專利名稱：禽類及禽蛋中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的制作方法
發(fā)明人R.D.伊瓦瑞，A.J.哈維，J.A.莫里斯，G.劉和J.C.拉普背景技術(shù)a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入禽類細(xì)胞以及使外源遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中表達(dá)的載體和方法。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因禽類，包括雞和火雞，以及含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋。
b)相關(guān)領(lǐng)域描述很多天然和合成的蛋白質(zhì)已用于診斷和治療性應(yīng)用；很多其他蛋白質(zhì)正處于開發(fā)或臨床試驗(yàn)階段?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法包括從天然來源中分離以及在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組生產(chǎn)。然而，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法的復(fù)雜性和高成本，人們正在開發(fā)其他的方法。例如，已報(bào)道了在豬、綿羊、山羊和牛的奶中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的方法。這些方法有幾個(gè)局限性，包括創(chuàng)始動(dòng)物和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物群體之間長時(shí)間傳代次數(shù)，大量的管理和醫(yī)療成本，以及由于基因組中轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的位置效應(yīng)所致表達(dá)水平的變化。也正在利用大麥和黑麥的碾磨和麥芽工藝生產(chǎn)蛋白質(zhì)。然而，植物的翻譯后修飾與脊椎動(dòng)物的翻譯后修飾有所不同，這種不同常對(duì)外源蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生決定性影響。
將輸卵管作為生物反應(yīng)器如組織培養(yǎng)和乳腺生物反應(yīng)器一樣，禽類的輸卵管也可能作為生物反應(yīng)器。修飾禽類遺傳物質(zhì)使高水平分泌外源蛋白質(zhì)并包裝于禽蛋中的方法成功使得能便宜地生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)。這種方法有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)a)減少了傳代次數(shù)(24周)和通過人工授精可快速建立轉(zhuǎn)基因群體；b)容易通過增加群體大小擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模以滿足產(chǎn)品需求；c)所表達(dá)蛋白質(zhì)可經(jīng)歷翻譯后修飾；4)可自動(dòng)喂養(yǎng)和收集蛋；d)卵清天然無菌；和e)由于卵清中蛋白質(zhì)的濃度高從而降低了工藝成本。
禽類包括雞的生殖系統(tǒng)已有很好的描述。母雞的蛋由經(jīng)過輸卵管時(shí)被分泌于卵黃上的幾層組成。蛋的產(chǎn)生開始于母雞卵巢中大卵黃的形成。然后未受精的卵母細(xì)胞定位于卵黃囊上部。隨著排卵或卵黃從卵巢中排出，卵母細(xì)胞進(jìn)入輸卵管漏斗時(shí)，如果有精子，卵母細(xì)胞受精，然后進(jìn)入有管狀腺體細(xì)胞排列的輸卵管蛋白分泌部(magnum)。這些腺體細(xì)胞可向蛋白分泌部腔中分泌卵清蛋白質(zhì)，包括卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白、伴白蛋白和卵粘蛋白，在腔中這些蛋白質(zhì)沉積于禽胚胎和卵黃上。
卵白蛋白基因編碼一種在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中特異表達(dá)的45kD的蛋白質(zhì)，(Beato，Cell56335-344(1989))。卵白蛋白是含量最豐富的卵清蛋白質(zhì)，包括50％以上的管狀腺體細(xì)胞產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)，或每個(gè)大A級(jí)蛋約有4克蛋白質(zhì)(Gilbert，“蛋的白蛋白及其形成”，Physiology and Biochemistry of theDomestic Fowl，Bell和Freeman，主編，科學(xué)出版社，倫敦，紐約，1291-1329頁)。已經(jīng)克隆和分析了卵白蛋白基因及其每側(cè)區(qū)域20kb以上的序列(Lai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA752205-2209(1978)；Gannon等，Nature 278428-424(1979)；Roop等，Cell 1963-68(1980)；和Royal等，Nature279125-132(1975))。
對(duì)卵白蛋白基因的調(diào)控給予了很大關(guān)注。該基因響應(yīng)甾體激素，例如雌激素、糖皮質(zhì)激素和黃體激素，這些激素可誘導(dǎo)未成熟仔雞每個(gè)管狀腺體細(xì)胞累積產(chǎn)生約70,000個(gè)卵白蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄物，和誘導(dǎo)成熟產(chǎn)蛋母雞每個(gè)管狀腺體細(xì)胞100,000個(gè)卵清蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄物(Palmiter，J.Biol.Chem.2488260-8270(1973)；Palmiter，Cell 4189-197(1975))。轉(zhuǎn)染的管狀腺體細(xì)胞中的DNA酶超敏性分析和啟動(dòng)子-報(bào)告基因試驗(yàn)確定了一個(gè)7.4kb的區(qū)域含有卵白蛋白基因表達(dá)所需的序列。此5’側(cè)翼區(qū)含有四個(gè)從中心算起距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-0.25、-0.8、-3.2和-6.0kb的DNA酶I超敏感位點(diǎn)。這些位點(diǎn)分別稱為HS-I、-II、-III和-IV。這些區(qū)域反映了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，并且與輸卵管細(xì)胞中卵白蛋白基因的表達(dá)特異性相關(guān)(Kaye等，EMBO 31137-1144(1984))。HS-II和-III的超敏性是雌激素誘導(dǎo)的，支持了這些區(qū)域在卵白蛋白基因表達(dá)的激素誘導(dǎo)中具有作用(的觀點(diǎn))。
HS-I和-II都是卵白蛋白基因轉(zhuǎn)錄的甾體誘導(dǎo)所必需的，在移植的管狀腺細(xì)胞中，含有這些元件的5’區(qū)的一個(gè)1.4kb部分足以驅(qū)動(dòng)甾體依賴的卵清蛋白表達(dá)(Sanders和McKnight，Biochemistry 276550-6557(1988))。HS-I稱為負(fù)響應(yīng)元件(“NRE”)，因?yàn)樗袔讉€(gè)在缺少激素時(shí)能抑制卵白蛋白表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件(Haekers等，Mol.Endo.91113-1126(1995))。蛋白因子結(jié)合于這些元件，包括一些只在輸卵管核中發(fā)現(xiàn)的因子，提示這些因子在組織特異性表達(dá)中有作用。HS-II稱為甾體依賴的響應(yīng)元件(“SDRE”)，因?yàn)樗鼘?duì)啟動(dòng)甾體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄是必需的。它可結(jié)合稱為Chirp-I的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體。Chirp-I受雌激素誘導(dǎo)并在環(huán)己胺的存在下迅速轉(zhuǎn)換(Dean等，Mol.Cell.Biol.162015-2024(1996))。利用移植的管狀腺體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)確定了一套附加的以甾體依賴方式結(jié)合SDRE的因子，包括NFκB類似因子(Nordstrom等，J.Biol.Chem.26813193-13202(1993)；Schweers和Sanders，J.Biol.Chem.26610490-10497(1991))。
關(guān)于HS-III和-IV的功能了解極少。HS-III包括功能性雌激素響應(yīng)元件，當(dāng)它與雌激素受體cDNA共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞時(shí)使卵清蛋白近端啟動(dòng)子或異源啟動(dòng)子具有雌激素誘導(dǎo)性。這些數(shù)據(jù)提示，HS-III可能在卵白蛋白基因的總體調(diào)控中起功能性作用。關(guān)于HS-IV的功能了解很少，只知道它不含有功能性雌激素響應(yīng)元件。(Kato等，Cell 68731-742(1992))。
通過導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)和/或打斷特定基因來修飾真核基因組引起了人們很大的興趣。已證明某些真核細(xì)胞可能是生產(chǎn)外源性真核蛋白質(zhì)的優(yōu)良宿主。導(dǎo)入編碼某些蛋白質(zhì)的基因還可能產(chǎn)生具有更高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新表型。此外，通過導(dǎo)入能使遺傳缺陷型細(xì)胞表達(dá)其不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的外源基因，可治療一些遺傳疾病。最后，通過插入或去除遺傳物質(zhì)對(duì)動(dòng)物基因組進(jìn)行修飾，有助于基因功能的基礎(chǔ)研究，并可能最終導(dǎo)入用于治療疾病的基因，或者改進(jìn)動(dòng)物的表型。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已用幾種不同的方法實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因。第一，在哺乳動(dòng)物包括小鼠、豬、山羊、綿羊和牛中，將轉(zhuǎn)基因顯微注射入受精卵的原核，然后將受精卵放于代孕母體的子宮內(nèi)，在其中受精卵發(fā)育成其種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因的創(chuàng)始動(dòng)物。用工程方法改造的轉(zhuǎn)基因攜帶有含特定調(diào)控序列指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)在特定類型細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因是隨機(jī)插入基因組的，所以轉(zhuǎn)基因插入基因組位點(diǎn)的位置效應(yīng)可能不同程度地引起轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的下降。該方法還要求對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行鑒定，以使指導(dǎo)在所需類型細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的必要序列得以確定并包含在轉(zhuǎn)基因載體中(Hogan等，小鼠胚胎操作，Cold Spring Harbor Laboratory，紐約(1988))。
產(chǎn)生動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的第二種方法是靶向基因打斷，該方法中，將攜帶側(cè)接有選擇標(biāo)記基因的目的基因序列的靶向載體導(dǎo)入胚胎干(“ES”)細(xì)胞。通過同源重組，該靶向載體替代了目的基因序列在染色體上的位置或插入序列內(nèi)部阻止目標(biāo)基因產(chǎn)物的表達(dá)。選出攜帶有正確打斷的基因的ES細(xì)胞克隆，然后將其注射入早期胚泡產(chǎn)生嵌合性創(chuàng)始動(dòng)物，其中一些創(chuàng)始動(dòng)物種系中攜帶有該轉(zhuǎn)基因。如果該轉(zhuǎn)基因刪除了目標(biāo)位點(diǎn)，則該目標(biāo)位點(diǎn)被轉(zhuǎn)基因載體中的外源DNA所替代，該外源DNA含有編碼用于選擇培養(yǎng)中經(jīng)轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因的DNA，還可能含有編碼外源蛋白質(zhì)的插入并替代被刪除基因，以使目標(biāo)基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該外源基因表達(dá)的DNA序列(美國專利Nos.5,464,764和5,487,992(M.P.Capecchi和K.R.Thomas))。該方法的局限性在于，ES細(xì)胞在很多動(dòng)物中是不能獲得的，包括山羊、牛、綿羊和豬。而且，當(dāng)被刪除的基因?qū)τ谠撋锘蚣?xì)胞型的生存或正常發(fā)育是必需時(shí)，此法不可行。
最近，禽類轉(zhuǎn)基因的發(fā)展已使我們可對(duì)禽類基因組進(jìn)行修飾?？蓪?fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒注射入新產(chǎn)蛋的雞胚盤胚下腔中產(chǎn)生種系轉(zhuǎn)基因雞(美國專利號(hào)5,162,215；Bosselman等，Science243533-534(1989)；Thoraval等，TransgenicResearch 4369-36(1995))?？蓪y帶有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸隨機(jī)插入胚胎細(xì)胞的染色體中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因。已有描述利用該插入融合基因構(gòu)建物5’或3’區(qū)的絕緣子元件來克服插入位點(diǎn)的位置效應(yīng)(Chim等，Cell 74504-514(1993))。
在另一種方法中，將轉(zhuǎn)基因顯微注射入受精卵胚盤中產(chǎn)生穩(wěn)定的能將基因轉(zhuǎn)遞給F1代的轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始禽(Love等，Bio/Technology1260-63(1994))。然而，該方法有幾點(diǎn)不足。為收集受精卵必須犧牲母雞，轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始禽的份數(shù)低，注射的卵需要在代孕殼中花費(fèi)大量勞動(dòng)力體外培養(yǎng)。
在另一種方法中，將含有假定的原生殖細(xì)胞(“PGCs”)的胚盤細(xì)胞從供體卵切下，用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染并導(dǎo)入受體胚的胚下腔。將該轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞摻入受體胚產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚，預(yù)期其中一些胚的種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因通過非同源重組隨機(jī)插入染色體位點(diǎn)。然而，用該方法還沒有產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始禽類。
Lui，Poult.Sci.68999-1010(1995)，用含有卵黃原蛋白基因側(cè)接DNA序列的靶向載體刪除培養(yǎng)的雞胚盤細(xì)胞的部分固有基因。然而，還沒有證明這些細(xì)胞有助于形成種系并因此產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚。此外，當(dāng)被刪除的基因?qū)τ谠撋锘蚣?xì)胞型的生存或正常發(fā)育是必需的，此法不可行。
因此可見，需要一種能將可操作性連接有合適啟動(dòng)子的外源DNA導(dǎo)入禽類基因組中的方法以實(shí)現(xiàn)外源基因有效表達(dá)的方法。而且，需要?jiǎng)?chuàng)建能在輸卵管中表達(dá)外源基因并將表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到蛋中的種系修飾的轉(zhuǎn)基因禽類。
干擾素1957年發(fā)現(xiàn)干擾素時(shí)，它作為一種重要的抗病毒制劑受到歡迎。70年代后期，干擾素開始與重組基因技術(shù)相結(jié)合。今天，干擾素是癌癥生物過程的復(fù)雜性以及對(duì)付這種復(fù)雜性的忍耐性和毅力價(jià)值的象征。
引起癌癥的異?；虬ㄖ辽偃N類型第一種是癌基因，當(dāng)其改變時(shí)促進(jìn)了癌癥特征性的異常生長和分裂。第二，腫瘤抑制基因，當(dāng)其改變時(shí)不能控制這種異常生長和分裂。第三，DNA修復(fù)基因，當(dāng)其改變時(shí)不能修復(fù)致癌的突變。研究者推測(cè)體內(nèi)大約有30-40種腫瘤抑制基因，各編碼產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可能受到“主”腫瘤抑制蛋白質(zhì)例如Rb(成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，首先與其相關(guān)聯(lián))和p53(與很多不同的腫瘤相關(guān))的控制。實(shí)驗(yàn)室證據(jù)提示，僅使這些腫瘤抑制基因之一回復(fù)到正常功能就可顯著降低惡性腫瘤的侵襲性。
發(fā)現(xiàn)干擾素可抑制細(xì)胞生長時(shí)，激起了科學(xué)家們對(duì)干擾素的極大興趣。另外，還發(fā)現(xiàn)干擾素對(duì)免疫系統(tǒng)有某些正面作用。現(xiàn)在認(rèn)為干擾素與腫瘤抑制蛋白質(zhì)類似它能抑制細(xì)胞尤其是惡性細(xì)胞的生長；阻抑許多癌基因和生長因子的作用；與其他生物制劑不同，它能抑制對(duì)于癌轉(zhuǎn)移過程很關(guān)鍵的細(xì)胞移動(dòng)能力。
