專利名稱：使用肺炎克雷伯氏菌生產(chǎn)1,2－丙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求2003年4月2日提交給韓國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局的韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?003-20734的優(yōu)先權(quán)，將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。
本發(fā)明涉及使用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiela pneumoniae)生產(chǎn)1，2-丙二醇的方法。
背景技術(shù)：
[3]1，2-丙二醇是一種用于生產(chǎn)旋光化合物中的非常有用的中間體，所述旋光化合物包括藥物、農(nóng)業(yè)化學(xué)制品、抗凍物和生理活性試劑。
按照已知的產(chǎn)生1，2-丙二醇的化學(xué)合成路徑，1，2-丙二醇可以通過(guò)衍生自丙烯的丙烯氧化物的氫化作用來(lái)產(chǎn)生。當(dāng)通過(guò)這種化學(xué)合成路徑產(chǎn)生1，2-丙二醇時(shí)，過(guò)量的水是必須的以抑制聚乙二醇的產(chǎn)生。此外，涉及1，2-丙二醇的產(chǎn)生的丙烯氧化物的產(chǎn)生需要昂貴的化學(xué)催化劑并且會(huì)導(dǎo)致大量的副產(chǎn)物，諸如氯乙醇和chroline，其導(dǎo)致了環(huán)境污染。
在產(chǎn)生1，2-丙二醇的已知生物方法中，通過(guò)使用大腸桿菌(E.coli)和其它微生物，將L-鼠李糖和L-巖藻糖用于產(chǎn)生它。但是，L-鼠李糖和L-巖藻糖非常昂貴并且使用這些材料是不經(jīng)濟(jì)的。Cameron等公開(kāi)了一種使用熱解糖好熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)HG-8(ATCC 31960)從葡萄糖中產(chǎn)生1，2-丙二醇的方法(Biotechnol.Prog.2001，卷17，第52～56頁(yè))。授權(quán)給Cameron等的美國(guó)專利號(hào)6,303,352公開(kāi)了一種使用重組大腸桿菌從葡萄糖中產(chǎn)生1，2-丙二醇的方法。
然而上面列出的所有的常規(guī)方法使用的菌株不包括肺炎克雷伯氏菌。已知的是，當(dāng)將肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)在包含6-脫氧已糖，諸如鼠李糖和巖藻糖的培養(yǎng)基中時(shí)，在厭氧條件下，1，2-丙二醇的產(chǎn)量增加。還已知使用肺炎克雷伯氏菌在需氧和厭氧條件下都可以從葡萄糖中產(chǎn)生1，2-丙二醇。然而，對(duì)于商業(yè)化來(lái)說(shuō)，產(chǎn)自葡萄糖的1，2-丙二醇的產(chǎn)量太低(Juan Aguilar等，J.Bact.Jan.1985，435-437)。
研究已經(jīng)集中于使用肺炎克雷伯氏菌從非糖碳源、價(jià)格低廉的糖碳源，諸如包括鼠李糖和巖藻糖的6-脫氧已糖中產(chǎn)生1，2-丙二醇的高效方法。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)將肺炎克雷伯氏菌于需氧條件下培養(yǎng)在包含大量常見(jiàn)糖碳源，諸如葡萄糖的培養(yǎng)基中時(shí)，1，2-丙二醇可以以高產(chǎn)量產(chǎn)生。
最佳方式[8]本發(fā)明將參考隨后的實(shí)施例更詳細(xì)地進(jìn)行描述。隨后的實(shí)施例是說(shuō)明性的而不意欲限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1培養(yǎng)肺炎克雷伯氏菌以產(chǎn)生1，2-丙二醇[10]將登記號(hào)為ATCC 25955的肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)在具有下面表1中組成的培養(yǎng)基中以進(jìn)行1，2-丙二醇的生產(chǎn)。生產(chǎn)1，2-丙二醇的培養(yǎng)基的pH為6.8。
表1.1，2-丙二醇生產(chǎn)培養(yǎng)基的組成[12]
將50mL的培養(yǎng)基注入250mL的擋板燒瓶中并在壓力下于121℃滅菌15分鐘。加入培養(yǎng)基中的葡萄糖也單獨(dú)滅菌。將滅菌的培養(yǎng)基和葡萄糖充分混合以獲得生產(chǎn)1，2-丙二醇的培養(yǎng)基。
將預(yù)培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)平板上的肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955接種在20mL LB肉湯中并于200rpm下培養(yǎng)24小時(shí)。將1mL培養(yǎng)的肉湯接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行1，2-丙二醇的生產(chǎn)并在37℃和200rpm培養(yǎng)24小時(shí)。
