專利名稱：釀酒酵母基因的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)酒精飲料如啤酒、日本米酒或燃料酒精等的工業(yè)酵母的基因尤其是用于生產(chǎn)酒精飲料的釀酒酵母的基因的篩選方法。更特別的是，它涉及酒精飲料生產(chǎn)中的一定方法，其中釀酒酵母的DNA序列信息被匯編到數(shù)據(jù)庫(kù)中以便參與產(chǎn)量增長(zhǎng)和/或風(fēng)味改善例如風(fēng)味的穩(wěn)定化、增強(qiáng)等的基因被選出，也涉及適合釀造(其中基因表達(dá)受到控制)的酵母例如選定基因被破壞的酵母或基因過(guò)表達(dá)的酵母的培育方法，還涉及應(yīng)用培育的酵母生產(chǎn)酒精飲料的方法。
背景技術(shù)：
生產(chǎn)燃料酒精、酒精飲料如啤酒或日本米酒等的技術(shù)已應(yīng)用工業(yè)酵母而得到發(fā)展。特別是在應(yīng)用釀酒酵母的酒精飲料生產(chǎn)中，已在增加產(chǎn)量和改善風(fēng)味例如酒精飲料風(fēng)味的穩(wěn)定化或強(qiáng)化的技術(shù)中見(jiàn)到活躍的發(fā)展。
全球消費(fèi)最多的酒精飲料是啤酒，2001年全球生產(chǎn)的啤酒數(shù)量是大約140,000,000kL。啤酒類型根據(jù)酵母類型和發(fā)酵方法大致分成三類。這三類是，自然發(fā)酵型啤酒，其中發(fā)酵應(yīng)用存活在啤酒廠中的酵母和微生物而進(jìn)行；ale類型啤酒，其中發(fā)酵應(yīng)用屬于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的表層發(fā)酵酵母在20到25℃的溫度下進(jìn)行，而隨后的成熟時(shí)間被縮短；和Large類型啤酒，其中發(fā)酵應(yīng)用屬于巴斯德氏糖酵母(Saccharomyces pastorianus)的底部發(fā)酵酵母在6到15℃的溫度下進(jìn)行，然后經(jīng)歷低溫成熟過(guò)程?，F(xiàn)在，全球生產(chǎn)的啤酒不少于90％是Large類型啤酒，因此，用于釀制Large類型啤酒的底部發(fā)酵酵母已被最廣泛地應(yīng)用在啤酒釀造中。
在應(yīng)用包括上述提及的釀酒酵母的微生物進(jìn)行生產(chǎn)的所謂發(fā)酵生產(chǎn)中，重要的是發(fā)酵過(guò)程最優(yōu)化以及有用的菌株被選出和培育，以增加產(chǎn)量和改善產(chǎn)品質(zhì)量。
在啤酒釀造最優(yōu)化的情形中，已實(shí)施了某一方法，其中一定量的酵母代謝物例如醇(如乙醇)、酯、有機(jī)酸等被監(jiān)測(cè)，然后是溫度、氣流數(shù)量、原材料含量等被控制。在這一情形中，酵母細(xì)胞的材料吸收和排泄及細(xì)胞中的代謝進(jìn)行暗箱操作，而只進(jìn)行非常膚淺的控制。此外，為了例如對(duì)酒精飲料給出高風(fēng)味的目的，用于抑制啤酒釀造過(guò)程中氧供應(yīng)量等的過(guò)程控制方法已被嘗試。然而在這一方法中，酵母自身的生長(zhǎng)率因?yàn)楣┭醪蛔惚唤档?，而?fù)面效應(yīng)例如發(fā)酵的阻滯和/或啤酒質(zhì)量的退化可能出現(xiàn)。因此，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程的方式對(duì)產(chǎn)量和啤酒質(zhì)量進(jìn)行改善方面，存在一定的限制。
另一方面，關(guān)于有用的工業(yè)酵母例如有用的啤酒酵母的培育方法，除了實(shí)際培育(actual breeding)外，用于選出合意株系的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。啤酒釀造本身在巴斯德發(fā)現(xiàn)微生物之前已很好地進(jìn)行，并且在啤酒釀造中，從啤酒廠應(yīng)用的多種酵母株中選出更適合的啤酒酵母株的方法一直傳統(tǒng)性地實(shí)施，但是幾乎沒(méi)有具有良好特性的酵母被培育出。
作為陽(yáng)性培育方法的實(shí)例，存在一種方法，其中應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)或放射性射線所致的人工基因突變。然而，釀酒酵母尤其啤酒釀造中廣泛應(yīng)用的底部發(fā)酵酵母在許多情形中是多倍體。在那種情況下，不可能產(chǎn)生出合意的突變體，除非突變?cè)谒袑⒈煌蛔兊牡任换虬l(fā)生。因此，雖然在實(shí)驗(yàn)室單倍體酵母的情形中有可能誘導(dǎo)出合意的突變，但在多倍體的啤酒酵母的情形中，基本上是不可能的。
近年來(lái)已嘗試一定的培育方法，其中突變或雜交培育通過(guò)應(yīng)用從底部發(fā)酵酵母分離出的孢子而進(jìn)行(參考，例如，非專利文獻(xiàn)1)。然而，底部發(fā)酵酵母是多倍體，并具有復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)，因此，具有增殖能力的孢子的分離有困難，而且?guī)缀醪豢赡苡纱说玫骄哂辛己锰匦缘木辍?br> 另一方面，所需的基因應(yīng)用基因工程技術(shù)而被引入和在釀酒酵母中表達(dá)，近來(lái)已成為可能，由此也有可能通過(guò)應(yīng)用基因功能分析的結(jié)果和已被進(jìn)行功能分析的基因而培育具有所需特征的酵母。然而，與全部基因組序列已被闡明的面包酵母(啤酒糖酵母；參考，例如，非專利文獻(xiàn)2)相比，底部發(fā)酵酵母的全部基因組序列尚未闡明，并且關(guān)于參與底部發(fā)酵酵母所特異的釀酒特性的基因和所述基因在啤酒釀造中的功能，只有非常少數(shù)的發(fā)現(xiàn)。
近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄子分析已應(yīng)用DNA微陣列進(jìn)行，其中DNA片段或核苷酸寡聚物(每一個(gè)都具有結(jié)構(gòu)基因或染色體的內(nèi)區(qū)域的部分序列)被固定在固體支持物上。例如，Olesen，等人在釀造過(guò)程中應(yīng)用GeneFilters(Research Genetics Co.制造)進(jìn)行了底部發(fā)酵酵母的廣泛的基因表達(dá)分析(參考，例如，非專利文獻(xiàn)3)。然而，既然底部發(fā)酵酵母的全部基因組序列尚未被闡明，則什么基因被監(jiān)控以精確地表達(dá)也是不明確的。因此，這類信息非常不充分，而無(wú)法應(yīng)用于底部發(fā)酵酵母的代謝分析、有用酵母的培育及啤酒釀造過(guò)程的控制。
現(xiàn)在，超過(guò)100個(gè)微生物物種的全基因組序列已被確定(參考，例如，非專利文獻(xiàn)6)，包括啤酒糖酵母，大腸桿菌(Escherichia coli)(參考，例如，非專利文獻(xiàn)4)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)(參考，例如，非專利文獻(xiàn)5)。根據(jù)已確定的DNA序列，這些微生物的基因被鑒別，大量基因的功能在沒(méi)有進(jìn)行遺傳、生化和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的情況下被預(yù)測(cè)。然而，工業(yè)酵母例如釀酒酵母具有高度多倍體性和復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)，并因推測(cè)其裝配(連接DNA序列的操作)將會(huì)有困難。因此，包含兩種不同類型基因組(參考，例如，非專利文獻(xiàn)7)的底部發(fā)酵酵母的全基因組序列尚未被報(bào)道。
在具體的醇或酒精飲料生產(chǎn)中，存在著在產(chǎn)品中增加亞硫酸(sulfite)濃度以控制風(fēng)味的技術(shù)。亞硫酸已知為具有抗氧化活性的化合物，并在食品、飲料和制藥以及酒精飲料領(lǐng)域中被廣泛用作抗氧化劑。例如，對(duì)葡萄酒而言，需要較長(zhǎng)的成熟期，亞硫酸對(duì)其質(zhì)量的保存起重要作用。也已知，在啤酒釀造中，質(zhì)量保存期根據(jù)產(chǎn)品中包含的亞硫酸的濃度增加而變長(zhǎng)。因此，當(dāng)產(chǎn)品中亞硫酸的數(shù)量增加時(shí)，有可能制備具有極佳的風(fēng)味穩(wěn)定性和質(zhì)量保存期較長(zhǎng)的產(chǎn)品。
增加產(chǎn)品中亞硫酸數(shù)量的最簡(jiǎn)單方式是添加亞硫酸。在日本，就葡萄酒而言，經(jīng)健康、勞動(dòng)和福利部(Ministry of Health，Labor andWelfare)允許，以殘余亞硫酸濃度計(jì)，可添加亞硫酸至不超過(guò)350ppm的程度。然而在那種情形中，既然亞硫酸被歸類為食品添加劑，當(dāng)考慮到消費(fèi)者對(duì)食品添加劑的負(fù)面印象時(shí)，添加亞硫酸到啤酒中就不太合適。
然而，用于釀造的酵母通過(guò)將介質(zhì)中的硫酸鹽還原而生成了硫化氫，以合成含硫的代謝物，例如含硫的氨基酸。亞硫酸是該途徑的中間代謝物。如果發(fā)酵期間亞硫酸被有效地排出細(xì)胞，則麥芽汁和產(chǎn)品中的亞硫酸數(shù)量都會(huì)增加。
有兩個(gè)方法可以在發(fā)酵過(guò)程中增加麥芽汁里的亞硫酸濃度。一是控制發(fā)酵過(guò)程而另一個(gè)是培育釀酒酵母。至于發(fā)酵過(guò)程的調(diào)控，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的亞硫酸的數(shù)量與溶解氧的濃度成反比，因此，已嘗試某一方法，其中溶解氧的濃度被減少，以便增加亞硫酸的數(shù)量，同時(shí)亞硫酸的氧化被抑制。然而，在該方法中，酵母的生長(zhǎng)速率因氧氣的缺乏而減少，這會(huì)具有負(fù)效應(yīng)例如發(fā)酵的阻滯和質(zhì)量的退化。因此，該方法不實(shí)用。
另一方面，如上面提及的，培育釀酒酵母的基因工程技術(shù)已得到發(fā)展。例如，有某些報(bào)道關(guān)注酵母的硫代謝。亞硫酸(SO2)是含硫氨基酸和維生素合成的中間產(chǎn)物，通過(guò)硫酸離子(SO42-)→APS(腺嘌呤硫酸)→PAPS(磷酸腺嘌呤硫酸)→亞硫酸離子(SO32-)的途徑產(chǎn)生，其中硫酸離子從細(xì)胞外被整合。曾經(jīng)嘗試增加MET3基因和MET14基因的拷貝數(shù)量，以增強(qiáng)酵母產(chǎn)生亞硫酸的能力，所述MET3基因參與硫酸離子(SO42-)→APS(腺嘌呤硫酸)的反應(yīng)，所述MET14基因參與APS(腺嘌呤硫酸)→PAPS(磷酸腺嘌呤硫酸)的反應(yīng)(參考，例如，非專利文獻(xiàn)8)。另一嘗試的實(shí)例是亞硫酸離子(SO32-)的減少因MET10基因被破壞而被抑制，從而酵母所產(chǎn)生的亞硫酸的數(shù)量得到增加(參考，例如，非專利文獻(xiàn)9)。根據(jù)這類嘗試，MET10基因被破壞個(gè)體所產(chǎn)生的亞硫酸的數(shù)量將增加到不少于親代菌株的10倍的程度，但另一方面，發(fā)酵中的阻滯現(xiàn)象加重，并且啤酒中乙醛與1-丙醇的數(shù)量增加，這已成為實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)問(wèn)題。
因此，雖然工業(yè)酵母例如釀酒酵母的培育方法(應(yīng)用基因工程)的發(fā)展正在進(jìn)行中，但目前的狀態(tài)是，由于釀酒酵母的基因組信息不充分，對(duì)參與釀酒酵母釀造特征的基因的挑選、對(duì)基因所編碼蛋白質(zhì)的功能的分析及那些發(fā)現(xiàn)對(duì)于培育的應(yīng)用都沒(méi)有充分開(kāi)展。
因此，顯示所期望特征而沒(méi)有發(fā)酵速度和產(chǎn)品質(zhì)量退化的酵母的培育方法尚未建立，并且，不僅釀造工業(yè)而且在應(yīng)用酵母的其它工業(yè)都存在對(duì)于發(fā)展這樣的方法的很大需求。
(非專利文獻(xiàn)1)C.Gjermansen″Construction of a hybrid brewingstrain of Saccharomyces carlsbergensis by mating of meioticsegregants″，Carlsberg Res.Commun.，卷46，頁(yè)1-11(1981).
(非專利文獻(xiàn)2)A.Goffeau等″The Yeast Genome Directory″，Nature，卷387，頁(yè)5-105(1997).
(非專利文獻(xiàn)3)K.Olesen等″The dynamics of the Saccharomycescarlsbergensis brewing yeast transcriptome during aproduction-scale lager beer fermentation″，F(xiàn)EMS Yeast Research，卷2，頁(yè)563-573(2000).
(非專利文獻(xiàn)4)F.R.Blattner等″The Complete Genome Sequenceof Escherichia coli K-12″，Science，卷277，頁(yè)1453-1462(1997).
(非專利文獻(xiàn)5)S.T.Cole等″Deciphering the biology ofMycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence″.Nature，卷393，頁(yè)537-544(1998).
(非專利文獻(xiàn)6)The National Center for BiotechnologyInformation，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/micr.html.
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(非專利文獻(xiàn)8)C.Korch等Proc.Eur.Brew.Conv.Congress，Lisbon，頁(yè)201-208(1991).
(非專利文獻(xiàn)9)J.Hansen等″Inactivation of MET 10 in brewer′syeast specifically increases SO2formation during beerproduction″，Nature Biotech.，卷14，頁(yè)1587-1591(1996).
(非專利文獻(xiàn)10)T.Sijen等″Transcriptional andposttranscriptional gene silencing are mechanisticallyrelated″，Curr.Biol.，卷11，頁(yè)436-440(2001).
(非專利文獻(xiàn)11)N.Goto等″SSU1-R，a sulphite resistance geneof wine yeast，is an allele of SSU 1 with a different upstreamsequence″，J.Ferment.Bioeng.，卷86，頁(yè)427-433(1998).
(非專利文獻(xiàn)12)D.Avram等″SSU 1 encodes a plasma membraneprotein with a central role in a network of proteins conferringsulfite tolerance in Saccharomyces cerevisiae″，J.Bacteriol.，卷179，頁(yè)5971-5974(1997).
(非專利文獻(xiàn)13)H.Park等″SSU 1 mediates sulphite efflux inSaccharomyces cerevisiae″，Yeast，卷16，頁(yè)881-888(2000).