細(xì)胞間通信依賴于組織中所有結(jié)構(gòu)組分發(fā)揮正常功能，信息通過以下結(jié)構(gòu)組分傳遞基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架以及細(xì)胞自身。在癌中，細(xì)胞間的通信網(wǎng)絡(luò)受到破壞。如果細(xì)胞骨架被破壞，信息就不能傳輸?shù)胶酥?，核開始功能異常。因?yàn)楹耸前┗蚧蚰[瘤抑制基因開啟或關(guān)閉的部位，這種功能異常可導(dǎo)致惡性腫瘤。當(dāng)發(fā)生這種情況時(shí)，細(xì)胞開始不規(guī)則生長并且不分化。它們還可能開始移動(dòng)并打擾其它細(xì)胞。據(jù)認(rèn)為干擾素可能與其他細(xì)胞外或細(xì)胞物質(zhì)協(xié)同，恢復(fù)平衡和自身穩(wěn)定，確保信息正確傳輸。干擾素抑制生長、抑制移動(dòng)能力、通過粘附分子增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)環(huán)境響應(yīng)的能力。它還糾正細(xì)胞骨架的缺陷和損傷。已發(fā)現(xiàn)干擾素可阻抑新血管形成，新血管形成的起始步驟是惡性腫瘤生長非常所必需的。而且，它能阻抑纖維化，纖維化是對(duì)刺激很多不同類型細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞生長所致傷害的一種反應(yīng)，(KathrynL.Hale，Oncolog，干擾素一種生物治療的演化，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的新看法)。
干擾素是當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞受到病毒侵犯時(shí)產(chǎn)生的，被釋放到血流或細(xì)胞間的液體中，誘導(dǎo)健康的細(xì)胞產(chǎn)生抗擊感染的酶。很多年以來，用于研究的人干擾素的供應(yīng)受到高成本提取技術(shù)的限制。然而1980年，通過遺傳工程可獲得更大量的這種蛋白質(zhì)(即這種蛋白質(zhì)的重組形式)?？茖W(xué)家們還確定體內(nèi)可產(chǎn)生三種不同類型的干擾素，分別稱為α(α)、β(貝塔)和γ(伽瑪)干擾素。起初認(rèn)為干擾素是高度物種特異性的，但是現(xiàn)在知道，各種干擾素可能在其他物種里具有不同的活性范圍。α干擾素(α-IFN)已被批準(zhǔn)用于毛細(xì)胞白血病和丙型肝炎的治療。還發(fā)現(xiàn)α-IFN對(duì)肝癌和肝硬化主要原因的慢性乙型肝炎和生殖道疣及一些罕見的血和骨髓癌癥有效。含有α-IFN的鼻噴霧劑可提供抗鼻病毒引起的感冒的某些保護(hù)力。人α-IFN屬于一個(gè)細(xì)胞外信號(hào)傳遞蛋白質(zhì)家族，具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性。IFN-α蛋白質(zhì)由人9號(hào)染色體上成簇的13個(gè)基因組成的多基因家族編碼。白細(xì)胞中大多數(shù)IFN-α基因受仙臺(tái)(Sendai)病毒誘導(dǎo)在mRNA水平上表達(dá)。另外，還發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平至少能產(chǎn)生九種不同亞型的蛋白質(zhì)。表達(dá)幾種類似的IFN-α蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義還不知道，然而，認(rèn)為它們?cè)诳共《尽⑸L抑制和自殺細(xì)胞刺激活性方面具有劑量上不相同的模式?，F(xiàn)在，兩種IFN-α變體，IFN-α2a和IFN-α2b，已通過重組技術(shù)在大腸桿菌中大量生產(chǎn)并投入市場(chǎng)作為藥物。與天然的IFN-α不同，已發(fā)現(xiàn)這些重組的IFN-α產(chǎn)品在某些患者中具有免疫原性，這可能是因?yàn)镮FN-α蛋白質(zhì)的非天然形式所致。因此，對(duì)于IFN-α藥物的發(fā)展，不但需要鑒定正常人白細(xì)胞中表達(dá)的IFN-α亞型和變體，而且需要特征分析它們可能的翻譯后修飾(Nyman等(1998)Eur.J.Biochem.253485-493)。
Nyman等(見上)研究了天然人IFN-α的糖基化。他們發(fā)現(xiàn)，仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)后白細(xì)胞產(chǎn)生的九種亞型中有兩個(gè)是糖基化的，稱為IFN-α14c和IFN-α2b，與以前的研究一致。IFN-α14是唯一一個(gè)有潛在N-糖基化位點(diǎn)的IFN-α亞型，所述潛在糖基化位點(diǎn)為Asn2和Asn72，但實(shí)際上只有Asn72發(fā)生糖基化。IFN-α2在蘇氨酸106(Thr106)位發(fā)生O-糖基化。令人感興趣的是，其他的IFN-α亞型在這個(gè)位置不含有Thr。在該研究中，Nyman等釋放和分離了這些寡糖鏈并用質(zhì)譜法和特異性糖苷酶消化分析了它們的結(jié)構(gòu)。IFN-α2b和IFN-α14c在反相高效液相色譜(RP-HPLC)中均解析為三個(gè)峰。對(duì)RP-HPLC產(chǎn)生的IFN-α2b諸組分做電噴離子質(zhì)譜(ESI-MS)分析顯示它們的分子量有所不同，提示這些組分代表了不同的糖形。每個(gè)組分釋放的O-聚糖的質(zhì)譜分析證實(shí)了這一點(diǎn)。據(jù)估計(jì)，IFN-α2b含有約20％的核心2型五糖，約50％雙唾液酸和30％單唾液酸的核心1型聚糖。Nyman等的數(shù)據(jù)與以前的IFN-α2b糖基化的部分特征一致(Adolf等，(1991)Biochem.J.276511-518)。IFN-α14c和IFN-α2b中糖基化的作用還不是很清楚。根據(jù)Nyman等(見上)，碳?xì)滏湆?duì)于其生物活性不重要，但是糖基化可能會(huì)影響該蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性。
人類基因組中至少有15種功能基因編碼IFN-α家族的蛋白質(zhì)。氨基酸序列相似性一般位于90％的區(qū)域，這些分子在結(jié)構(gòu)上緊密相關(guān)。IFN-α蛋白質(zhì)含有166個(gè)氨基酸(IFN-α2除外，它有165個(gè)氨基酸)，特征是含有四個(gè)保守的可形成兩個(gè)二硫橋的半胱氨酸殘基。諸IFN-α類的特征為輕微酸性，缺少天門冬酰胺相連的糖基化識(shí)別位點(diǎn)(IFN-α14除外，它含有天門冬酰胺相連的糖基化識(shí)別位點(diǎn))。已知有三種IFN-α2變體，它們?cè)诘?3位和34位上氨基酸不同IFN-α2a(Lys-23，His-34)、IFN-α2b(Arg-23，His-34)和IFN-α2c(Arg-23，Arg-34)。其他兩種稱為IFN-ω1和IFN-β的人IFN是N-糖基化的，與IFN-α關(guān)系更遠(yuǎn)。IFN-α、-β、-ω合起來稱為I類IFNs，它們能結(jié)合相同的高親和性細(xì)胞膜受體(Adolf等，(1991)，Biochem.J.276511-518)。
Adolf等(見上)利用單克隆抗體的特異性從人白細(xì)胞IFN中分離得到了天然的IFN-α2。他們通過免疫親和層析得到了具有期望的抗病毒活性純度95％的IFN-α2蛋白質(zhì)。用反相HPLC分析天然的IFN-α2表明，該天然蛋白質(zhì)可以分辨為親水性均比大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-α2高的兩種成分。SDS/PAGE顯示，該蛋白質(zhì)在分子質(zhì)量上也是異質(zhì)性的，可產(chǎn)生三條帶，所有條帶的電泳遷移率都低于相等的大腸桿菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
Adolf等(見上)還推測(cè)天然的IFN-α2攜帶有O-連接的糖殘基。用堿切割假定的多肽-糖鍵斷裂，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是均質(zhì)的，與重組蛋白質(zhì)的分子量相同，證實(shí)了他們的假說。在蛋白水解斷裂后，分離和分析產(chǎn)生的片段，將天然和重組的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步比較，使他們確定了一種候選的糖肽。該多肽的序列分析鑒定了Thr-106為O-糖基化位點(diǎn)。所有已發(fā)表的IFN-α2種類的氨基酸序列比較顯示，這個(gè)蘇氨酸殘基是IFN-α2獨(dú)有的。在其他所有IFN蛋白質(zhì)中的相應(yīng)位置上(107)為甘氨酸、異亮氨酸或谷氨酸。
大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-α2制品缺少O-糖基化并且已在很多國家注冊(cè)為藥物。然而，缺少糖基化可能會(huì)影響治療應(yīng)用的大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-α2的免疫原性。研究顯示，16位接受酵母生產(chǎn)的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的患者中，4位產(chǎn)生了該蛋白質(zhì)的抗體。令人感興趣的是，發(fā)現(xiàn)這些抗體能與在內(nèi)源性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子中受O-連接的糖基化保護(hù)但在該重組因子中暴露的表位反應(yīng)(Adolf等，見上)。
類似地，描述了在患者長期治療之后誘導(dǎo)了針對(duì)重組大腸桿菌IFN-α2的抗體，據(jù)推測(cè)，天然IFN-α2比重組IFN-α2蛋白質(zhì)的免疫原性低(Galton等，(1989)Lancet 2572-573)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于將外源核酸序列穩(wěn)定導(dǎo)入禽類基因組以表達(dá)外源序列來改變禽類表型或產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的載體和方法。具體說，生產(chǎn)了在輸卵管中表達(dá)外源序列并使外源蛋白質(zhì)沉積到蛋中的轉(zhuǎn)基因禽類。本發(fā)明包括含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋。本發(fā)明進(jìn)一步提供可在轉(zhuǎn)基因禽類輸卵管中有效表達(dá)并沉積于禽蛋中的新形式干擾素和促紅細(xì)胞生成素。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供在禽類特定組織中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的方法。外源蛋白質(zhì)可在禽類輸卵管血液和/或其他細(xì)胞和組織中表達(dá)。將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛ヅ弑P細(xì)胞中，優(yōu)選接近X期的胚盤細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類，從而在輸卵管蛋白分泌部的管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)，分泌入腔中，沉積于硬殼蛋的卵清中。如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類在其種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因。因此，可通過將外源基因人工導(dǎo)入禽類胚胎細(xì)胞中和以孟德爾方式可將外源基因穩(wěn)定傳遞給禽類后代，將外源基因轉(zhuǎn)入禽類。
本發(fā)明包括一種在禽類輸卵管中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的方法。該方法包括，第一步，提供含有編碼序列和操作性連接于該編碼序列的啟動(dòng)子以使啟動(dòng)子可影響該核酸在禽類輸卵管中表達(dá)的載體。下一步，創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和/或組織，其中，將所述載體導(dǎo)入新分離的、培養(yǎng)中或胚胎中的禽胚胎胚盤細(xì)胞，以使該載體序列隨機(jī)插入禽基因組。最后，由轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞和/或組織產(chǎn)生成熟的在輸卵管中表達(dá)外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因禽類。當(dāng)輸卵管中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)也被分泌到輸卵管腔并沉積于硬殼蛋的卵清中時(shí)，該方法也可用于生產(chǎn)含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋。
一方面，通過載體隨機(jī)插入到禽類基因組染色體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雞，可任選地包括用DNA轉(zhuǎn)染胚胎胚盤細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞注射入受體胚盤下的胚下腔。該方法所用的載體含有融合于外源編碼序列并指導(dǎo)該編碼序列在輸卵管管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的另一方面，通過在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的5’和3’LTRs之間攜帶有轉(zhuǎn)基因遺傳密碼的復(fù)制缺陷型或可復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)胚胎胚盤細(xì)胞，獲得隨機(jī)染色體插入和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類。例如，可利用含有經(jīng)修飾的含有插入到啟動(dòng)子區(qū)段下游的外源基因的pNLB質(zhì)粒的禽白血病病毒(ALV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？捎冒b在病毒顆粒中的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的RNA拷貝感染胚胎胚盤發(fā)育為轉(zhuǎn)基因禽類。或者，將能產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的輔助細(xì)胞導(dǎo)入胚胎胚盤。
本發(fā)明的另一方面提供一種含有編碼序列和操作及位置上相關(guān)可使該編碼序列在禽類輸卵管中表達(dá)的啟動(dòng)子的載體。此載體包括，但不限于，禽白血病病毒(ALV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。該啟動(dòng)子能充分驅(qū)動(dòng)此編碼序列在禽類輸卵管中的有效表達(dá)。此編碼序列編碼可沉積于硬殼蛋卵清中的外源蛋白質(zhì)。此編碼序列編碼的外源蛋白質(zhì)可以是如轉(zhuǎn)基因禽可產(chǎn)生的干擾素-α2b(TPD IFN-α2b)或轉(zhuǎn)基因禽類可產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TPDEPO)。本發(fā)明方法中所用的載體含有尤其適于外源蛋白質(zhì)在禽類和禽蛋中表達(dá)的啟動(dòng)子。這樣，此外源編碼序列的表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)基因禽類的輸卵管和血液中以及禽蛋的卵清中。所述啟動(dòng)子包括但不限于，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，MDOT啟動(dòng)子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子，鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子，鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子，卵白蛋白啟動(dòng)子，溶菌酶啟動(dòng)子，伴白蛋白啟動(dòng)子，卵類粘蛋白啟動(dòng)子，卵粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子。任選地，該啟動(dòng)子可以是至少一種啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段，例如，卵白蛋白啟動(dòng)子，溶菌酶啟動(dòng)子，伴白蛋白啟動(dòng)子，卵類粘蛋白啟動(dòng)子，卵粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。
本發(fā)明的一個(gè)方面包括將卵白蛋白啟動(dòng)子截短和/或?qū)⒙寻椎鞍讍?dòng)子的關(guān)鍵調(diào)控元件壓縮使其保留在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)所需的序列，同時(shí)使其足夠小而易于摻入載體。例如，可利用卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)段的總長度約0.88kb-7.4kb，優(yōu)選長0.88kb-1.4kb。優(yōu)選該區(qū)段含有卵清蛋白基因甾類依賴性調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件。任選地，此區(qū)段也可包括卵白蛋白基因的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)殘基。或者，該啟動(dòng)子是溶菌酶基因、伴白蛋白基因、卵類粘蛋白基因、卵粘蛋白基因和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。此類啟動(dòng)子的一個(gè)例子是合成的含有卵類粘蛋白(MD)啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OT)啟動(dòng)子元件的MDOT啟動(dòng)子。
本發(fā)明的另一方面，整合入禽類基因組的載體含有操作上連接于外源編碼序列的組成型啟動(dòng)子(例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子，鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子)。或者，可使用非組成型啟動(dòng)子例如鼠乳腺腫瘤(MMTV)啟動(dòng)子。
本發(fā)明的其他方面提供在其種系組織的遺傳物質(zhì)中攜帶有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類。更具體說，該轉(zhuǎn)基因包含外源基因和操作及位置上與外源基因相關(guān)的啟動(dòng)子以表達(dá)此外源基因。所述外源基因在轉(zhuǎn)基因禽的輸卵管和血液中表達(dá)。該外源基因編碼外源蛋白質(zhì)例如TPD IFN-α2b或TPD EPO。該外源蛋白質(zhì)可沉積于硬殼蛋的卵清中。
本發(fā)明的另外一方面提供的禽蛋含有對(duì)于該禽類為外源性的蛋白質(zhì)。利用本發(fā)明可使外源蛋白質(zhì)在輸卵管細(xì)胞中表達(dá)，分泌到輸卵管蛋白分泌部腔并沉積于禽蛋的卵清中。包在禽蛋中的蛋白質(zhì)量可達(dá)到每只蛋1克或更多。所述外源蛋白質(zhì)包括，但不限于，TPD IFN-α2b和TPD EPO。
