagc60atcatgtcac cacttccact agcagttgac aatg94<210>22<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的21bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYB3hp21)-upper鏈的3’端<400>22tcgacattgt caactgctag tggaaaggag gttccactag cagttgacaa tg 52<210>23<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PHYB基因沉默表達(dá)的21bp的dsRNA編碼區(qū)序列，來自PHYB(PHYB3hp21)-lower鏈的3’端<400>23tcgacattgt caactgctag tggaacctcc tttccactag cagttgacaa tg 52<210>24
<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PDS基因(PDS42)沉默表達(dá)的42bp的dsRNA編碼序列-upper鏈<400>24tcgacttaac ttgtaaggaa tattacgatc ctaaccggtc aatgctagga ggagcattga60ccggttagga tcgtaatatt ccttacaagt taag94<210>25<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PDS基因(PDS42)沉默表達(dá)的42bp的dsRNA編碼序列-lower鏈<400>25tcgacttaac ttgtaaggaa tattacgatc ctaaccggtc aatgctcctc ctagcattga60ccggttagga tcgtaatatt ccttacaagt taag94<210>26<211>52<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于PDS基因(PDS21)沉默表達(dá)的21bp的dsRNA編碼區(qū)序列-upper鏈<400>26tcgacttaac ttgtaaggaa tattaaggag gtaatattcc ttacaagtta ag 52<210>27<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PDS基因(PDS21)沉默表達(dá)的21bp的dsRNA編碼區(qū)序列-lower鏈<400>27tcgacttaac ttgtaaggaa tattacctcc ttaatattcc ttacaagtta ag 52<210>28<211>115<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>小發(fā)夾RNA編碼區(qū)(GUS_A)<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(11)<223>SalI/PvuI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(53)<223>有義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(54)..(62)<223>環(huán)結(jié)構(gòu)<220>
<221>misc_feature<222>(63)..(104)<223>反義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(105)..(115)<223>SalI/PvuI限制性位點
<400>28gtcgacgatc gtgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg tcaataatca ggagttcctt 60cttcctgatt attgacccac actttgccgt aatgagtgac cgcagtcgac gatcg 115<210>29<211>112<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>小發(fā)夾RNA編碼區(qū)(GUS_B)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(8)<223>SalI/PvuI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(50)<223>有義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(51)..(59)<223>環(huán)結(jié)構(gòu)<220>
<221>misc_feature<222>(60)..(101)<223>反義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(102)..(112)<223>SalI/pvuI限制性位點<400>29gtcgacgatc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa gttccttctt 60tatcgaatcc tttgccacgc aagtccgcat cttcatgacg agtcgacgat cg 112<210>30<211>115<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>小發(fā)夾RNA編碼區(qū)(GUS_C)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(11)<223>SalI/PvuI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(53)<223>有義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(54)..(62)<223>環(huán)結(jié)構(gòu)<220>
<221>misc_feature<222>(63)..(104)<223>反義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(105)..(115)<223>SalI/PvuI限制性位點<400>30gtcgacgatc gtgcgacctc gcaaggcata ttgcgcgttg gcggtaacaa gaagttcctt 60ctttcttgtt accgccaacg cgcaatatgc cttgcgaggt cgcagtcgac gatcg 115<210>31<211>115<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>小發(fā)夾RNA編碼區(qū)(EIN_A)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(11)<223>SalI/PvuI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(53)
<223>有義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(54)..(62)<223>環(huán)結(jié)構(gòu)<220>
