專利名稱：將分子遞送到細(xì)胞的方法和載體復(fù)合物的制作方法
本申請要求于2003年5月1日提交的序列號為60/467,516的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)。序列號為60/467,516的美國臨時申請的說明書的全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
本發(fā)明系在批準(zhǔn)號為P01-DA-08924的來自國家藥物濫用研究所的政府支持下完成的。美國政府對本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
生物細(xì)胞對于被允許穿過細(xì)胞膜的分子通常是高選擇性的。因此，將例如小分子和生物分子這樣的化合物遞送(或運送)進入細(xì)胞，通常受限于該化合物的物理性質(zhì)。該小分子和生物分子可以是，例如，具有藥物活性的化合物。
這樣的分子(包括大分子，如蛋白質(zhì)和核酸)在體內(nèi)被遞送至細(xì)胞內(nèi)的不足，已經(jīng)成為大量潛在有效的化合物在治療、預(yù)防和/或診斷中的應(yīng)用的障礙。此外，因為在體內(nèi)缺乏將化合物有效地遞送到細(xì)胞內(nèi)的能力，許多在體外看來很有前途的化合物已經(jīng)作為潛在的藥物而被放棄了。
許多報導(dǎo)都已提及通過共價地將化合物附著到“蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)閾”(PTDs)而將化合物遞送至細(xì)胞的問題。Schwarze等(TrendsPharmacol Sci.2000；2145-8)和授權(quán)給Dowdy的美國專利第6,221,355號披露了幾種能夠以濃度依賴性的方式穿過細(xì)胞的脂質(zhì)雙層的PTDs。所披露的PTDs包括來源于HIV-1tat蛋白、來源于由觸角足(簡寫為ANTP)基因編碼的果蠅同型轉(zhuǎn)錄因子、以及來源于單純皰疹病毒VP22轉(zhuǎn)錄因子的PTDs。HIV-1 tat PTD的長度為十一個氨基酸，ANTP PTD的長度為十六個氨基酸，而VP22 PTD的長度為34個氨基酸。
然而，最近出版的資料顯示這些PTDs經(jīng)由能量依賴性的胞吞作用而進入細(xì)胞。因此，“PTD-運載物”復(fù)合物包括在細(xì)胞內(nèi)涵體的小泡內(nèi)，而不存在于例如細(xì)胞的胞質(zhì)。因此，該“PTD-運載物”復(fù)合物必需從內(nèi)涵體的小泡釋放，以便具有生物活性(Richard et al.，J Biol.Chem.2003；278585-590；Drin et al.，J Biol.Chem.2003；27831192-31201)。此外，最近的報導(dǎo)表明PTDs對細(xì)胞是有毒性的。
因此，需要有能夠以不依賴能量的非胞吞方式穿過細(xì)胞的脂質(zhì)膜的肽。此外，為了避免通常周知的對較大的肽的免疫反應(yīng)，需要有較小的、耐肽酶的肽。最后，所述肽載體對于細(xì)胞沒有毒性，這也是很重要的。

發(fā)明內(nèi)容
通過本發(fā)明提供的一種用于將分子遞送到細(xì)胞的方法，從而滿足了這些要求。本方法包括將載體復(fù)合物與所述細(xì)胞接觸，其中該載體復(fù)合物包括所述分子和芳香族陽離子肽，并且其中該芳香族陽離子肽包括(a)至少一個凈正電荷；(b)最少三個氨基酸；(c)最多十個氨基酸；
(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為，其中3pm是小于或者等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為，其中3a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時，pt也可以為1。
在另一個具體實施例中，本發(fā)明提供了一種載體復(fù)合物，該載體復(fù)合物包括分子和芳香族陽離子肽，其中芳香族陽離子肽包括(a)至少一個凈正電荷；(b)最少三個氨基酸；(c)最多十個氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為，其中3pm是小于或者等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為，其中3a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時，pt也可以為1。
在另一個具體實施例中，本發(fā)明提供了一種用于將分子遞送至細(xì)胞的方法。該方法包括將分子和芳香族陽離子肽與細(xì)胞接觸，其中該芳香族陽離子肽包括(a)至少一個凈正電荷；(b)最少三個氨基酸；(c)最多十個氨基酸；
(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為，其中3pm是小于或者等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為，其中3a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時，pt也可以為1。