本發(fā)明的另外一方面提供分離的包含人干擾素-α2b(IFN-α2b)最佳編碼序列，即編碼轉(zhuǎn)基因禽可產(chǎn)生的干擾素-α2b(TPD IFN-α2b)的重組轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b編碼序列的多聚核苷酸序列。本發(fā)明還包括分離的包含TPDIFN-α2b多肽序列的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)的Thr-106位被N-乙?；?氨基半乳糖、半乳糖、N-乙?；?葡糖胺、唾液酸和其組合物O-糖基化。
本發(fā)明還設(shè)想一種包含TPD IFN-α2b多肽序列的藥物組合物，其中的蛋白質(zhì)在Thr-106位被N-乙酰基-氨基半乳糖、半乳糖、N-乙?；?葡糖胺、唾液酸和其組合物O-糖基化。
本發(fā)明的另外一方面提供一種分離的包含人促紅細(xì)胞生成素(EPO)最佳編碼序列，即編碼轉(zhuǎn)基因禽類可產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TPD EPO)的重組轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素編碼序列的多聚核酸序列。
本發(fā)明的另外一方面提供一種含有第一和第二編碼序列及操作和位置上與該第一和第二編碼序列相關(guān)的可在禽類輸卵管中表達(dá)該第一和第二編碼序列的啟動(dòng)子的載體。該載體還包含位于該第一和第二編碼序列之間的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件，其中，第一編碼序列編碼蛋白質(zhì)X，第二編碼序列編碼蛋白質(zhì)Y，蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y沉積于硬殼蛋的卵清中。例如，蛋白質(zhì)X可以是單克隆抗體的輕鏈(LC)，蛋白質(zhì)Y可以是單克隆抗體的重鏈(HC)。或者，第二編碼序列編碼的蛋白質(zhì)(例如，酶)能對(duì)第一編碼序列編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾。該載體任選地可含有其它的編碼序列和其它IRES元件，通過IRES元件將載體中的每個(gè)編碼序列與其他編碼序列分開。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)含有蛋白質(zhì)如單克隆抗體、酶或其他蛋白質(zhì)的禽蛋的方法。這種方法包括提供含有啟動(dòng)子、編碼序列和至少一個(gè)IRES元件的載體；通過將該載體導(dǎo)入禽類胚胎胚盤細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織，其中，該載體序列隨機(jī)插入禽類基因組；由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)基因禽類。如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類能在其輸卵管中表達(dá)所述編碼序列，將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分泌入輸卵管腔中，從而沉積于硬殼蛋的卵清中。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1A和1B，顯示卵白蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體，該載體含有卵白蛋白啟動(dòng)子片段和編碼序列即編碼外源蛋白質(zhì)X的基因X。X代表感興趣的任何外源基因或外源蛋白質(zhì)。
圖2A、2B、2C和2D，顯示本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體含有卵白蛋白啟動(dòng)子和編碼序列即編碼外源蛋白質(zhì)X的基因X。X代表感興趣的任何外源基因或外源蛋白質(zhì)。
圖2E，顯示擴(kuò)增用于插入2A和2B載體中外源基因的方法。
圖2F，顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體含有控制編碼序列，基因X表達(dá)的卵白蛋白啟動(dòng)子。該載體還包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件，以使第二編碼序列，基因Y能夠表達(dá)。X和Y代表感興趣的任何基因。
圖3A和3B，分別顯示ALV衍生的載體pNLB和pNLB-CMV-BL的示意圖。因?yàn)镹LB還沒有完全測(cè)序，bp(堿基對(duì))的測(cè)量是從已發(fā)表的數(shù)據(jù)(Cosset等，1991；Thoraval等，1995)和本文討論的數(shù)據(jù)估計(jì)的。因?yàn)檎先腚u的基因組時(shí)將出現(xiàn)這兩個(gè)載體，所以顯示了它們。
圖4A和4B，顯示嵌合和轉(zhuǎn)基因雞血清中β-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)的量。圖4A中，孵化后8個(gè)月測(cè)定的以NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的G0雞血清中生物活性內(nèi)酰胺酶濃度。示出了世代、性別和翅圈號(hào)碼。測(cè)定了孵化后6至7個(gè)月G1轉(zhuǎn)基因雞的內(nèi)酰胺酶血清濃度。箭頭表示從公雞2395繁殖產(chǎn)生的G1雞。在圖4B中，測(cè)定了G1和G2轉(zhuǎn)基因雞的內(nèi)酰胺酶血清濃度。箭頭表示從母雞5657或公雞4133繁殖產(chǎn)生的G2雞。雞4133、5308和5657的樣品與圖4A中的相同。收集5657繁殖的G2雞的孵化后3至60天的樣品。收集4133繁殖的G2雞孵化后3個(gè)月的樣品。
圖5，顯示具有母雞5657(圖5A)或公雞4133(圖5B)所帶轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的雞的譜系。2395是攜帶有多個(gè)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的公雞。將2395與一個(gè)非轉(zhuǎn)基因母雞交配，產(chǎn)生了3個(gè)各在其基因組的唯一位點(diǎn)攜帶有轉(zhuǎn)基因的后代。簡(jiǎn)單起見，將未顯示表達(dá)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)基因后代和非轉(zhuǎn)基因后代從譜系中略去。以下面的符號(hào)表示翅圈號(hào)碼○母雞；□公雞；●攜帶有NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因的母雞；■攜帶有NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因的公雞。
圖6，顯示母雞5657及其后代卵清中的β-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)量。圖6A中，檢測(cè)了5657及其轉(zhuǎn)基因后代卵清中的活性內(nèi)酰胺酶。對(duì)照取自于未處理的母雞，連產(chǎn)雞(clutchmate)是從母雞5657繁殖的非轉(zhuǎn)基因G2雞。2000年三月收集雞蛋。箭頭表示從母雞5657繁殖的G2雞。圖6B中，將攜帶有一拷貝轉(zhuǎn)基因(半合子)的G2轉(zhuǎn)基因母雞的卵清樣品與攜帶有兩拷貝轉(zhuǎn)基因(純合)的G3母雞6978的卵清樣品進(jìn)行了比較。2001年二月收集雞蛋。左邊標(biāo)明了世代和翅圈號(hào)碼。
圖7，顯示從公雞4133繁殖的G2和G3母雞卵中的β-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)。圖7A中，檢測(cè)了從公雞4133繁殖的四個(gè)代表性半合子轉(zhuǎn)基因母雞卵清的活性內(nèi)酰胺酶。收集蛋的時(shí)間分別是1999年10月，2000年3月和2001年2月，每次收集后一個(gè)月一只母雞至少檢測(cè)4只蛋。對(duì)照代表未處理母雞的卵清。左邊標(biāo)明了翅圈號(hào)碼。計(jì)算每個(gè)時(shí)期四只母雞的平均值。圖7B中，將半合子G2轉(zhuǎn)基因母雞的卵清與半合子和純合子轉(zhuǎn)基因G3母雞的卵清作比較。2001年2月收集雞蛋。每只母雞的世代和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)列于數(shù)據(jù)欄中。攜帶一個(gè)或兩個(gè)拷貝的母雞的平均濃度見該圖底部。
圖8A和8B，分別顯示用于在雞中表達(dá)IFN-α2b的pNLB-CMV-IFN載體和用于在雞中表達(dá)促紅細(xì)胞生成素(EPO)的pNLB-MDOT-EPO載體。
圖9，顯示轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b(TPD IFN-α2b)的新糖基化模式，包括所有的6條帶。
圖10，顯示人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-α2b(PBL IFN-α2b或天然的hIFN)和轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b(TPD IFN-α2b或卵清hIFN)的比較。
圖11A，顯示優(yōu)化的人干擾素-α2b(IFN-α2b)的合成核酸序列(cDNA，殘基1-498)，即重組TPD IFN-α2b(SEQ ID NO1)。圖11B，顯示轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b(TPD IFN-α2b)的合成核酸序列(殘基1-165)(SEQID NOS2)。
圖12A，顯示優(yōu)化的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)的合成核酸序列(cDNA，殘基1-579)，即重組TPD EPO(SEQID NO3)。圖12B，顯示轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TPD EPO)的合成核酸序列(殘基1-193)(SEQID NO4)。(對(duì)于天然的人EPO，又見NCBI登錄號(hào)NP_000790)。
圖13，顯示與IFN-MM CDS相連接的合成MDOT啟動(dòng)子。MDOT啟動(dòng)子包含雞卵類粘蛋白基因(卵類粘蛋白啟動(dòng)子)的-435bp至-166bp(見NCBI登錄號(hào)J00894)和雞伴白蛋白基因(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子)的-251至+29bp(見NCBI登錄號(hào)Y00497，M11862和X01205)的元件。
圖14提供主要卵清蛋白質(zhì)的小結(jié)。
圖15A和15D，顯示pCMV-LC-emcvIRES-HC載體，其中，為檢測(cè)單克隆抗體的表達(dá)，通過放置腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES使該載體能表達(dá)人單克隆抗體的輕鏈(LC)和重鏈(HC)。與之相比，圖15B和15C分別顯示獨(dú)立的載體pCMV-HC和pCMV-LC，其中，這些載體也用于檢測(cè)單克隆抗體的表達(dá)。
發(fā)明詳述a)定義和一般參數(shù)提出下面的定義用于闡述和明確描述本發(fā)明所用的各種術(shù)語的含義和范圍。
“核酸或多聚核苷酸序列”包括，但不限于，真核生物的mRNA、cDNA、基因組DNA以及合成的DNA和RNA序列，包括天然的核苷堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。該術(shù)語還包括含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾堿基的序列。
“編碼序列”或“開放閱讀框”指當(dāng)置于合適的調(diào)控序列控制下可在體外或體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯(如果是DNA)或翻譯(如果是mRNA)成多肽的多聚核苷酸或核酸序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)末端翻譯起始密碼子和3’(羧基)末端翻譯終止密碼子界定。轉(zhuǎn)錄終止序列一般位于編碼序列的3’端。編碼序列的5’和/或3’末端可側(cè)接有非翻譯區(qū)。
“外顯子”指基因的一部分，當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄為核轉(zhuǎn)錄物時(shí)，該部分在核剪接除去內(nèi)含子或間插序列后表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)mRNA中。
核酸“控制序列”或“調(diào)控序列”指啟動(dòng)子序列、翻譯起始和終止密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控區(qū)、增強(qiáng)子等，它們對(duì)于在特定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯某給定編碼序列是必需的和充分的。適合真核細(xì)胞的控制序列例如有啟動(dòng)子、聚腺苷酸信號(hào)和增強(qiáng)子。重組載體中不一定存在所有的這些控制序列只需存在對(duì)于所需基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯必需和充分的控制序列，。
“可操作性或操作性連接于”指可發(fā)揮所需功能的編碼和控制序列的配置。因此，操作性連接于編碼序列的控制序列可影響該編碼序列的表達(dá)。在細(xì)胞中，編碼序列可操作性連接于或受控于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，在此區(qū)DNA聚合酶結(jié)合于啟動(dòng)子序列，將編碼序列轉(zhuǎn)錄為可翻譯成蛋白質(zhì)的mRNA?？刂菩蛄锌刹槐嘏c編碼序列毗連，只要它們可發(fā)揮功能指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。因此，例如，啟動(dòng)子序列和編碼序列之間可以有間插的不翻譯但可轉(zhuǎn)錄的序列，而該啟動(dòng)子序列仍認(rèn)為是“可操作性連接于”該編碼序列。
對(duì)于核酸序列例如編碼序列和控制序列，術(shù)語“異源的”和“外源的”指正常情況下不與重組構(gòu)建物的某區(qū)域或特定染色體位點(diǎn)相關(guān)的序列，和/或正常情況下不與特定細(xì)胞相關(guān)的序列。因此，核酸構(gòu)建物的“外源”區(qū)域是在自然狀態(tài)下未發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)連的其它核酸分子內(nèi)或與該分子相連的核酸的可鑒定區(qū)段。例如，構(gòu)建物的外源區(qū)域可包含與自然狀態(tài)下未與之相關(guān)連的序列相連的編碼序列。外源編碼序列的另一個(gè)例子是編碼序列本身是自然界中未發(fā)現(xiàn)的構(gòu)建物(例如，合成的含有與天然基因不同的密碼子的序列)。類似地，用某宿主細(xì)胞正常情況下不存在的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的該宿主細(xì)胞，對(duì)本發(fā)明而言認(rèn)為是外源的。
本文所用“外源蛋白質(zhì)”指自然狀態(tài)下不存在于特定組織或細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，外源表達(dá)構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物是這種蛋白質(zhì)，或在特定組織或細(xì)胞自然狀態(tài)下不以某確定數(shù)量存在的蛋白質(zhì)。
“內(nèi)源基因”指自然發(fā)生的因此正常情況下與特定細(xì)胞相關(guān)的基因或片段。
本文所述的表達(dá)產(chǎn)物可包括具有確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)物質(zhì)。然而，精確的結(jié)構(gòu)取決于很多因素，尤其是對(duì)于蛋白質(zhì)很普遍的化學(xué)修飾。例如，因?yàn)樗械牡鞍踪|(zhì)都含有可電離的氨基和羧基基團(tuán)，所以可獲得酸性或堿性鹽形式或中性形式的蛋白質(zhì)。例如，可用糖分子(糖基化)或其它化學(xué)方法包括例如與脂、磷酸、乙?；鶊F(tuán)等共價(jià)結(jié)合或離子結(jié)合，經(jīng)常通過與糖連接的化學(xué)衍生方法來產(chǎn)生一級(jí)氨基酸序列。這些修飾可發(fā)生在體外或體內(nèi)，后者是宿主細(xì)胞通過翻譯后加工系統(tǒng)進(jìn)行的。這些修飾可增加或降低分子的生物活性，這些化學(xué)修飾的分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
克隆、擴(kuò)增、表達(dá)和純化的其他方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。代表性方法見Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory(1989)。
“載體”指包括單鏈、雙鏈、環(huán)狀或超螺旋DNA或RNA的多聚核苷酸。一個(gè)典型載體可包含以下操作性連接于適宜位置能使功能基因表達(dá)的元件復(fù)制起始位點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、5’mRNA引導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、核酸盒(Nucleic acidcassette)、終止位點(diǎn)和聚腺苷酸位點(diǎn)以及選擇性標(biāo)記序列。在具體應(yīng)用時(shí)可省略一個(gè)或多個(gè)此類元件。核酸盒可包含供待表達(dá)核酸序列插入的限制性位點(diǎn)。在功能性載體中，核酸盒包含含有翻譯起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)的待表達(dá)核酸序列。構(gòu)建物中可任選地包含內(nèi)含子，優(yōu)選地距編碼序列5’≥100bp。構(gòu)建載體時(shí)要使特定的編碼序列和合適的調(diào)控序列位于該載體中，編碼序列相對(duì)于調(diào)控序列的位置和方向應(yīng)使得編碼序列在調(diào)控序列或調(diào)控序列的控制下轉(zhuǎn)錄。為實(shí)現(xiàn)這一目的，可能需要對(duì)編碼特定感興趣蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行修飾。例如，在有些情況下可能需要修飾該序列使其以正確方向與控制序列相連，或使其保持讀碼框。在插入載體之前將控制序列和其他調(diào)控序列與編碼序列連接?；蛘撸瑢⒕幋a序列直接克隆到已含有控制序列和該控制序列調(diào)控下的合適的讀碼框中的限制性位點(diǎn)的表達(dá)載體。