發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容本發(fā)明的目標(biāo)是提供對(duì)于參與所期望釀造特性的基因進(jìn)行選擇的方法，所述方法以這樣的方式實(shí)現(xiàn)，即匯編了工業(yè)酵母尤其是用于酒精飲料如啤酒的釀酒酵母的全部基因組序列的數(shù)據(jù)庫(kù)(在此之后，可被縮寫成基因組DB)被制備；釀酒酵母擁有的基因被從數(shù)據(jù)庫(kù)中選出；基因的功能分析通過(guò)破壞或過(guò)表達(dá)而進(jìn)行。另一目標(biāo)是提供酵母(其顯示所述基因參與的釀造特性)的培育方法，以及生產(chǎn)醇或酒精飲料的方法(其中產(chǎn)量和質(zhì)量都因應(yīng)用所述酵母而被改善)。另一目標(biāo)是提供上述基因和所述基因編碼的肽。
已知廣泛用于工業(yè)目的的釀酒酵母是多倍體，特別是底部發(fā)酵酵母是異源多倍性，它由至少兩種基因組所組成。一種基因組被認(rèn)為是源自全部基因組序列已被闡明的啤酒糖酵母的基因組，而其它基因組的來(lái)源仍未被闡明。
為了找到未被鑒別的顯示優(yōu)良釀造所必需功能的基因，本發(fā)明者已測(cè)定底部發(fā)酵酵母的全部基因組序列。然后將底部發(fā)酵酵母的氨基酸序列與那些在啤酒糖酵母的基因組DB中登記的類型比較，而釀酒酵母基因所編碼蛋白的功能被評(píng)估。結(jié)果，闡明了底部發(fā)酵酵母的基因大致分為顯示幾乎與啤酒糖酵母具有100％氨基酸同一性的Sc類型基因，和顯示大約70到97％同一性的非Sc類型基因。此外也已闡明，底部發(fā)酵酵母具有由Sc類型染色體、非Sc類型染色體和Sc/非Sc類型嵌合染色體組成的復(fù)雜染色體。底部發(fā)酵酵母整個(gè)染色體的結(jié)構(gòu)在

圖1中顯示?；诒景l(fā)明闡明的基因組信息，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)這樣一個(gè)出乎意料的復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)，并發(fā)展出了對(duì)底部發(fā)酵酵母基因的篩選方法。更具體而言，已完成了對(duì)釀酒酵母特異的釀造特性的參與基因進(jìn)行篩選的方法，其特征在于(A)工業(yè)酵母尤其是屬于釀酒酵母中的一種的底部發(fā)酵酵母的全部基因組序列得到分析，(B該)基因組序列與啤酒糖酵母的全部基因組序列進(jìn)行了比較，(C)與啤酒糖酵母的基因所編碼的氨基酸序列具有70到97％同一性的底部發(fā)酵酵母的氨基酸序列的編碼基因被選出，及(D)進(jìn)行選定基因的功能分析，由此基因所賦予酵母的釀造特性被鑒定。本發(fā)明者已基于那些發(fā)現(xiàn)重復(fù)地進(jìn)行了精深的研究，并完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及(1)對(duì)在醇或酒精飲料生產(chǎn)中參與產(chǎn)量增加和/或風(fēng)味改善的基因的篩選方法，特征在于(a)分析工業(yè)酵母的全部基因組序列，(b)這些序列與啤酒糖酵母的那些進(jìn)行了比較，(c)選擇與啤酒糖酵母的基因所編碼的氨基酸序列具有70到97％同一性的工業(yè)酵母的氨基酸序列的編碼基因，及(d)進(jìn)行選出基因的功能分析，由此鑒定基因所賦予酵母的特性。
(2)根據(jù)上述(1)的篩選方法，其中DNA陣列被用于上述1(d)中的功能分析。
(3)根據(jù)上述(2)的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，一種或多種包含下列DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸被粘附到固體支持物；DNA序列(1)具有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的開(kāi)放閱讀框中的核苷酸，及(2)不存在于全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸區(qū)域之外的區(qū)域中。
(4)根據(jù)上述(2)的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，一種或多種在嚴(yán)格條件下與上述(3)中所定義的寡核苷酸雜交的寡核苷酸被粘附到固體支持物。
(5)根據(jù)上述(2)的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，一種或多種包含下列DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸被粘附到固體支持物；DNA序列(1)具有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的非編碼區(qū)域中的核苷酸，及(2)不存在于所述全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸區(qū)域之外的區(qū)域中。
(6)根據(jù)上述(2)的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，一種或多種在嚴(yán)格條件下與上述(5)中所定義的寡核苷酸雜交的寡核苷酸被粘附到固體支持物。
(7)根據(jù)上述(2)的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，選自下列四組中的兩組或更多組的寡核苷酸被粘附到固體支持物一種或多種上述(3)所定義的寡核苷酸；一種或多種上述(4)所定義的寡核苷酸；一種或多種上述(5)所定義的寡核苷酸；及一種或多種上述(6)所定義的寡核苷酸。
(8)根據(jù)上述(1)到(7)中任意項(xiàng)的篩選方法，其中工業(yè)酵母是釀酒酵母。
(9)根據(jù)上述(1)到(8)中任意項(xiàng)的篩選方法，其中釀酒酵母是啤酒酵母。
(10)根據(jù)上述(1)的篩選方法所得到的基因。
(11)根據(jù)上述(10)的基因，其特征在于，當(dāng)上述(10)提及的基因在酵母中表達(dá)時(shí)，酵母的培養(yǎng)基中的亞硫酸濃度增加。
(12)包含SEQ ID NO1或2所代表的DNA序列的DNA，和在嚴(yán)格條件下與所述DNA雜交的DNA。
(13)具有SEQ ID NO3或4所代表的氨基酸序列的多肽的編碼DNA，和具有一定氨基酸序列的多肽的編碼DNA，在所述氨基酸序列中，SEQ ID NO3或4所代表的氨基酸序列具有一到數(shù)個(gè)氨基酸殘基的缺失和/或替代和/或添加。
(14)包含上述(9)到(12)中任意項(xiàng)所提及的基因或DNA的重組載體。
(15)根據(jù)上述(9)的重組載體，其中啟動(dòng)子和/或終止子位于上述(10)到(13)中任意項(xiàng)所提及的基因或DNA的鄰近位置。
(16)根據(jù)上述(15)的重組載體，其中啟動(dòng)子是顯示組成性表達(dá)的啟動(dòng)子。
(17)根據(jù)上述(15)或(16)的重組載體，其中啟動(dòng)子是甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子。
(18)包含上述(10)到(17)中任意項(xiàng)所提及的基因或DNA或重組載體的轉(zhuǎn)化子。
(19)根據(jù)上述(18)的轉(zhuǎn)化子，其中轉(zhuǎn)化子屬于糖酵母屬的酵母。
(20)上述(10)到(13)中任意項(xiàng)提及的基因或DNA所編碼的多肽或具有一定氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列中，所述多肽的氨基酸序列中的一到數(shù)個(gè)氨基酸殘基被缺失和/或替代和/或添加。
(21)具有SEQ ID NO3或4所代表的氨基酸序列的多肽或具有一定氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列中，SEQ ID NO3或4所代表的氨基酸序列具有一到數(shù)個(gè)氨基酸殘基的缺失和/或替代和/或添加。
(22)用于醇或酒精飲料生產(chǎn)的方法，特征在于應(yīng)用了上述(18)或(19)所提及的轉(zhuǎn)化子。
(23)適合生產(chǎn)醇或酒精飲料的酵母的培育方法，特征在于上述(10)或(11)所提及的基因或上述(12)或(13)所提及的DNA上的基因的表達(dá)被調(diào)控。
(24)根據(jù)上述(23)的培育方法，其中酵母屬于糖酵母屬。
(25)根據(jù)上述(23)或(24)的培育方法所得到的酵母。
(26)應(yīng)用上述(25)提及的酵母生產(chǎn)醇或酒精飲料的方法。
(27)應(yīng)用根據(jù)上述(26)的生產(chǎn)醇或酒精飲料的方法所生產(chǎn)的醇或酒精飲料。
(28)DNA陣列，其中一種或多種包含下列DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸被粘附到固體支持物；DNA序列(1)具有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的開(kāi)放閱讀框中的核苷酸，及(2)不存在于所述全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸區(qū)域之外的區(qū)域中。
(29)DNA陣列，其中在嚴(yán)格條件下與上述(28)所定義的寡核苷酸雜交的一種或多種寡核苷酸被粘附到固體支持物。
(30)DNA陣列，其中一種或多種包含下列DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸被粘附到固體支持物；
DNA序列(1)有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的非編碼區(qū)域中的核苷酸，及(2)不存在于所述全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸區(qū)域之外的區(qū)域中。
(31)DNA陣列，其中在嚴(yán)格條件下與上述(30)所定義的寡核苷酸雜交的一種或多種寡核苷酸被粘附到固體支持物；及(32)DNA陣列，其中選自下列四組中的兩組或更多組的寡核苷酸被粘附到固體支持物一種或多種上述(28)所定義的寡核苷酸；一種或多種上述(29)所定義的寡核苷酸；一種或多種上述(30)所定義的寡核苷酸；及一種或多種上述(31)所定義的寡核苷酸。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示底部發(fā)酵酵母的總?cè)旧w結(jié)構(gòu)。白杠代表Sc類型染色體而黑杠代表非Sc類型染色體。橢圓代表著絲粒。羅馬數(shù)字顯示對(duì)應(yīng)的啤酒糖酵母染色體數(shù)字。在顯示非Sc類型染色體的附圖中，以黑色標(biāo)出的部分顯示連接發(fā)生在該區(qū)域。例如，在非ScII-非ScIV中，顯示非ScII與非ScIV在黑色標(biāo)出的部分(300kb)相連接。
圖2顯示從菌株34/70的基因組DNA制得的3648個(gè)粘粒兩端的DNA序列與啤酒糖酵母的基因組序列的同一性的分布。X-軸表示與啤酒糖酵母的同一性，例如，X-軸上的84％表示超過(guò)82％而不超過(guò)84％的同一性。Y-軸表示顯示同一性的粘粒末端序列的數(shù)目。
圖3顯示啤酒糖酵母基因組序列的粘粒和鳥槍克隆(shotgunclones)的圖譜實(shí)例。①和②表示分別存在于啤酒糖酵母染色體XVI的Watson鏈和Crick鏈上的基因。③和④表示分別插入到粘?？寺≈械腟c類型和非Sc類型DNA片段。⑤和⑥表示分別插入到鳥槍克隆中的Sc類型和非Sc類型DNA片段。
圖4顯示啤酒糖酵母基因組序列的毗連群的圖譜實(shí)例。(A)是對(duì)啤酒糖酵母的染色體XVI的示意性描述。(B)是其中啤酒糖酵母染色體XVI的857到886kb的部分被放大的插圖。Y-軸指出毗連群對(duì)啤酒糖酵母基因組序列的％同一性。X-軸指出毗連群在啤酒糖酵母基因組序列中的位置。毗連群(實(shí)線)用分別來(lái)自鳥槍和粘粒讀數(shù)(read)的正向和反向連接線(點(diǎn)線)連接。
圖5顯示基于DNA微陣列的比較性基因組雜交的結(jié)果。菌株34/70的基因組DNA與DNA微陣列(Affymetrix Gene Chip Yeast Genome S98Array)雜交，而每一ORF(開(kāi)放閱讀框)的信號(hào)相對(duì)于單倍體菌株S288C的信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并以Signal Log Ratio(2n)顯示。SignalLog Ratios按染色體XVI中的基因順序畫出線條。非Sc類型基因不與此Sc類型陣列雜交，因此，Signal Log Ratios顯示急劇改變處的點(diǎn)(用箭頭指出)被認(rèn)為是易位的位置。
圖6顯示從DNA微陣列和PCR的分析所推斷出的菌株34/70染色體XVI結(jié)構(gòu)。
圖7顯示SSU1破壞株和親代株(BH96)的發(fā)酵特征。a)顯示酵母的生長(zhǎng)(OD 600)，b)顯示表觀提取值(apparent extract)(w/w％)的變化，而c)顯示亞硫酸濃度(ppm)。
圖8顯示SSu1過(guò)表達(dá)株和親代株(BH225)的發(fā)酵特征。a)顯示酵母的生長(zhǎng)(OD 600)，b)顯示表觀提取值(w/w％)的變化，而c)顯示亞硫酸濃度(ppm)。
圖9顯示在應(yīng)用MET14過(guò)表達(dá)株和親代株(KN009F和FOY227)的發(fā)酵過(guò)程中的亞硫酸濃度變化。
圖10顯示ScSSU1和非-ScSSU1的DNA序列。
圖11顯示ScMET14和非-ScMET14的DNA序列。
圖12顯示菌株34/70的發(fā)酵特征。a)顯示酵母的生長(zhǎng)(OD 600)，而b)顯示表觀提取值(w/w％)的變化。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式關(guān)于本發(fā)明中的工業(yè)酵母，可例舉啤酒、葡萄酒、日本米酒等的釀酒酵母和用于燃料酒精生產(chǎn)的酵母。更具體而言，糖酵母屬的酵母等可被列出，而在本發(fā)明中，啤酒酵母例如巴斯德氏糖酵母Weihenstephan 34/70，BH 84，NBRC 1951，NBRC 1952，NBRC 1953，NBRC 1954，等可被應(yīng)用。也有可能應(yīng)用威士忌酒酵母如啤酒糖酵母NCYC 90等，葡萄酒酵母如Kyokai葡萄酒酵母No.1，No.3，No.4等，日本米酒酵母如Kyokai日本米酒酵母No.7，No.9等。
根據(jù)本發(fā)明的基因篩選方法的特征在于(A)工業(yè)酵母尤其是作為釀酒酵母中的一種的底部發(fā)酵酵母的全部基因組序列被分析，(B)基因組DNA序列與啤酒糖酵母的全部基因組序列進(jìn)行了比較，(C)與啤酒糖酵母的基因所編碼的氨基酸序列有70到97％同一性的底部發(fā)酵酵母的氨基酸序列的編碼基因被選出，及更進(jìn)一步地，(D)進(jìn)行選出基因的功能分析，由此鑒定基因所賦予酵母的釀造特性。
當(dāng)通過(guò)本發(fā)明的篩選方法得到的基因被用于進(jìn)行如下方式的表達(dá)調(diào)控，即基因在酵母中過(guò)表達(dá)和/或基因被破壞時(shí)，也有可能培育具有極佳釀造特性的酵母。因此，通過(guò)本發(fā)明的篩選方法得到的基因，該基因所編碼的肽，應(yīng)用該基因培育工業(yè)酵母的方法，通過(guò)該培育方法得到的酵母，及應(yīng)用該酵母生產(chǎn)醇或酒精飲料的方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
(A)工業(yè)酵母的全部基因組序列的測(cè)定工業(yè)酵母的全部基因組序列的測(cè)定包括步驟有(a)來(lái)自酵母的基因組DNA被制備，(b)鳥槍文庫(kù)和(c)粘粒文庫(kù)從這些基因組DNA制得，(d)將用于DNA序列測(cè)定的DNA片段從那些文庫(kù)克隆制得，(e)文庫(kù)DNA片段的DNA序列通過(guò)測(cè)序反應(yīng)測(cè)定，及(f)那些DNA片段的序列被組裝，以重建全部基因組DNA序列。
對(duì)于用于(a)到(f)的方法，沒(méi)有特別的限制，這些方法可根據(jù)已知方式操作，而它們的每一項(xiàng)的優(yōu)選方法在下面提及。
(a)基因組DNA的制備例如提取、純化等優(yōu)選根據(jù)已知方法進(jìn)行，例如″Yeast，a practical approach(IRL Press，6.2.1，p.228)″和″Seibutukagakujikkennhou，No.39，Experiments in YeastMolecular Genetics(Yasuharu Oshima編，Gakkai Shuppan Center，頁(yè)84-85，1996)″。DNA制備的優(yōu)選方法的具體實(shí)例在下面提及。
用于制備基因組DNA的酵母細(xì)胞通過(guò)普通方法培養(yǎng)。關(guān)于培養(yǎng)基，任何自然和合成的培養(yǎng)基都可被應(yīng)用，只要培養(yǎng)基包含能被酵母所代謝的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等，微生物的培養(yǎng)能通過(guò)這樣而有效地進(jìn)行。例如，YPD培養(yǎng)基(2％(w/w)葡萄糖，1％(w/w)酵母提取物和2％(w/w)聚胨)可被應(yīng)用。關(guān)于培育的方法，推薦在約25-35℃振蕩培育過(guò)夜。
培養(yǎng)后，細(xì)胞通過(guò)離心從培養(yǎng)基中提取出來(lái)。得到的細(xì)胞沉淀用清洗液清洗。清洗液的實(shí)例是緩沖液A(50mM磷酸鈉，25mM EDTA和1％(v/v)β-巰基乙醇；pH 7.5)，等。從清洗后的細(xì)胞制備基因組DNA可根據(jù)基因組DNA的普通制備方法進(jìn)行，其中細(xì)胞壁應(yīng)用Zymolyase和SDS降解；蛋白質(zhì)等應(yīng)用苯酚和苯酚/氯仿溶液除去；而基因組DNA應(yīng)用乙醇或類似物沉淀。更具體而言，下面的方法可作為實(shí)例。
培養(yǎng)的細(xì)胞被清洗和重懸浮于緩沖液A中，然后約5-10mg的Zymolyase 100T(Seikagaku Kogyo)被加入，而混合物在25-40℃輕微振蕩大約30分鐘到2小時(shí)。振蕩后，含有SDS的緩沖液例如緩沖液B(0.2M Tris-HCl，80mM EDTA和1％SDS；pH 9.5)被加入，而混合物被允許置于約60-70℃中大約30分鐘以降解細(xì)胞。之后，細(xì)胞降解物在冰上冷卻，與5M乙酸鉀混合，并被允許進(jìn)一步被置于冰上約60分鐘。得到的溶液被離心(例如，15℃下以5,000g離心10分鐘)以取走上清。等體積的乙醇被加入上清以沉淀DNA，而混合物立即離心(例如，15℃下以5,000g離心10分鐘)以得到DNA。得到的沉淀用70％(v/v)乙醇清洗，進(jìn)行自然干燥并溶解在溶液例如TE緩沖液(10mM Tris-HCl和1mM EDTA；pH 8.0)中以給出基因組DNA粗溶液。氯化銫和二苯并亞胺被加入并溶解在基因組DNA粗溶液中，混合溶液進(jìn)行超離心分離(例如，25℃下以100,000g離心17小時(shí))，進(jìn)行紫外光照射以便DNA條帶被看到，而較低的條帶被回收。二苯并亞胺通過(guò)以氯化銫溶液所飽和的異丙醇提取提取出來(lái)的DNA溶液而被除去。然后4倍體積的0.3M乙酸鈉被加入提取出的水層，隨之混合，DNA通過(guò)乙醇沉淀，并通過(guò)離心被回收。回收的DNA以RNase處理，并以苯酚/氯仿提取，而DNA再次以乙醇從回收的水層中通過(guò)沉淀被純化。通過(guò)離心回收的沉淀以70％(v/v)乙醇清洗，進(jìn)行自然干燥并溶解在TE緩沖液中以制得基因組DNA溶液。
(b)鳥槍文庫(kù)的制備至于應(yīng)用上述(a)所制得的酵母基因組DNA制備基因組DNA文庫(kù)的方法，可應(yīng)用在″Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ThirdEdition(2001)″(在此之后縮寫為″Molecular Cloning，ThirdEdition″)中提及的方法，而關(guān)于制備特別適合測(cè)定全部基因組序列的鳥槍文庫(kù)的制備方法，下面的方法可作為實(shí)例。
TE緩沖液被加入(a)中制得的基因組DNA，而基因組DNA應(yīng)用Hydroshear(GeneMachines制造)或類似物被片段化。基因組片段的末端應(yīng)用DNA Blunting Kit(Takara Shuzo制造)或類似物被鈍化，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的方式分離。然后，約1.5-2.5kb的基因組片段從凝膠中被切出，用于洗脫DNA的緩沖液例如MG-洗脫緩沖液(0.5mol/L乙酸銨，10mmol/L乙酸鎂，1mmol/L EDTA和0.1％SDS)或類似物被加入凝膠中，隨后在約25-40℃振蕩過(guò)夜以洗脫DNA。DNA洗脫液以苯酚/氯仿處理并用乙醇沉淀以給出基因組文庫(kù)插入物。所有上述提及的插入物和某一適當(dāng)?shù)妮d體例如pUC18 SmaI/BAP(AmershamBiosciences制造)應(yīng)用T4連接酶(Takara Shuzo制造)在約10-20℃連接約20-50小時(shí)。連接反應(yīng)產(chǎn)物用乙醇沉淀，得到的重組載體DNA溶于適當(dāng)數(shù)量的TE緩沖液。通過(guò)電穿孔方式或類似方式，重組載體DNA被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌例如Electro Cell DH5a菌株(Takara Shuzo制造)。推薦電穿孔在所附實(shí)驗(yàn)指南中提及的條件下進(jìn)行。
含有基因組DNA片段的重組載體所插入的轉(zhuǎn)化子在適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基上被選出。例如，當(dāng)pUC 18 SmaI/BAP被用作載體時(shí)，轉(zhuǎn)化子在含有約0.01-0.1mg/mL的氨芐青霉素，約0.1mg/mL的X-gal和約1mmol/L的異丙基-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)的LB平板培養(yǎng)基(含有1.6％瓊脂的LB培養(yǎng)基(10g/L細(xì)菌用胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和10g/L氯化鈉；pH 7.0))上通過(guò)約30-37℃下培育過(guò)夜形成白色菌落，因此，選出很容易。轉(zhuǎn)化子在含有約0.1mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中約30-37℃下應(yīng)用384-孔滴定平板培養(yǎng)過(guò)夜，與LB相同體積的50％甘油水溶液被加入其中，而混合物被攪拌以給出甘油貯存液。通常甘油貯存液能在約-80℃下保存。
(c)粘粒文庫(kù)的制備在(a)中制備的基因組DNA應(yīng)用適當(dāng)?shù)南拗菩悦咐鏢au3AI(Takara Shuzo制造)進(jìn)行部分消化。有可能將Sau3AI所消化的DNA片段插入到質(zhì)粒載體例如Super CosI載體(Stratagene制造)的BamHI位點(diǎn)中。限制性酶的處理和連接可根據(jù)所附的方案進(jìn)行。通過(guò)這樣的方法所得到的連接產(chǎn)物應(yīng)用例如Gigapack III Gold(Stratagene制造)進(jìn)行包裝，并根據(jù)所附的實(shí)驗(yàn)程序指南將其引入大腸桿菌例如XL1-Blue MR菌株(Stratagene制造)。將其鋪展到含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，并在約30-37℃培育過(guò)夜以得到轉(zhuǎn)化子。得到的轉(zhuǎn)化子在含有約0.1mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中約30-37℃下應(yīng)用96孔滴定平板培養(yǎng)過(guò)夜，與LB相同體積的50％甘油水溶液被加入，混合物被攪拌以給出甘油貯存液。通常甘油貯存液能在約-80℃下保存。