圖1.Caco-2細(xì)胞內(nèi)肽的攝取。[3H][Dmt1]DALDA(A)和[14C]Gly-Sar(B)的攝取的時間過程。在37℃或者4℃下，Caco-2細(xì)胞與[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)或者[14C]Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)孵育1小時。隨后在溶解后的細(xì)胞中測定放射性。(C)將[3H][Dmt1]DALDA的積聚物進行酸洗的結(jié)果。Caco-2細(xì)胞與[3H][Dmt1]DALDA在37℃下孵育1小時。在細(xì)胞溶解前，對細(xì)胞進行酸洗，以便去除與細(xì)胞表面結(jié)合的放射性(物質(zhì))。(D)[Dmt1]DALDA的濃度對[Dmt1]DALDA攝取的影響。細(xì)胞在37℃下與一定濃度范圍(1μM-3mM)的[Dmt1]DALDA孵育1小時。所有的數(shù)據(jù)用三個獨立單層的平均數(shù)±S.E.表示。其中誤差棒(errorbar)不明顯，它們比標(biāo)記組更小。
圖2.pH和DEPC對Caco-2細(xì)胞內(nèi)[3H][Dmt1]DALDA(A和C)和[14C]Gly-Sar(B和D)的攝取的影響。在37℃和不同pH條件下將Caco-2細(xì)胞與[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)或[14C]Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)孵育1小時(A和B)。在37℃下將細(xì)胞與[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)或[14C]Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)孵育1小時(C和D)之前，在25℃將細(xì)胞與0.2mM DEPC預(yù)先孵育10分鐘。所有的數(shù)據(jù)用三個獨立的單層的平均數(shù)±S.E.表示。
圖3.(A)[3H][Dmt1]DALDA在不同的細(xì)胞系中的攝取。在37℃將細(xì)胞與[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)孵育1小時。在細(xì)胞溶解前，將細(xì)胞酸洗，以便除去細(xì)胞表面結(jié)合的放射性。數(shù)據(jù)顯示了代表耐酸的放射性，并且用三個獨立的單層的平均數(shù)±S.E.表示。(B)[3H][Dmt1]DALDA與細(xì)胞膜的特異性結(jié)合。在25℃將從SH-SY5Y細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞制備的細(xì)胞膜與[3H][Dmt1]DALDA(15-960pM)孵育1小時。通過1μM未標(biāo)記的[Dmt1]DALDA的包含物評估非特異性結(jié)合。通過快過濾將游離的放射性配體與結(jié)合的放射性配體分離。沒有看到與Caco-2細(xì)胞的特異性結(jié)合。對于SH-SY5Y細(xì)胞，Kd值是118pM(范圍是87-149)，而Bmax值是96fmol/mg蛋白質(zhì)。
圖4.(A)[3H][Dmt1]DALDA(填充柱)和[14C]Gly-Sar(空心柱)的泄漏。在37℃或4℃用[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)或[14C]Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)將Caco-2細(xì)胞預(yù)先加載1小時。隨后用培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，并在37℃或4℃與培養(yǎng)基孵育1小時。在培養(yǎng)基和細(xì)胞溶解產(chǎn)物中均測定放射性，而數(shù)據(jù)用泄漏入培養(yǎng)基中的肽的百分?jǐn)?shù)表示。(B)DEPC對[3H][Dmt1]DALDA泄漏的影響。在用[3H][Dmt1]DALDA加載前，在25℃將細(xì)胞與0.2mMDEPC預(yù)先孵育10分鐘。(C)異搏定，一種p-糖蛋白抑制劑，對[3H][Dmt1]DALDA的泄漏(C)和攝取(D)的影響。
圖5.[3H][Dmt1]DALDA和[14C]Gly-Sar穿過Caco-2單層的轉(zhuǎn)運。將Caco-2細(xì)胞(2×105)接種在轉(zhuǎn)孔細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)的多微孔膜上。通過將[3H][Dmt1]DALDA或者[14C]Gly-Sar加入到頂部隔間來測定肽從頂部到底側(cè)的轉(zhuǎn)運，并且在加入肽后的不同時間將20-μl等分試樣從頂部和底側(cè)隔間移出，以便測定放射性。