“啟動(dòng)子”是DNA上可與RNA聚合酶結(jié)合從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)。在有些實(shí)施方式中，通過添加或刪除序列來修飾啟動(dòng)子，或者以其它序列包括天然和合成序列以及這兩種序列的組合物來替代啟動(dòng)子。很多真核啟動(dòng)子含有兩種類型的識(shí)別序列TATA盒和上游啟動(dòng)子元件。前者，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，參與指導(dǎo)RNA聚合酶在正確的位置啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，而后者似乎決定了轉(zhuǎn)錄速率，位于TATA盒上游。增強(qiáng)子也可促進(jìn)相連啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但很多增強(qiáng)子只在特定細(xì)胞型中發(fā)揮功能。很多增強(qiáng)子/啟動(dòng)子元件來源于病毒，例如，SV40啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子和鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子均在很多細(xì)胞型中有活性，被稱為“組成型”或“遍在型”啟動(dòng)子。或者，本發(fā)明中也可采用非組成型啟動(dòng)子例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子。插入克隆位點(diǎn)的核酸序列可含有編碼感興趣多肽的任何開放讀碼框，條件是當(dāng)該編碼序列編碼感興趣的多肽時(shí)，它應(yīng)該沒有可阻礙產(chǎn)生正確mRNA分子和/或產(chǎn)生異常剪接的或異常mRNA分子的隱蔽剪接位點(diǎn)。
“標(biāo)記基因”指編碼使正確轉(zhuǎn)染的細(xì)胞得以鑒定和分離的蛋白質(zhì)的基因。適宜的標(biāo)記基因包括，但不限于綠色、黃色和藍(lán)色熒光蛋白基因(分別為GFP、YFP、BFP)。其他適宜的標(biāo)記基因包括胸苷激酶(tk)、二氫葉酸還原酶(DHFR)和氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因。后者引入對(duì)氨基甙類抗菌素如卡那霉素、新霉素和硫酸慶大霉素的抗性。可將這些和其他標(biāo)記基因例如編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-內(nèi)酰胺酶、β-半乳糖苷酶(β-gal)的基因，與表達(dá)所需蛋白質(zhì)的基因一起整合入一級(jí)核酸盒，或者選擇標(biāo)記可能包含在獨(dú)立的載體上共轉(zhuǎn)染。
“報(bào)告基因”是通過其編碼的蛋白質(zhì)的存在來“報(bào)告”其在細(xì)胞中的活性的一種標(biāo)記基因。
“逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?！?，“轉(zhuǎn)導(dǎo)顆?！?transducing particle或transductionparticle)指能夠?qū)⒎遣《镜腄NA或RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的復(fù)制缺陷型或可復(fù)制的病毒。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“轉(zhuǎn)染”都表示將多肽導(dǎo)入禽類胚盤細(xì)胞。
“蛋白分泌部”(Magnum)是含有能合成和分泌禽蛋的卵清蛋白質(zhì)的管狀腺體細(xì)胞的輸卵管漏斗和峽之間的部分。
本文所用“MDOT啟動(dòng)子”是在輸卵管蛋白分泌部而非其它組織的管狀腺體細(xì)胞中有活性的合成啟動(dòng)子。MDOT包含卵類粘蛋白(MD)和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OT)啟動(dòng)子的元件(圖13)。
在“優(yōu)化的編碼序列”中用到術(shù)語“優(yōu)化的”，其中，可利用在卵清蛋白質(zhì)卵清蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的各特定氨基酸最常用的密碼子設(shè)計(jì)優(yōu)化的人干擾素-α2b(IFN-α2b)的多聚核苷酸序列將其被插入本發(fā)明載體中。更具體地，優(yōu)化的人干擾素-α2b的DNA序列可根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)化密碼子的使用率通過Wisconsin Package 9.1版(Genetics Computer Group Inc.，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為GCU 34％，GCC 31％，GCA 26％，GCG 8％。因此，將GCU作為優(yōu)化的人IFN-α2b編碼序列中的大多數(shù)丙氨酸的密碼子。用含有編碼優(yōu)化的人IFN-α2b基因的載體來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽，其能在組織和卵中表達(dá)轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的IFN-α2b(TPD IFN-α2b)。類似地，用以上方法設(shè)計(jì)優(yōu)化的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)多聚核苷酸序列來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類，其能在組織和蛋中表達(dá)轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TPD EPO)。
b)新載體和胚盤細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因通過本發(fā)明的方法，可將轉(zhuǎn)基因?qū)肭蓊惻咛ヅ弑P細(xì)胞，產(chǎn)生在其種系組織的遺傳物質(zhì)中攜帶有該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因雞或火雞或其他禽類。胚盤細(xì)胞是典型的VII-XII期細(xì)胞，或與之相等的細(xì)胞，優(yōu)選的是近X期的細(xì)胞。可用于本發(fā)明的細(xì)胞包括胚胎生殖細(xì)胞(EG)、胚胎干細(xì)胞(ES)和原生殖細(xì)胞(PGCs)。胚胎胚盤細(xì)胞可以是新分離的、保持在培養(yǎng)中的或胚胎中的。
本文描述了可用于實(shí)施本發(fā)明方法的載體?？捎眠@些載體將外源編碼序列穩(wěn)定導(dǎo)入禽類基因組?；蛘?，可用這些載體在禽類特定組織尤其是輸卵管中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。還可將這些載體用于生產(chǎn)含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋的方法中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，編碼序列和啟動(dòng)子均位于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的5’和3’LTRs之間。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來源于禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病毒(MLV)或慢病毒。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該載體包含操作性連接于編碼序列的信號(hào)肽編碼序列，從而在細(xì)胞中翻譯后該信號(hào)肽將指導(dǎo)該載體表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌入硬殼蛋的卵清中。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該載體還包含標(biāo)記基因，其中所述標(biāo)記基因操作性連接于該啟動(dòng)子。
在有些情況下，將本發(fā)明的載體導(dǎo)入胚胎胚盤細(xì)胞是用新分離的或培養(yǎng)中的胚胎胚盤來進(jìn)行的。然后，一般是將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞注射入蛋的受體胚盤下的胚下腔。然而在有些情況下，可將載體直接送入胚盤胚的細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用于轉(zhuǎn)染胚盤細(xì)胞并產(chǎn)生隨機(jī)穩(wěn)定整合入禽基因組的載體含有某編碼序列和操作及位置上相關(guān)的啟動(dòng)子，以在禽類輸卵管蛋白分泌部的管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)該編碼序列，其中，該編碼序列編碼一種可沉積于硬殼蛋卵清中的外源蛋白質(zhì)。任選地，啟動(dòng)子可以是卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)足夠大的區(qū)段以指導(dǎo)編碼序列在管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明包括將卵白蛋白啟動(dòng)子截短和/或?qū)⒙寻椎鞍讍?dòng)子的關(guān)鍵調(diào)控元件壓縮，以使其保留在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)所需的序列，同時(shí)使其足夠小易于與載體整合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可利用卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。該區(qū)段包含卵清蛋白基因的5’側(cè)翼區(qū)域。卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)段的總長度為0.88kb-7.4kb，優(yōu)選0.88kb-1.4kb。優(yōu)選該區(qū)段含有卵清蛋白基因甾類依賴性調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件。任選地，該區(qū)段也包含卵白蛋白基因的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)殘基。因此，該啟動(dòng)子可來源于卵白蛋白基因、溶菌酶基因、伴白蛋白基因、卵類粘蛋白基因、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白基因或卵粘蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)(圖.14)。此類啟動(dòng)子的一個(gè)例子是包含卵類粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子元件的合成性MDOT啟動(dòng)子(圖.13)。該啟動(dòng)子也可以是很大程度上但是不完全是對(duì)輸卵管蛋白分泌部特異性的，例如溶菌酶啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子也可以是鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子。或者，該啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子(例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子，鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子等)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、MDOT啟動(dòng)子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子。任選地，該啟動(dòng)子可以至少是啟動(dòng)子區(qū)的至少一個(gè)區(qū)段，例如卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。在一個(gè)更優(yōu)的實(shí)施方式中，該啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。
圖.1A和1B說明了卵白蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體例子?；騒是編碼外源蛋白質(zhì)的編碼序列。彎曲箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，此載體含有卵白蛋白基因1.4kb的5’側(cè)翼序列(圖.1A)。圖.1A“-1.4kb啟動(dòng)子”序列對(duì)應(yīng)于從卵白蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約1.4kb開始延伸到卵白蛋白基因5’非翻譯區(qū)約9個(gè)殘基的序列。這個(gè)約1.4kb長的區(qū)段含有兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)控元件，甾類依賴性調(diào)控元件(SDRE)和負(fù)調(diào)控元件(NRE)。之所以稱為NRE是因?yàn)樗袔讉€(gè)在缺少激素(例如雌激素)時(shí)可阻斷基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件。一個(gè)更短的0.88kb區(qū)段也可含有這兩種元件。在另一個(gè)實(shí)施例中，此載體含有卵白蛋白基因約7.4kb的5’側(cè)翼序列并含有兩個(gè)附加元件(HS-III和HS-IV)，已知其中一個(gè)含有可使該基因響應(yīng)雌激素誘導(dǎo)的功能區(qū)(圖.1B)。一個(gè)更短的6kb區(qū)段也含有這四個(gè)元件，可任選地用于本發(fā)明。
用于本發(fā)明隨機(jī)整合的每個(gè)載體優(yōu)選包含至少一個(gè)1.2kb的雞β-珠蛋白基因位點(diǎn)元件，該元件可使基因在插入基因組的位點(diǎn)既不活化也不失活。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，將兩個(gè)絕緣子元件加入到卵白蛋白基因構(gòu)建物的一端。在β-珠蛋白位點(diǎn)中，此絕緣子元件作用是阻止遠(yuǎn)端位點(diǎn)控制區(qū)(LCR)活化珠蛋白基因區(qū)上游的基因，并且已顯示可克服轉(zhuǎn)基因蠅中的位置效應(yīng)，表明它們可防止插入位點(diǎn)的正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)。只有在該基因的5’或3’末端才需要絕緣子元件，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因是以多拷貝串聯(lián)形式整合有效產(chǎn)生了一系列側(cè)翼連接有相鄰轉(zhuǎn)基因的絕緣子的基因。在另一個(gè)實(shí)施方式中，絕緣子元件不連于該載體而是和該載體共轉(zhuǎn)染。這種情況下，所述載體和元件通過隨機(jī)整合入基因組的過程在細(xì)胞中串聯(lián)連接。
任選地，每個(gè)載體還可包含標(biāo)記基因以鑒定和富集已穩(wěn)定整合表達(dá)載體的細(xì)胞克隆。用能驅(qū)動(dòng)各類細(xì)胞型高水平表達(dá)的遍在啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該標(biāo)記基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該標(biāo)記基因是受溶菌酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人干擾素(基因)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，是受蟾蜍延伸因子1-α(ef-1α)啟動(dòng)子(Johnson和Krieg，Gene 147223-26(1994))驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因(Zolotukhin等，J.Virol 704646-4654(1995))。蟾蜍ef-1α啟動(dòng)子是一種能在各類細(xì)胞中都表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子。GFP含有能增強(qiáng)熒光的突變并且已被人源化或修飾以使其密碼子符合人基因的密碼子使用特點(diǎn)。因?yàn)槭聦?shí)上禽類的密碼子使用率和人的一樣，所以該基因的人源化形式也能在禽類胚盤細(xì)胞中高表達(dá)。在其他可選的實(shí)施方式中，該標(biāo)記基因可操作性連接于遍在啟動(dòng)子HSV tk，CMV，β-肌動(dòng)蛋白或RSV中的一個(gè)。
人和禽類的密碼子使用率相配很好，當(dāng)用無脊椎動(dòng)物的基因作為轉(zhuǎn)基因中的編碼序列時(shí)，可修飾無脊椎動(dòng)物的基因序列以改變適當(dāng)?shù)拿艽a子從而使密碼子使用率與人和禽類的相似。
可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何幾種方法轉(zhuǎn)染胚盤細(xì)胞。首先將核酸與聚賴氨酸或陽離子脂混和以促進(jìn)載體穿過細(xì)胞膜從而幫助將載體導(dǎo)入細(xì)胞。然而，優(yōu)選通過采用輸送運(yùn)運(yùn)載體例如脂質(zhì)體或病毒將載體導(dǎo)入細(xì)胞。用于將本發(fā)明載體導(dǎo)入胚盤細(xì)胞的病毒包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒和牛痘病毒。
在轉(zhuǎn)染胚盤細(xì)胞的一種方法中，用包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將該載體運(yùn)送進(jìn)胚胎胚盤細(xì)胞以使該載體整合入禽類基因組。
向胚胎中的胚胎胚盤細(xì)胞運(yùn)送逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的另一種方法，可將能產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的輔助細(xì)胞運(yùn)送入胚盤。
用于將轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入禽類基因組的優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒是復(fù)制缺陷型禽類白血病病毒(ALV)、復(fù)制缺陷型鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒。為了產(chǎn)生合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將卵白蛋白啟動(dòng)子的一個(gè)區(qū)域和一個(gè)或多個(gè)外源基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的5’和3’長末端重復(fù)(LTRs)之間以修飾pNLB載體。因?yàn)槁寻椎鞍讍?dòng)子驅(qū)動(dòng)卵清蛋白的表達(dá)且在輸卵管管狀腺體細(xì)胞中有活性，所以置于卵白蛋白啟動(dòng)子下游的任何編碼序列都將能在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)。雖然在培養(yǎng)的輸卵管管狀腺體細(xì)胞中檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)7.4kb的卵白蛋白啟動(dòng)子產(chǎn)生活性最高的構(gòu)建物，然而用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)優(yōu)選將卵白蛋白啟動(dòng)子縮短。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有卵白蛋白啟動(dòng)子的1.4kb片段；0.88kb區(qū)段也是足夠的。