(d)用于DNA序列測(cè)定的DNA片段的制備釀酒酵母的全部基因組序列能主要應(yīng)用全基因組鳥槍方法被測(cè)定。其DNA序列被測(cè)定的DNA片段能應(yīng)用上述(b)中制得的鳥槍文庫(kù)通過(guò)PCR制備。具體而言，基因組鳥槍文庫(kù)的克隆應(yīng)用復(fù)制器(GeneSolution制造)被轉(zhuǎn)接到384孔的滴定平板并無(wú)晃動(dòng)地在約30-37℃下培養(yǎng)過(guò)夜，在所述滴定平板上，每一孔都被放入約50μl含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。應(yīng)用復(fù)制器(Gene Solution制造)或類似物，培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到384孔的反應(yīng)平板(AB Gene制造)，在所述反應(yīng)平板上，每一孔都被放入約10μl PCR反應(yīng)溶液(Takara Shuzo制造的TaKaRaEx Taq)，而PCR根據(jù)Makino等的方案(DNA Research，卷5，頁(yè)1-9(1998))或類似方法應(yīng)用GeneAmp PCR System 9700(AppliedBiosystems制造)或類似設(shè)備進(jìn)行，其中插入的片段被擴(kuò)增。
過(guò)量的引物和核苷酸應(yīng)用用于PCR產(chǎn)物純化的試劑盒(AmershamBioscience制造)等除去，而測(cè)序反應(yīng)應(yīng)用樣本作為模板進(jìn)行。
來(lái)自(c)的質(zhì)粒文庫(kù)的質(zhì)粒DNA能以下面的方法制備。也就是，源于質(zhì)粒文庫(kù)的克隆被轉(zhuǎn)接到96孔平板的每一孔中并在約30-37℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，所述96孔平板上，每一孔中放入了約1.0mL含氨芐青霉素的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基例如2×YT培養(yǎng)基(1.6％細(xì)菌用胰蛋白胨，1％酵母提取物和0.5g氯化鈉；pH 7.0)。來(lái)自所述培養(yǎng)物的粘粒DNA能應(yīng)用KURABO PI-1100 AUTOMATIC DNA ISOLATION SYSTEM(KURABO制造)根據(jù)KURABO的指南或類似物而制備，而它們能被用作測(cè)序反應(yīng)的模板。
(e)測(cè)序反應(yīng)測(cè)序反應(yīng)能應(yīng)用商業(yè)性可得的測(cè)序試劑盒等進(jìn)行。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例顯示如下。
測(cè)序反應(yīng)混合物能按下述制備。上述(d)中制得的PCR產(chǎn)物或粘粒DNA與約2μl的DYEnamic ET Terminator Sequencing Kit(AmershamBioscience制造)和合適的引物混合以給出約8μl的反應(yīng)混合物。M13正向引物(M13-21)和M13反向引物(M13RV)(Takara Bio制造)等被用于源自鳥槍DNA的PCR產(chǎn)物的測(cè)序反應(yīng)，而正向引物例如SS-cosF.1(SEQ ID NO7)和反向引物例如SS-cos R.1(SEQ ID NO8)等被用于粘粒DNA。引物和DNA片段的數(shù)量分別是大約1-4pmole和約50-200ng。
約50到70個(gè)循環(huán)的染料終止測(cè)序反應(yīng)能應(yīng)用反應(yīng)溶液和GeneAmp PCR System9700(Applied Biosciences制造)進(jìn)行。當(dāng)商業(yè)性可得的試劑盒例如DYEnamic ET Terminator Sequencing Kit被應(yīng)用時(shí)，循環(huán)參數(shù)參照所附的指南。樣本的純化應(yīng)用MultiScreen HV平板(Millipore制造)等根據(jù)Millipore的指南進(jìn)行。純化的反應(yīng)產(chǎn)物用乙醇沉淀，而得到的沉淀被干燥并在暗處以約4℃儲(chǔ)存。干燥的產(chǎn)物應(yīng)用商業(yè)性可得的測(cè)序儀和分析儀例如MegaBACE 1000Sequencing System(Amersham Bioscience制造)和ABI PRISM 3700DNA Analyzer(Applied Biosystems制造)等根據(jù)所附的指南進(jìn)行分析。
(f)基因組序列通過(guò)組裝(其中確定了多個(gè)被測(cè)序的DNA片段的順序)而重建基因組DNA的重建能根據(jù)上述(4)中所得到的DNA片段的序列信息進(jìn)行?；蚪MDNA序列重建的所有操作能在UNIX平臺(tái)上進(jìn)行。Basecall能通過(guò)軟件例如phred(The University of Washington)或類似物被操作，載體序列的屏蔽能通過(guò)軟件例如Cross Match(TheUniversity of Washington)或類似物進(jìn)行，而組裝能通過(guò)軟件例如Phrap(The University of Washington)或類似物進(jìn)行。作為組裝結(jié)果得到的毗連群能應(yīng)用繪圖編輯器例如consed(一個(gè)繪圖編輯器，TheUniversity of Washington)或類似物而被分析。從base call到組裝的系列工作能利用phredPhrap(consed所帶的原本)而全部進(jìn)行。(B)釀酒酵母的全部基因組序列與啤酒糖酵母的那些進(jìn)行的比較(A)中得到的全部基因組序列與啤酒糖酵母的那些所進(jìn)行的比較包括(g)匯編了質(zhì)粒兩個(gè)末端和鳥槍克隆及毗連群的DNA序列中的每一個(gè)與啤酒糖酵母基因組序列的比較數(shù)據(jù)而形成比較數(shù)據(jù)庫(kù)，在啤酒糖酵母基因組序列上繪制了它們的圖譜。
(g)匯編了質(zhì)粒兩個(gè)末端和鳥槍克隆的DNA序列及毗連群的DNA序列之中的每一個(gè)與啤酒糖酵母基因組序列的比較數(shù)據(jù)而形成比較數(shù)據(jù)庫(kù)，在啤酒糖酵母基因組序列上繪制了它們的圖譜。
廣泛應(yīng)用的工業(yè)酵母例如底部發(fā)酵酵母(巴斯德氏糖酵母)已被認(rèn)為是啤酒糖酵母和其密切相關(guān)物種(例如巴揚(yáng)氏糖酵母)的自然雜交體″Int.J.Syst.Bacteriol.volume 35，pages 508-511(1985)″?？紤]到上述，(e)中制得的粘?？寺蓚€(gè)末端的DNA序列通過(guò)同源性搜索算法針對(duì)啤酒糖酵母基因組序列進(jìn)行同源性搜索，其中同源區(qū)域和每一DNA序列與啤酒糖酵母基因組序列的同一性能被測(cè)定，數(shù)據(jù)庫(kù)由此能制得。粘粒DNA序列對(duì)應(yīng)于啤酒糖酵母基因組DNA序列的同一性百分比分布圖的實(shí)例顯示在圖2中。粘粒的DNA序列粗略分為顯示與啤酒糖酵母基因組序列有超過(guò)94％同一性的DNA序列組，和顯示與其有大約84％同一性的DNA序列組。因此，顯示超過(guò)94％同一性的DNA序列被命名為源于啤酒糖酵母的Sc類型DNA，而顯示大約84％同一性的DNA序列被命名為源于啤酒糖酵母密切相關(guān)物種的非Sc類型DNA序列，具有Sc類型DNA序列或非Sc類型DNA序列的基因被分別命名為Sc類型基因或非Sc類型基因。
類似地，(e)中制得的鳥槍克隆兩端的DNA序列與啤酒糖酵母的基因組DNA序列的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)被制備?；趶闹频玫谋容^性數(shù)據(jù)庫(kù)得到的信息，進(jìn)行粘?？寺『网B槍克隆在啤酒糖酵母基因組序列上的圖譜繪制(參見(jiàn)，例如圖3)。(f)中制得的毗連群的DNA序列與啤酒糖酵母基因組序列的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)也被制備，而圖譜繪制被完成。雖然圖譜繪制技術(shù)幾乎與上述提及的那種相同，但當(dāng)毗連群通過(guò)來(lái)自相同粘粒和鳥槍克隆的配對(duì)的正向-反向DNA序列連接時(shí)，那些毗連群被連接(參見(jiàn)，例如圖4)。
(C)與啤酒糖酵母的基因所編碼的氨基酸序列具有70到97％同一性的底部發(fā)酵酵母的氨基酸序列的編碼基因的選出對(duì)與啤酒糖酵母的基因所編碼的氨基酸序列具有70到97％同一性的底部發(fā)酵酵母的氨基酸序列的編碼基因進(jìn)行選擇的方法包括(h)鑒別ORF(開(kāi)放閱讀框)和功能分配的方法。
(h)ORF和其功能分配的鑒別對(duì)(f)中所組裝的DNA序列中的ORF的鑒別被完成。優(yōu)選的實(shí)施例在下面具體提及。關(guān)于起始密碼子和終止密碼子所包圍的一定長(zhǎng)度DNA序列(例如不少于150個(gè)堿基)，能應(yīng)用程序例如用于在六種閱讀框包括互補(bǔ)序列中鑒別ORF類型的ORF發(fā)現(xiàn)者(http//www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)或類似物，進(jìn)行對(duì)存在于(f)中所組裝的DNA序列中的ORF的鑒別。
所鑒別的ORF編碼的蛋白質(zhì)的功能分配，能應(yīng)用例如BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)或類似物針對(duì)啤酒糖酵母的ORF的氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索，所述啤酒糖酵母的ORF的氨基酸序列已在Saccharomyces Genome Database(SGDhttp//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)登記和公布。
另一方面，有可能通過(guò)基于DNA微陣列的比較性基因組雜交和PCR而分析釀酒酵母的染色體結(jié)構(gòu)。
酵母基因組DNA應(yīng)用Quiagen Genomic Tip 100/G(10243)和Qiagen Genomic DNA Buffer Set(19060)根據(jù)試劑盒所附的指南被制備。DNA(10μg)用DNaseI(Invitrogen制造)根據(jù)Winzeler等人的方法(Science，volume 281，pages 1194-1197(1998))而消化，應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶(Roche制造)而生物素化，并與DNA微陣列(Affymetrix Gene ChipYeast Genome S98 Array)雜交。雜交和微陣列的信號(hào)強(qiáng)度的探測(cè)應(yīng)用Gene Chip Analysis Basic System和Affymetrix制造的分析軟件(Microarray Suite 5.0)進(jìn)行。
與釀酒酵母DNA雜交的每一探針的信號(hào)應(yīng)用分析軟件(Microarray Suite 5.0)相對(duì)于單倍體實(shí)驗(yàn)室酵母株S288C的信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并以信號(hào)對(duì)數(shù)比(2n)顯示。信號(hào)對(duì)數(shù)比應(yīng)用電子制表軟件(Microsoft Excel 2000)按每一染色體中的基因順序畫出線條，而信號(hào)對(duì)數(shù)比以柱狀圖顯示(參見(jiàn)，例如圖5)。非Sc類型基因不與啤酒糖酵母陣列雜交，因此，Sc類型基因用量影響信號(hào)對(duì)數(shù)比，而信號(hào)對(duì)數(shù)比顯示急劇改變處的點(diǎn)被認(rèn)為是在Sc類型和非Sc類型染色體之間的易位位置。
嵌合染色體結(jié)構(gòu)能被PCR所證實(shí)，其中源自釀酒酵母的基因組DNA被用作模板，而Sc類型和非Sc類型鳥槍序列被用作引物。
PCR根據(jù)所附指南應(yīng)用Takara PCR Thermal Cycler SP并使用所附的Takara LA TaqTM和緩沖液完成。
作為PCR的結(jié)果，通過(guò)0.8％瓊脂糖電泳證實(shí)了來(lái)自釀酒酵母的一定長(zhǎng)度的DNA片段被擴(kuò)增。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室菌株的啤酒糖酵母的基因組DNA被用作PCR模板時(shí)，沒(méi)有DNA片段的擴(kuò)增被探測(cè)到。如果擴(kuò)增自釀酒酵母的DNA片段兩個(gè)末端的DNA序列被進(jìn)一步確證，它將與通過(guò)鳥槍方法測(cè)定的基因組序列一致，而且可以證實(shí)這一區(qū)域內(nèi)部發(fā)生了Sc類型和非Sc類型染色體之間的易位，嵌合染色體通過(guò)所述易位而形成。
(D)源自底部發(fā)酵酵母的基因的功能分析基因功能分析的階段包括(i)基因的選出，(i′)基因的克隆，(j)通過(guò)破壞對(duì)基因進(jìn)行功能分析，及(k)通過(guò)過(guò)表達(dá)對(duì)基因進(jìn)行功能分析。
(i)基因的選出對(duì)于選出基因進(jìn)行功能分析的方法，沒(méi)有特別限制，而優(yōu)選的方法是，例如，應(yīng)用上述(h)中得到的功能分配的方法和應(yīng)用如下所述的DNA微陣列的方法。應(yīng)用DNA微陣列的方法是，例如，進(jìn)行基因表達(dá)分析以鑒別基因，所述基因在某些條件下顯示特征性的表達(dá)特性；或者通過(guò)探測(cè)探針信號(hào)強(qiáng)度的差異進(jìn)行比較性基因組雜交以鑒別基因，該基因具有不同的拷貝數(shù)目或不同的DNA序列。
(i′)基因的克隆上述(i)中選出的基因能根據(jù)例如Molecular Cloning，ThirdEdition中提及的普通方法從底部發(fā)酵酵母得到。也就是，具有該基因鄰近序列的寡核苷酸被合成，而普通PCR克隆方法應(yīng)用從底部發(fā)酵酵母制得的基因組DNA作為模板進(jìn)行，由此所選出的基因能被分離和得到。關(guān)于這樣得到的DNA序列，例如有SEQ ID NO1或NO2。
當(dāng)基因被命名為例如基因①時(shí)，基因①或用于通過(guò)PCR方法擴(kuò)增基因①的引物也可基于上述序列信息而應(yīng)用多核苷酸合成儀合成。此外，基因①不僅表示具有與基因①相同DNA序列的DNA片段，也表示在嚴(yán)格條件下與上面的基因雜交的DNA片段。在嚴(yán)格條件下雜交的DNA片段表示通過(guò)菌落雜交方法、斑塊雜交方法、southern印跡雜交方法或類似方法，應(yīng)用包含上面所鑒別的基因①序列的DNA片段作為探針而得到的DNA片段。具體而言，如下DNA片段可被列出顯示出與基因①的DNA序列至少具有不少于60％的同一性，優(yōu)選與其具有不少于80％的同一性，而更優(yōu)選與其具有不少于95％的同一性。雜交可根據(jù)″Molecular Cloning，Third Edition″，″Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997)(在此之后縮寫為Current Protocols in Molecular Biology)，″DNA Cloning 1Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，OxfordUniversity(1995)″等資料中提及的方法進(jìn)行。
更具體而言，含有上述全長(zhǎng)基因①的鳥槍克隆能應(yīng)用(g)中得到的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)并基于同源性和位置信息等而獲得。當(dāng)鳥槍文庫(kù)中沒(méi)有包含所述全長(zhǎng)基因的克隆時(shí)，編碼所述全長(zhǎng)基因的DNA片段通過(guò)PCR方法制備。例如，含有上述基因的DNA片段應(yīng)用以SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所代表的合成的DNA引物對(duì)而得到。類似地，應(yīng)用基于公布的SGD信息所設(shè)計(jì)的引物對(duì)，并應(yīng)用啤酒糖酵母或底部發(fā)酵酵母的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，由此制備對(duì)應(yīng)于非Sc類型基因的全長(zhǎng)Sc類型基因。例如，應(yīng)用SEQ ID NO15和NO16的合成的寡核苷酸作為引物對(duì)，含有Sc類型基因的DNA片段能被得到。
按上述所制備的Sc或非Sc類型的DNA片段被插入，例如，附于TA克隆試劑盒(Invitrogen)的pCR 2.1-TOPO載體(應(yīng)用了TA克隆試劑盒或類似物)，由此制備了分別包含具有Sc和非Sc類型基因的DNA片段的重組載體TOPO/Sc基因和TOPO/非Sc基因。Sc和非Sc類型DNA片段的DNA序列能通過(guò)Sanger的方法(″F.Sanger，Science，volume 214，page 1215，1981″)證實(shí)。
(j)通過(guò)破壞對(duì)基因進(jìn)行功能分析根據(jù)文獻(xiàn)″Goldstein，等人，Yeast，volume 15，page 1541，(1999)″的方法，有可能通過(guò)PCR制備用于基因破壞的DNA片段，其中含有藥物抗性基因的質(zhì)粒(例如pFA 6a(G418r)，pAG 25(nat1))被用作模板。作為PCR的引物對(duì)，非-ScSSU1_for(SEQ ID NO17)/非-ScSSU1_rv(SEQ ID NO18)或類似物被用于非-ScSSU1破壞，而對(duì)于Sc SSU1破壞，ScSSU1_for(SEQ ID NO19)/ScSSU1_rv(SEQ IDNO20)或類似物被應(yīng)用。對(duì)于非Sc類型基因破壞，也有可能應(yīng)用質(zhì)粒例如pPGAPAUR(AUR1-C)和引物對(duì)例如非-ScSSU1_for+pGAPAUR(SEQ ID NO21)/非-ScSSU1_rv+AURI-C(SEQ ID NO22)。
底部發(fā)酵酵母以通過(guò)上述方法制得的用作基因破壞的DNA片段轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化可遵循Japanese Patent Laid-Open Gazette No.07/303,475中提及的方法。進(jìn)一步地，用于選擇轉(zhuǎn)化子的藥物的濃度可通過(guò)探查用作受體的酵母的敏感性而恰當(dāng)?shù)卮_定。
關(guān)于在此制得的轉(zhuǎn)化子，已應(yīng)用Southern分析證實(shí)每一藥物抗性基因被引入而所述基因被正確地破壞。具體而言，從親代菌株和轉(zhuǎn)化子提取的基因組DNA首先被適當(dāng)?shù)南拗菩悦杆?，以區(qū)分Sc和非Sc類型基因(例如37℃下18小時(shí))，然后用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移到膜上。之后，它們與對(duì)Sc類型或非Sc類型基因特異的探針雜交，例如根據(jù)Alkphos Direct Labelling Reagents(Amersham)的方案在55℃下18小時(shí)，而信號(hào)通過(guò)CDP-Star探測(cè)。
(i′)中得到的基因的功能能通過(guò)應(yīng)用親代菌株和上述(j)中制得的SSU1破壞體的發(fā)酵試驗(yàn)及比較它們的發(fā)酵特性而被證實(shí)。發(fā)酵試驗(yàn)?zāi)鼙煌瓿桑缭谙旅娴臈l件下應(yīng)用麥芽汁進(jìn)行初始提取物約10-15％發(fā)酵規(guī)模1-3升溶解的氧濃度約8-10ppm發(fā)酵溫度約15℃接種率約4-6g濕酵母細(xì)胞/L麥芽汁被定時(shí)取樣，并對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)(OD 600)，表觀提取值，參與(i′)中所得到基因的功能的物質(zhì)的濃度等進(jìn)行分析。例如，當(dāng)(i′)中所得到基因的功能參與亞硫酸釋放時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中麥芽汁里的亞硫酸濃度被分析。亞硫酸的定量分析以如下方式進(jìn)行，即亞硫酸通過(guò)在酸性條件下的蒸餾被捕獲在過(guò)氧化氫溶液中，并以堿進(jìn)行滴定(theBrewing Society of Japan的用于BCOJ啤酒分析的修訂方法)。
(k)通過(guò)過(guò)表達(dá)對(duì)基因進(jìn)行功能分析包含非Sc類型全長(zhǎng)基因的DNA片段通過(guò)合適的限制性酶從(i′)中制得的質(zhì)粒TOPO/非Sc基因切離。它被插入用于基因表達(dá)的載體例如pNI-NUT的克隆位點(diǎn)以構(gòu)建用于非Sc類型基因過(guò)表達(dá)的載體(pYI-非Sc類型基因)。載體pNI-NUT包含作為同源重組位點(diǎn)的URA3和作為選擇標(biāo)記的諾爾絲抗性基因(nat1)及氨芐青霉素抗性基因(Ampr)。另一方面，用于Sc類型基因(pNI-Sc類型基因)過(guò)表達(dá)的載體具有一定結(jié)構(gòu)，在所述結(jié)構(gòu)中上述pYI-非Sc類型基因被相應(yīng)Sc類型基因所替代。對(duì)于此處引入的Sc或非Sc類型基因的過(guò)表達(dá)，優(yōu)選被組成性表達(dá)的基因的啟動(dòng)子和終止子所驅(qū)動(dòng)，例如甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)。
底部發(fā)酵酵母應(yīng)用由上述方法所制得的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化通過(guò)Japanese Patent Laid-Open Gazette No.07/303,475中提及的方法進(jìn)行，而轉(zhuǎn)化子在合適的選擇性培養(yǎng)基上選出。過(guò)表達(dá)的證實(shí)可通過(guò)RT-PCR方法等進(jìn)行?？俁NA的提取可應(yīng)用RNeasy Mini Kit(Qiagen)或類似物根據(jù)試劑盒所附的“用于從酵母中分離總RNA”的指南進(jìn)行。例如，有可能應(yīng)用ScSSU1_for331(SEQ ID NO23)/ScSSU1_982rv(SEQ ID NO24)和非Sc-SSU1_for329(SEQ ID NO25)/非Sc-SSU1_981rv(SEQ ID NO26)作為特異性引物對(duì)分別用于Sc和非ScSSU1基因的擴(kuò)增。為擴(kuò)增作為內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)的組成性表達(dá)的基因，例如PDA1，PDA1_for1(SEQ ID NO27)/PDA1_730rv(SEQ ID NO28)等可用作特異性引物對(duì)。PCR產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并用溴乙錠染色探測(cè)。所述基因在轉(zhuǎn)化子中的過(guò)表達(dá)通過(guò)PCR產(chǎn)物的數(shù)量比較而證實(shí)。
(i′)中得到的基因的功能分析能通過(guò)應(yīng)用親代菌株和上面(k)中制得的過(guò)表達(dá)菌株的發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行。發(fā)酵試驗(yàn)可在(j)中提及的條件下進(jìn)行。
根據(jù)(j)中提及的相同方法，麥芽汁被定時(shí)取樣并監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)(OD600)，表觀提取值和參與(i′)中所得基因功能的物質(zhì)的濃度。