圖6.[Dmt1，dnsDap4]DALDA和[Dmt1，atnDap4]DALDA的細(xì)胞攝取。在37℃將Caco-2細(xì)胞與0.1μ4M[Dmt1，dnsDap4]DALDA孵育15分鐘。隨后用PBS沖洗和覆蓋細(xì)胞。在室溫下10分鐘內(nèi)進行顯微鏡觀察。在340nm進行激發(fā)，在520nm測量發(fā)射。出現(xiàn)的熒光擴散到整個細(xì)胞質(zhì)，但是完全排除在細(xì)胞核外。在37℃小泡濃度的缺乏表明非內(nèi)吞性攝取。
圖7.三種肽與交聯(lián)劑SMCC結(jié)合的質(zhì)譜分析確認(rèn)。將SMCC(1μg)和肽(5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室溫下孵育30分鐘、然后在4℃貯存。將所述樣品的等分試樣與基質(zhì)(50％的乙腈中飽和的3-羥基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的檸檬酸銨)以1∶10的比率混合，然后將其點樣在不銹鋼的靶向平板(target plate)上。通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜分析(MALDI-TOFMS)分析樣品。所述肽和它們各自的SMCC結(jié)合物的分子量顯示在質(zhì)譜圖上。
圖8.肽增加β-半乳糖苷酶(β-Gal)被攝取入N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的能力。將細(xì)胞(N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞或Caco-2)平鋪在96孔板內(nèi)(2×104個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃將細(xì)胞與β-半乳糖苷酶或與肽結(jié)合(經(jīng)由SMCC)的β-半乳糖苷酶孵育1小時。然后用磷酸鹽緩沖液將細(xì)胞洗4次。隨后在37℃用β-半乳糖苷酶染色系統(tǒng)(Roche)將細(xì)胞染色至少2小時，隨后在顯微鏡下檢查。(A)當(dāng)Caco-2細(xì)胞與β-半乳糖苷酶孵育時，沒有觀察到β-半乳糖苷酶的攝取。(B)藍(lán)色細(xì)胞的存在表明Caco-2細(xì)胞內(nèi)與[Dmt1]DALDA共軛結(jié)合的β-半乳糖苷酶的攝取。(C)Caco-2細(xì)胞內(nèi)與[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]結(jié)合的β-半乳糖苷酶的攝取增加。(D)Caco-2細(xì)胞內(nèi)與[Phe1]DALDA結(jié)合的β-半乳糖苷酶的攝取增加。β-半乳糖苷酶與單獨的SMCC的結(jié)合沒有增加攝取。
圖9.與[Dmt1]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物的共同孵育增加了綠色熒光蛋白(GFP)進入Huh7細(xì)胞的攝取。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃將細(xì)胞與0.5ml DMEM孵育60分鐘，該DMEM僅包含3μg GFP(A)；包含3μg GFP和40μl[Dmt1]DALDA(B)；或者包含3μg GFP和40μl與SMCC共軛結(jié)合的[Dmt1]DALDA(C)。隨后將2ml細(xì)胞培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中，并且將其在細(xì)胞孵育器中孵育額外的24小時。孵育后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中將細(xì)胞沖洗四次，隨后通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察保留在活細(xì)胞中的GFP。在340nm處進行激發(fā)，而在520nm處測量發(fā)射。頂部的板塊代表通過Huh7細(xì)胞的0.8μm厚的中部的水平光學(xué)部分的GFP的圖像。底部的板塊代表同一區(qū)域內(nèi)的不同界面的對比圖像。
圖10.[Dmt1]DALDA與RNA低聚物的共軛結(jié)合。利用γ-32P-ATP和多聚核苷酸激酶在5’末端將合成的RNA低聚物(長度為40個核苷酸)磷酸化。通過凝膠電泳將產(chǎn)物純化。在1mg EDC(N-[3-二甲基氨基丙基-N’-乙基碳酰亞胺])存在時，500,000cpm凝膠-純化的RNA低聚物與[Dmt1]DALDA共軛結(jié)合。將共軛反應(yīng)的產(chǎn)物([Dmt1]DALDA-RNA低聚物)與單獨的RNA低聚物在15％的聚丙烯酰胺基脲凝膠上分析。