實(shí)施例2培養(yǎng)物中1，2-丙二醇的定量[16]測(cè)量獲自實(shí)施例1的培養(yǎng)物中的1，2-丙二醇的量。將1ml的培養(yǎng)物收集到1.5mL的管中并在12,000rpm離心10分鐘。將離心所得的上清液轉(zhuǎn)移到空管中并用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行5倍稀釋。使用高效液相色譜(HPLC)測(cè)量在每個(gè)稀釋樣品中1，2-丙二醇的量。
將結(jié)果顯示于下面的表2中。如表2中所示，1，2-丙二醇產(chǎn)生的量是3.838g/L，比通過(guò)使用常規(guī)方法(Juan Aguilar等，J.Bact.Jan.1985，435～437)獲得的1，2-丙二醇的量要高。
表2在培養(yǎng)物中1，2-丙二醇的量[19]
實(shí)施例3通過(guò)添加有機(jī)酸中間代謝物提高產(chǎn)量[21]研究了加入延胡索酸作為有機(jī)酸中間代謝物對(duì)1，2-丙二醇產(chǎn)量的影響。出于此目的，將1mM/L的延胡索酸加入實(shí)施例1中制備的產(chǎn)生1，2-丙二醇的培養(yǎng)基中。將肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955在與實(shí)施例1相同的條件下，培養(yǎng)在包含延胡索酸的培養(yǎng)基中，并且使用如實(shí)施例2所用的相同方法測(cè)量產(chǎn)生的1，2-丙二醇的量。
結(jié)果顯示于下面的表3中。如表3中所示，與實(shí)施例2的結(jié)果相比，2，3-丙二醇的產(chǎn)量顯著增加，實(shí)施例2中沒(méi)有添加延胡索酸到實(shí)施例1制備的產(chǎn)生1，2-丙二醇的培養(yǎng)基中。
表3使用含延胡索酸的培養(yǎng)基產(chǎn)生的1，2-丙二醇的量[24]
基于上述實(shí)施例的結(jié)果，證實(shí)了通過(guò)于需氧條件中，將肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)在包含過(guò)量糖碳源的培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生比使用常規(guī)方法所產(chǎn)生的更高的1，2-丙二醇的產(chǎn)量。此外，當(dāng)將有機(jī)酸作為中間代謝物添加到產(chǎn)生1，2-丙二醇的培養(yǎng)基中時(shí)，可以進(jìn)一步提高1，2-丙二醇的產(chǎn)量。
發(fā)明方式[26]本發(fā)明提供一種通過(guò)在需氧條件下將肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)在包含常見(jiàn)糖碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)生1，2-丙二醇的高效方法。
按照本發(fā)明的一方面，提供一種產(chǎn)生1，2-丙二醇的方法，所述方法包括將肺炎克雷伯氏菌在需氧條件下培養(yǎng)在包含10-30g/L的糖碳源的培養(yǎng)基中，所述糖碳源不包括6-脫氧己糖；和(b)從培養(yǎng)物中分離1，2-丙二醇。
按照本發(fā)明實(shí)施方案產(chǎn)生1，2-丙二醇的高效方法包括在需氧條件下，將肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)在包含糖碳源的培養(yǎng)基中，所述糖碳源不包括6-脫氧已糖；和從培養(yǎng)物中分離1，2-丙二醇。肺炎克雷伯氏菌可以是登記號(hào)為ATCC 25955的菌株。使用常用方法，例如，離子交換層析、高效液相色譜(HPLC)和結(jié)晶法可以從培養(yǎng)物中分離1，2-丙二醇。
或者，培養(yǎng)基還可以包含有機(jī)酸作為中間代謝物。有機(jī)酸中間代謝物可以是，但不限于，選自由丙酮酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸組成的組中。對(duì)于分批培養(yǎng)，所有的有機(jī)酸中間代謝物可以在培養(yǎng)的起始階段添加到培養(yǎng)基中，而在補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中，可以在培養(yǎng)過(guò)程中將有機(jī)酸中間代謝物連續(xù)或間歇地添加。