關(guān)于通過(guò)本發(fā)明的篩選方法得到的DNA，可以提及含有上面得到的非Sc類型基因的DNA序列的DNA和與所述DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA。
通過(guò)本發(fā)明的篩選方法得到的DNA包括單鏈和雙鏈的DNA，雖然它們是不受限的。與包含上面得到的非Sc類型基因的DNA序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA包括所述基因編碼的蛋白質(zhì)的密碼子的簡(jiǎn)并突變體。簡(jiǎn)并突變體表示通過(guò)密碼子簡(jiǎn)并而編碼相同氨基酸序列的多核苷酸片段，雖然在DNA序列方面，它不同于被本發(fā)明所選出的非Sc類型的DNA序列。
其具體實(shí)例是具有由SEQ ID NO1或2所顯示的序列的DNA，在嚴(yán)格條件下與所述DNA雜交的DNA，等。在嚴(yán)格條件下雜交的DNA表示通過(guò)菌落雜交方法、斑塊雜交方法、southern印跡雜交方法或類似方法，應(yīng)用具有本文上面鑒別出的非Sc類型序列的DNA作為探針而制得的DNA。
雜交可根據(jù)″Molecular Cloning，Third Edition″，″CurrentProtocols in Molecular Biology″，″DNA Cloning 1CoreTechniques，A Practical Approach，Second Edition，OxfordUniversity(1995)″等提及的方法進(jìn)行?？呻s交的DNA的具體實(shí)例是當(dāng)通過(guò)用于同源性搜索的軟件例如FASTA，BLAST(Smith-Waterman″Meth.Enzym.，volume 164，page 765(1988)″)等應(yīng)用默認(rèn)設(shè)置(初始設(shè)置)的參數(shù)進(jìn)行計(jì)算時(shí)，與SEQ ID NO1或2中所顯示的DNA序列具有至少不少于60％同一性的DNA，優(yōu)選具有不少于80％同一性的DNA，而更優(yōu)選具有不少于95％同一性的DNA。
通過(guò)本發(fā)明的篩選方法得到的DNA的實(shí)例是包含SEQ ID NO3或4所顯示氨基酸序列的多肽的編碼DNA或在嚴(yán)格條件下與所述DNA雜交的DNA。
通過(guò)本發(fā)明的篩選方法得到的DNA所編碼的多肽的實(shí)例是包含上面所得ORF的DNA序列的DNA編碼的多肽，和在嚴(yán)格條件下與所述DNA雜交的DNA編碼的多肽，或包含SEQ ID NO3或4所顯示的氨基酸序列的多肽。
進(jìn)一步地，包含一定氨基酸序列的多肽也包括在本發(fā)明中，在所述氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被缺失和/或替代和/或添加且所述氨基酸序列具有與所述多肽本質(zhì)上相同的活性。表述“與所述多肽本質(zhì)上相同的活性”表示此活性與以在缺失、替代或添加之前多肽固有的酶活性或功能所代表的活性相同。所述多肽能通過(guò)″Molecular Cloning，Third Edition″，″Current Protocols inMolecular Biology″，″Nuc.Acids.Res.，volume 10，page 6487(1982)″，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，volume 79，page 6409(1982)″，″Gene，volumn 34，page 315(1985)″，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，volume 82，page 488(1985)″等所提及的位點(diǎn)特異性突變引入法而制備。例如，它能通過(guò)引入位點(diǎn)特異性突變到包含SEQ ID NO3或4所顯示氨基酸序列的多肽的編碼DNA中而被制備。雖然對(duì)缺失和/或替代和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)目沒(méi)有特別的限制，但數(shù)目是在這樣的程度之內(nèi)，即能通過(guò)已知方法例如上述位點(diǎn)特異性突變方法而缺失和/或替代和/或添加的程度，也就是一個(gè)到數(shù)十個(gè)，優(yōu)選1到20，更優(yōu)選1到10，仍更優(yōu)選的是1到5。
本發(fā)明的多肽氨基酸序列中出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失和/或替代和/或添加表示在同一序列的氨基酸序列的任意一個(gè)或多個(gè)位置存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失和/或替代和/或添加。那些缺失和/或替代和/或添加可同時(shí)發(fā)生，而替代或添加的氨基酸殘基可以是自然發(fā)生的類型或非自然發(fā)生類型。自然類型的氨基酸殘基的實(shí)例是L-丙氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酰胺，L-谷氨酸，甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-纈氨酸和L-半胱氨酸等。
能互相替代的氨基酸殘基的實(shí)例將在下面顯示。同一組中的氨基酸殘基可互相替代。
A組亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，正纈氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，0-甲基絲氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸和環(huán)己基丙氨酸。
B組天冬氨酸，谷氨酸，異天冬氨酸，異谷氨酸，2-氨基己二酸和2-氨基辛二酸。
C組天冬酰胺和谷氨酰胺。
D組賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸，2，4-二氨基丁酸和2，3-二氨基丙酸。
E組脯氨酸，3-羥脯氨酸和4-羥脯氨酸。
F組絲氨酸，蘇氨酸和高絲氨酸。
G組苯丙氨酸和酪氨酸。
為了使得到的突變后多肽的活性與突變前多肽的活性本質(zhì)上相同，當(dāng)以用于分析的軟件例如BLAST和FASTA并應(yīng)用默認(rèn)設(shè)置(初始設(shè)置)進(jìn)行計(jì)算時(shí)，優(yōu)選突變后的多肽與突變前多肽的氨基酸序列具有至少60％或更多，通常80％或更多，或者尤其是95％或更多的同一性。
也有可能通過(guò)化學(xué)合成方法例如Fmoc法(芴基甲氧基羰基方法)、tBoc法(叔丁氧基羰基方法)等生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。有可能進(jìn)一步通過(guò)應(yīng)用Advanced ChemTech，Perkin-Elmer，Pharmacia，ProteinTechnology Instrument，Synthecell-Vega，PerSeptive，Shimadzu等制造的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
當(dāng)本發(fā)明的方法被應(yīng)用時(shí)，有可能測(cè)定工業(yè)酵母的全部基因組序列，鑒別工業(yè)酵母的有用基因，及確定所述基因的功能。存在許多如下情形工業(yè)酵母中的基因在工業(yè)上有用，而當(dāng)基因基于確定的功能被分類時(shí)，酵母的特性被闡明，并且用于工業(yè)酵母培育的寶貴信息能被得到。例如，當(dāng)工業(yè)酵母是釀酒酵母，那么在酒精飲料生產(chǎn)中參與產(chǎn)量增加和風(fēng)味改善的基因被鑒別，且萬(wàn)一基因?qū)Ξa(chǎn)量增加或風(fēng)味改善無(wú)益時(shí)，基因表達(dá)被基因的破壞、反義方法或RNAi方法(參考，例如，非專利文獻(xiàn)10)所抑制，由此可以培育顯示極佳釀造特性的酵母。如果基因?qū)Ξa(chǎn)量增加、風(fēng)味改善等有利，那么基因?qū)?huì)，例如，在酵母中過(guò)表達(dá)，由此可以培育顯示工業(yè)上有用的極佳的釀造特性的釀酒酵母。
通過(guò)本發(fā)明篩選方法得到的基因被用于培育有用酵母的實(shí)例顯示如下。
如上述已經(jīng)提及的，當(dāng)產(chǎn)品中的亞硫酸濃度增加時(shí)，有可能生產(chǎn)具有極佳風(fēng)味穩(wěn)定性的產(chǎn)品。因此，如果通過(guò)本發(fā)明篩選方法得到的基因?qū)喠蛩岬漠a(chǎn)生和外流作出貢獻(xiàn)，則下述現(xiàn)在成為可能轉(zhuǎn)化子被培養(yǎng)并表達(dá)所述基因，而作為產(chǎn)品中亞硫酸濃度增加的結(jié)果，產(chǎn)生具有極佳風(fēng)味穩(wěn)定性的產(chǎn)品。
已知底部發(fā)酵酵母將從細(xì)胞外吸取的硫酸離子還原成亞硫酸離子(SO32-)。然而，亞硫酸抑制甘油醛-3-磷酸脫氫酶并降低細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度，因此，酵母具有排出亞硫酸的功能以便過(guò)量的亞硫酸不會(huì)在細(xì)胞中積累。SSU1是已被分離出并顯示能互補(bǔ)亞硫酸敏感性突變(參考，例如，非專利文獻(xiàn)11)的基因。SSU1基因產(chǎn)物包含485個(gè)氨基酸殘基，結(jié)構(gòu)分析暗示它是具有9-10跨膜結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運(yùn)體(參考，例如，非專利文獻(xiàn)12)。此外，作為應(yīng)用SSU1過(guò)表達(dá)菌株的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，SSU1基因產(chǎn)物參與排出亞硫酸已經(jīng)得到證明(參考，例如，非專利文獻(xiàn)13)。
底部發(fā)酵酵母通常具有亞硫酸的高產(chǎn)生能力，而表層發(fā)酵酵母則很少產(chǎn)生亞硫酸。通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的篩選方法，除了在頂部和底部發(fā)酵酵母中都存在的ScSSU1基因之外，也有可能選出對(duì)底部發(fā)酵酵母特異的非ScSSU1基因。類似地，在編碼參與亞硫酸產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的MET14基因的情形中，也可能選出對(duì)底部發(fā)酵酵母特異的非ScMET14。例如，底部發(fā)酵酵母特異的非ScSSU1和非ScMET14的功能強(qiáng)烈參與亞硫酸的高生產(chǎn)能力，其特異于底部發(fā)酵酵母，為了培育顯示更高亞硫酸生產(chǎn)能力的酵母，強(qiáng)化那些非ScSSU1基因、非ScMET14等是有效的。
那些非ScSSU1基因和非ScMET14被強(qiáng)化的酵母培育方法在實(shí)施例中具體提及。
關(guān)于在本發(fā)明篩選方法所選出基因的引入中用作受體的酵母，沒(méi)有特別的限制，只要它是釀造可用的酵母，而現(xiàn)在被廣泛用作釀酒酵母的任何酵母例如啤酒酵母，包括BH 84，NBRC 1951，NBRC 1952，NBRC1953和NBRC 1954都可被應(yīng)用。此外，威士忌酵母(例如啤酒糖酵母NCYC 90)，葡萄酒酵母(例如葡萄酒酵母Kyokai No.1，No.3，No.4等)和日本米酒酵母(例如日本米酒酵母Kyokai No.7，No.9等)也可被應(yīng)用。
關(guān)于用于將基因引入上述受體的載體，沒(méi)有特別的限制，只要它是能在酵母中表達(dá)基因的載體，而任何多拷貝質(zhì)粒(YEp型)、單拷貝質(zhì)粒(Ycp型)和染色體DNA整合質(zhì)粒(Yip型)都可被應(yīng)用。YEp載體的實(shí)例是YEp 51(J.R.Broach等，Experimental Manipulation of GeneExpression，Academic Press，New York，83，1983)等；YCp載體的實(shí)例是YCp 50(M.D.Rose等，Gene，volume 60，page 237，1987)等；而YIp載體的實(shí)例是YIp 5(K.Struhl，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，volume 76，page 1035，1979)等。那些質(zhì)粒已被投入市場(chǎng)而很容易獲得。
上述載體可具有其它用于調(diào)控基因在酵母中表達(dá)的序列，例如啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子、沉默子、核糖體結(jié)合序列、終止子等。關(guān)于基因組成性表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子，沒(méi)有特別限制，只要它在釀酒酵母中發(fā)揮功能并獨(dú)立于產(chǎn)物中的亞硫酸濃度，任何組合都可被應(yīng)用。至于啟動(dòng)子，例如，有可能應(yīng)用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(TDH3)基因的啟動(dòng)子，磷酸甘油酸激酶(PGK1)基因的啟動(dòng)子等。那些啟動(dòng)子已為人知，例如，PGK1基因在公開(kāi)已知的文獻(xiàn)例如M.F.Tuite等，EMBOJ.，volume 1，page 603(1982)中被詳細(xì)提及，且很容易獲得。
調(diào)節(jié)所引入基因的表達(dá)的上述其它序列并不一定要由載體提供，只要通過(guò)本發(fā)明的篩選方法得到的DNA包括了它們。當(dāng)這類其它序列不被包含在所述DNA中時(shí)，優(yōu)選其它序列被分別制備并連接到所述DNA。或者，甚至在需要更高表達(dá)水平或表達(dá)的特異調(diào)節(jié)的情形中，適合這一目的的其它序列也被連接到所述DNA。
上面的載體轉(zhuǎn)化到受體中的方法可按照已知的程序進(jìn)行。例如，下面的方法可被應(yīng)用電穿孔方法″Meth.Enzym.，volume 194，page182(1990)″，原生質(zhì)球方法″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，volume 75，page 1929(1978)″，醋酸鋰方法″J.Bacteriology，volume 153，page163(1983)″，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，volume 75，page1929(1978)″中提及的方法，等。
更具體而言，受體被培養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(例如YEPD培養(yǎng)基″Genetic Engineering，vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)″，等)中以便600nm處的吸收值成為1-6。細(xì)胞通過(guò)離心收集，清洗，并以堿金屬離子或優(yōu)選濃度為約1M-2M的鋰離子進(jìn)行預(yù)處理。細(xì)胞在約30℃培育約60分鐘后，它們與將被引入的DNA(約1-20ug)在約30℃一起培育約60分鐘。聚乙二醇或優(yōu)選約4,000道爾頓的聚乙二醇被加入而最終濃度將是約20％-50％。培育在約30℃進(jìn)行約30分鐘后，細(xì)胞被進(jìn)行約42℃下大約5分鐘的加熱處理。優(yōu)選細(xì)胞懸浮液以標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基清洗，并被放置在預(yù)定量的新鮮標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，然后在約30℃培育約1小時(shí)。培育后，它被鋪展在合適的選擇性培養(yǎng)基平板上。
除上述之外，對(duì)于一般性克隆技術(shù)，參考″Molecular Cloning，Third Edition″，″Methods in Yeast Genetics，A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)″，等。
關(guān)于用于轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記，在釀酒酵母的情形中不可能應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，因此，G 418-抗性基因(G418r)，銅-抗性基因(CUP 1)″M.Marin，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，volume 81，page337，1984″，serulenin-抗性基因(fas2m，PDR 4)″Atsushi Inogoshi，等人，Seikagaku，volume 64，page 660，1992″，″M.Hussain，等人，Gene，volume 101，page 149，1991″，等可被應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明培育的釀酒酵母并非與親代菌株在酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵能力方面有差異。因此，原料、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)控制等可與傳統(tǒng)方法中的那些完全相同，這是本發(fā)明的一個(gè)重要方面。然而不言而喻的是，如果需要，條件如發(fā)酵周期可依個(gè)案而改變。例如，當(dāng)釀酒酵母的亞硫酸排出能力被強(qiáng)化且酒精飲料應(yīng)用這種酵母生產(chǎn)時(shí)，只有產(chǎn)品中的亞硫酸含量發(fā)生變化，與應(yīng)用親代菌株的情形之間在酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵能力方面的差異也就不存在。因此，原料、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)控制等可與傳統(tǒng)方法中的那些完全相同，而亞硫酸含量增加且風(fēng)味被改善的酒精飲料生產(chǎn)的成本沒(méi)有增加。
(E)本發(fā)明的DNA陣列的生產(chǎn)本發(fā)明的DNA陣列能基于上面(f)中得到的ORF的DNA序列信息而產(chǎn)生。實(shí)例包括包含固體支持物的DNA陣列，以下多核苷酸中的至少一種附著于所述固體支持物包含上面(f)項(xiàng)得到的DNA序列的多核苷酸；在嚴(yán)格條件下與所述多核苷酸雜交的多核苷酸；及包含所述多核苷酸的DNA序列中10到200個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。實(shí)例還包括包含固體支持物的DNA陣列，以下多核苷酸中的至少一種附著于所述固體支持物編碼包含如上面(h)所得氨基酸序列的多肽的多核苷酸；在嚴(yán)格條件下與所述多核苷酸雜交的多核苷酸；包含所述多核苷酸的DNA序列中10到200個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸；及包含從上面(h)推導(dǎo)出的兩個(gè)ORF間的基因間DNA序列的多核苷酸。
本發(fā)明的DNA陣列包括本領(lǐng)域已知的基底層如DNA芯片、多核苷酸陣列及DNA微陣列和DNA巨陣列(macroarray)，或類似物，并包含固體支持物和附著于固體支持物表面的片段的多個(gè)多核苷酸。作為附著于固體支持物的多核苷酸或寡核苷酸，上面(f)項(xiàng)和(h)項(xiàng)中得到的本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸能被應(yīng)用。下述的分析能通過(guò)將多核苷酸或寡核苷酸以高密度附著至固體支持物而有效完成，雖然高固定密度并非總是必需。實(shí)現(xiàn)高密度的裝置如陣列機(jī)器人或類似物可商業(yè)性地從Takara Shuzo(GMS417 Arrayer)獲得，而商業(yè)性可得的產(chǎn)品能被應(yīng)用。本發(fā)明的寡核苷酸也能在固體支持物上通過(guò)光蝕刻方法或類似方法(Nat.Genet.21，20-24(1999))被直接合成。在此方法中，能由光照射除去的具有保護(hù)性基團(tuán)的連接物被首先附著于固體支持物如載玻片或類似物。然后，它通過(guò)遮光板(mask)(光蝕刻遮光板)(允許光只在附著部分的確定部分透過(guò))被光照射。接下來(lái)，具有能由光照射除去的保護(hù)性基團(tuán)的寡核苷酸被加到這部分。因此，核苷酸的連接反應(yīng)只出現(xiàn)在被照射部分。通過(guò)重復(fù)此程序，每一個(gè)都具有所需序列的彼此不同的寡核苷酸能在各自的部分被合成。通常，將被合成的寡核苷酸具有10到30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。用于DNA陣列生產(chǎn)的方法沒(méi)有特別的限制，而此方法可根據(jù)已知的方式被操作，而它們所有類型中優(yōu)選的方法在下面被提及。
(l)DNA陣列的產(chǎn)生(l)-1固體支持物多核苷酸或片段能附著于其表面的任何材料都能用作本發(fā)明DNA陣列的固體支持物。固體支持物的材料和形狀沒(méi)有特別的限制，而優(yōu)選的材料是某些作為材料的香樹(shù)脂例如聚碳酸酯、塑料或類似物，作為固態(tài)的材料和板樣和膜樣。
(l)-2寡核苷酸的選擇將被固定在本發(fā)明DNA陣列的平板上的寡核苷酸的實(shí)例如下?；谏厦?h)中得到的ORF的DNA序列和/或從上面(h)推導(dǎo)來(lái)的基因間DNA序列，獨(dú)有和互補(bǔ)性的針對(duì)釀酒酵母全基因組序列的探針(PMProbe；Perfect Match Probe)能應(yīng)用產(chǎn)生探針的一定方法如GeneChip(Affymetrix)技術(shù)或類似物而設(shè)計(jì)。這些探針的實(shí)例是(i)寡核苷酸，其具有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的開(kāi)放閱讀框中的核苷酸，該核苷酸不存在于所述全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸序列區(qū)域之外的區(qū)域中，(ii)寡核苷酸，其具有(i)中所述寡核苷酸的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列，(iii)在嚴(yán)格條件下與(i)和(ii)中所述寡核苷酸雜交的寡核苷酸。這些探針的其它實(shí)例是(iv)寡核苷酸，其具有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的非編碼區(qū)域中的核苷酸，該核苷酸不存在于所述全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸序列區(qū)域之外的區(qū)域中，(v)具有(iv)中所述寡核苷酸的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸，(vi)在嚴(yán)格條件下與(iv)和(v)中所述寡核苷酸雜交的寡核苷酸。這些寡核苷酸的核苷酸數(shù)目沒(méi)有限制，但優(yōu)選10到30個(gè)核苷酸。每個(gè)座位可以設(shè)計(jì)11-50個(gè)探針，但主要集中于每個(gè)座位的3′引物側(cè)，因?yàn)槊總€(gè)座位使用多套探針能在探測(cè)和數(shù)據(jù)分析中提供冗余度，能減輕偶爾發(fā)生的交叉雜交所潛在的混淆效應(yīng)，可以使所有探針不必為了獲得定量信息而進(jìn)行相同的雜交。為進(jìn)一步增加探測(cè)的敏感度和特異性，每一PM探針能根據(jù)密切相關(guān)的錯(cuò)配探針(MM探針)而被設(shè)計(jì)，除了一個(gè)錯(cuò)配堿基也就是堿基13外，所述錯(cuò)配探針與PM探針一樣。在本發(fā)明中應(yīng)用的寡核苷酸的優(yōu)選長(zhǎng)度是26個(gè)堿基，但不存在對(duì)于寡核苷酸長(zhǎng)度的特殊限制。