圖11.[Dmt1]DALDA-[32P]RNA低聚物的共軛結(jié)合物被攝取入Caco-2細(xì)胞。將Caco-2細(xì)胞(1×106)在DMEM培養(yǎng)基中洗三次，并且在DMEM中預(yù)先孵育5分鐘。隨后，將細(xì)胞與[Dmt1]DALDA-[32P]RNA低聚物的共軛結(jié)合物或?qū)φ誖NA(接近20,000cpm)在37℃孵育60分鐘。孵育后，沖洗、溶解細(xì)胞，并且測定細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的放射性。[Dmt1]DALDA-[32P]RNA共軛結(jié)合物的攝取與單獨的RNA的攝取相比高(＞)三倍多(圖11)。
圖12.肽-SMCC共軛結(jié)合物對增加RNA低聚物被攝取入Huh7細(xì)胞的影響。(A)時間對細(xì)胞攝取RNA低聚物的影響。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃將該細(xì)胞與1.0mlDMEM孵育15或60分鐘，該DMEM中包含單獨的[32P]RNA低聚物(單鏈，11個堿基，～100,000cpm)，或者包含[32P]RNA低聚物和40μl[Dmt1]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物。隨后將細(xì)胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以便將其在溶解緩沖液中孵育30分鐘之前除去非特異性結(jié)合，隨后測定保留的放射性。RNA低聚物與[Dmt1]DALDA-SMCC在37℃共同孵育提高了RNA低聚物的攝取，在15分鐘的孵育后提高了10倍，在60分鐘的孵育后提高了20倍。(B)溫度對細(xì)胞攝取RNA低聚物的影響。4℃時[Dmt1]DALDA-SMCC提高RNA攝取的能力更小，雖然它仍將攝取增加了10倍。(C)借助不同的肽-SMCC共軛結(jié)合物增加細(xì)胞對RNA的攝取。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃將該細(xì)胞與1.0ml DMEM孵育15分鐘，該DMEM中包含單獨的[32P]RNA低聚物，或者包含[32P]RNA低聚物和40ml肽-SMCC共軛結(jié)合物。全部三種肽-SMCC共軛結(jié)合物均增加了RNA的攝取。
圖13.與[Dmt1]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物的共同孵育增加了兩種不同長度的RNA的攝取。將[Dmt1]DALDA與SMCC共軛結(jié)合，并通過質(zhì)譜分析確認(rèn)。在室溫下將11-merRNA低聚物和1350-mer RNA與[Dmt1]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物混合15分鐘。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃和5％CO2下將該細(xì)胞與1ml DMEM孵育60分鐘，該DMEM中包含單獨的RNA(～100,000cpm)，或者包含與[Dmt1]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物混合的RNA。隨后將細(xì)胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以便除去非特異性結(jié)合。將沖洗后的細(xì)胞在溶解緩沖液中孵育30分鐘，隨后對保留的放射性計數(shù)。相較于與單獨的RNA孵育，與[Dmt1]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物的共同孵育增加了11-merRNA的攝取達(dá)22倍，而增加了1350-mer RNA的攝取達(dá)3倍。
圖14.DNA低聚物與[Dmt1]DALDA的共軛結(jié)合。將SMCC(1μg)和[Dmt1]DALDA(5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室溫下孵育30分鐘、隨后在4℃與去保護的3’-硫醇基DNA低聚物混合24小時。孵育后，將樣品的等分試樣與基質(zhì)(50％的乙腈中飽和的3-羥基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的檸檬酸銨)以1∶10的比率混合，并且將其點樣在不銹鋼的靶向平板上。通過MALDI-TOF MS分析樣品(A)。已發(fā)現(xiàn)3’-硫醇基DNA低聚物和[Dmt1]DALDA-DNA共價復(fù)合物的分子量分別為6392和7171。在與多聚核苷酸激酶的反應(yīng)中，利用γ-32P-ATP將位于5’-末端的共軛結(jié)合和非共軛結(jié)合的低聚物磷酸化，而激酶反應(yīng)的產(chǎn)物在15％的聚丙烯酰胺脲凝膠上分析，并且被凝膠-純化，用于細(xì)胞攝取研究(B)。