按照本發(fā)明，糖碳源包括，但不限于，通?？傻玫奶?，諸如選自由阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖和前述的糖的組合組成的組中的糖。換言之，使用在本發(fā)明中的糖碳源不包括6-脫氧已糖，諸如鼠李糖和巖藻糖。優(yōu)選的糖碳源的實(shí)例是葡萄糖。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的是根據(jù)細(xì)胞代謝速度，在預(yù)定時(shí)期內(nèi)將培養(yǎng)基中的糖碳源的含量維持在過(guò)量。例如，糖碳源的量可以在10-30g/L，優(yōu)選地10-20g/L的范圍內(nèi)。如果是葡萄糖，糖碳源的量可以在，最優(yōu)選地10-30g/L的范圍內(nèi)。如果糖碳源的量高于30g/L或低于10g/L，1，2-丙二醇的產(chǎn)量較低。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可以每升包含5-15g的Na2HP4，3-8g的KH2PO4，0.5-4g的NH4Cl，2-7g的NaCl，3-10g的酵母提取物，0.1-3mmol的MgSO4，和10-30g的葡萄糖。
可以在30-37℃的溫度和pH 5-8的條件下進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌的培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，可以補(bǔ)充一定量的氧以提供需氧條件。例如，可以通過(guò)一般已知的供氧方法，例如通過(guò)搖動(dòng)培養(yǎng)器、使用攪拌器來(lái)攪拌或注入空氣來(lái)供給氧?？梢栽?-1vvm來(lái)供給氧。
工業(yè)適用性[34]如上所述，在按照本發(fā)明產(chǎn)生1，2-丙二醇的方法中，使用包含更廉價(jià)的常見(jiàn)糖碳源的培養(yǎng)基和肺炎克雷伯氏菌可以產(chǎn)生更高產(chǎn)量的1，2-丙二醇。當(dāng)有機(jī)酸作為中間代謝物添加到培養(yǎng)基中時(shí)，1，2-丙二醇的產(chǎn)量可以進(jìn)一步被提高。
盡管已經(jīng)參考其可仿效的實(shí)施方案說(shuō)明和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的是，在不背離如后附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍前提下，可以在其形式和細(xì)節(jié)上作出各種修改。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)1，2-丙二醇的方法，所述方法包括(a)將肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)于需氧條件下，培養(yǎng)在包含10-30g/L的糖碳源的培養(yǎng)基中，所述糖碳源不包括6-脫氧己糖；和(b)從所述培養(yǎng)物中分離1，2-丙二醇。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包括有機(jī)酸中間代謝物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中有機(jī)酸中間代謝物選自由丙酮酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸組成的組中。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中糖碳源選自由阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖和前述的糖的組合組成的組中。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基每升包含5-15g的Na2HP4，3-8g的KH2PO4，0.5-4g的NH4Cl，2-7g的NaCl，3-10g的酵母提取物，0.1-3mmol的MgSO4，和10-30g的葡萄糖。
6.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中在pH5-8和30-37℃的溫度的條件下在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)肺炎克雷伯氏菌。
7.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中在培養(yǎng)過(guò)程中，氧以0-1vvm進(jìn)行提供。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生1，2－丙二醇的方法。所述方法包括于需氧條件下，將肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)在包含10－30g/L的糖碳源的培養(yǎng)基中，所述糖碳源不包括6－脫氧已糖；并從所述培養(yǎng)物中分離1，2－丙二醇。使用所述方法，通過(guò)將肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)在包含更廉價(jià)糖碳源的培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生高產(chǎn)量的1，2－丙二醇。
文檔編號(hào)C12P7/18GK1780918SQ200480011487
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月2日
發(fā)明者樸英薰, 鄭珍守, 趙光命, 姜聲旭, 嚴(yán)惠媛 申請(qǐng)人:Cj株式會(huì)社