(l)-3將寡核苷酸附著于固體支持物對(duì)于用來(lái)將寡核苷酸附著于固體支持物的方法，不存在特殊限制，此方法可根據(jù)已知的方式被操作，而優(yōu)選的方法在下面提及。例如，所有按上面((1)-2)設(shè)計(jì)的PM和MM探針能應(yīng)用一定方法如GeneChip技術(shù)或類似物而被附著于固體支持物表面以產(chǎn)生DNA陣列。
對(duì)于應(yīng)用DNA微陣列的分析所用的方法，不存在特殊限制，而對(duì)于它們每一個(gè)而言是優(yōu)選的方法在下面提及，也就是，用于鑒別在一定條件下顯示出特征性的表達(dá)特性的基因的基因表達(dá)分析、工業(yè)酵母的分類、核苷酸多態(tài)性的探測(cè)及選擇進(jìn)行功能分析的基因的實(shí)例在下面提及。
(m)基因表達(dá)分析釀酒酵母的基因表達(dá)分析能應(yīng)用本發(fā)明的根據(jù)(1)中所述方法而產(chǎn)生的DNA陣列進(jìn)行。應(yīng)用DNA陣列，根據(jù)培養(yǎng)基以及環(huán)境的變化，有可能鑒別高度可誘導(dǎo)或可還原的基因。也有可能應(yīng)用DNA陣列在釀造中鑒別Larger釀酒酵母的特異性基因。但不限于這些實(shí)例。
基因表達(dá)分析包括工業(yè)酵母的培養(yǎng)，mRNA的制備，標(biāo)記的cRNA(或cDNA)的合成，雜交和數(shù)據(jù)分析。對(duì)于基因表達(dá)分析的方法，不存在特殊限制，而對(duì)它們每一個(gè)而言是優(yōu)選的方法在下面提及。
(m)-1在多種條件下培養(yǎng)工業(yè)酵母工業(yè)酵母能在用于任何目的的多種條件下培養(yǎng)。例如，用于鑒別對(duì)培養(yǎng)基的組成變化起反應(yīng)的基因的培養(yǎng)能按下述進(jìn)行。工業(yè)酵母能在富含鋅的培養(yǎng)基如LZMM培養(yǎng)基+40μM硫酸鋅中于30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。LZMM培養(yǎng)基含有0.17％酵母氮基w/o氨基酸(DIFCO制造)，0.5％硫酸銨，20mM檸檬酸鈉(pH 4.2)，125μM MnCl2，10μM FeCl2，2％麥芽糖，10mM EDTA(pH 8.0)或類似物。收集細(xì)胞并以消毒過(guò)的蒸餾水清洗三次。足量的細(xì)胞在以下培養(yǎng)基中接種到光學(xué)密度(OD600)為0.25或類似1)除去鋅的培養(yǎng)基(LZMM培養(yǎng)基)或類似物，2)加入鋅的培養(yǎng)基(LZMM+40uM硫酸鋅)或類似物，3)氧化壓力培養(yǎng)基(LZMM+40uM硫酸鋅+2mM H2O2)或類似物，4)缺少碳源的培養(yǎng)基(從上面LZMM+40uM硫酸鋅中除去了麥芽糖)或類似物。細(xì)胞在30℃下生長(zhǎng)6小時(shí)左右，并被收集用于RNA制備。啤酒發(fā)酵條件下從發(fā)酵試管中提取出的細(xì)胞能被用于下面的實(shí)驗(yàn)。
(m)-2 mRNA的制備總RNA的制備能應(yīng)用RNeasyMini Kit(QIAGEN制造)或類似物根據(jù)指南進(jìn)行。Poly(A)+來(lái)自總RNA的mRNA的制備應(yīng)用OligotexDirect mRNA試劑盒(QIAGEN制造)或類似物根據(jù)指南進(jìn)行。用于制備mRNA的方法沒(méi)有特別的限制，方法可根據(jù)已知的方式操作。
(m)-3標(biāo)記cRNA的合成標(biāo)記cRNA的合成能應(yīng)用BioArray HighYield RNA TranscriptLabeling Kit(Affymetrix制造)或類似物根據(jù)指南進(jìn)行。生物素能被用于標(biāo)記。用于標(biāo)記cRNA的合成方法沒(méi)有特別的限制，方法可根據(jù)已知的方式操作。
(m)-4雜交5μg的生物素標(biāo)記cRNA，1.7μl的3nM ControlOligonucleotide B2(Affymetrix制造)，5μl的20X EukaryoticHybridization Controls(Affymetrix制造)，1μl的10mg/mlHerring Sperm DNA(Affymetrix制造)，1μl的50mg/ml乙?；疊SA(Affymetrix制造)，50μl的2X Hybridization緩沖液(Affymetrix制造)被混合，并加水(Affymetrix制造)至終體積為100μl，并根據(jù)Affymetrix的技術(shù)指南與DNA陣列雜交。雜交16小時(shí)后，雜交混合物被除去，而DNA陣列應(yīng)用GeneChipFludics Station(Affymetrix制造)或類似物清洗，并根據(jù)Affymetrix的技術(shù)指南用鏈霉親和素藻紅素(300μl的2X MES Stain Buffer(Affymetrix制造)，24μl的50mg/ml乙?；疊SA(Affymetrix制造)，6μl的1mg/ml鏈霉親和素-藻紅素(Affymetrix制造)，270μl的水(Affymetrix制造))染色。用于雜交的方法沒(méi)有特別的限制，方法可根據(jù)已知的方式操作。
(m)-5數(shù)據(jù)分析DNA陣列的數(shù)據(jù)分析能根據(jù)技術(shù)指南應(yīng)用商業(yè)性可得的軟件(例如Affymetrix制造的GCOS(GeneChip Operating Software)，SiliconGenetics制造的GeneSpring，Takara Shuzo制造的ImaGene，F(xiàn)ujiPhoto Film制造的Array Gauge，Amersham Pharmacia Biotech制造的ImageQuant或類似物)進(jìn)行。顯示特征性表達(dá)特性的基因能被鑒別，并被選出用于功能分析。
此外，被鑒別的基因能被用作基因標(biāo)記以指出發(fā)酵過(guò)程中的酵母狀態(tài)。
用于數(shù)據(jù)分析的方法沒(méi)有特別的限制，方法可根據(jù)已知的方式操作。
(n)工業(yè)酵母的分類有可能應(yīng)用上面提及的DNA陣列對(duì)工業(yè)酵母分類。酵母基因組DNA的制備和與DNA陣列的雜交可如前所述進(jìn)行。陣列信號(hào)強(qiáng)度的探測(cè)應(yīng)用Affymetrix制造的Gene Chip Analysis Basic System和分析軟件(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0)進(jìn)行。與釀酒酵母DNA雜交的探針的百分比被計(jì)算，而菌株34/70和被試驗(yàn)菌株之間的同一性被評(píng)估。工業(yè)酵母菌株能基于同一性而分類。
(o)核苷酸多態(tài)性的探測(cè)有可能通過(guò)與上面提及的DNA陣列的比較性基因組雜交而探測(cè)核苷酸多態(tài)性。每一探針的一套寡核苷酸由完全匹配寡核苷酸(PM)和錯(cuò)配寡核苷酸(MM)組成，前者與菌株34/70的序列一致，后者包含單個(gè)堿基的錯(cuò)配，例如，在寡核苷酸的中心位置。有可能從其在MM中的信號(hào)強(qiáng)度高于(例如，超過(guò)5倍)PM中的信號(hào)強(qiáng)度的基因探測(cè)核苷酸多態(tài)性。
(p)用作功能分析的基因的選出根據(jù)比較性基因組雜交分析的結(jié)果，具有顯示低信號(hào)強(qiáng)度的探針組的基因可能被丟失了或具有與菌株34/70的序列不同的序列。相反地，具有顯示高信號(hào)強(qiáng)度的探針組的基因可具有高拷貝數(shù)目。這類基因能被選用于功能分析，因?yàn)槠浠蜃豢蓪?duì)菌株34/70和被試驗(yàn)菌株之間的發(fā)酵特性差異作出貢獻(xiàn)。具有通過(guò)上面提及的方法而探測(cè)到的核苷酸多態(tài)性的基因也能被選用于功能分析。
實(shí)施例本發(fā)明的細(xì)節(jié)以下面的實(shí)施例被提及，雖然本發(fā)明不局限于下面的實(shí)施例。
(實(shí)施例1)巴斯德氏糖酵母Weihenstephan 34/70(在此之后縮寫成菌株34/70)的染色體DNA的制備染色體DNA的制備通過(guò)″Yeast，a practical approach(IRLPress)6.2.1(pages 228-229)″中提及的方法進(jìn)行，該方法被部分修改。細(xì)胞被接種并以30℃生長(zhǎng)在200mL的YPD培養(yǎng)基(2％葡萄糖，1％酵母提取物和2％聚胨)中直到培養(yǎng)物的660nm處吸收值變成4。細(xì)胞通過(guò)離心收集，并以緩沖液A(50mM磷酸鉀，25mM EDTA和1％(v/v)β-巰基乙醇；pH 7.5)清洗，重懸浮在25mL的緩沖液A中，而7mg的Zymolyase 100T(Seikagaku Kogyo)被加入其中，混合物在37℃被適度振蕩60分鐘。25mL的緩沖液B(0.2M Tris-HCl，80mMEDTA和1％SDS；pH 9.5)被加入其中，然后混合物被允許置于65℃下30分鐘，冰上冷卻，與12mL的5M醋酸鉀混合，并被允許置于冰上又一個(gè)60分鐘。得到的溶液以5,000g在15℃離心10分鐘。相同體積的乙醇被加入到回收的上清以沉淀DNA，而混合物立即以5,000g在15℃離心10分鐘以收集沉淀。得到的沉淀以70％(v/v)乙醇清洗，進(jìn)行自然干燥并溶于5mL的TE緩沖液(10mM Tris-HCl和1mM的EDTA；pH 8.0)以給出DNA的粗溶液。氯化銫(4.06g)和840μg的二苯并亞胺(Hoechst 33258)被加入并溶于3.5mL的DNA粗溶液，混合物以100,000g在25℃進(jìn)行17小時(shí)的離心分離，并暴露于紫外光以使DNA條帶可見(jiàn)，更低的條帶被回收?；厥盏腄NA溶液以用氯化銫溶液飽和的異丙醇進(jìn)行提取以除去二苯并亞胺(Hoechst 33258)。4倍體積的0.3M醋酸鈉被加入回收的水層，隨后混合，然后3倍體積的乙醇被加入其中以沉淀DNA，所述DNA通過(guò)離心被回收?；厥盏腄NA溶于包含75μg/mL RNase的TE緩沖液中，37℃保持5分鐘，以苯酚/氯仿提取三次，水層被進(jìn)一步以乙醇進(jìn)行沉淀。通過(guò)離心回收的沉淀以70％(v/v)乙醇清洗，進(jìn)行自然干燥并溶于TE緩沖液中以制備染色體DNA溶液。
(實(shí)施例2)鳥槍文庫(kù)的制備實(shí)施例1中制得的菌株34/70的基因組溶液濃度應(yīng)用TE緩沖液被調(diào)至1mg/mL，而它的0.1mL被用Hydroshear(GeneMachines制造；速度6；循環(huán)20次)處理以片段化基因組DNA?；蚪M片段的末端應(yīng)用DNA Blunting Kit(Takara Shuzo制造)鈍化，以0.8％瓊脂糖電泳分離，而1.5到2.5kb的基因組片段被從膠中切下，DNA被洗脫。DNA洗脫液用苯酚/氯仿處理，并用乙醇沉淀以給出基因組文庫(kù)插入物。所有上面的插入物和0.5μg的pUC18 SmaI/BAP(AmershamBiosciences制造)在15℃應(yīng)用T4連接酶(Takara Shuzo制造)進(jìn)行連接，連接15小時(shí)。
連接反應(yīng)產(chǎn)物以乙醇沉淀并溶于10μL的TE緩沖液中。連接溶液(1μL)以電穿孔方式在所附實(shí)驗(yàn)指南中提及的條件下被插入40μL的大腸桿菌Electro Cell DH5a(Takara Shuzo制造)中。得到的產(chǎn)物鋪展在含有0.1mg/mL的氨芐青霉素，0.1mg/mL的X-gal和1mmol/L的異丙基-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)的LB平板培養(yǎng)基(含有1.6％瓊脂的LB培養(yǎng)基(1％細(xì)菌用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化鈉；pH 7.0))，并在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
從所述平板培養(yǎng)基上形成的菌落得到的轉(zhuǎn)化子在加入了50μL含有0.1mg/mL的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的384孔滴定平板中進(jìn)行37℃下的無(wú)振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后50μL的50％甘油水溶液被加入其中，隨后攪拌，混合物被用作甘油貯存液。
(實(shí)施例3)粘粒文庫(kù)的制備約0.1mg的實(shí)施例1中得到的基因組DNA以Sau3AI(TakaraShuzo制造)部分消化。片段到Super Cos I載體(Stratagene制造)的BamHI位點(diǎn)中的插入根據(jù)指南進(jìn)行。通過(guò)此方法制得的連接產(chǎn)物應(yīng)用Gigapack III Gold(Stratagene制造)進(jìn)行包裹，并根據(jù)指南被引入大腸桿菌XL1-Blue MR菌株(Stratagene制造)。它在含有0.1mg/mL的氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上鋪展，并在37℃培育過(guò)夜。得到的轉(zhuǎn)化子應(yīng)用96孔的滴定平板在含有0.1mg/mL的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(每孔50μL)中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后50μL的50％甘油溶液被加入其中，隨后攪拌，混合物被用作甘油貯存液。
(實(shí)施例4)DNA序列的測(cè)定(4-1)DNA片段的制備菌株34/70的全部基因組序列主要應(yīng)用全基因組鳥槍方法測(cè)定。其DNA序列將被通過(guò)那一方法測(cè)定的DNA片段從上面實(shí)施例2中制得的鳥槍文庫(kù)通過(guò)PCR方法制備。具體而言，源于全基因組鳥槍文庫(kù)的克隆應(yīng)用復(fù)制器(Gene Solution制造)接種到384孔的滴定平板，50μL含有0.1mg/mL的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基被置于所述滴定平板的每一孔中，并在37℃無(wú)振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。所述培養(yǎng)液用復(fù)制器(GeneSolution制造)被轉(zhuǎn)移到含有10μL用于PCR的反應(yīng)混合物(TakaraShuzo制造的TaKaRa Ex Taq)的384孔反應(yīng)平板(AB Gene制造)，PCR根據(jù)Makino等″DNA Research，volume 5，pages 1-9(1998)″的方案應(yīng)用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems制造)進(jìn)行以擴(kuò)增插入片段。之后，過(guò)量的引物和核苷酸通過(guò)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Amersham Bioscience制造)除去，而測(cè)序反應(yīng)應(yīng)用純化的PCR樣品作為模板進(jìn)行。
來(lái)自上面實(shí)施例3的粘粒文庫(kù)的DNA片段根據(jù)下面的方法制備。也就是，源于整個(gè)粘粒文庫(kù)的克隆被接種到96孔平板的每一孔(其中放入了1.0mL含有50μg/mL氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基(1.6％bactotrypsin，0.1％酵母提取物和0.5％氯化鈉；pH 7.0))中，并進(jìn)行30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。粘粒DNA應(yīng)用KURABO PI-1100 AUTOMATIC DNAISOLATION SYSTEM(KURABO制造)根據(jù)KURABO的指南由所述培養(yǎng)物制得，并被用作測(cè)序反應(yīng)的模板。
(4-2)測(cè)序反應(yīng)測(cè)序反應(yīng)混合物按下述制備。上面(4-1)中制得的PCR產(chǎn)物或粘粒DNA與約2μL的DYEnamic ET Terminator Sequencing Kit(Amersham Bioscience制造)及適當(dāng)?shù)囊锘旌弦越o出約8μL的反應(yīng)混合物。M13正向引物(M13-21)和M13反向引物(M13RV)(Takara Bio制造)被用于源于鳥槍DNA的PCR產(chǎn)物的測(cè)序反應(yīng)，而正向引物SS-cosF.1(SEQ ID NO7)和反向引物SS-cos R.1(SEQ ID NO8)被用于粘粒DNA。引物和DNA片段的數(shù)量分別是3.2pmol和50到200ng。所述反應(yīng)溶液應(yīng)用GeneAmp PCR System 9700進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的染色終止子測(cè)序反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)參照DYEnamic ET TerminatorSequencing Kit所附的指南。樣品的純化應(yīng)用Multi Screen HV Plate(Millipore制造)根據(jù)Millipore的指南進(jìn)行。純化的反應(yīng)物在暗處4℃保存。所述純化的反應(yīng)物應(yīng)用Mega BACE 1000 Sequencing System(Amersham Bioscience制造)和ABI PRISM 3700 DNAAnalyser(Applied Biosystems制造)根據(jù)其所附指南進(jìn)行分析。通過(guò)Mega BACE 1000 Sequencing System得到的332,592個(gè)序列的數(shù)據(jù)和通過(guò)3700 DNA Analyser得到的13,461個(gè)序列的數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)移到服務(wù)器Enterprise 6500(Sun Microsystems制造)并保存。346,053個(gè)序列的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于約7倍的全基因組大小。
實(shí)施例中所用的PCR引物的清單在表3中顯示。
(實(shí)施例5)組裝(確定多個(gè)被測(cè)序的DNA片段的順序)從上面實(shí)施例4中得到的346,053個(gè)序列的DNA片段的序列信息進(jìn)行基因組DNA序列重建的所有工作在UNIX平臺(tái)上進(jìn)行。Base call通過(guò)phred(The University of Washington)進(jìn)行，載體序列的屏蔽應(yīng)用Cross_Match(The University of Washington)進(jìn)行，而組裝應(yīng)用Phrap(The University of Washington)或類似物進(jìn)行。作為組裝結(jié)果得到的毗連群應(yīng)用繪圖編輯器consed(The University ofWashington)而被分析。從base call到組裝的系列工作全都利用consed所附的原本phredPhrap而進(jìn)行。
(實(shí)施例6)相對(duì)于啤酒糖酵母全部基因組序列的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)的制備巴斯德氏糖酵母被認(rèn)為是啤酒糖酵母與其密切相關(guān)物種的自然雜交體″Int.J.Syst.Bacteriol.，volume 35，pages 508-511(1985)″。因此，(4-2)中得到的粘粒DNA克隆的兩端DNA序列(包含10,044個(gè)堿基)都通過(guò)同源性搜索算法針對(duì)啤酒糖酵母基因組序列進(jìn)行同源性搜索，由此，對(duì)于每一DNA序列，在啤酒糖酵母基因組序列上的同源區(qū)域進(jìn)行比對(duì)，并確定它們的同一性以制備數(shù)據(jù)庫(kù)。相對(duì)于對(duì)應(yīng)的啤酒糖酵母基因組DNA序列的粘粒DNA序列的同一性分布表在圖2中顯示。粘粒的DNA序列粗略分為顯示與啤酒糖酵母基因組DNA序列有不少于94％同一性的DNA序列組，和顯示與其有大約84％同一性的DNA序列組。顯示不少于94％同一性的DNA序列組被命名為源于啤酒糖酵母的Sc類型的DNA序列，而顯示大約84％同一性的DNA序列組被命名為源于密切相關(guān)物種的非Sc類型的DNA序列。類似地，(4-1)中得到的鳥槍克隆兩端的DNA序列與啤酒糖酵母的基因組DNA序列的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)(表1)被制備。表1顯示3,648-粘?？寺啥薉NA序列與啤酒糖酵母的基因組DNA序列的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)的實(shí)例。表1顯示了每一啤酒糖酵母基因組DNA序列上進(jìn)行DNA序列測(cè)定的粘粒正向序列和反向序列的同源區(qū)域及同一性。
表1

基于由所制得的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)得到的信息，粘?？寺『网B槍克隆在啤酒糖酵母基因組序列上的圖譜繪制被完成(圖3)。此外，實(shí)施例5中得到的毗連群DNA序列和啤酒糖酵母基因組序列的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)(表1)被制備，然后進(jìn)行圖譜繪制。雖然用于圖譜繪制的方式幾乎與上面提及的方法相同，但如果粘粒和鳥槍克隆的正向和反向序列出現(xiàn)在不同毗連群中，則這些毗連群通過(guò)正向-反向連接而連接起來(lái)(圖4)。
(實(shí)施例7)ORF功能的鑒別和分配進(jìn)行對(duì)實(shí)施例5所組裝的DNA序列中的ORF(開(kāi)放閱讀框)的鑒別。實(shí)施例具體顯示如下。對(duì)存在于實(shí)施例5所組裝的DNA序列中的ORF的鑒別，應(yīng)用可得的用于在六種閱讀框中鑒別ORF類型的ORFfinder(http//www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)程序，在從起始密碼子到終止密碼子的長(zhǎng)度不少于150個(gè)堿基的序列(包括其互補(bǔ)序列)中進(jìn)行。所抽選ORF的功能的分配通過(guò)對(duì)啤酒糖酵母ORF的氨基酸序列(已在SGD中登記并公開(kāi))的同源性搜索而完成。表2顯示了對(duì)應(yīng)于非Sc基因組中所存在ORF的功能的分配結(jié)果的啤酒糖酵母ORF名稱的例子。從表的左側(cè)開(kāi)始，釀酒酵母中存在的ORF的名稱，多核苷酸中的ORF長(zhǎng)度，多肽中的ORF長(zhǎng)度，通過(guò)同源性搜索確定的啤酒糖酵母ORF的名稱，同一性，吻合長(zhǎng)度及基因的功能都被顯示。
表2

(實(shí)施例8)通過(guò)基于DNA微陣列的比較性基因組雜交和PCR對(duì)染色體結(jié)構(gòu)的分析酵母基因組DNA的制備應(yīng)用Qiagen Genomic Tip 100/G(#10243QIAGEN制造)和Qiagen Genomic DNA Buffer Set(#19060QIAGEN制造)根據(jù)試劑盒所附的指南進(jìn)行。DNA(10μg)用DNase I(Invitrogen制造)根據(jù)Winzeler等″Science，volume 281，pages1194-1197(1998)″的方法消化，通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶(Roche制造)生物素化，并與DNA微陣列(Affymetrix Gene Chip Yeast Genome S98 ArrayAffymetrix制造)雜交。雜交和陣列信號(hào)強(qiáng)度的探測(cè)應(yīng)用Affymetrix制造的Gene Chip Analysis Basic System進(jìn)行。