圖15.與[Dmt1]DALDA共軛結(jié)合的DNA低聚物的細(xì)胞攝取。利用SMCC將3’-硫醇修飾的20-基體DNA共軛結(jié)合到[Dmt1]DALDA上，并且通過質(zhì)譜分析確認(rèn)共軛結(jié)合物的形成。用32P將共軛結(jié)合和非共軛結(jié)合的DNA低聚物在其5’-末端用放射性同位素標(biāo)記，并凝膠提純。用DMEM沖洗神經(jīng)N2A(1×106個細(xì)胞/孔)細(xì)胞，然后在37℃和5％CO2的條件下將該細(xì)胞與1mlDMEM孵育2小時或19小時，該DMEM中包含有或沒有與DNA低聚物(～100,000cpm)共軛結(jié)合的[Dmt1]DALDA。然后將細(xì)胞在DMEM中沖洗四次，在醋酸鈉溶液中沖洗一次，以便除去非特異性結(jié)合。隨后將所述細(xì)胞在溶解緩沖液中孵育30分鐘，隨后確定保留的放射性。Y-軸表示DNA的攝取，用總放射性的百分?jǐn)?shù)表示。
圖16.[Dmt1]DALDA對培養(yǎng)的細(xì)胞是沒有毒性的。將神經(jīng)N2A細(xì)胞與[Dmt1]DALDA(1nM到10μM)孵育，并且通過MTT實驗測定細(xì)胞的生存能力。
圖17.[Dmt1]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物沒有在Huh7細(xì)胞中引起凋亡。將Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)在DMEM中沖洗三次，并且加入1ml新鮮的培養(yǎng)基。隨后，將50ul PBS中[Dmt1]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物(1mM)或僅PBS(對照)加入到所述細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且在37℃和5％CO2的條件下孵育24小時。孵育后，將1μl可以使凋亡的細(xì)胞核染色的Hoechst染料加入到細(xì)胞中，并且孵育額外的15分鐘。通過用細(xì)胞培養(yǎng)基(不含pH指示劑)沖洗細(xì)胞除去過多的Hoechst染料，然后利用熒光顯微鏡(在350nm處激發(fā)，而在461nm處測量發(fā)射)比較經(jīng)[Dmt1]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物處理的細(xì)胞和對照細(xì)胞。
具體實施例方式
本發(fā)明基于發(fā)明人的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該發(fā)現(xiàn)為包括至少一個分子和芳香族陽離子肽的一些載體復(fù)合物能夠以不依賴能量的機制穿過細(xì)胞膜，并且將該分子遞送到細(xì)胞內(nèi)。
芳香族陽離子肽本發(fā)明中所用的芳香族陽離子肽具有如下所述的凈正電荷，是水溶性和高極性的。該肽包括最少三個氨基酸，優(yōu)選包括最少四個氨基酸，通過肽鍵共價連接。
該芳香族陽離子肽中存在的氨基酸的最大數(shù)目是十個，優(yōu)選約八個，最優(yōu)選約六個。最佳地，該肽中存在的氨基酸的數(shù)目是約四個。用于限定氨基酸的最大數(shù)目的術(shù)語“約”是指增加或者減少一個氨基酸。
本發(fā)明中所用的芳香族陽離子肽的氨基酸可以是任何氨基酸。正如本文中所使用的，術(shù)語“氨基酸”指的是包括至少一個氨基和至少一個羧基的任何有機分子。優(yōu)選地，至少一個氨基位于相對于羧基的α位。
該氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如，通常存在于蛋白質(zhì)中的二十種最常見的氨基酸，即，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷胺酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、以及纈氨酸(Val)。
其它天然存在的氨基酸包括，例如，在與蛋白質(zhì)合成無關(guān)的代謝過程中合成的氨基酸。例如，在產(chǎn)生尿的過程中哺乳動物代謝合成的氨基酸鳥氨酸。
本發(fā)明所用的芳香族陽離子肽可選地包括一個或多個非天然存在的氨基酸。在一個具體實施例中，該肽沒有天然存在的氨基酸。
非天然存在的氨基酸是這樣的氨基酸，其通常不在生物機體的正常代謝過程中合成，并且不天然存在于蛋白質(zhì)中。
此外，本發(fā)明中所用的非天然存在的氨基酸優(yōu)選不被常見的蛋白酶所識別。因此，非天然存在的氨基酸優(yōu)選對常見的蛋白酶有抗性，并且更優(yōu)選對常見的蛋白酶不敏感。
非天然存在的氨基酸可以存在于該肽的任何位置。例如，非天然存在的氨基酸可以在N-末端、C-末端、和/或N-末端和C-末端之間的任何一個或多個位置。
舉例來說，非天然存在的氨基酸可以包括烷基、芳基、或者烷芳基。烷基氨基酸的一些實例包括α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸、以及ε-氨基己酸。芳基氨基酸的一些實例包括鄰-、間-、以及對-氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些實例包括鄰-、間-、以及對-氨基苯乙酸，以及γ-苯基-β-氨基丁酸。
非天然存在的氨基酸還包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括，例如，在天然存在的氨基酸上添加一個或多個化學(xué)基團。