<221>misc_feature<222>(63)..(104)<223>反義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(105)..(115)<223>SalI/PvuI限制性位點<400>31gtcgacgatc gcatcttatg ccaatatgtt gcagctcgca taagcgttgt gacgttcctt60ctgtcacaac gcttatgcga gctgcaacat attggcataa gatggtcgac gatcg115<210>32<211>112<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>小發(fā)夾RNA編碼區(qū)(EIN_B)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(8)<223>SalI/PvuI限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(50)<223>有義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(51)..(59)<223>環(huán)結(jié)構(gòu)<220>
<221>misc_feature<222>(60)..(101)
<223>反義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(102)..(112)<223>SalI/PvuI限制性位點<400>32gtcgacgatc ggcaggcctg gtattacttc tctatgtttc tggcgtcttg gttccttctc60aagacgccag aaacatagag aagtaatacc aggcctgccg agtcgacgat cg 112<210>33<211>115<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>小發(fā)夾RNA編碼區(qū)(EIN_C)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(11)<223>SalI/PvuI限制性位點
<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(53)<223>有義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(54)..(62)<223>環(huán)結(jié)構(gòu)<220>
<221>misc_feature<222>(63)..(104)<223>反義RNA編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(105)..(115)<223>SalI/PvuI限制性位點<400>33gtcgacgatc gcatagctgt ttcctgtgtg aaattggtat ccgctcacaa ttcgttcctt60ctgaattgtg agcggatacc aatttcacac aggaaacagc tatggtcgac gatcg11權(quán)利要求
1.用于在植物細(xì)胞中降低目的基因表達(dá)的方法，其包括下列步驟(a)給所述植物細(xì)胞提供嵌合基因，所述嵌合基因包括下列有效連接的DNA片段i)啟動子，所述啟動子是由所述植物細(xì)胞的DNA依賴性RNA聚合酶III識別的啟動子，其特征在于所述啟動子是包含與所述DNA依賴性RNA聚合酶III相互作用的所有順式作用啟動子元件的III型啟動子；ii)DNA片段，當(dāng)所述DNA片段轉(zhuǎn)錄時，產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子包含有義和反義核苷酸序列，(1)所述有義核苷酸序列包含與轉(zhuǎn)錄自所述目的基因的RNA的大約19個連續(xù)核苷酸序列的核苷酸序列大約有90到100％序列一致性的大約19個連續(xù)核苷酸；(2)所述反義核苷酸序列包含與所述有義序列的大約19個連續(xù)核苷酸序列的核苷酸序列的互補(bǔ)序列有大約90到100％序列一致性的大約19個連續(xù)核苷酸；其中所述有義和反義核苷酸序列能形成大約19-200個核苷酸長度的雙鏈RNA；和iii)寡聚dT片段，所述寡聚dT片段含有至少4個連續(xù)T殘基；并且(b)鑒定植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)與不包含所述嵌合基因的植物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)相比被降低。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述啟動子是選自編碼U6s nRNA的植物基因的啟動子、編碼U3snRNA的植物基因的啟動子或編碼7SL RNA的植物基因的啟動子的3型POLIII啟動子。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述啟動子包含選自下列的核苷酸序列SEQ ID Nr1的從位點7的核苷酸到位點322的核苷酸、SEQ ID Nr2的從位點7的核苷酸到位點408的核苷酸、SEQ ID Nr3的從位點7的核苷酸到位點313的核苷酸、SEQ ID Nr4的從位點7的核苷酸到位點446的核苷酸、SEQ ID Nr5的從位點7的核苷酸到位點436的核苷酸、SEQ ID Nr6的從位點7的核苷酸到位點468的核苷酸、SEQ ID Nr7的從位點7的核苷酸到位點384的核苷酸、或SEQ ID Nr8的從位點7的核苷酸到位點421的核苷酸。
4.權(quán)利要求1到3中任一項的方法，其中所述植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞并且所述啟動子來源于雙子葉或單子葉植物或植物細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1到3中任一項的方法，其中所述植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞并且所述啟動子來源于單子葉植物或植物細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1到3中任一項的方法，其中所述啟動子對所述植物細(xì)胞而言是內(nèi)源的。
7.權(quán)利要求1到6中任一項的方法，其中所述目的基因是轉(zhuǎn)基因。
8.權(quán)利要求1到6中任一項的方法，其中所述目的基因是內(nèi)源基因。
9.權(quán)利要求1到8中任一項的方法，其中所述植物細(xì)胞包含于植物中。
10.描述于權(quán)利要求1到9中任一項的嵌合基因。
11.包含權(quán)利要求10的嵌合基因的植物細(xì)胞。
12.一種植物，所述植物在其植物細(xì)胞內(nèi)包含權(quán)利要求10的嵌合基因。
全文摘要
提供了當(dāng)使用具有長度短于大約200個堿基對的莖區(qū)的dsRNA序列時增加基因沉默功效的方法和手段，具體方法為提供編碼這類dsRNA序列的嵌合基因，所述嵌合基因具有由DNA依賴性RNA聚合酶III識別的啟動子，所述啟動子包含與DNA依賴性RNA聚合酶III相互作用的所有順式作用啟動子元件。
文檔編號C12N15/11GK1750752SQ200480004730
公開日2006年3月22日 申請日期2004年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月19日
發(fā)明者王明波, C·A·赫利維爾, P·M·沃特豪斯 申請人:聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織