與菌株34/70的DNA雜交的每一探針的信號(hào)應(yīng)用分析軟件(Microarray Suite 5.0Affymetrix制造)相對(duì)于單倍體實(shí)驗(yàn)室酵母株S288C進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并以信號(hào)對(duì)數(shù)比(2n)顯示。信號(hào)對(duì)數(shù)比應(yīng)用電子制表程序(Microsoft Excel 2000)按每一染色體中的基因順序畫出線條，而信號(hào)對(duì)數(shù)比以柱狀圖顯示在圖5中。非Sc類型基因不與啤酒糖酵母陣列雜交，因此，Sc類型基因用量影響信號(hào)對(duì)數(shù)比，而信號(hào)對(duì)數(shù)比顯示急劇改變處的點(diǎn)被認(rèn)為是在Sc類型和非Sc類型染色體之間的易位位置。
基于通過(guò)鳥槍法測(cè)定的菌株34/70基因組序列，嵌合基因結(jié)構(gòu)被PCR證實(shí)，所述PCR中，具有一側(cè)是Sc類型而另一側(cè)是非Sc類型的DNA序列(XVI-1(L)cer-95894(SEQ ID NO9)/XVI-1(R)nonSc-106302rv(SEQ ID NO10)和XVI-2(L)cer-859737(SEQ ID NO11)/XVI-2(R)nonSc-864595rv(SEQ ID NO12)的兩對(duì)引物被設(shè)計(jì)，源于菌株34/70的基因組DNA被用作模板。染色體XVI易位的兩個(gè)實(shí)例顯示如下。
PCR應(yīng)用TaRara LS TaqTM和其所附的緩沖液根據(jù)所附指南通過(guò)Takara PCR Thermal Cycler SP進(jìn)行。
作為PCR的結(jié)果，通過(guò)0.8％瓊脂糖電泳證實(shí)了預(yù)期長(zhǎng)度的DNA片段從菌株34/70得到擴(kuò)增，而當(dāng)實(shí)驗(yàn)株啤酒糖酵母X2180-1A的基因組DNA被用作PCR模板時(shí)，DNA片段的擴(kuò)增無(wú)法探測(cè)。此外，當(dāng)從菌株34/70擴(kuò)增的DNA片段的兩端DNA序列被證實(shí)時(shí)，它與通過(guò)鳥槍法測(cè)定的基因組序列一致，這證實(shí)了Sc類型和非Sc類型染色體之間的易位發(fā)生在這樣一個(gè)區(qū)域內(nèi)。
根據(jù)上面的結(jié)論估計(jì)出，至少兩種染色體存在于染色體XVI中，如圖6所示。根據(jù)同一技術(shù)，證實(shí)了Sc染色體和非Sc染色體之間的連接，或者換句話說(shuō)，證實(shí)了存在嵌合染色體結(jié)構(gòu)的區(qū)域。這類Sc染色體和非Sc染色體的嵌合染色體結(jié)構(gòu)至少在菌株34/70總?cè)旧w的13個(gè)位置中被證實(shí)(圖1)。
作為基因組分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了底部發(fā)酵酵母的染色體結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，且在菌株34/70中至少存在37種染色體。
(實(shí)施例9)菌株34/70的SSU1基因的克隆含有非ScSSU1基因的鳥槍克隆應(yīng)用實(shí)施例6中得到的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。存在含有約2.4kb片段(包含了全長(zhǎng)的非ScSSU1 ORF)的SSS103_G08，其中鳥槍克隆的正向和反向序列與啤酒糖酵母的序列的同一性分別是62.9％和82.9％。
SSS103-G08被從基因組DNA文庫(kù)中選出，然后全長(zhǎng)的非ScSSU1通過(guò)PCR制備。合成的SacI-non-Sc-SSU1_for1(SEQ ID NO13)和BglII-non-Sc-SSU1_rv1460(SEQ ID NO14)的DNA被用作引物。作為這一組合的結(jié)果，非ScSSU1的堿基1到1460被擴(kuò)增，而給出了約1.5kb的SacI-BglII片段。
關(guān)于ScSSU1基因，全長(zhǎng)基因應(yīng)用基于SGD信息設(shè)計(jì)的引物對(duì)以菌株34/70基因組DNA作為模板由PCR得到。SacI-ScSSU1_for1(SEQID NO15)和BglII-ScSSU1_rv1406(SEQ ID NO16)的合成性DNA用作引物。作為這一組合的結(jié)果，ScSSU1基因的堿基1到1406被擴(kuò)增，而給出了約1.4kb的SacI-BglII片段。
如上述得到的ScSSU1和非ScSSU1基因應(yīng)用TA克隆試劑盒(Invitrogen)插入試劑盒所附的pCR 2.1-TOPO載體中，它們被分別命名為TOPO/ScSSU1和TOPO/非ScSSU1。得到的ScSSU1和非ScSSU1基因的序列通過(guò)Sanger″F.Sanger，Science，volume 214，page1215，1981″的方法得到證實(shí)(圖10)。
(實(shí)施例10)每一SSU1基因的破壞根據(jù)文獻(xiàn)″Goldstein等人，Yeast，volume 15，page 1541(1999)″中提及的方法，用于基因破壞的DNA片段應(yīng)用包含藥物抗性標(biāo)記的質(zhì)粒(pFA6a(G418r)，pAG 25(nat1))作為模板通過(guò)PCR制備。作為PCR的引物，non-Sc-SSU1_for(SEQ ID NO17)/non-Sc-SSU1_rv(SEQ ID NO18)被用于非ScSSU1基因的破壞，而ScSSU1_for(SEQID NO19)/ScSSU1_rv(SEQ ID NO20)被用于ScSSU1基因的破壞。質(zhì)粒pPGAPAUR(AUR1-C)和引物non-Sc-SSU1_for+pGAPAUR(SEQ IDNO21)/non-Sc-SSU1_rv+AURI-C(SEQ ID NO22)被進(jìn)一步用于非ScSSU1基因的破壞。這樣，用于ScSSU1和非ScSSU1基因破壞的兩種和三種DNA片段被分別制備。
應(yīng)用以上方法制備的用于基因破壞的DNA片段轉(zhuǎn)化底部發(fā)酵酵母BH 96。轉(zhuǎn)化通過(guò)Japanese Patent Laid-Open Gazette No.07/303,475中提及的方法進(jìn)行，而藥物濃度是遺傳霉素為300mg/L，諾爾絲菌素為50mg/L，金擔(dān)子素A為1mg/L。
關(guān)于所制得的轉(zhuǎn)化子，基因破壞由Southern分析所證實(shí)。首先，從親代菌株和破壞株提取到的基因組DNA進(jìn)行限制性酶處理(37℃或18小時(shí))，證實(shí)ScSSU1基因破壞用NcoI，而證實(shí)非ScSSU1基因破壞用HindIII，然后用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移到膜上。之后，以對(duì)ScSSU1或非ScSSU1特異的探針按照Alkphos DirectLabelling Reagents(Amersham)的草案進(jìn)行雜交(55℃18小時(shí))，而信號(hào)通過(guò)CDP-Star探測(cè)。
其基因破壞得到證實(shí)的每一菌株命名如下。
Sc-1(ScSSU1/Scssu1G418r)Sc-2(Scssu1G418r/Scssu1nat1)
非Sc-1(非ScSSU1/非ScSSU1/非Scssu1G418r)非Sc-2(非ScSSU1/非Scssu1G418r/非Scssu1nat1)非Sc-3(非Scssu1G418r/非Scssu1nat1/非Scssu1AUR1-C)(實(shí)施例11)發(fā)酵試驗(yàn)中亞硫酸產(chǎn)生的定量分析發(fā)酵試驗(yàn)應(yīng)用親代菌株和實(shí)施例10中制得的破壞株Sc-1至非Sc-3在下面條件下進(jìn)行。
原始提取12.75％發(fā)酵規(guī)模2升溶解氧濃度約9ppm發(fā)酵溫度15℃接種率10g的濕酵母細(xì)胞/2L的麥芽汁麥芽汁定期取樣并監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)(OD600)(圖7-(a))、表觀提取值(圖7-(b))和亞硫酸濃度(圖7-(c))。麥芽汁中的亞硫酸的定量分析以這樣的方法進(jìn)行，即亞硫酸以酸性條件下蒸餾的方式在過(guò)氧化氫溶液中被捕獲，并以堿進(jìn)行滴定(the Brewing Society of Japan的修訂的BCOJ啤酒分析方法)。
結(jié)果是麥芽汁中ScSSU1破壞株產(chǎn)生的亞硫酸幾乎與親代菌株所產(chǎn)生的相同，而非ScSSU1破壞株產(chǎn)生的亞硫酸顯著減少。這暗示底部發(fā)酵酵母特異的非ScSSU1基因?qū)溠恐衼喠蛩岬漠a(chǎn)生起重要作用。
同時(shí)，生長(zhǎng)率和提取物消耗率在非ScSSU1破壞株中顯著減小，這支持了細(xì)胞中過(guò)量的亞硫酸導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的觀點(diǎn)。
(實(shí)施例12)每一SSU1基因的過(guò)表達(dá)包括全長(zhǎng)非ScSSU1 ORF的約1.5kb的片段通過(guò)限制性酶(SacI-BglII)的處理從實(shí)施例9所提及的質(zhì)粒TOPO/非ScSSU1中被切下。然后此片段插入已被限制性酶(SacI-BglII)類似處理的質(zhì)粒pNI-NUT中，以構(gòu)建非ScSSU1過(guò)表達(dá)載體pYI-non-ScSSU1。載體pNI-NUT包含作為同源重組位點(diǎn)的URA3及作為選擇標(biāo)記的諾爾絲菌素抗性基因(nat1)和氨芐青霉素抗性基因(Ampr)。另一方面，ScSSU1過(guò)表達(dá)載體pNI-ScSSU1具有某一結(jié)構(gòu)，其中上述pYI-non-ScSSU1的非ScSSU1基因被源于啤酒糖酵母的約2kb的SSU1-R置換″J.Ferment.Bioeng.，volume 86，page 427(1998)″。甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動(dòng)子和終止子被用于每一SSU1基因的過(guò)表達(dá)。
底部發(fā)酵酵母BH225被按照上述方法制得的過(guò)表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化通過(guò)Japanese Patent Laid-Open Gazette No.07/303,475中提及的方法進(jìn)行，并在含有50mg/L的諾爾絲菌素的YPD平板培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。
過(guò)表達(dá)的證實(shí)通過(guò)RT-PCR進(jìn)行。總RNA的提取應(yīng)用RNeasy MiniKit(Qiagen)并根據(jù)試劑盒所附“用于從酵母分離總RNA”的指南進(jìn)行。ScSSU1_for331(SEQ ID NO23)/ScSSUI_982rv(SEQ ID NO24)被用作ScSSU1特異引物；non-ScSSU1_for329(SEQ ID NO25)/non-ScSSU1_981rv(SEQ ID NO26)被用作非ScSSU1特異引物；而PDA1_for1(SEQ ID NO27)/PDA1_730rv(SEQ ID NO28)被用作組成性表達(dá)基因PDA1(其被用作內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn))的特異引物。PCR產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖電泳分離，用溴乙錠溶液染色，轉(zhuǎn)化子的每一SSUI基因的信號(hào)值以PDA 1的信號(hào)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并與親代菌株的值進(jìn)行比較。這樣證實(shí)的過(guò)表達(dá)菌株被命名為ScSSU1過(guò)表達(dá)菌株和非ScSSU1過(guò)表達(dá)菌株。
(實(shí)施例13)發(fā)酵試驗(yàn)中亞硫酸產(chǎn)生的定量分析應(yīng)用親代菌株和每一種實(shí)施例12中得到的SSU1過(guò)表達(dá)菌株的發(fā)酵試驗(yàn)在下面的條件下進(jìn)行。
原始提取12.83％發(fā)酵規(guī)模2升溶解氧濃度約9ppm發(fā)酵溫度12℃接種率10g的濕酵母細(xì)胞/2L的麥芽汁如在實(shí)施例11中的，麥芽汁被定期取樣，并監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)(OD600)(圖8-(a))、表觀提取值(圖8-(b))和亞硫酸濃度(圖8-(c))。關(guān)于亞硫酸的產(chǎn)生，與親代菌株的那些相比(發(fā)酵末期為12ppm)，它在Sc SSU1過(guò)表達(dá)菌株中只稍微高一些(發(fā)酵末期為19ppm)，而非ScSSU1過(guò)表達(dá)菌株顯示出明顯的增加(同一階段時(shí)為45ppm)。同時(shí)，生長(zhǎng)速率和提取物消耗速率在親代菌株和過(guò)表達(dá)菌株之間沒(méi)有差異。
根據(jù)上面的結(jié)果，通過(guò)本發(fā)明中所示的底部發(fā)酵酵母特異的亞硫酸-排出泵編碼基因的過(guò)表達(dá)，有可能增加啤酒中的亞硫酸濃度而不改變發(fā)酵過(guò)程和發(fā)酵周期。結(jié)果是，現(xiàn)在有可能生產(chǎn)具有極佳風(fēng)味穩(wěn)定性和更長(zhǎng)保質(zhì)期的酒精飲料。
(實(shí)施例14)菌株34/70的MET14基因的克隆非Sc MET14基因的DNA序列從實(shí)施例6中得到的比較性數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。含有約1.9kb(全長(zhǎng))的非Sc MET14基因的鳥槍克隆SSS 134_021被得到；其正向和反向DNA序列與啤酒糖酵母的同一性分別是79.0％和56.0％。
鳥槍克隆134_021從鳥槍文庫(kù)選出，而全長(zhǎng)的非Sc MET14基因通過(guò)PCR得到。作為引物對(duì)，SacI-nonSc-MET14_for-21(SEQ ID NO29)和BamHI-nonSc-MET14_rv618(SEQ ID NO30)的合成性DNA被應(yīng)用(表3)。作為這一組合的結(jié)果，得到了被SacI和BamHI限制性位點(diǎn)所包含的非Sc MET14基因(約0.6kb)。
(表3)

關(guān)于Sc MET14基因，全長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)基因應(yīng)用基于SGD信息設(shè)計(jì)的引物對(duì)并應(yīng)用菌株34/70的基因組DNA作為模板通過(guò)PCR得到。SacI-ScMET14_for(SEQ ID NO31)和BamHI-ScMET14_rv(SEQ ID NO32)的合成性DNA被用作引物。作為這一組合的結(jié)果，得到了被SacI和BamHI限制性位點(diǎn)所包含的Sc MET14基因(約0.6kb)。
按上述得到的Sc MET14和非Sc MET14基因應(yīng)用TA克隆試劑盒(Invitrogen制造)插入到試劑盒所附的pCR2.1-TOPO載體中，且它們被分別命名為TOPO/ScMET14和TOPO/非Sc-MET14。
得到的Sc MET14和非Sc MET14基因的DNA序列通過(guò)Sanger″Science，volume 214，page 1215(1981)″的方法核查(圖11)。
(實(shí)施例15)Sc SSU1過(guò)表達(dá)菌株中的每一MET14基因的過(guò)表達(dá)含有實(shí)施例14中提及的Sc MET14或非Sc MET14的約0.6kb的片段被插入表達(dá)載體pUP3GLP(Japanese Patent Laid-OpenGazette No.2000/316,559)的多克隆位點(diǎn)中以構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pUP3Sc MET14和pUP3nonSc-MET14，其中每一MET14基因都在甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控下表達(dá)。頂部發(fā)酵酵母即菌株KN009F被實(shí)施例12中提及的Sc SSU1過(guò)表達(dá)載體pNI-SSU1轉(zhuǎn)化，以制備作為Sc SSU1過(guò)表達(dá)菌株的菌株FOY227。菌株FOY227被上面的pUP3ScMET14和pUP3nonSc-MET14轉(zhuǎn)化以制備菌株FOY306和菌株FOY307，在菌株FOY306和菌株FOY 307中，Sc MET14和非Sc MET14以及Sc SSU1被分別過(guò)表達(dá)。
(實(shí)施例16)發(fā)酵試驗(yàn)中亞硫酸產(chǎn)生的定量分析在下面的條件下應(yīng)用實(shí)施例15中制得的菌株作為Sc SSU1過(guò)表達(dá)菌株的菌株FOY227，作為菌株FOY227中的Sc MET14過(guò)表達(dá)菌株的FOY306，作為菌株FOY227中的非Sc MET14過(guò)表達(dá)菌株的菌株FOY307及親代菌株KN009 F，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。
原始提取12.84％發(fā)酵規(guī)模1.5升溶解氧濃度約9ppm發(fā)酵溫度所有時(shí)間都在25℃接種率7.5g的濕酵母細(xì)胞/1.5L的麥芽汁如在實(shí)施例11中的，麥芽汁被定期取樣，并監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)(OD600)、表觀提取值和亞硫酸濃度。關(guān)于酵母生長(zhǎng)和提取物的消耗量，菌株間沒(méi)有差異。然而，關(guān)于亞硫酸的產(chǎn)生，與親代菌株KN009F的那些(發(fā)酵末期為0.32ppm)相比，它在Sc SSU1過(guò)表達(dá)菌株FOY227(發(fā)酵末期為3.4ppm)和Sc MET14與Sc SSU1過(guò)表達(dá)菌株FOY306(同一階段時(shí)為6.4)中只稍微高一些，而非Sc MET14與Sc SSU1過(guò)表達(dá)菌株FOY307顯示出明顯的增加(同一階段時(shí)為16.6ppm)，如圖9中所示。
根據(jù)上面的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明中所示的底部發(fā)酵酵母特異的腺苷酰硫酸激酶的編碼基因的過(guò)表達(dá)能有效增加啤酒中的亞硫酸濃度而不改變發(fā)酵過(guò)程和發(fā)酵時(shí)間。結(jié)果是，現(xiàn)在有可能生產(chǎn)具有極佳風(fēng)味穩(wěn)定性和更長(zhǎng)保質(zhì)期的酒精飲料。
(實(shí)施例17)底部發(fā)酵酵母DNA微陣列的生產(chǎn)底部發(fā)酵酵母DNA微陣列基于以下二者的DNA序列信息而被生產(chǎn)上面(h)中得到的ORF和從菌株34/70的全基因組序列推導(dǎo)出的ORF之間的基因間DNA序列。
DNA微陣列的生產(chǎn)基于下面四組的DNA序列信息(1)來(lái)自34/70菌株全部基因組序列信息的22483個(gè)區(qū)域，(2)不與34/70菌株中Sc類型ORF一樣的來(lái)自SGD的403個(gè)啤酒糖酵母ORF，(3)來(lái)自Genbank提供的巴斯德氏糖酵母基因的27個(gè)區(qū)域，(4)用作內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)的64個(gè)基因的DNA序列，對(duì)底部發(fā)酵酵母的全基因組序列特異的PM探針(完全匹配探針，長(zhǎng)25個(gè)堿基)應(yīng)用GeneChip(Affymetrix)技術(shù)設(shè)計(jì)。
為了得到定量的和可重復(fù)的信息，分別針對(duì)(1)，(2)，(3)和(4)的每一座位或區(qū)域設(shè)計(jì)11個(gè)探針和20個(gè)探針。為進(jìn)一步增加探測(cè)的敏感度和特異性，除了中間位置有一個(gè)錯(cuò)配堿基(也就是，堿基13)外具有與PM探針一樣的序列的錯(cuò)配探針(MM探針)也被設(shè)計(jì)。
所有設(shè)計(jì)的PM和MM探針被合成并被包裝在載玻片(Affymetrix制造)中以應(yīng)用GeneChip技術(shù)生產(chǎn)微陣列。
(1)被包含于A)非Sc類型ORF的6307個(gè)DNA序列，B)Sc類型ORF的7640個(gè)DNA序列，C)來(lái)自34/70菌株的線粒體ORF的28個(gè)DNA序列，D)沒(méi)有被鑒別為上述ORF但應(yīng)用NCBI-BlastX同源性搜索法具有與啤酒糖酵母蛋白質(zhì)的一定相似性的553個(gè)DNA序列，E)如上述A)或B)之間的7955個(gè)基因間DNA序列。
(2)被包含于YBL108C-A，YBR074W，YFL061W，YIL165C，YGR291C，YJR052W，YDR223W，YAL025C，YAR073W，YFL057C，YLL015W，YJR105W，YLR299C-A，YNR073C，YDL246C，YHL049C，YAR010C，YKL096W，YBL026W，YMR230W，YAL037C-A，YAL037C-B，YAL037W，YAL063C-A，YAL064C-A，YAL064W，YAL065C，YAL068W-A，YAL069W，YAR009C，YAR020C，YAR042W，YAR047C，YAR053W，YAR060C，YAR061W，YAR062W，YBL027W，YBL040C，YBL068W-A，YBL101W-B，YBL109W，YBL112C，YBR092C，YBR191W-A，YBR219C，YCL019W，YCL029C，YCL065W，YCL066W，YCL068C，YCL069W，YCL073C，YCL074W，YCL075W，YCL076W，YCR035C，YCR036W，YCR038W-A，YCR101C，YCR104W，YCR105W，YCR106W，YCR107W，YCR108C，YDL003W，YDL037C，YDL064W，YDL073W，YDL094C，YDL095W，YDL096C，YDL136W，YDL143W，YDL152W，YDL191W，YDL200C，YDL201W，YDL247W-A，YDL248W，YDR014W，YDR015C，YDR034C-D，YDR039C，YDR045C，YDR098C-B，YDR160W，YDR210C-D，YDR210W-B，YDR215C，YDR225W，YDR261C-D，YDR261W-B，YDR292C，YDR302W，YDR304C，YDR305C，YDR342C，YDR344C，YDR364C，YDR365W-B，YDR427W，YDR433W，YDR471W，YDR510C-A，YDR543C，YDR544C，YEL012W，YEL075W-A，YER039C-A，YER046W-A，YER056C-A，