例如，一個或多個化學(xué)基團可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸殘基的芳香環(huán)的2’、3’、4’、5’、或6’位置中的一個或多個，或者色氨酸殘基的苯并環(huán)的4’、5’、6’、或7’位置中的一個或多個。該基團可以是能被添加到芳香環(huán)上的任何化學(xué)基團。這樣的基團的一些實例包括支鏈的或直鏈的C1-C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、或叔丁基、C1-C4烴氧基(即烷氧烷)、氨基、C1-C4烷基胺(例如，甲胺基)以及C1-C4二烷基胺(例如，二甲胺基)、硝基、羥基、鹵素(即，氟、氯、溴、或碘)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特殊實例包括正纈氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、以及羥脯氨酸(Hyp)。
本發(fā)明所用的肽中的氨基酸的修飾的另一實例是該肽中的天冬氨酸或者谷氨酸殘基的羧基的衍生作用(衍生化)。衍生作用的一個實例是用氨或者用伯胺或仲胺，例如，甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺，進行氨基化。衍生作用的另一實例包括利用，例如，甲醇或乙醇，進行酯化作用。
另一種這樣的修飾包括賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基的氨基的修飾。例如，這樣的氨基可以被?；Ｒ恍┖线m的?；ǎ?，包括任何上述C1-C4烷基的苯甲?；蛲轷；缫阴；虮；?。
非天然存在的氨基酸通常可以是左旋型(L-)、右旋型(D-)、或者其混合物。合適的非天然存在的氨基酸的實例還包括上述任何天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)型，以及L-和/或D-非天然存在的氨基酸。在這點上，應(yīng)該注意雖然已發(fā)現(xiàn)D-氨基酸存在于某些肽類抗生素中(該肽類抗生素是利用除細(xì)胞的正常核糖體蛋白合成器以外的方式合成的)，但是它們通常不存在于蛋白中。用于此處時，這樣的D-氨基酸指的是非天然存在的氨基酸。
為了使對蛋白酶的敏感性最小，本發(fā)明中所用的肽應(yīng)該具有少于五個，優(yōu)選少于四個，更優(yōu)選少于三個，以及最優(yōu)選地少于兩個相鄰的能被常見蛋白酶識別的L-氨基酸，而不管這些氨基酸是天然存在的或是非天然存在的。在一個具體實施例中，該肽僅有D-氨基酸，而沒有L-氨基酸。
如果該肽包含對蛋白酶敏感的氨基酸序列，那么氨基酸中至少有一個優(yōu)選為非天然存在的D-氨基酸，由此使其具有蛋白酶抗性。對蛋白酶敏感的序列的實例包括能夠被常見的蛋白酶，如肽鏈內(nèi)切酶和胰蛋白酶，切開的兩個或多個相鄰的堿性氨基酸。堿性氨基酸的實例包括精氨酸、賴氨酸及組氨酸。
在生理pH下，相較于芳香族陽離子肽中氨基酸殘基的總數(shù)，該肽具有最小數(shù)目的凈正電荷，這是很重要的。生理pH下，凈正電荷的最小數(shù)目下文中表示為(pm)。該肽中氨基酸殘基的總數(shù)表示為(r)。
下述的凈正電荷的最小數(shù)目均是在生理pH下。這里所用的術(shù)語“生理pH”指的是哺乳動物機體的組織和器官的細(xì)胞內(nèi)的正常pH。例如，人類的生理pH正常時接近7.4，但哺乳動物的正常生理pH可以是從約7.0到約7.8的任何pH。
這里所用的“凈電荷”指的是存在于該肽中的氨基酸所攜帶的正電荷的數(shù)目與負(fù)電荷的數(shù)目的差值。在本說明書中，可以理解為凈電荷是在生理pH下測定的。在生理pH下具有正電荷的天然存在的氨基酸包括L-賴氨酸、L-精氨酸、以及L-組氨酸。在生理pH下具有負(fù)電荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
通常，肽具有帶正電荷的N-末端氨基和帶負(fù)電荷的C-末端羧基。在生理pH下該電荷互相抵消。作為計算凈電荷的實例，肽酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-組氨酸-色氨酸-精氨酸(Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg)具有一個帶負(fù)電荷的氨基酸(即谷氨酸)和四個帶正電荷的氨基酸(即，兩個精氨酸殘基，一個賴氨酸，以及一個組氨酸)。因此，上述肽具有三個凈正電荷。
在本發(fā)明的一個具體實施例中，該芳香族陽離子肽在生理pH下的凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)。在這個具體實施例中，凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系如下