任選地，本發(fā)明的任何載體也可任選包含信號(hào)肽的編碼序列，該信號(hào)肽可指導(dǎo)載體中編碼序列表達(dá)的蛋白質(zhì)從輸卵管管狀腺體細(xì)胞分泌出來。本發(fā)明的這一方面有效地?cái)U(kuò)大了利用本發(fā)明方法可沉積于禽蛋的外源蛋白質(zhì)的范圍。當(dāng)一種外源蛋白質(zhì)不能分泌時(shí)，可修飾攜帶其編碼序列的載體使其含有溶菌酶基因的60bp編碼信號(hào)肽的DNA序列?？蓪⒕幋a該信號(hào)肽的DNA序列插入載體中并使其位于該cDNA編碼蛋白質(zhì)的N端。
圖.2A-2D說明合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建物例子。此載體構(gòu)建物與5’和3’LTRs一起插入禽類基因組。Neo是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。彎曲箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。圖.2A和2B說明LTR和攜帶有編碼溶菌酶信號(hào)肽(LSP)的序列的輸卵管轉(zhuǎn)錄物，而圖.2C和2D說明沒有這種序列的轉(zhuǎn)錄物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體策略有兩部分?？蓪⒑姓婧松镄盘?hào)肽的任何蛋白質(zhì)克隆入圖.2B和2D所示載體中?？蓪⑼ǔ２荒芊置诘娜魏蔚鞍踪|(zhì)克隆入圖.2A和2B所示載體以使其能由管狀腺體細(xì)胞分泌。
圖.2E說明將外源蛋白質(zhì)克隆入溶菌酶信號(hào)肽載體的策略。用一對(duì)含有可使擴(kuò)增的基因在雙酶切后插入質(zhì)粒中限制性酶切位點(diǎn)的寡聚核苷酸作為引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增編碼序列，基因X的一個(gè)拷貝。5’和3’寡聚核苷酸分別含有Bsu36I和Xba1限制性位點(diǎn)。
本發(fā)明的另一方面包括在本發(fā)明的任何載體中利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)以從雙順反子或多順反子mRNA中翻譯兩種或多種蛋白質(zhì)(實(shí)施例15)。將IRES單元融合于一種或多種其它的編碼序列的5’末端，然后插入載體中原始編碼序列的末端，從而通過IRES使這些編碼序列彼此分開(圖.2F，15A和15D)。按照本發(fā)明的這一方面，有利于產(chǎn)物的翻譯后修飾，因?yàn)橐粋€(gè)編碼序列編碼的酶能夠修飾另一個(gè)編碼序列的產(chǎn)物。例如，第一個(gè)編碼序列編碼的膠原可能被第二個(gè)編碼序列編碼的酶羥基化和活化。在圖.2F的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例子中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件位于兩個(gè)外源編碼序列(基因X和基因Y)之間。IRES可使得由卵白蛋白啟動(dòng)子指導(dǎo)的同樣的轉(zhuǎn)錄物翻譯出蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y。彎曲箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)?；騒編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)預(yù)期在管狀腺體細(xì)胞中是最高的，該細(xì)胞特異性表達(dá)但不分泌。基因Y編碼的蛋白質(zhì)也在管狀腺體細(xì)胞中特異表達(dá)，但因?yàn)樗挥行Х置?，所以蛋白質(zhì)Y被包裝入蛋中。圖.15A和15D的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例中，由于放置了腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES，一個(gè)載體pCMV-LC-emcvIRES-HC可表達(dá)人單克隆抗體的輕鏈(LC)和重鏈(HC)?？捎肅MV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。(又見Murakami等(1997)“通過含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的可復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體高水平表達(dá)外源基因”Gene 20223-29；Chen等，(1999)“更有效的禽類復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的產(chǎn)生和設(shè)計(jì)”Dev.Biol.214370-384；Noel等(2000)“通過遺傳修飾的皮膚成纖維細(xì)胞持續(xù)系統(tǒng)地輸送單克隆抗體”J.Invest.Dermatol.115740-745)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明任何方法中所用載體的編碼序列都含有一個(gè)3’非翻譯區(qū)(3’UTR)以保證產(chǎn)生的RNA的穩(wěn)定性。當(dāng)將3’UTR添加到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，該融合的卵白蛋白啟動(dòng)子、基因X和3’UTR在構(gòu)建物中的方向必須反轉(zhuǎn)，以使3’UTR的加入不影響全長基因組RNA的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該3’UTR可以是卵白蛋白或溶菌酶基因的3’UTR，或是在蛋白分泌部細(xì)胞中有功能的任何3’UTR，如SV40的晚期區(qū)域。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，用組成型啟動(dòng)子(例如CMV)在禽類輸卵管蛋白分泌部中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的編碼序列。這種情況下，表達(dá)不局限于蛋白分泌部；在禽類的其他組織中也有表達(dá)(例如，血液)。利用這種含有組成型啟動(dòng)子和編碼序列的轉(zhuǎn)基因，尤其適合于影響蛋白質(zhì)在輸卵管中的表達(dá)和其后分泌入卵清中(見圖.8A，以CMV驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建物為例，如在雞中表達(dá)IFN-α2b的pNLB-CMV-IFN載體)。
圖3A顯示基于復(fù)制缺陷型禽白血病病毒(ALV)的載體pNLB，一種適合用于本發(fā)明的此種實(shí)施方式的載體。在pNLB載體中，用新霉素抗性基因(Neo)和編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因替代了ALV的大部分基因組。圖.3B顯示載體pNLB-CMV-BL，其中，用CMV啟動(dòng)子和β-內(nèi)酰胺酶編碼序列(β-La或BL)取代lacZ基因。在具體實(shí)施例(實(shí)施例1，見下)中報(bào)道了該載體的構(gòu)建。由CMV啟動(dòng)子表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶，并且在其3’長末端重復(fù)序列(LTR)有聚腺苷酸信號(hào)(pA)。β-內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)含有天然信號(hào)肽；因此，它存在于血液和卵清中。
以pNLB-CMV-BL載體轉(zhuǎn)導(dǎo)禽類胚胎(實(shí)施例2，見下)。產(chǎn)生的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的母雞每只卵的卵清含有高達(dá)60微克(μg)的分泌的活性β-內(nèi)酰胺酶(實(shí)施例2和3，見下)。
圖8A和8B分別顯示用于表達(dá)干擾素-α2b(IFN-α2b)的pNLB-CMV-IFN載體和用于表達(dá)促紅細(xì)胞生成素(EPO)的pNLB-MDOT-EPO載體。這兩種外源蛋白質(zhì)(EPO，IFN)可在禽類中表達(dá)，優(yōu)選的是雞和火雞。
pNLB-MDOT-EPO載體是以EPO編碼序列替代BL編碼序列而創(chuàng)建的(實(shí)施例10，見下)。在一個(gè)實(shí)施方式中，采用稱為MDOT的合成啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)EPO的表達(dá)。MDOT含有卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子元件。人EPO的DNA序列可根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)化密碼子使用率，通過Wisconsin Package 9.1版(Genetics Computer Group Inc.，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序，利用由雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創(chuàng)建的。合成EPO DNA序列并將其克隆入載體產(chǎn)生質(zhì)粒pNLB-MDOT-EPO(又名pAVIJCRA145.27.2.2)。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)生了此載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，滴定這些轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒以確定可用于注射胚胎的合適濃度。然后以轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒注射蛋，其后孵化蛋21天?？捎貌杉诜趸笠恢艿淖须u血清樣品做ELISA試驗(yàn)來測(cè)定外源蛋白質(zhì)例如EPO的水平。選擇雄雞用于交配，其中篩選出精子中含有EPO轉(zhuǎn)基因的G0公雞。優(yōu)選通過人工授精使精子樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的公雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配。篩選血DNA樣品是否存在該轉(zhuǎn)基因。常能發(fā)現(xiàn)一些仔雞是轉(zhuǎn)基因的(G1禽)。檢測(cè)仔雞血清是否存在人EPO(例如ELISA試驗(yàn))。也可檢測(cè)G1母雞蛋的卵清是否存在人EPO。本發(fā)明中蛋中的EPO(即，來源于優(yōu)化的人EPO編碼序列)具有生物活性(實(shí)施例11)。
類似地，以IFN編碼序列替代BL編碼序列可得到pNLB-CMV-IFN載體(圖8A)(實(shí)施例12，見下)。在一個(gè)實(shí)施方式中，用組成型巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)驅(qū)動(dòng)IFN表達(dá)。更具體地，用巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和SV40 polyA位點(diǎn)控制IFN編碼序列。圖8A說明用于在禽類中表達(dá)IFN的pNLB-CMV-IFN，優(yōu)選的禽類為雞和火雞。創(chuàng)建了人IFN-α2b的優(yōu)化編碼序列，其中，用在卵清蛋白質(zhì)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中的各特定氨基酸最常使用的密碼子來設(shè)計(jì)人IFN-α2b序列其插入本發(fā)明載體。更具體地，優(yōu)化的人IFN-α2b DNA序列(圖11A)可根據(jù)母雞的輸卵管優(yōu)化使用密碼子，通過BACKTRANSLATE程序(見上)利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為GCU 34％，GCC 31％，GCA 26％，GCG 8％。因此，將GCU作為優(yōu)化的人IFN-α2b序列匯總絕大多數(shù)丙氨酸的密碼子。可用含有優(yōu)化的人IFN-α2b序列的基礎(chǔ)的載體來產(chǎn)生在其組織和蛋中表達(dá)TPD IFN-α2b的轉(zhuǎn)基因禽類。
產(chǎn)生此載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒并滴定這些轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒以確定可用于注射胚胎的合適濃度(實(shí)施例2，見下)。這樣就產(chǎn)生了嵌合的禽類(又見實(shí)施例13，見下)。依據(jù)Speksnijder工藝(美國專利號(hào)5,897,998)將禽蛋放于窩中，以轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒注射蛋。注射后孵化蛋約21天。采集孵化后一周的仔雞血清樣品測(cè)定其中hIFN的水平(例如ELISA試驗(yàn))。與EPO類似(見上)，選擇雄雞用于交配。為篩選精子中含有IFN轉(zhuǎn)基因的G0公雞，提取公雞精子樣品的DNA。通過人工授精，使精子樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的公雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因公雞的血清是否存在hIFN(例如用ELISA試驗(yàn))。如果證實(shí)有該外源蛋白質(zhì)，用轉(zhuǎn)基因公雞的精子人工授精非轉(zhuǎn)基因母雞。一定比率的后代將攜帶有該轉(zhuǎn)基因(例如，大于50％)。當(dāng)本發(fā)明的蛋中存在IFN(即，來源于優(yōu)化的人IFN編碼序列)時(shí)，要檢測(cè)IFN的生物活性。與EPO類似，這些蛋中通常含有有生物活性的IFN，例如TPD IFN-α2b(圖11B)。c)轉(zhuǎn)基因禽類和禽蛋中外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)本發(fā)明提供在禽類輸卵管中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)和生產(chǎn)含有外源蛋白質(zhì)的蛋的方法，該方法還包括一個(gè)附加后續(xù)步驟，即提供合適的載體及將此載體導(dǎo)入胚胎胚盤細(xì)胞從而使載體整合入禽類基因組。該后續(xù)步驟包括從前面步驟產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因胚盤細(xì)胞得到成熟的轉(zhuǎn)基因禽類。任選地，從胚盤細(xì)胞產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)基因禽類任選包括將轉(zhuǎn)基因胚盤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎并使該胚胎充分發(fā)育，從而隨著該胚胎的發(fā)育所述細(xì)胞整合入禽類。然后使產(chǎn)生的仔雞生長成熟。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，直接用胚胎中的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)胚盤細(xì)胞(實(shí)施例2)。使產(chǎn)生的胚胎發(fā)育，使仔雞成熟。
在這兩種情況下，轉(zhuǎn)基因胚盤細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類稱為創(chuàng)始禽。有些創(chuàng)始禽在其輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中攜帶有轉(zhuǎn)基因，這些禽將在其輸卵管中表達(dá)轉(zhuǎn)基因編碼的外源蛋白質(zhì)。除輸卵管之外，外源蛋白質(zhì)也可能在其他組織中表達(dá)(例如，血液)。如果外源蛋白質(zhì)含有適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列，它將會(huì)分泌到輸卵管腔和蛋的卵清中。有些創(chuàng)始禽為種系創(chuàng)始禽(實(shí)施例8和9)。種系創(chuàng)始禽是在其種系組織的遺傳物質(zhì)中攜帶有轉(zhuǎn)基因的創(chuàng)始禽，它們也可在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中攜帶有表達(dá)外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因。因此，根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因禽類將含有表達(dá)外源蛋白質(zhì)的管狀腺體細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因禽的后代也將含有表達(dá)外源蛋白質(zhì)的輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞?；蛘?，后代禽可在禽的特定組織中表達(dá)該外源基因表達(dá)而決定的某種表型(實(shí)施例6，表2)。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)基因禽是雞或火雞。
可用本發(fā)明高產(chǎn)量低成本表達(dá)各種所需蛋白質(zhì)，包括可用作人類和動(dòng)物的藥物、診斷劑以及家畜飼料添加劑的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)例如干擾素(IFN)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、人生長激素、溶菌酶和β-酪蛋白是根據(jù)本發(fā)明需要在輸卵管中表達(dá)并沉積于蛋中的例子(實(shí)施例2，3和5)。其他可能生產(chǎn)的蛋白質(zhì)包括，但不限于，白蛋白、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、膠原、因子VIII，IX，X(等)、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸、胰島素、乳鐵蛋白、蛋白質(zhì)C、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、組織型血纖蛋白溶酶原活化子(tPA)、促生長素和胰凝乳蛋白酶。也可表達(dá)遺傳工程抗體，例如能結(jié)合人腫瘤細(xì)胞表面抗原并破壞腫瘤的免疫毒素，用做藥物或診斷試劑。
d)轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b(TPD IFN-α2b)