YER060W-A，YER074W，YER138C，YER187W，YER188C-A，YER190C-A，YFL002W-A，YFL014W，YFL019C，YFL020C，YFL030W，YFL031W，YFL051C，YFL052W，YFL053W，YFL054C，YFL055W，YFL056C，YFL063W，YFL065C，YFL066C，YFL067W，YFR012W-A，YGL028C，YGL041C，YGL052W，YGL210W-A，YGL259W，YGL262W，YGL263W，YGR034W，YGR038C-B，YGR089W，YGR107W，YGR109W-A，YIL082W-A，YGR122C-A，YGR146C，YGR148C，YGR161W-B，YGR182C，YGR183C，YGR271C-A，YGR290W，YGR295C，YHL009W-A，YHL009W-B，YHL015W-A，YHL046W-A，YHL047C，YHL048C-A，YHL048W，YHR032C-A，YHR032W-A，YHR039C-A，YHR043C，YHR070C-A，YHR071C-A，YHR071W，YHR141C，YHR165W-A，YHR179W，YHR180C-B，YHR180W-A，YHR182W，YHR193C，YHR193C-A，YHR207C，YHR211W，YHR213W-A，YHR216W，YHR217C，YHR218W-A，YIL029C，YIL052C，YIL069C，YIL148W，YIL171W，YIL174W，YIL176C，YIR018C-A，YIR041W，YIR042C，YIR043C，YIR044C，YJL012C-A，YJL014W，YJL062W-A，YJL136C，YJL175W，YJL222W-B，YJR024C，YJR027W，YJR032W，YJR053W，YJR054W，YJR094W-A，YJR107W，YJR110W，YJR111C，YJR140W-A，YJR151C，YJR152W，YJR153W，YJR154W，YJR155W，YJR162C，YKL018W，YKL020C，YKL044W，YKL224C，YKL225W，YKR012C，YKR013W，YKR017C，YKR018C，YKR019C，YKR020W，YKR035C，YKR036C，YKR040C，YKR041W，YKR042W，YKR052C，YKR053C，YKR057W，YKR062W，YKR094C，YKR102W，YKR103W，YKR104W，YLL014W，YLL030C，YLL037W，YLL038C，YLL043W，YLL065W，YLR029C，YLR030W，YLR062C，YLR098C，YLR099W-A，YLR107W，YLR139C，YLR140W，YLR142W，YLR144C，YLR145W，YLR154C-G，YLR154W-A，YLR154W-B，YLR154W-C，YLR154W-E，YLR154W-F，YLR155C，YLR156W，YLR157C-B，YLR157W-C，YLR162W，YLR205C，YLR207W，YLR209C，YLR227W-B，YLR236C，YLR237W，YLR238W，YLR245C，YLR251W，YLR271W，YLR278C，YLR287C-A，YLR305C，YLR306W，YLR311C，YLR317W，YLR338W，YLR344W，YLR345W，YLR354C，YLR364W，YLR380W，YLR401C，YLR402W，
YLR410W-B，YLR411W，YLR412C-A，YLR412W，YLR413W，YLR448W，YLR460C，YLR461W，YLR463C，YLR465C，YML003W，YML039W，YML073C，YMR087W，YMR143W，YMR175W-A，YMR247W-A，YMR268W-A，YMR324C，YMR325W，YNL020C，YNL035C，YNL054W-B，YNL243W，YNR034W-A，YNR075C-A，YNR077C，YOL038C-A，YOL053W，YOL101C，YOL103W-B，YOL162W，YOL163W，YOL164W，YOL164W-A，YOL165C，YOL166C，YOL166W-A，YOR050C，YOR096W，YOR101W，YOR192C-B，YOR192C-C，YOR225W，YOR235W，YOR343W-B，YOR366W，YOR381W-A，YOR382W，YOR383C，YOR384W，YOR385W，YOR386W，YOR387C，YOR389W，YPL003W，YPL019C，YPL023C，YPL036W，YPL048W，YPL055C，YPL060C-A，YPL175W，YPL194W，YPL197C，YPL257W-B，YPR002C-A，YPR008W，YPR014C，YPR028W，YPR043W，YPR048W，YPR087W，YPR094W，YPR108W，YPR137C-B，YPR161C，YPR162C，YPR163C，YPR164W，YPR165W，YPR166C，YPR167C，YPR168W，YPR169W，YPR169W-A，YPR170C，YPR170W-A，YPR171W，YPR172W，YPR173C，YPR174C，YPR175W，YPR176C，YPR177C，YPR178W，YPR179C，YPR180W，YPR181C，YPR182W，YPR183W，YPR184W，YPR185W，YPR186C，YPR187W，YPR188C，YPR189W，和YPR190C(3)被包含于GenBank登錄號(hào)AY130327，BAA96796.1，BAA96795.1，BAA14032.1，NP_012081.1，NP_009338.1，BAA19915.1，P39711，AY130305，AF399764，AX684850，AB044575，AF114923，AF114915，AF114903，M81158，AJ229060，X12576，X00731，X01963
(4)被包含于GenBank Accession No.J04423.1，J04423.1，J04423.1，J04423.1，J04423.1，J04423.1，J04423.1，X03453.1，X03453.1，L38424.1，L38424.1，L38424.1，X17013.1，X17013.1，X17013.1，M24537.1，M24537.1，M24537.1，X04603.1，X04603.1，X04603.1，K01391.1，K01391.1，K01391.1，J04423.1，J04423.1，J04423.1，J04423.1，J04423.1，J04423.1，J04423.1，X03453.1，X03453.1，L38424.1，L38424.1，L38424.1，X17013.1，X17013.1，X17013.1，M24537.1，M24537.1，M24537.1，X04603.1，X04603.1，X04603.1，V01288.1，V01288.1，V01288.1，X16860.1，X16860.1，X16860.1，L12026.1，L12026.1，L12026.1，Z75578.1，Z75578.1，Z75578.1，Z75578.1，Z75578.1，J01355.1，J01355.1，J01355.1，J01355.1和J01355.1(實(shí)施例18)在鋅缺乏條件下高度可誘導(dǎo)的分子標(biāo)記的鑒別1. mRNA的制備菌株34/70在LZMM培養(yǎng)基+40uM硫酸鋅中于30℃下振蕩生長(zhǎng)過(guò)夜。LZMM培養(yǎng)基含有0.17％酵母氮基w/o氨基酸(DIFCO制造)，0.5％硫酸銨，20mM檸檬酸鈉(pH 4.2)，125μM MnCl2，10μM FeCl2，2％麥芽糖，10mM EDTA(pH 8.0)。收集細(xì)胞并以消毒過(guò)的蒸餾水清洗三次，隨后在500mL下列培養(yǎng)基中接種至光密度(OD600)為0.25∶1)除去鋅的培養(yǎng)基(LZMM培養(yǎng)基)，2)加入鋅的培養(yǎng)基(LZMM+40uM硫酸鋅)，3)氧化壓力性培養(yǎng)基(LZMM+40uM硫酸鋅+2mM H2O2)，4)碳源缺乏性培養(yǎng)基(從上面的LZMM+40uM硫酸鋅中除去麥芽糖)。細(xì)胞在30℃生長(zhǎng)6小時(shí)，并被收集用于RNA制備。
總RNA的制備應(yīng)用RNeasyMini Kit(QIAGEN制造)根據(jù)所附指南進(jìn)行。Poly(A)+來(lái)自總RNA的mRNA的制備應(yīng)用Oligotex DirectmRNA試劑盒(QIAGEN制造)并根據(jù)所附指南進(jìn)行。
2.生物素標(biāo)記的cRNA的合成生物素標(biāo)記的cRNA的合成應(yīng)用BioArray HighYield RNATranscript Labeling Kit(Affymetrix制造)根據(jù)所附指南進(jìn)行。
3.雜交5μg的生物素標(biāo)記的cRNA，1.7μl的3nM ControlOligonucleotide B2(Affymetrix制造)，5μl的20X EukaryoticHybridization Controls(Affymetrix制造)，1μl的10mg/mlHerring Sperm DNA(Affymetrix制造)，1μl的50mg/ml乙?；疊SA(Affymetrix制造)，50μl的2X Hybridization緩沖液(Affymetrix制造)，和水(Affymetrix制造)混合，終體積為100μl，并根據(jù)Affymetrix的技術(shù)指南雜交到DNA微陣列。雜交16小時(shí)后，雜交混合物被除去，而DNA微陣列應(yīng)用GeneChipFludics Station(Affymetrix制造)清洗，并用600μl的鏈霉親和素藻紅素(300μl的2X MES Stain Buffer(Affymetrix制造)，24μl的50mg/ml乙酰化BSA(Affymetrix制造)，6μl的1mg/ml鏈霉親和素-藻紅素(Affymetrix制造)，270μl的水(Affymetrix制造))根據(jù)Affymetrix的技術(shù)指南染色。
4.數(shù)據(jù)分析微陣列的信號(hào)強(qiáng)度的探測(cè)應(yīng)用Gene Chip Analysis Basic System和分析軟件(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0)根據(jù)Affymetrix的技術(shù)指南進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用GCOS中的All Probe Set進(jìn)行以調(diào)整比較分析中的信號(hào)。應(yīng)用GCOS創(chuàng)建基因表達(dá)的比較文件，其比較(1)除去鋅的條件與加入鋅的條件，(2)氧化壓力條件與加入鋅的條件，及(3)碳源缺乏性條件與加入鋅的條件。只在上面的比較(1)中其表達(dá)以信號(hào)對(duì)數(shù)比被增加超過(guò)了0.3的基因顯示在表4中。
Sc-1159-1_at，Sc-1161-1_at，Sc-5030-1_at，Sc-2123-1_at分別對(duì)應(yīng)于Sc YGL258W，Sc YGL256W，Sc YOL154W，Sc YKL175W。且已知這些基因在除去鋅的條件下被轉(zhuǎn)錄性地誘導(dǎo)(Higgins，V.J.等人，Appl.Environ.Microbiol.，697535-7540(2003))。Lg-4216-1_s_at被設(shè)計(jì)成對(duì)應(yīng)于非Sc YKL175W(具有鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)物活性)。已知鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)物在除去鋅的條件下被轉(zhuǎn)錄性地誘導(dǎo)總之，以下這點(diǎn)已被顯示出，即除去鋅的條件下被高度誘導(dǎo)的分子標(biāo)記能應(yīng)用底部發(fā)酵酵母DNA微陣列而被鑒別。
(表4)

信號(hào)對(duì)數(shù)比(2n)指明了當(dāng)兩個(gè)陣列被比較時(shí)轉(zhuǎn)錄的幅度和方向。通過(guò)探測(cè)指出，基于以GCOS中的默認(rèn)參數(shù)通過(guò)探測(cè)算法計(jì)算出的探測(cè)p值，轉(zhuǎn)錄子是被可靠地探測(cè)(P；存在)還是無(wú)法探測(cè)(A；缺乏)。變化指出，基于以GCOS中的默認(rèn)參數(shù)通過(guò)變化算法計(jì)算出的變化p值，轉(zhuǎn)錄是可靠地增加(I；增加)還是減少(D；減少)或不變(NC；不變)?；蛎Q指明了對(duì)應(yīng)的探針組被設(shè)計(jì)的位置。類型指明了基因是ScORF(Sc)還是非Sc ORF(非Sc)。
(實(shí)施例19)啤酒發(fā)酵條件下的釀酒酵母基因表達(dá)分析應(yīng)用菌株34/70的發(fā)酵試驗(yàn)在下面的條件下進(jìn)行。
原始提取12.84％發(fā)酵規(guī)模2升溶解氧濃度約9ppm發(fā)酵溫度15℃接種率10g的濕酵母細(xì)胞/2L的麥芽汁麥芽汁被定期取樣，并監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)(OD 600)(圖12-(a))和表觀提取值(圖12-(b))。mRNA提取自接種42小時(shí)后的發(fā)酵試管中取出的細(xì)胞，生物素標(biāo)記，并與如實(shí)施例18中所述的底部發(fā)酵酵母DNA微陣列雜交。信號(hào)強(qiáng)度的探測(cè)應(yīng)用Affymetrix制造的Gene ChipAnalysis Basic System和分析軟件(GCOS；GeneChip OperatingSoftware 1.0)進(jìn)行。
存在不少的基因，其Sc類型探針組和非Sc類型探針組顯示非常不同的信號(hào)強(qiáng)度。涉及啤酒發(fā)酵過(guò)程中的亞硫酸產(chǎn)生的SSU1基因和MET14基因的實(shí)例顯示在表5中。在菌株34/70的SSU1基因和MET14基因的情形中，非Sc類型的表達(dá)分別高于Sc類型的表達(dá)3.4倍和7倍。
為了證實(shí)此差異既不是因?yàn)槊恳惶结樈M的雜交效率不同也不是因?yàn)镾c和非Sc類型探針組之間的交叉雜交，與底部發(fā)酵酵母DNA微陣列的比較性的基因組雜交應(yīng)用菌株34/70，實(shí)驗(yàn)室菌株(啤酒糖酵母)S288C和卡爾斯伯酵母(S.carlsbergensis)株IF011023進(jìn)行。基因組DNA的制備，與DNA微陣列的雜交及信號(hào)強(qiáng)度的探測(cè)以前述方法進(jìn)行。如表6中所示，非Sc類型的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)Sc類型的比，在菌株34/70中對(duì)于SSU1基因是1.0而對(duì)于MET14基因是1.3。此結(jié)果顯示Sc和非Sc探針組的雜交效率幾乎相同。
此外，不具有非Sc類型基因的菌株S288C對(duì)非Sc類型探針組顯示非常低的信號(hào)強(qiáng)度，而不具有Sc類型SSU1基因和Sc類型MET14的菌株IF011023，對(duì)Sc類型SSU1和Sc類型MET14探針組顯示非常低的信號(hào)強(qiáng)度。這些結(jié)果清晰地表明交叉雜交不在Sc和非Sc類型探針組之間發(fā)生。
根據(jù)這些結(jié)果，在菌株34/70中，非Sc SSU1和非Sc MET14的表達(dá)分別顯著高于Sc SSU1和Sc MET14的那些。這些基因被認(rèn)為是對(duì)底部發(fā)酵酵母的亞硫酸高生產(chǎn)能力起作用的候選者。
總之，這一點(diǎn)已被證明，即應(yīng)用底部發(fā)酵酵母DNA微陣列的釀酒酵母株的基因表達(dá)分析在用于功能分析的基因的選出中有用。
(表5)

(表6)

(實(shí)施例20)通過(guò)與底部發(fā)酵酵母DNA微陣列的比較性基因組雜交對(duì)釀造菌株進(jìn)行分類酵母基因組DNA的制備和與DNA微陣列的雜交按實(shí)施例8中所述進(jìn)行。微陣列信號(hào)強(qiáng)度的探測(cè)應(yīng)用Affymetrix制造的Gene ChipAnalysis Basic System和分析軟件(GCOS；GeneChip OperatingSoftware 1.0)進(jìn)行。與釀酒酵母DNA雜交的探針的百分比被計(jì)算，而菌株34/70與試驗(yàn)菌株間的同一性被評(píng)估，如表7中所示。菌株BH225，BH232和BH235與超過(guò)99％的底部發(fā)酵酵母DNA微陣列的Sc類型和非Sc類型探針雜交。它暗示了這些菌株非常類似于菌株34/70，及此微陣列對(duì)這些菌株的基因表達(dá)分析有用。另一方面，菌株BH212顯示相對(duì)低的雜交百分比(對(duì)Sc類型和非Sc類型探針?lè)謩e是97.8％和97.7％)，這意味著此菌株與菌株34/70有很小一點(diǎn)差異。根據(jù)這些結(jié)果，larger釀造菌株之間的關(guān)系能被評(píng)估，而larger釀造菌株的分類能被進(jìn)行。
根據(jù)對(duì)菌株BH212分析的結(jié)果，顯示非常低的信號(hào)強(qiáng)度的某些基因座位被發(fā)現(xiàn)。它們可能在菌株BH212中被丟失了，或者它們的序列可與菌株34/70的那些有差異。相反地，顯示高信號(hào)強(qiáng)度的某些基因座位也被發(fā)現(xiàn)。這些基因座位在菌株BH212中的拷貝數(shù)目可能較高。這類基因座位能被選用于功能分析，因?yàn)樗鼈兛蓪?duì)菌株BH212和菌株34/70間的發(fā)酵特性的差異起作用。
(表7)雜交的探針百分比

(實(shí)施例21)核苷酸多態(tài)性的探測(cè)此外，(單)核苷酸多態(tài)性通過(guò)比較性基因組雜交的分析可被探測(cè)。每一探針的寡核苷酸組由完全匹配寡核苷酸(PM)和錯(cuò)配寡核苷酸(MM)組成，前者與菌株34/70的序列一樣，后者在寡核苷酸的中心位置含有單個(gè)堿基的錯(cuò)配。實(shí)驗(yàn)室菌株S288C的基因組DNA與底部發(fā)酵酵母DNA微陣列雜交。如表8中所示，在MM中顯示比PM中更高(超過(guò)5倍)信號(hào)的探針具有單核苷酸多態(tài)性。
(表8)

工業(yè)應(yīng)用性匯編了工業(yè)酵母(或尤其是用于酒精飲料如啤酒的生產(chǎn)的釀酒酵母)的全基因組序列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)被制備。應(yīng)用這一數(shù)據(jù)庫(kù)，釀酒酵母的基因被選出，且基因功能通過(guò)酵母細(xì)胞中的破壞或過(guò)表達(dá)而被分析，還發(fā)現(xiàn)了參與所期望的釀造特性的基因。此外，有可能通過(guò)調(diào)控所述基因的表達(dá)培育酵母株，并生產(chǎn)產(chǎn)量和質(zhì)量得到改善的醇或酒精飲料，例如具有高濃度亞硫酸(在產(chǎn)品中顯示抗氧化活性)、極佳的風(fēng)味穩(wěn)定性和更長(zhǎng)保質(zhì)期的酒精飲料。
基于匯編了工業(yè)酵母或尤其是釀酒酵母的全基因組序列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)，DNA陣列被生產(chǎn)。應(yīng)用該DNA陣列，有可能分析基因的功能，對(duì)工業(yè)酵母進(jìn)行分類及探測(cè)核苷酸多態(tài)性等等。
序列表<110>Suntory Limited<120>釀酒酵母基因的篩選方法<130>S07F1263<160>32<210>1<211>1377<212>DNA<213>糖酵母屬物種<400>1atggtcgcta gttggatgct cactgccaca agggatttca accctttcat gtttgtcatg 60gttatggggg tcggtatttc atcgaatatt ctgtacagct tcccgtatcc ggcgaggtgg 120ctgaggatat gctcgtacat catgtttgcc attacatgtt tgattttcat ctctgtacag 180gcgctgcagc ttttgcacat ggtcatctat atcaaagaaa aaagctttag agattacttc 240aatgaatatt tcagaagtct gaagtacaat ttattttggg gtacttatcc catgggatta 300gtaacaatca taaatttttt gggggcgctg tcacaaaaat ttaccacgac aagccctgcg 360aatgccaagc acttgatcat ttttgtttac gtcctgtggt ggtatgacct cgcggtttgt 420ttagtaaccg cttgggggat ttcattcctc atctggcaaa agtactactt cgtggacggg 480gttggaaatc actcttcata cagttcacga atggcttccg accacatgaa aagcgtactg 540ttgctagata tcattccgct ggtcgttgtc gcttcgagcg gtgggacatt tacaatgtca 600
aaaatattcg gtaccacttt tgataggaat attcaattgc taacactggt catctgtgcc 660ctggtttggc tacacgctct tatatttgtc tttattctga ttacaatata cttctggaat 720ctttacatca ataagatacc accaatgacg caggtattta cgttgttctt ggtattgggg 780ccattgggcc aaggaagttt tggtattttg ttgcttactg acaatataag aaagtatgta 840gaaaaatact acccaaggga aaacatcacc atggaacaag aaatactaac cattatggtt 900ccgtggtgtt tcaaggttct gggcatgaca tttgctttgg cattaatcgc tatgggttac 960ttctttacgg taatttccct tatttcgatt ttatcatact acaatgaaag agttgttgac 1020aatgaaacag gcaaagtgaa aaggatctac actttccata aaggtttctg ggggatgact 1080ttcccgatgg gtaccatgtc tttgggaaac gaggagctgt atctgcaata caaccagtat 1140gttcccttat atgcattcag agtcatagct accatatatg gtggtatttg tgtttgctgg 1200tcaatcttat gcctctcgtg cacgttgtat ggttacctga aaacgattct ccatgctgcc 1260cgtaaacctt cgtttttatc agaggaaggg acggagaaga ctgtcaattc tcctttcaac 1320agcatcgaaa gtgtggagga atcaaactcg gctatcgata gtacatattt aacataa1377<210>2<211>609<212>DNA<213>糖酵母屬物種<400>2atggctacta atatcacttg gcatccaaat cttacctacg acgaacgtaa ggaattaaga 60aagcaagacg gctgtaccgt ttggttgacc ggtctaagtg cgtcaggaaa aagtacaata 120gcttgtgcac tggaacaatt actgcttcaa aaaaacttat ctgcttatag gttagatggt 180gataacattc gttttggttt gaataaggat ttgggcttct cagaaaagga cagaaatgaa 240aacattcgta gaattagtga agtatccaag ctattcgctg attcgtgtgc tgtatccatc 300acttcattta tttccccata cagagtcgat agagacagag cccgtgattt acataaggaa 360gcaggcttga agttcattga aatttttgtt gatgttccat tagaagtcgc tgagcaaaga 420gaccctaagg gtttgtataa gaaagccaga gaaggtgtga ttaaagagtt cactggtatt 480