在另一具體實施例中，該芳香族陽離子肽在凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中2pm是小于或等于r+1的最大數(shù)。在這個具體實施例中，凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系如下

在一個具體實施例中，凈正電荷的數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的數(shù)目(r)相等。在另一優(yōu)選的具體實施例中，該肽具有三個或四個氨基酸殘基以及最少一個凈正電荷，優(yōu)選為最少兩個凈正電荷，以及更優(yōu)選地，最少三個凈正電荷。
芳香族陽離子肽具有相較于凈正電荷總數(shù)(pt)的最小數(shù)目的芳香基，這也是重要的。芳香基的最小數(shù)目在下文表示為(a)。
具有芳香基的天然存在的氨基酸包括這些氨基酸組氨酸、色氨酸、酪氨酸、以及苯丙氨酸。例如，六肽賴氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸具有兩個凈正電荷(由賴氨酸和精氨酸殘基提供)和三個芳香基(由酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸殘基提供)。
在本發(fā)明的一個具體實施例中，本發(fā)明的方法中所用的芳香族陽離子肽在芳香基的最小數(shù)目(a)與生理pH下凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)pt為1時，a也可以為1。在這個具體實施例中，芳香基的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系如下

在另一具體實施例中，該芳香族陽離子肽在芳香基的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中2a是小于或等于pt+1的最大數(shù)。在這個具體實施例中，芳香族氨基酸殘基的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系如下

在另一具體實施例中，芳香基的數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)相等。
羧基，尤其是C-末端氨基酸的末端羧基，優(yōu)選用，例如，氨來酰胺化以形成C-末端酰胺?？蛇x地，C-末端氨基酸的末端羧基可以被伯胺或仲胺酰胺化。該伯胺或仲胺可以是，例如，烷基，尤其是支鏈或直鏈的C1-C4烷基，或芳基胺。相應(yīng)的，該肽的C-末端的氨基酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)轷０坊?、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N，N-二甲基酰胺基、N，N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或者N-苯基-N-乙基酰胺基。
另外，具有多于一個羧基的氨基酸殘基(例如，天冬酰胺殘基、谷胺酰胺殘基、天冬氨酸殘基及谷氨酸殘基)的自由羧基基團，無論其存在于任何位置，也可以被酰胺化。在這些部位的酰胺化作用可以利用氨或上述任何伯胺或仲胺進行。
在一個具體實施例中，本發(fā)明的方法中所用的芳香族陽離子肽是具有兩個凈正電荷和至少一個芳香族氨基酸的三肽。在一具體實施例中，本發(fā)明的方法中所用的芳香族陽離子肽是具有兩個凈正電荷和兩個芳香族氨基酸的三肽。
本發(fā)明的方法中所用的芳香族陽離子肽包括但不限于下述肽的實例賴氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2，苯丙氨酸-右旋精氨酸-組氨酸，右旋酪氨酸-色氨酸-賴氨酸-NH2，色氨酸-右旋賴氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2，酪氨酸-組氨酸-右旋甘氨酸-甲硫氨酸，苯丙氨酸-精氨酸-右旋組氨酸-天冬氨酸，酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-NH2，甲硫氨酸-酪氨酸-右旋賴氨酸-苯丙氨酸-精氨酸，右旋組氨酸-谷氨酸-賴氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-精氨酸，賴氨酸-右旋谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-色氨酸-NH2，