本發(fā)明包括禽類產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽干擾素-α2b(TPD IFN-α2b)。TPD IFN-α2b顯示正常情況下人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-α2b(PBL IFN-α2b)中不存在的新糖基化模式并含有兩種新糖形(條帶4和5是α-Gal延伸的二糖；見圖9)。TPDIFN-α2b還含有與人PBL IFN-α2b相似的在雞中比人中更有效產(chǎn)生的O-連接的碳水化合物結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明設(shè)想一種含有人IFN-α2b優(yōu)化的多聚核苷酸序列，即重組轉(zhuǎn)基因禽干擾素-α2b(TPD IFN-α2b)編碼序列(SEQ ID NO1)的分離的多聚核苷酸。優(yōu)化的人IFN-α2b編碼序列包含498個(gè)核酸165個(gè)氨基酸(見SEQ ID NO1和圖11A)。類似地，天然的人IFN-α2b編碼序列包含498個(gè)核酸(NCBI登錄號(hào)AF405539和GI15487989)和165個(gè)氨基酸(NCBI登錄號(hào)AAL01040和GI15487990)。可利用在卵清蛋白質(zhì)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中各特定氨基酸最常使用的密碼子來設(shè)計(jì)優(yōu)化的人干擾素-α2b編碼序列將其插入本發(fā)明載體。更具體地，優(yōu)化的人干擾素-α2bDNA序列可根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)化密碼子使用率，通過Wisconsin Package 9.1版(Genetics Computer Group Inc.，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為GCU 34％，GCC 31％，GCA 26％，GCG 8％。因此，可將GCU作為優(yōu)化的人IFN-α2b編碼序列大多數(shù)丙氨酸的密碼子。用含有優(yōu)化的人IFN-α2b基因的載體來產(chǎn)生在組織和卵中表達(dá)TPD IFN-α2b的轉(zhuǎn)基因禽類。
如在實(shí)施例13中(見下)所述的，可在雞中生產(chǎn)TPD IFN-α2b。然而，也可在火雞或其他禽類中生產(chǎn)TPD IFN-α2b。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在雞和火雞以及它們的硬殼蛋中表達(dá)TPD IFN-α2b。碳?xì)浠衔锓治?實(shí)施例14，見下)包括單糖分析和FACE分析，可揭示糖的組成或蛋白質(zhì)的新糖基化模式。TPD IFN-α2b顯示如下的單糖殘基N-乙?；?氨基半乳糖(NAcGal)、半乳糖(Gal)、N-乙酰基-葡糖胺(NAcGlu)和唾液酸(SA)。然而，在TPD IFN-α2b中沒有N-連接的糖基化，而是在Thr-106 O-糖基化。這種類型的糖基化與人IFN-α2的相似，其中，106位的Thr殘基是IFN-α2獨(dú)有的。與天然IFN-α相似，TPD IFN-α2b沒有甘露糖殘基。FACE分析顯示代表各種糖殘基的6條帶(圖9)，其中條帶1、2、3分別是未唾酸化、單唾酸化和雙唾酸化的(圖10)。唾液酸(SA)連接是α2-3與半乳糖(Gal)和α2-6與N-乙?；?氨基半乳糖(NAcGal)連接。條帶6代表未唾酸化的四糖。條帶4和5是在人PBL IFN-α2b或天然的人IFN(天然hIFN)中未發(fā)現(xiàn)的α-半乳糖(α-Gal)延伸的雙糖。圖10顯示TPD IFN-α2b(卵清hIFN)和人PBL IFN-α2b(天然hIFN)的比較。TPD IFN-α2b(見下)中條帶3和4，條帶4和5之間還有次帶。
本發(fā)明設(shè)想TPD IFN-α2b的一種分離的多肽序列(SEQID NO2)(又見圖11B)及它的藥物組合物，其中該蛋白質(zhì)在Thr-106位以特定殘基O-糖基化。這些殘基如下(i)Gal-NAcGal-(ii)SA-Gal-NAcGal-(iii)SA-Gal-NAcGal-|SA(iv)Gal-NAcGlu-NAcGal-|Gal(v)Gal-Gal-NAcGal-(vi)Gal-Gal-NAcGal-|SA其中，Gal＝半乳糖NAcGal＝N-乙?；?氨基半乳糖NAcGlu＝N-乙?；?葡糖胺SA＝唾液酸在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，百分比如下(i)Gal-NAcGal- 約20％(ii)SA-Gal-NAcGal- 約29％(iii)SA-Gal-NAcGal- 約9％|SA(iv)Gal-NAcGlu-NAcGal- 約6％|Gal(v)Gal-Gal-NAcGal- 約7％
(vi)Gal-Gal-NAcGal-約12％|SA條帶3和4，條帶4和帶5之間有次帶，在TPD IFN-α2b中約占17％。
e)實(shí)施例以下具體實(shí)施例是為闡述本發(fā)明而不應(yīng)對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1載體構(gòu)建用由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和報(bào)告基因β-內(nèi)酰胺酶組成的表達(dá)盒替代復(fù)制缺陷型禽白血病病毒(ALV)的載體pNLB(Cosset等，1991)的lacZ基因。圖3A和3B分別圖示了pNLB和pNLB-CMV-BL載體構(gòu)建物。
為了用轉(zhuǎn)基因有效替代pNLB的lacZ基因，首先創(chuàng)建了一個(gè)中間銜接子質(zhì)粒，pNLB-銜接子。將鈍化的pNLB ApaI/ApaI片段(Cosset等，J.Virol.653388-94(1991))(pNLB中5’ApaI殘基位于lacZ上游289bp，3’ApaI殘基位于3’LTR和Gag區(qū)段的3’端)插入到鈍化的pBluescriptK(-)KpnI/SacI位點(diǎn)得到pNLB-銜接子。將填平的pCMV-B MluI/XbaI區(qū)段(Moore等，Anal.Biochem.247203-9(1997))插入鈍化的pNLB-銜接子的KpnI/NdeI位點(diǎn)，以CMV啟動(dòng)子和BL基因替代lacZ(在pNLB中，KpnI殘基位于lacZ上游67bp，NdeI殘基位于lacZ終止密碼子上游100bp)，這樣，得到了pNLB-銜接子-CMV-BL。為了創(chuàng)建pNLB-CMV-BL，用pNLB-銜接子-CMV-BL的HindIII/BlpI插入片段替換pNLB的HindIII/BlpI插入片段(含有l(wèi)acZ)。因?yàn)槲粗脑蛑苯訉⑩g端片段連接入pNLB的HindIII/BlpI位點(diǎn)大多數(shù)可產(chǎn)生重排的亞克隆，因此這個(gè)兩步克隆是必要的。
實(shí)施例2NLB-CMV-BL創(chuàng)始禽群的創(chuàng)建將Sentas和Isoldes在含有以下成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)F10(Gibco)，5％新生牛血清(Gibco)，1％雞血清(Gibco)，50μg/ml腐草霉素(Cayla Laboratories)和50μg/ml潮霉素(Sigma)。如Cosset等(1993)所述產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，引入本文作為參考，但以下例外。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pNLB-CMV-BL(得自實(shí)施例1，如上)轉(zhuǎn)染9×105Sentas兩天后，收集6-16小時(shí)新鮮培養(yǎng)基中的病毒并滴定。用所有的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)導(dǎo)添加了終濃度為4μg/ml的聚凝胺的3個(gè)100mm平板中的3×106Isoldes。接下來一天中，將此培養(yǎng)基替換為含有50μg/ml腐草霉素，50μg/ml潮霉素和200μg/ml G418(Sigma)的培養(yǎng)基。10-12天后，分離單個(gè)的G418r克隆并轉(zhuǎn)移到24孔板中。7-10天后，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)Sentas然后進(jìn)行G418篩選來測(cè)定每個(gè)克隆的效價(jià)。一般，60個(gè)克隆中有2個(gè)效價(jià)為1-3×105。擴(kuò)增這些克隆，將病毒濃集到2-7×106，如Allioli等，Dev.Biol.16530-7(1994)所述，引入本文作為參考。檢測(cè)NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的β-內(nèi)酰胺酶確證了CMV-BL表達(dá)盒的完整性。
將轉(zhuǎn)導(dǎo)載體NLB-CMV-BL注射入546個(gè)未孵育的SPF白來杭雞(White Leghorn)胚胎的胚下腔中，其中孵出了126只小雞，檢測(cè)這些小雞是否向血液中分泌β-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)。為測(cè)定未知樣品中活性內(nèi)酰胺酶的濃度，采用了動(dòng)態(tài)比色測(cè)定法，在該方法中，一種紫色底物PADAC被內(nèi)酰胺酶特異性轉(zhuǎn)化為黃色化合物。通過監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD570nm的降低定量測(cè)定內(nèi)酰胺酶的活性，與有不同水平純化內(nèi)酰胺酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較(稱為“內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)”)。也可通過觀察測(cè)試樣品過夜后或幾天后紫色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的評(píng)分來確定樣品中是否存在內(nèi)酰胺酶(“過夜內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)”)。后一方法適用于檢測(cè)很低水平的內(nèi)酰胺酶或篩選大量樣品。在一至四周齡時(shí)，檢測(cè)小雞血清樣品是否存在內(nèi)酰胺酶。27只小雞血清中有很低水平的只能在過夜內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)中檢測(cè)到的內(nèi)酰胺酶，這些小雞成熟后，不再檢測(cè)到內(nèi)酰胺酶。如下表1和圖4A所示，在孵化后六到七個(gè)月還有另外9只雞(3雄，6雌)的血清內(nèi)酰胺酶水平在11.9-173.4ng/ml。
表1NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)導(dǎo)的雞中β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)
1NA不適用。
2對(duì)照取自未處理母雞3代表5至20個(gè)蛋的平均值實(shí)施例3β-內(nèi)酰胺酶在G0母雞卵清中的表達(dá)57只以NLB-CMV-BL逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的小母雞發(fā)育到性成熟，在八月齡時(shí)檢測(cè)每只母雞卵清的活性β-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)。57只雞中，有6只內(nèi)酰胺酶水平顯著，范圍為56.3至250.0ng/ml(表1，見上)。即使在PADAC與樣品培育幾天之后，該組中仍沒有其他母雞的卵清中可檢測(cè)到內(nèi)酰胺酶。在24只模擬注射的母雞和用不攜帶有內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)基因的NLB載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的42只母雞的卵清中未檢測(cè)到內(nèi)酰胺酶。在初始試驗(yàn)6個(gè)月后，有表達(dá)的6只雞的卵清中仍能檢測(cè)到穩(wěn)定的內(nèi)酰胺酶表達(dá)(表1，見上)。
用抗β-內(nèi)酰胺酶抗體進(jìn)行Western印跡試驗(yàn)在所有這6只母雞的卵清中都檢測(cè)到了β-內(nèi)酰胺酶。該卵清內(nèi)酰胺酶與用作標(biāo)準(zhǔn)品的純化的細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)酰胺酶大小相同。以Western分析卵清中檢測(cè)到的量與酶學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)到的相一致，表明卵清內(nèi)酰胺酶的很大一部分是有生物活性的。即使在4℃儲(chǔ)存幾個(gè)月后，母雞卵清中產(chǎn)生的內(nèi)酰胺酶也不會(huì)喪失活性，分子量也沒有改變。這一發(fā)現(xiàn)使得含有內(nèi)酰胺酶的蛋可儲(chǔ)存更長的時(shí)間直到分析。
實(shí)施例4G1和G2轉(zhuǎn)基因雞中β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)基因的種系傳遞及血清表達(dá)抽提收集自56只G0公雞的精子DNA，選擇定量PCR檢測(cè)到的精子DNA中轉(zhuǎn)基因含量水平顯著的三只雞來交配。這些公雞是同樣的在其血液中β-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)水平最高的三只(公雞2395、2421和2428)。公雞2395產(chǎn)生了3只G1轉(zhuǎn)基因后代(在422只后代中)，而其他兩只在總共630只后代中未產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。對(duì)三只G1轉(zhuǎn)基因雞各自的血DNA做Southern分析證實(shí)了轉(zhuǎn)基因是完整的并且整合在唯一的隨機(jī)位點(diǎn)。孵化后6-11周時(shí)，G1轉(zhuǎn)基因雞5308、5657和4133的血清分別含有0.03、2.0和6.0μg/ml的內(nèi)酰胺酶。在6-7月齡再對(duì)這些雞進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，內(nèi)酰胺酶的水平降到了0.03、1.1和5.0μg/ml(圖4A)。
將母雞5657和公雞4133與非轉(zhuǎn)基因雞交配得到轉(zhuǎn)基因半純合后代。圖5顯示從公雞4133或母雞5657繁育的轉(zhuǎn)基因雞及其后代的譜系。也繁殖轉(zhuǎn)基因公雞5308，但其后代血清和卵清中的內(nèi)酰胺酶濃度很低或檢測(cè)不到。在孵化后3-90天測(cè)定隨機(jī)選擇的G2轉(zhuǎn)基因雞血清中活性內(nèi)酰胺酶濃度。從母雞5657繁育的五只G2轉(zhuǎn)基因雞中，活性內(nèi)酰胺酶濃度都在1.9-2.3μg/ml(相較于親代1.1μg/ml的表達(dá)，圖4B)。所有的樣品都在相同的時(shí)期收集，因此，由于母雞5657的內(nèi)酰胺酶濃度在其成熟后相應(yīng)地下降了，預(yù)期其后代血清中內(nèi)酰胺酶濃度比親代高。類似地，從公雞4133繁育的五只隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)基因雞血清內(nèi)酰胺酶濃度都與其親代的相似但高于親代(圖4B)。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因母雞卵清中β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)G1母雞5657的蛋含有每毫升卵清130ng的活性β-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)。內(nèi)酰胺酶濃度在最初產(chǎn)的一些蛋中較高，然后達(dá)到至少可穩(wěn)定九個(gè)月的平臺(tái)期。母雞5657和非轉(zhuǎn)基因公雞繁育的轉(zhuǎn)基因母雞蛋的內(nèi)酰胺酶濃度與親代相似(圖6A)。經(jīng)定量PCR和Southern分析檢測(cè)，G2母雞8617和同科G2公雞8839繁育的母雞6978是轉(zhuǎn)基因純合子。正如預(yù)期的那樣，在雞6978的蛋中內(nèi)酰胺酶濃度高于其半合子親代將近兩倍(圖6B)。沒有分析其他的由母雞5657繁育的G3母雞，因?yàn)槟鸽u6978是其連產(chǎn)雞中唯一的雌性。重要的是，應(yīng)注意母雞8867、8868和8869的蛋是相隔11個(gè)月收集的并且具有相似的內(nèi)酰胺酶濃度(圖6A和6B)，又一次表明，卵清中的表達(dá)水平在產(chǎn)卵期中是一致的。
將公雞4133與非轉(zhuǎn)基因母雞交配得到半合子G2母雞。分析了15只轉(zhuǎn)基因母雞，卵清中都含有濃度范圍在0.47-1.34μg/ml的內(nèi)酰胺酶。圖7A顯示四只代表性的母雞。6個(gè)月后檢測(cè)時(shí)，平均表達(dá)水平已經(jīng)從大約1.0μg/ml降到0.8μg/ml(圖7A)。在最初的蛋中表達(dá)水平高，其后幾個(gè)月中水平降低。然后，蛋中內(nèi)酰胺酶濃度保持恒定。
G2母雞8150和同科G2公雞8191雜交產(chǎn)生半合子和純合子G3母雞。所有G3母雞卵清中表達(dá)了濃度范圍在0.52-1.65μg/ml的內(nèi)酰胺酶(圖7B)。G3純合母雞的平均表達(dá)水平比半合子G2和G3母雞高47％。公雞4133及其后代繁育的G2和G3母雞蛋中內(nèi)酰胺酶的量差別很大(圖7A和7B)，雖然此組中任何給定母雞蛋中的內(nèi)酰胺酶水平相對(duì)恒定。預(yù)期對(duì)于純合基因型，內(nèi)酰胺酶的平均表達(dá)加倍。Western印跡分析證實(shí)轉(zhuǎn)基因在G2轉(zhuǎn)基因雞的蛋中正確地產(chǎn)生完整的內(nèi)酰胺酶。Western印跡檢測(cè)到的內(nèi)酰胺酶水平與酶活試驗(yàn)檢測(cè)到的內(nèi)酰胺酶水平密切相關(guān)，表明卵清內(nèi)酰胺酶的大部分具有生物活性。因此，成功地利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在雞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定和可靠的表達(dá)。
可檢測(cè)到卵黃中內(nèi)酰胺酶的沉積但比卵清中低。分析了公雞4133系的七只G2或G3母雞，卵黃中內(nèi)酰胺酶的濃度范圍在107-375ng/ml或卵清中濃度的20％。某給定母雞的卵黃和卵清內(nèi)酰胺酶水平無相關(guān)性(Harvey等，“外源蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因雞卵清中的表達(dá)”(2000年4月)Nat.Biotechnol.20396-399)。
實(shí)施例6創(chuàng)始雄禽的產(chǎn)生用新產(chǎn)的自來杭雞受精卵進(jìn)行NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)導(dǎo)。將7-10微升濃縮顆粒注射入開窗蛋的胚下腔中，封閉窗口后孵化出仔雞。注射了546只卵。提取血DNA并通過Taqman試驗(yàn)采用檢測(cè)新霉素抗性(neor)基因的探針-引物對(duì)，分析是否存在轉(zhuǎn)基因。如下表2所示，在所有仔雞約25％的血DNA中可檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因。