tcagctcctt acgaagctcc aaaggcccca gagttgcatt taagaactga ccaaaagact 540gttgaagaat gtgctgctat catttatgag tacctggtca atgagaagat tatccggaag 600catctataa 609<210>3<211>458<212>PRT<213>糖酵母屬物種<400>3Met Val Ala Ser Trp Met Leu Thr Ala Thr Arg Asp Phe Asn Pro5 10 15Phe Met Phe Val Met Val Met Gly Val Gly Ile Ser Ser Asn Ile20 25 30Leu Tyr Ser Phe Pro Tyr Pro Ala Arg Trp Leu Arg Ile Cys Ser35 40 45Tyr Ile Met Phe Ala Ile Thr Cys Leu Ile Phe Ile Ser Val Gln50 55 60Ala Leu Gln Leu Leu His Met Val Ile Tyr Ile Lys Glu Lys Ser65 70 75Phe Arg Asp Tyr Phe Asn Glu Tyr Phe Arg Ser Leu Lys Tyr Asn80 85 90Leu Phe Trp Gly Thr Tyr Pro Met Gly Leu Val Thr Ile Ile Asn95 100 105Phe Leu Gly Ala Leu Ser Gln Lys Phe Thr Thr Thr Ser Pro Ala110 115 120
Asn Ala Lys His Leu Ile Ile Phe Val Tyr Val Leu Trp Trp Tyr125 130 135Asp Leu Ala Val Cys Leu Val Thr Ala Trp Gly Ile Ser Phe Leu140 145 150Ile Trp Gln Lys Tyr Tyr Phe Val Asp Gly Val Gly Asn His Ser155 160 165Ser Tyr Ser Ser Arg Met Ala Ser Asp His Met Lys Ser Val Leu170 175 180Leu Leu Asp Ile Ile Pro Leu Val Val Val Ala Ser Ser Gly Gly185 190 195Thr Phe Thr Met Ser Lys Ile Phe Gly Thr Thr Phe Asp Arg Asn200 205 210Ile Gln Leu Leu Thr Leu Val Ile Cys Ala Leu Val Trp Leu His215 220 225Ala Leu Ile Phe Val Phe Ile Leu Ile Thr Ile Tyr Phe Trp Asn230 235 240Leu Tyr Ile Asn Lys Ile Pro Pro Met Thr Gln Val Phe Thr Leu245 250 255Phe Leu Val Leu Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Ile Leu260 265 270Leu Leu Thr Asp Asn Ile Arg Lys Tyr Val Glu Lys Tyr Tyr Pro275 280 285Arg Glu Asn Ile Thr Met Glu Gln Glu Ile Leu Thr Ile Met Val290 295 300Pro Trp Cys Phe Lys Val Leu Gly Met Thr Phe Ala Leu Ala Leu305 310 315Ile Ala Met Gly Tyr Phe Phe Thr Val Ile Ser Leu Ile Ser Ile320 325 330Leu Ser Tyr Tyr Ash Glu Arg Val Val Asp Ash Glu Thr Gly Lys
335 340 345Val Lys Arg Ile Tyr Thr Phe His Lys Gly Phe Trp Gly Met Thr350 355 360Phe Pro Met Gly Thr Met Ser Leu Gly Asn Glu Glu Leu Tyr Leu365 370 375Gln Tyr Asn Gln Tyr Val Pro Leu Tyr Ala Phe Arg Val Ile Ala380 385 390Thr Ile Tyr Gly Gly Ile Cys Val Cys Trp Ser Ile Leu Cys Leu395 400 405Ser Cys Thr Leu Tyr Gly Tyr Leu Lys Thr Ile Leu His Ala Ala410 415 420Arg Lys Pro Ser Phe Leu Ser Glu Glu Gly Thr Glu Lys Thr Val425 430 435Asn Ser Pro Phe Asn Ser Ile Glu Ser Val Glu Glu Ser Asn Ser440 445 450Ala Ile Asp Ser Thr Tyr Leu Thr455 458<210>4<211>202<212>PRT<213>糖酵母屬物種<400>4Met Ala Thr Asn Ile Thr Trp His Pro Asn Leu Thr Tyr Asp Glu5 10 15
Arg Lys Glu Leu Arg Lys Gln Asp Gly Cys Thr Val Trp Leu Thr20 25 30Gly Leu Ser Ala Ser Gly Lys Ser Thr Ile Ala Cys Ala Leu Glu35 40 45Gln Leu Leu Leu Gln Lys Asn Leu Ser Ala Tyr Arg Leu Asp Gly50 55 60Asp Asn Ile Arg Phe Gly Leu Asn Lys Asp Leu Gly Phe Ser Glu65 70 75Lys Asp Arg Asn Glu Asn Ile Arg Arg Ile Ser Glu Val Ser Lys80 85 90Leu Phe Ala Asp Ser Cys Ala Val Ser Ile Thr Ser Phe Ile Ser95 100 105Pro Tyr Arg Val Asp Arg Asp Arg Ala Arg Asp Leu His Lys Glu110 115 120Ala Gly Leu Lys Phe Ile Glu Ile Phe Val Asp Val Pro Leu Glu125 130 135Val Ala Glu Gln Arg Asp Pro Lys Gly Leu Tyr Lys Lys Ala Arg140 145 150Glu Gly Val Ile Lys Glu Phe Thr Gly Ile Ser Ala Pro Tyr Glu155 160 165Ala Pro Lys Ala Pro Glu Leu His Leu Arg Thr Asp Gln Lys Thr170 175 180Val Glu Glu Cys Ala Ala Ile Ile Tyr Glu Tyr Leu Val Asn Glu185 190 195Lys Ile Ile Arg Lys His Leu200<210>5
<211>15<212>人工序列<213>M13_for<400>5agtcacgacg ttgta15<210>6<211>17<212>人工序列<213>M13_rv<400>6caggaaacag ctatgac 17<210>7<211>22<212>人工序列<213>SS-cosF.1
<400>7aggcgtatca cgaggccctt tc22<210>8<211>29<212>人工序列<213>SS-cosR.1<400>8cttatcgatg ataagcggtc aaacatgag 29<210>9<211>36<212>人工序列<213>XVI-1(L)cer-95894<400>9cgcaagctcc gtacgttcaa cattcttatg aacggc 36<210>10<211>36
<212>人工序列<213>XVI-1(R)nonSc-106302rv<400>10gcatcatcgt cgtgatcctt ctttggcaaa tgcagg 36<210>11<211>36<212>人工序列<213>XVI-2(L)cer-859737<400>11gcgggtattt tgatggtaaa tctacaagcc ctcggc 36<210>12<211>35<212>人工序列<213>XVI-2(R)nonSc-864595rv<400>12cccagacaca gtttccagta tcatcctcgc agaac 35
<210>13<211>26<212>人工序列<213>SacI-nonScSSU1_for1<400>13gagctcatgg tcgctagttg gatgct26<210>14<211>26<212>人工序列<213>BglII-nonScSSU1_rv1460<400>14agatctcagc ttcagcccaa tccatt26<210>15<211>26<212>人工序列<213>SacI-ScSSU1_for1
<400>15gagctcatgg ttgccaattg ggtact26<210>16<211>26<212>人工序列<213>BglII-ScSSU1_rv1406<400>16agatctctcc tacatgaaat gcttgc26<210>17<211>120<212>人工序列<213>nonScSSU1_for<400>17atggtcgcta gttggatgct cactgccaca agggatttca accctttcat atcgaatatt 60ctgtacagct gtttgtcatg gttatggggg tcggtatttc ccttgacagt cttgacgtgc 120
<210>18<211>120<212>人工序列<213>nonScSSU1_rv<400>18tgttaaatat gtactatcga tagccgagtt tgattcctcc acactttcga acagtcttct 60ccgtcccttc ctctgataaa tgctgttgaa aggagaattg cgcacttaac ttcgcatctg 120<210>19<211>120<212>人工序列<213>ScSSU1_for<400>19atggttgcca attgggtact tgctcttacg aggcagtttg accccttcat gtttatgatg 60gtcatgggtg tcggcatttc atcgaatatt ctatatagct ccttgacagt cttgacgtgc 120<210>20<211>120<212>人工序列
<213>ScSSU1_rv<400>20ttatgctaaa cgcgtaaaat ctagagccga gtttgattct tccacgcttt caatgctgtt 60atacggagaa actgtcgtct tttccgtacc tgactctgaa cgcacttaac ttcgcatctg 120<210>21<211>120<212>人工序列<213>nonScSSU1_for+pGAPAUR<400>21atggtcgcta gttggatgct cactgccaca agggatttca accctttcat gtttgtcatg 60gttatggggg tcggtatttc atcgaatatt ctgtacagct ccggagctta ccagttctca 120<210>22<211>120<212>人工序列<213>nonScSSU1_rv+AUR1-C<400>22
tgttaaatat gtactatcga tagccgagtt tgattcctcc acactttcga tgctgttgaa 60aggagaattg acagtcttct ccgtcccttc ctctgataaa tcgactctag aggatccaga 120<210>23<211>20<212>人工序列<213>ScSSU1_for331<400>23tcgaaagcga acacgacgaa 20<210>24<211>21<212>人工序列<213>ScSSU1_982rv<400>24cgacagaaat cacggtgaaa a 21<210>25<211>22
<212>人工序列<213>nonScSSU1_329<400>25tgtcacaaaa atttaccacg ac 22<210>26<211>22<212>人工序列<213>nonScSSU1_981rv<400>26aagggaaatt accgtaaaga ag 22<210>27<211>21<212>人工序列<213>PDA1_for1<400>27atgtttgtcg cacctgtatc t 21
<210>28<211>18<212>人工序列<213>PDA1_730rv<400>28gattagaggc accatcac 18<210>29<211>33<212>人工序列<213>SacI-nonSc-MET14_for-21<400>29ctcgagctct cgtgaaattc attgaaacaa atg33<210>30<211>30<212>人工序列<213>BamHI-nonSc-MET14_rv618
<400>30ggatccttat aagatttata gatgcttccg 30<210>31<211>33<212>人工序列<213>SacI-ScMET14_for<400>31ctcgagctca gaaaagttgg aattatttct cca 33<210>32<211>30<212>人工序列<213>BamHI-ScMET14_rv<400>32ggatccaatg tacagtaatc ggtcaaatta 30
權(quán)利要求
1.對(duì)于在醇或酒精飲料生產(chǎn)中參與產(chǎn)量增加和/或風(fēng)味改善的基因的篩選方法，特征在于(a)工業(yè)酵母的全部基因組序列被分析，(b)這些序列與啤酒糖酵母的那些序列進(jìn)行比較，(c)與啤酒糖酵母的基因所編碼的氨基酸序列具有70到97％同一性的工業(yè)酵母的氨基酸序列的編碼基因被選出，及(d)對(duì)選出的基因進(jìn)行功能分析，由此鑒定所述基因所賦予酵母的特性。
2.權(quán)利要求1的篩選方法，其中DNA陣列被用于權(quán)利要求1(d)中的功能分析。
3.權(quán)利要求2的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，一種或多種包含下列DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸被粘附到固體支持物；DNA序列(1)具有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的開(kāi)放閱讀框中的核苷酸，及(2)不存在于所述全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸區(qū)域之外的區(qū)域中。
4.權(quán)利要求2的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，一種或多種在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求3所定義的寡核苷酸雜交的寡核苷酸被粘附到固體支持物。
5.權(quán)利要求2的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，一種或多種包含下列DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸被粘附到固體支持物；DNA序列(1)具有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的非編碼區(qū)域中的核苷酸，及(2)不存在于所述全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸區(qū)域之外的區(qū)域中。
6.權(quán)利要求2的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，一種或多種在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求5所定義的寡核苷酸雜交的寡核苷酸被粘附到固體支持物。
7.權(quán)利要求2的方法，其中應(yīng)用了DNA陣列，在所述DNA陣列中，選自下列四組中的兩組或更多組的寡核苷酸被粘附到固體支持物一種或多種權(quán)利要求3所定義的寡核苷酸；一種或多種權(quán)利要求4所定義的寡核苷酸；一種或多種權(quán)利要求5所定義的寡核苷酸；及一種或多種權(quán)利要求6所定義的寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任意項(xiàng)的篩選方法，其中所述工業(yè)酵母是釀酒酵母。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任意項(xiàng)的篩選方法，其中所述釀酒酵母是啤酒酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的篩選方法所得到的基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的基因，其特征在于，當(dāng)權(quán)利要求10提及的基因在酵母中表達(dá)時(shí)，酵母的培養(yǎng)基中的亞硫酸濃度增加。
12.包含SEQ ID NO1或2所表示DNA序列的DNA，和在嚴(yán)格條件下與所述DNA雜交的DNA。
13.具有SEQ ID NO3或4所表示氨基酸序列的多肽的編碼DNA，和具有一定氨基酸序列的多肽的編碼DNA，在所述一定氨基酸序列中，SEQ ID NO3或4所代表的氨基酸序列具有一到數(shù)個(gè)氨基酸殘基的缺失和/或替代和/或添加。
14.包含權(quán)利要求9到12中任意項(xiàng)所提及的基因或DNA的重組載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的重組載體，其中啟動(dòng)子和/或終止子位于權(quán)利要求10到13中任意項(xiàng)所提及的基因或DNA的鄰近位置。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的重組載體，其中啟動(dòng)子是顯示組成型表達(dá)的啟動(dòng)子。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的重組載體，其中啟動(dòng)子是甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子。
18.包含權(quán)利要求10到17中任意項(xiàng)所提及的基因或DNA或重組載體的轉(zhuǎn)化子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)化子，其中轉(zhuǎn)化子屬于糖酵母屬的酵母。
20.權(quán)利要求10到13中任意項(xiàng)提及的基因或DNA所編碼的多肽或具有一定氨基酸序列的多肽，在所述一定氨基酸序列中，所述多肽的氨基酸序列具有一個(gè)到數(shù)個(gè)氨基酸殘基的缺失和/或替代和/或添加。
21.具有SEQ ID NO3或4所表示氨基酸序列的多肽或具有一定氨基酸序列的多肽，在所述一定氨基酸序列中，SEQ ID NO3或4所表示的氨基酸序列具有一到數(shù)個(gè)氨基酸殘基的缺失和/或替代和/或添加。
22.生產(chǎn)醇或酒精飲料的方法，特征在于應(yīng)用了權(quán)利要求18或19所提及的轉(zhuǎn)化子。
23.適合生產(chǎn)醇或酒精飲料的酵母的培育方法，特征在于調(diào)控權(quán)利要求10或11所提及的基因或權(quán)利要求12或13所提及的DNA上的基因的表達(dá)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的培育方法，其中酵母屬于糖酵母屬。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的培育方法所得到的酵母。
26.應(yīng)用權(quán)利要求25提及的酵母生產(chǎn)醇或酒精飲料的方法。
27.應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求26的生產(chǎn)醇或酒精飲料的方法所生產(chǎn)的醇或酒精飲料。
28.DNA陣列，其中一種或多種包含下列DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸被粘附到固體支持物；DNA序列(1)具有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的開(kāi)放閱讀框中的核苷酸，及(2)不存在于所述全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸區(qū)域之外的區(qū)域中。
29.DNA陣列，其中在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求28所定義的寡核苷酸雜交的一種或多種寡核苷酸被粘附到固體支持物。
30.DNA陣列，其中一種或多種包含下列DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸被粘附到固體支持物；DNA序列(1)具有10到30個(gè)存在于工業(yè)酵母的全部基因組序列的非編碼區(qū)域中的核苷酸，及(2)不存在于所述全部基因組序列中除所述10到30個(gè)核苷酸區(qū)域之外的區(qū)域中。
31.DNA陣列，其中在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求30所定義的寡核苷酸雜交的一種或多種寡核苷酸被粘附到固體支持物。
32.DNA陣列，其中選自下列四組中的兩組或更多組的寡核苷酸被粘附到固體支持物一種或多種權(quán)利要求28所定義的寡核苷酸；一種或多種權(quán)利要求29所定義的寡核苷酸；一種或多種權(quán)利要求30所定義的寡核苷酸；及一種或多種權(quán)利要求31所定義的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明的目標(biāo)是提供對(duì)于參與所期望釀造特性的基因進(jìn)行選擇的方法，所述方法以這樣的方式進(jìn)行，即匯編了工業(yè)酵母尤其是用于酒精飲料如啤酒的釀酒酵母的全部基因組序列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)被制備；參與釀酒酵母所特異擁有的釀造特性的基因被從數(shù)據(jù)庫(kù)中選出；以及基因的功能分析通過(guò)破壞或過(guò)表達(dá)而進(jìn)行，并提供基于匯編了工業(yè)酵母或者尤其是釀酒酵母的全部基因組序列(被附著在固體平板上)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)的DNA陣列(其中寡核苷酸被選定)。另一目標(biāo)是提供酵母(其具有基因參與的釀造特性)的培育方法，以及生產(chǎn)醇或酒精飲料的方法(其中產(chǎn)量和質(zhì)量都應(yīng)用酵母而被改善)。另一目標(biāo)是提供釀酒酵母所特異的基因和基因所編碼的肽。實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的手段是對(duì)在醇或酒精飲料生產(chǎn)中參與產(chǎn)量增加和/或風(fēng)味改善的基因進(jìn)行篩選的方法，其特征在于(A)工業(yè)酵母的全部基因組序列得到分析，(B)基因組序列與啤酒糖酵母的全部基因組序列進(jìn)行了比較，(C)與啤酒糖酵母的基因所編碼的氨基酸序列有70到97％同一性的工業(yè)酵母的氨基酸序列的編碼基因被選出，及(D)進(jìn)行基因的功能分析，由此鑒定基因所賦予酵母的特性。
文檔編號(hào)C12C12/00GK1774512SQ200480009789
公開(kāi)日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2004年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者中尾嘉宏, 中村規(guī)尚, 兒玉由紀(jì)子, 藤村朋子, 蘆刈俊彥 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社