表2用NLB-CMV-BL載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因小結(jié)
實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因的種系傳遞用Taqman檢測(cè)精子DNA中的neor基因來鑒定用于交配的候選G0雄性。鑒定到三只G0雄性，其中每只雞的精子DNA中NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因均高于背景水平。將精子中轉(zhuǎn)基因?yàn)殛栃缘乃蠫0雄雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配以鑒定完全轉(zhuǎn)基因的G1后代。
對(duì)于NLB-CMV-BL，分別繁育了1026只仔雞，每種轉(zhuǎn)基因獲得了三只G1仔雞(表2，見上)。所有G1后代都來自精子DNA中轉(zhuǎn)基因水平最高的雄性，而且每只雄性繁育出相等數(shù)目的仔雞。
實(shí)施例8G1和G2的Southern分析為證實(shí)插入的載體序列的整合和完整性，對(duì)G1和G2轉(zhuǎn)基因的DNA進(jìn)行Southern印跡分析。以HindIII消化血DNA，將其與neor探針雜交以檢測(cè)NLB-CMV-BL載體內(nèi)部HindIII位點(diǎn)形成的接頭片段(圖3B)和整合位點(diǎn)側(cè)翼的基因組位點(diǎn)。攜帶有NLB-CMV-BL的3只G1雞中的每只都含有獨(dú)特長度的接頭片段，表明轉(zhuǎn)基因已整合到三個(gè)不同的基因組位點(diǎn)。將G1與非轉(zhuǎn)基因母雞交配得到半合子G2。如表2(見上)所示，如單個(gè)轉(zhuǎn)基因整合的孟德爾分離所預(yù)期的那樣，攜帶有NLB-CMV-BL的G1公雞的后代50.8％是轉(zhuǎn)基因的。G2后代HindIII消化的DNA的Southern分析，檢測(cè)到與它們的轉(zhuǎn)基因親代大小相似的接頭片段，表明轉(zhuǎn)基因被完整傳遞。
實(shí)施例9篩選轉(zhuǎn)基因純合子G3后代為獲得轉(zhuǎn)基因純合子轉(zhuǎn)基因雞，將相同位點(diǎn)整合有NLB-CMV-BL的G2半合子雞(例如，同一只G1雄性的后代)雜交，繁育了兩組雞第一組是來源于G1 4133雄性的母雞和公雞，第二組來源于G1 5657母雞。用Taqman試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定G3后代中的neor轉(zhuǎn)基因。用已知量的經(jīng)Southern分析確定為轉(zhuǎn)基因半合子的G1轉(zhuǎn)基因4133雄雞的基因組DNA來構(gòu)建此標(biāo)準(zhǔn)曲線。此標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)基因總拷貝的范圍是103-1.6×104或每個(gè)二倍體基因組0.2-3.1轉(zhuǎn)基因拷貝。因?yàn)樵谥笖?shù)期反應(yīng)組分是無限制的，所以擴(kuò)增效率很高并對(duì)給定的拷貝數(shù)給出了可重復(fù)的值。在拷貝數(shù)相差2倍的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線之間有可重復(fù)的一個(gè)循環(huán)的差異。
為確定G3后代中轉(zhuǎn)基因等位基因的數(shù)目，擴(kuò)增DNA并與標(biāo)準(zhǔn)品比較。非轉(zhuǎn)基因雞的DNA不擴(kuò)增。根據(jù)轉(zhuǎn)基因等位基因純合子雞繪制的圖，擴(kuò)增起始比等位基因半合子雞早一個(gè)循環(huán)。此序列檢測(cè)程序能依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和循環(huán)閾值(Ct)來計(jì)算出未知DNA樣品中等位基因的數(shù)目，在循環(huán)閾值處樣品的擴(kuò)增圖顯示顯著增高。數(shù)據(jù)示于下面表3。
為驗(yàn)證Taqman拷貝數(shù)分析，用PstI消化的DNA和與neor基因互補(bǔ)的探針檢測(cè)0.9kb片段通過Southern印跡分析所選雞的DNA。選擇檢測(cè)小片段是因?yàn)閷⑤^小DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到膜更易量化。該0.9kb條帶的信號(hào)強(qiáng)度與Taqman試驗(yàn)檢測(cè)到的G3轉(zhuǎn)基因雞的拷貝數(shù)良好對(duì)應(yīng)。用Southern印跡分析的其它18只G3轉(zhuǎn)基因雞的拷貝數(shù)與Taqman測(cè)定的一致。共分析了4133譜系33只后代，其中9只(27.3％)是非轉(zhuǎn)基因的，16只(48.5％)是半合子，8只(24.2％)是純合子。5657譜系共分析了10只后代，其中5只(50.0％)是非轉(zhuǎn)基因的，1只(10.0％)是半合子，4(40.0％)只是純合子。4133譜系G3后代所觀察到的非轉(zhuǎn)基因、半合子和純合子的比率統(tǒng)計(jì)上與預(yù)期的用x2測(cè)驗(yàn)(P≤0.05)測(cè)定的1∶2∶1比率沒有差異。5657譜系的后代不具有預(yù)期的分離，但這可能是由于所檢測(cè)后代的數(shù)目少而致(Harvey等，“用復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和高通量篩選程序進(jìn)行轉(zhuǎn)基因雞的連續(xù)生產(chǎn)”(“Consistent production of transgenic chickens using replicationdeficient retroviral vectors and high-throughput screening procedures”)(2002年2月)Poultry science 81202-212)。
實(shí)施例10pNLB-MDOT-EPO載體的載體構(gòu)建依照本說明書實(shí)施例1(載體構(gòu)建)所述，將BL編碼序列替換為EPO編碼序列(圖8B)，創(chuàng)建了pNLB-MDOT-EPO載體。用MDOT代替CMV啟動(dòng)子(圖13)。MDOT是含有卵類粘蛋白(MD)和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OT)啟動(dòng)子元件的合成啟動(dòng)子。(pNLB-MDOT-EPO載體，又名pAVIJCR-A145.27.2.2)。用Wisconsin Package，9.1版(Genetics Computer Group，Inc.，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序以從雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表，創(chuàng)建基于母雞卵巢優(yōu)化密碼子使用率的人EPO DNA序列。合成該DNA序列并用Integrated DNA Technologies，Coralville，IA，以規(guī)定的形式將此序列克隆入pCR II-TOPO(Invitrogen)3’突端的T中。然后用HindIII和FseI將EPO編碼序列從pEpoMM切下，用0.8％瓊脂糖-TAE凝膠純化，連接于HindIII和FseI消化的堿性磷酸酶處理的pCMV-IFNMM。產(chǎn)生的質(zhì)粒是含有受巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和SV40 polyA位點(diǎn)控制的EPO編碼序列的pAVIJCR-A137.43.2.2。用NcoI和FseI酶切質(zhì)粒pAVIJCR-A137.43.2.2，將正確的片段與用NcoI和FseI酶切的pMDOTIFN片段連接，得到含有受MDOT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EPO的pAVIJCR-A137.87.2.1。為將MDOT啟動(dòng)子控制的EPO編碼序列克隆入NLB逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，用KpnI和FseI酶切質(zhì)粒pALVMDOTIFN和pAVIJCR-A137.87.2.1。在0.8％瓊脂糖-TAE凝膠上純化正確的DNA片段，然后將這些片段連接并轉(zhuǎn)化入DH5α細(xì)胞。產(chǎn)生的質(zhì)粒為pNLB-MDOT-EPO(又名pAVIJCR-A145.27.2.2)。
實(shí)施例11表達(dá)EPO的轉(zhuǎn)基因雞和完全轉(zhuǎn)基因G1雞的產(chǎn)生如NLB-CMV-BL(見實(shí)施例2)那樣制備NLB-MDOT-EPO轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。根據(jù)Speksnijder工藝(美國專利號(hào)5,897,998)將300只白來杭雞蛋開窗，然后每只蛋注射～7×104轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。注射后孵化蛋21天，用EPO ELISA測(cè)定孵化后一周采集的仔雞血清樣品中的人EPO水平。
為篩選精子中含有EPO轉(zhuǎn)基因的G0公雞，用“Chelex-100抽提”(Walsh等，1991)提取公雞精子樣品的DNA。然后將DNA樣品用“neo for-1”(5’-TGGATT
表3測(cè)定G2轉(zhuǎn)基因雞繁育的G3后代中轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)
1Std.No平均數(shù)；NTC無模板對(duì)照。
2Ct循環(huán)閾值；樣品熒光出現(xiàn)高于背景的顯著增加的循環(huán)。
3平均數(shù)除以5100然后取舍到最近的第一個(gè)十進(jìn)制位所確定的每二倍體基因組的拷貝。
4NA不適用。
GCACGCAGGTTCT-3’)和“neo rev-1”(5’-GTGCCCAGTCATAGCCGAAT-3’)引物以及FAM標(biāo)記的NEO-探針1(5’-CCTCTCCACCCAAGCGGCCG-3’)在7700序列測(cè)定儀(Perkin Elmer)上進(jìn)行TaqmanTM分析以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因。將精子樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的8只G0公雞通過人工授精與非轉(zhuǎn)基因SPAFAS(白來杭雞)母雞交配。用上述的TaqmanTM分析篩檢血DNA樣品中轉(zhuǎn)基因的存在。
在1,054只后代中，發(fā)現(xiàn)16只仔雞是轉(zhuǎn)基因的(G1禽)。用EPO ELISA檢測(cè)雞血清中人EPO的存在，EPO為～70納克/毫升(ng/ml)。用EPO ELISA檢測(cè)G1母雞蛋的卵清中人EPO的存在，發(fā)現(xiàn)含有人EPO約～70ng/ml。當(dāng)以細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)在人EPO響應(yīng)細(xì)胞系(HCD57鼠紅細(xì)胞樣細(xì)胞)上檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋中存在的EPO(即，衍生自人EPO優(yōu)化的編碼序列)是生物活性的。
實(shí)施例12pNLB-CMV-IFN的載體構(gòu)建依照實(shí)施例1所述，以IFN編碼序列替代實(shí)施例1中的BL編碼序列創(chuàng)建了pNLB-CMV-IFN載體(圖8A)。
創(chuàng)建了優(yōu)化的編碼序列，其中，用卵清蛋白質(zhì)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中各特定氨基酸使用率最高的密碼子設(shè)計(jì)了優(yōu)選人干擾素-α2b(IFN-α2b)多聚核苷酸序列，將其插入本發(fā)明的載體。更具體地，優(yōu)化的人干擾素-α2b的DNA序列是根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)選使用密碼子并通過Wisconsin Package9.1版(Genetics Computer Group Inc.)，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)編譯的密碼子使用率表創(chuàng)建的。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為GCU 34％，GCC 31％，GCA 26％，GCG 8％。因此，將GCU作為優(yōu)化的人IFN-α2b編碼序列大多數(shù)丙氨酸的密碼子。用含有編碼優(yōu)化人IFN-α2b基因的載體，創(chuàng)建在組織和卵中表達(dá)轉(zhuǎn)基因禽IFN-α2b(TPD IFN-α2b)的轉(zhuǎn)基因禽類。
通過PCR以pfu多聚酶(Stratagene，La Jolla，CA)用20個(gè)循環(huán)94℃1min；50℃ 30sec；和72℃ 1min 10sec擴(kuò)增下表4中列出的模板和引物寡核苷酸。以“擠壓和浸透”方法(Maniatis等，1982)從12％的聚丙烯酰胺-TBE凝膠純化PCR產(chǎn)物，然后組合該P(yáng)CR產(chǎn)物在只用IFN-1和IFN-8作引物的擴(kuò)增反應(yīng)中作為模板(見表4)。將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用HindIII和XbaI酶切，從2％瓊脂糖-TAE凝膠純化，然后連入用HindIII和XbaI酶切堿性磷酸酶處理的pBluescriptKS(Stratagene)，產(chǎn)生質(zhì)粒pBluKSP-IFNMagMax。在ABI PRISM377 DNA測(cè)序儀(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)上用通用T7或T3引物，通過循環(huán)測(cè)序測(cè)定兩條鏈的序列。用轉(zhuǎn)換基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Transformer Site-DirectedMutagenesis Kit)(Clotech，Palo Alto，CA)的定點(diǎn)突變修正衍生自原始寡聚核苷酸模板的pBluKSP-IFN中的突變。然后將IFN編碼序列用HindIII和XbaI從修正的pBluKSP-IFN切下，從0.8％瓊脂糖-TAE凝膠純化并連入HindIII和XbaI酶切堿性磷酸酶處理的pCMV-BetaLa-3B-dH。產(chǎn)生的質(zhì)粒是含有受巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和SV40 polyA位點(diǎn)控制的IFN編碼序列的pCMV-IFN。為將CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制的IFN編碼序列克隆入NLB逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，先用ClaI和XbaI酶切pCMV-IFN，然后兩末端用DNA多聚酶的Klenow片段(New EnglandBioLabs，Beverly，MA)填平。將pNLB-銜接子用NdeI和KpnI酶切，用T4 DNA多聚酶(New England BioLabs)使兩末端為鈍性。將正確的DNA片段在0.8％瓊脂糖-TAE凝膠上純化，然后連接并轉(zhuǎn)化入DH5α細(xì)胞。產(chǎn)生的質(zhì)粒是pNLB-銜接子-CMV-IFN。然后將該質(zhì)粒用MluI酶切BlpI部分酶切，正確的片段用凝膠純化。將pNLB-CMV-EGFP用MluI和BlpI酶切，然后用堿性磷酸酶處理和凝膠純化。將pNLB-銜接子-CMV-IFN的MluI/BlpI部分片段與衍生自pNLB-CMV-EGFP MluI/BlpI酶切的大片段連接，產(chǎn)生pNLB-CMV-IFN。
表4用于IFN基因合成的寡聚核苷酸
實(shí)施例13表達(dá)IFN的轉(zhuǎn)基因雞和完全轉(zhuǎn)基因G1雞的產(chǎn)生依照實(shí)施例2的程序制備pNLB-CMV-IFN轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。根據(jù)Speksnijder工藝(美國專利號(hào)5,897,998)將300只白來杭雞(株系0)蛋開窗，然后每只蛋注射～7×104轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。注射后孵化蛋21天，通過IFN ELISA試驗(yàn)測(cè)定孵化后一周采集的仔雞血清樣品中的人IFN水平。
為篩選精子中含有IFN轉(zhuǎn)基因的G0公雞，用“Chelex-100抽提”(Walsh等，1991)提取公雞精子樣品的DNA。然后將DNA樣品用“neo for-1”(5’-TGGATTGCACGCAGGTTCT-3’)和“neo rev-1”(5’-GTGCCCAGTCATAGCCGAAT-3’)引物以及FAM標(biāo)記的NEO-探針1(5’-CCTCTCCACCCAAGCGGCCG-3’)在7700序列測(cè)定儀(Perkin Elmer)上進(jìn)行TaqmanTM分析以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因。將精子樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的3只G0公雞通過人工授精與非轉(zhuǎn)基因SPAFAS(白來杭雞)母雞交配。
如上所述用TaqmanTM分析篩檢血DNA樣品轉(zhuǎn)基因的存在。在1,597只后代中，發(fā)現(xiàn)1只公雞是轉(zhuǎn)基因的(又名“Alphie”)。用hIFN ELISA檢測(cè)Alphie血清中hIFN的存在，hIFN為200ng/ml。
用Alphie的精子對(duì)非轉(zhuǎn)基因SPAFAS(白來杭雞)母雞人工授精。用TaqmanTM分析檢測(cè)到202只中有106只(～52％)后代含有轉(zhuǎn)基因。這些繁育結(jié)果遵循孟德爾遺傳模式，表明Alphie是轉(zhuǎn)基因的。
實(shí)施例14轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的干擾素-α2b(TPD IFNα-2b)的碳水化合物分析實(shí)驗(yàn)證據(jù)揭示了家禽產(chǎn)生的干擾素-α2b(即TPD IFNα-2b)中有一種新糖基化模式。發(fā)現(xiàn)TPD IFNα-2b含有正常情況下人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-α2b(PBL IFNα-2b)或天然人干擾素-α2b(天然hIFN)中不存在的兩種新糖形(條帶4和5是α-Gal延伸的二糖；見圖9)。還發(fā)現(xiàn)TPD IFNα-2b含有與人PBL IFNα-2b相似但在雞中比在人中更有效產(chǎn)生的O-連接碳水化合物結(jié)構(gòu)。
對(duì)人IFN-α2b編碼序列(實(shí)施例12，見上)進(jìn)行優(yōu)化，產(chǎn)生重組IFN-α2b編碼序列。然后在雞中生產(chǎn)TPD IFN-α2b(實(shí)施例13，見上)。碳?xì)浠衔锓治霭▎翁欠治龊虵ACE分析揭示了該蛋白質(zhì)的糖組成或新糖基化模式。這樣，TPD IFN-α2b顯示含有以下單糖殘基N-乙?；?氨基半乳糖(NAcGal)、半乳糖(Gal)、N-乙?；?葡糖胺(NAcGlu)和唾液酸(SA)。在TPD IFN-α2b中沒發(fā)現(xiàn)N-連接的糖基化，而是在Thr-106位O-糖基化。這種類型的糖基化與人IFN-α2的相似，其中，106位的Thr殘基是IFN-α2獨(dú)有的。此外，沒有發(fā)現(xiàn)TPD IFN-α2b含有甘露糖殘基。FACE分析顯示了代表各種糖殘基的6條帶(圖9)，其中條帶1、2、3分別是未唾酸化、單唾酸化和雙唾酸化的(圖10)。唾液酸(SA)連接是α2-3-半乳糖(Gal)和α2-6-N-乙?；?氨基半乳糖(NAcGal)。條帶6代表未唾酸化的四糖。條帶4和5是在人PBL IFN-α2b中未發(fā)現(xiàn)的α-半乳糖(α-Gal)延伸的雙糖。圖10顯示TPD IFN-α2b(卵清hIFN)和人PBL IFN-α2b(天然hIFN)的比較。TPD IFN-α2b中條帶3和4，條帶4和帶5之間有次帶(見下)。
發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)在Thr-106位以特定殘基O-糖基化，例如(i)Gal-NAcGal-(ii)SA-Gal-NAcGal-(iii)SA-Gal-NAcGal-|SA(iv)Gal-NAcGlu-NAcGal-|Gal(v)Gal-Gal-NAcGal-(vi)Gal-Gal-NAcGal-|SA其中，Gal＝半乳糖NAcGal＝N-乙?；?氨基半乳糖NAcGlu＝N-乙酰基-葡糖胺SA＝唾液酸百分比如下(i)Gal-NAcGal- 約20％(ii)SA-Gal-NAcGal- 約29％(iii)SA-Gal-NAcGal-約9％
SA(iv)Gal-NAcGlu-NAcGal-約6％|Gal(v)Gal-Gal-NAcGal-約7％(vi)Gal-Gal-NAcGal- 約12％|SA條帶3和4，條帶4和5之間存在約占TPD IFN-α2b 17％的次帶。
實(shí)施例15家禽細(xì)胞中用EMCV IRES由質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的Mabs的表達(dá)通過在輕鏈(LC)和重鏈(HC)編碼序列間放置腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES(又見Jang等，(1988)“腦心肌炎病毒RNA 5’非翻譯區(qū)的一個(gè)區(qū)段在體外翻譯過程中指導(dǎo)核糖體的內(nèi)部進(jìn)入”J.Virol.622636-2643)從單個(gè)載體pCMV-LC-emcvIRES-HC表達(dá)人單克隆抗體的輕鏈和重鏈。用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。
為測(cè)定兩個(gè)獨(dú)立載體的單克隆抗體的表達(dá)，將與CMV啟動(dòng)子相連的LC或HC共轉(zhuǎn)染入LMH/2α細(xì)胞，該細(xì)胞是雌激素響應(yīng)性雞肝細(xì)胞系(又見Binder等(1990)“內(nèi)源和轉(zhuǎn)染的載脂蛋白II和卵黃原蛋白II基因在雌激素響應(yīng)性雞肝細(xì)胞系中的表達(dá)”Mol.Endocrinol.4201-208)。pCMV-LC和pCMV-HC的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了經(jīng)MABELISA測(cè)定為392ng/ml的單抗，而pCMV-LC-emcvIRES-HC轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了185ng/ml的單抗。
將CMV-LC-emcv-HC盒插入基于莫羅尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，產(chǎn)生pL-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG。用LMH/2α的親代系LMH細(xì)胞(又見Kawaguchi等(1987)“一種雞肝癌細(xì)胞系LMH的建立和鑒定”，CancerRes.474460-4464)作為靶細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儾痪哂行旅顾乜剐?。以pL-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)LMH細(xì)胞，以新霉素篩選并傳代幾周。獨(dú)立地以親代MLV載體LXRN轉(zhuǎn)導(dǎo)LMH細(xì)胞并用新霉素篩選。LXRN細(xì)胞的培養(yǎng)基為單抗陰性，而L-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG-轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的培養(yǎng)基含有22ng/ml單抗。
以上說明書引用的所有文獻(xiàn)(例如，美國專利，美國專利申請(qǐng)，出版物)都以參考文獻(xiàn)的形式引入本文。對(duì)本發(fā)明的各種改進(jìn)和變動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員是顯而易見的，不超出本發(fā)明的范圍和構(gòu)思。雖然已結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了描述，但應(yīng)了解，如權(quán)利要求所述，本發(fā)明不過分限于這些具體實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員顯而易見的用于實(shí)施本發(fā)明的方式的各種改進(jìn)都落在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種包含編碼序列和操作及位置上相關(guān)的啟動(dòng)子以在禽輸卵管中表達(dá)所述編碼序列的載體，其特征在于，所述編碼序列選自重組轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b和促紅細(xì)胞生成素的編碼序列。
2.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述啟動(dòng)子選自巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、MDOT啟動(dòng)子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子及其區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子能充分實(shí)現(xiàn)所述編碼序列在禽輸卵管中的表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，該載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并且其中所述編碼序列和所述啟動(dòng)子均位于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的5’和3’UTRs之間。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來源于禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒。
5.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，該載體還包括可操作性連接于所述編碼序列的信號(hào)肽編碼序列，從而在細(xì)胞中翻譯時(shí)信號(hào)肽將指導(dǎo)該載體表達(dá)的轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b或促紅細(xì)胞生成素分泌入硬殼蛋的卵清中。
6.如權(quán)利要求1所述的載體還包括標(biāo)記基因，其特征在于，所述標(biāo)記基因可操作性連接于選自以下的啟動(dòng)子巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、MDOT啟動(dòng)子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子及其區(qū)段。
7.一種在其種系組織的遺傳物質(zhì)中含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因包含外源基因及操作和位置上相關(guān)的啟動(dòng)子以表達(dá)轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b或促紅細(xì)胞生成素，其中所述外源基因在所述轉(zhuǎn)基因禽的輸卵管中表達(dá)。
8.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因禽，其特征在于，所述啟動(dòng)子選自巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、MDOT啟動(dòng)子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子及其區(qū)段。
9.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因禽，其特征在于，該轉(zhuǎn)基因禽選自雞和火雞。
10.一種含有對(duì)于某禽類為外源性蛋白質(zhì)的禽蛋，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b和促紅細(xì)胞生成素。
11.一種將外源編碼序列穩(wěn)定導(dǎo)入禽類基因組的方法，包括將權(quán)利要求1所述的載體導(dǎo)入禽類胚胎胚盤細(xì)胞中，其中該載體隨機(jī)插入禽類基因組。
12.一種在禽類輸卵管中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽干擾素-α2b或促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的方法，該方法包括提供包含編碼序列及可操作性連接于所述編碼序列的啟動(dòng)子的載體，其中所述啟動(dòng)子可影響該編碼序列在禽類輸卵管中的表達(dá)；通過將所述載體導(dǎo)入禽類胚胎胚盤細(xì)胞中創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織，其中該載體序列隨機(jī)插入禽類基因組；和由所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)基因禽，其中該轉(zhuǎn)基因禽能在其輸卵管和血液中表達(dá)轉(zhuǎn)基因禽干擾素-α2b或促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述啟動(dòng)子選自巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、MDOT啟動(dòng)子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子及其區(qū)段。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)將所述載體導(dǎo)入胚盤細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，將所述載體導(dǎo)入胚胎胚盤細(xì)胞的步驟包括將輔助細(xì)胞給予胚胎胚盤細(xì)胞，其中所述輔助細(xì)胞產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒。
16.一種產(chǎn)生含有轉(zhuǎn)基因禽干擾素-α2b或促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的禽蛋的方法，該方法包括提供包含編碼序列及可操作性連接于所述編碼序列的啟動(dòng)子的載體，其中所述啟動(dòng)子可影響該編碼序列在禽類輸卵管中的表達(dá)；通過將所述載體導(dǎo)入禽類胚胎胚盤細(xì)胞中創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織，其中該載體序列隨機(jī)插入禽類基因組；和從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)基因禽，其中該轉(zhuǎn)基因禽能在其輸卵管中表達(dá)編碼序列，并且將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分泌入輸卵管腔中，使轉(zhuǎn)基因禽干擾素-α2b或促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)沉積于硬殼蛋的卵清中。
17.一種包含優(yōu)化的人干擾素-α2b多聚核苷酸序列(SEQ ID NO1)的分離的多聚核苷酸。
18.一種包含轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-α2b多肽序列的分離的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)以Gal-NAcGal-、SA-Gal-NAcGal-、SA-Gal-NAcGal-|SAGal-NAcGlu-NAcGal-、Gal-Gal-NAcGal-和Gal-Gal-NAcGal-| |GalSA在Thr-106位O-糖基化。
19.如權(quán)利要求18所述的分離的蛋白質(zhì)，其特征在于，Gal-NAcGal-占20％，SA-Gal-NAcGal-占29％，SA-Gal-NAcGal-占9％，|SAGal-NAcGlu-NAcGal-占6％，Gal-Gal-NAcGal-占7％，和Gal-Gal-NAcGal-占| |GalSA12％。
20.一種包含轉(zhuǎn)基因禽干擾素-α2b多肽序列的藥物組合物，某特征在于，所述蛋白質(zhì)以Gal-NAcGal-、SA-Gal-NAcGal-、SA-Gal-NAcGal-|SAGal-NAcGlu-NAcGal-、Gal-Gal-NAcGal-和Gal-Gal-NAcGal-| |GalSA在Thr-106位O-糖基化。
21.如權(quán)利要求20所述的分離的藥物組合物，其特征在于，Gal-NAcGal-占20％，SA-Gal-NAcGal-占29％，SA-Gal-NAcGal-占9％，Gal-NAcGlu-NAcGal-占6％，| |SAGalGal-Gal-NAcGal-占7％和Gal-Gal-NAcGal-占12％。|SA
22.一種包含優(yōu)化的人促紅細(xì)胞生成素多聚核苷酸編碼序列(SEQ ID NO3)的分離的多聚核苷酸。
23.一種MDOT啟動(dòng)子，含有卵類粘蛋白(MD)和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OT)啟動(dòng)子元件。
24.一種載體，包含第一和第二編碼序列以及和所述第一和第二編碼序列操作和位置上相關(guān)的啟動(dòng)子以在禽類輸卵管表達(dá)所述第一和第二編碼序列；和位于第一和第二編碼序列之間的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)元件；其中所述第一編碼序列編碼蛋白質(zhì)X，所述第二編碼序列編碼蛋白質(zhì)Y，其中所述蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y沉積于硬殼蛋的卵清。
25.如權(quán)力要求24所述的載體，其特征在于，所述蛋白質(zhì)X是單克隆抗體的輕鏈(LC)，蛋白質(zhì)Y是單克隆抗體的重鏈(HC)。
26.如權(quán)力要求24所述的載體，它還包含至少一個(gè)附加的編碼序列和至少一個(gè)附加的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)元件，其特征在于，所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)元件位于兩個(gè)編碼序列之間，從而通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)元件將該載體的一個(gè)編碼序列與另一編碼序列相隔開。
27.如權(quán)力要求24所述的載體，其特征在于，所述第二編碼序列編碼的蛋白質(zhì)可以為第一編碼序列編碼的蛋白質(zhì)提供翻譯后修飾。
28.一種產(chǎn)生含有某種蛋白質(zhì)的禽蛋的方法，該方法包括提供如權(quán)力要求24所述的載體；通過將所述載體導(dǎo)入禽類胚胎胚盤細(xì)胞中創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織，其中該載體序列隨機(jī)插入禽類基因組；和從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)基因禽，其中該轉(zhuǎn)基因禽能在其輸卵管中表達(dá)編碼序列，并且將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分泌入輸卵管腔中，使該蛋白質(zhì)沉積于硬殼蛋的卵清中。
29.如權(quán)力要求28所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是單克隆抗體。
30.一種產(chǎn)生含有某種蛋白質(zhì)的禽蛋的方法，該方法包括提供如權(quán)力要求26所述的載體；通過將所述載體導(dǎo)入禽類胚胎胚盤細(xì)胞中創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織，其中該載體序列隨機(jī)插入禽類基因組；和從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽，其中該轉(zhuǎn)基因禽能在其輸卵管中表達(dá)編碼序列，并且將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分泌入輸卵管腔，以使蛋白質(zhì)沉積于硬殼蛋的卵清中。
31.如權(quán)力要求30所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供將外源核酸序列穩(wěn)定導(dǎo)入禽類基因組中以表達(dá)外源序列來改變禽類表型或產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的載體和方法。具體說，產(chǎn)生能在輸卵管中表達(dá)外源序列并使外源蛋白質(zhì)沉積到禽蛋中的轉(zhuǎn)基因禽。本發(fā)明包括含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋。本發(fā)明還提供在轉(zhuǎn)基因禽輸卵管中有效表達(dá)并沉積于禽蛋中的新形式干擾素和促紅細(xì)胞生成素。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1980571SQ200480005912
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2004年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月24日
發(fā)明者R·D·伊瓦瑞, A·J·哈維, J·A·莫里斯, G·劉, J·C·拉普 申請(qǐng)人:阿維季尼克斯股份有限公司, 佐治亞大學(xué)研究基金會(huì)股份有限公司