苯丙氨酸-右旋精氨酸-賴氨酸-色氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-組氨酸，甘氨酸-右旋苯丙氨酸-賴氨酸-酪氨酸-組氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2，纈氨酸-右旋賴氨酸-組氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-絲氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2，色氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋組氨酸-賴氨酸，賴氨酸-色氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-酪氨酸-右旋組氨酸-NH2，蘇氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋組氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-右旋組氨酸-賴氨酸，天冬氨酸-右旋色氨酸-賴氨酸-酪氨酸-右旋組氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-賴氨酸-NH2，右旋組氨酸-賴氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-谷氨酸-右旋天冬氨酸-右旋組氨酸-右旋賴氨酸-精氨酸-色氨酸-NH2，以及丙氨酸-右旋苯丙氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-賴氨酸-右旋色氨酸-組氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸。
在一個特別優(yōu)選的具體實施例中，芳香族陽離子肽具有的分子式為酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(為了方便用DALDA這個簡寫代表)。DALDA具有由氨基酸酪氨酸、精氨酸、和賴氨酸提供的三個凈正電荷，以及由氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸提供的兩個芳香基。DALDA中的酪氨酸可以是酪氨酸被修飾后的衍生物，如2’，6’-二甲基酪氨酸，以便產(chǎn)生分子式為2’6’-Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(即，Dmt1-DALDA)的化合物。其它經(jīng)修飾的酪氨酸衍生物包括2’-甲基酪氨酸(Mmt)；N，2’，6’-三甲基酪氨酸(Tmt)；以及2’-羥基-6’-甲基酪氨酸(Hmt)。
在另一個優(yōu)選的具體實施例中，位于DALDA的N-末端的氨基酸可以是苯丙氨酸或其衍生物。N-末端具有苯丙氨酸的芳香族陽離子肽的分子式苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(即，Phe1-DALDA)。優(yōu)選的苯丙氨酸的衍生物包括2’-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2’，6’-二甲基苯丙氨酸(Dmp)、N，2’，6’-三甲基苯丙氨酸(Tmp)、以及2’-羥基-6’-甲基苯丙氨酸(Hmp)。
在另一個具體實施例中，Dmt1-DALDA的氨基酸序列被重新排列，使Dmt不位于N-末端。這樣的芳香族陽離子肽的實例具有的分子式為右旋精氨酸-2’6’Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2。
本文中提及的任何特定的肽，如那些上面提及的肽和下面提及的肽，例如，表1中提及的肽，包括Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、右旋精氨酸-2’6’Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2以及它們的衍生物可以進一步包括功能類似物。如果該類似物與Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、或者右旋精氨酸-2’6’Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2具有同樣的功能，那么這樣的肽被認(rèn)為是Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、或者右旋精氨酸-2’6’Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2的功能類似物。該類似物可以是，例如，Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、或者右旋精氨酸-2’6’Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2的取代變體，其中一個或多個氨基酸被另外的氨基酸取代。
Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、或者右旋精氨酸-2’6’Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2的合適的取代變體包括保守的氨基酸替代物。氨基酸可以根據(jù)其理化特性分組如下
(a)非極性氨基酸丙氨酸(A)絲氨酸(S)蘇氨酸(T)脯氨酸(P)甘氨酸(G)；(b)酸性氨基酸天冬酰胺(N)天冬氨酸(D)谷氨酸(E)谷胺酰胺(Q)；(c)堿性氨基酸組氨酸(H)精氨酸(R)賴氨酸(K)；(d)疏水氨基酸甲硫氨酸(M)亮氨酸(L)異亮氨酸(I)纈氨酸(V)；以及(e)芳香族氨基酸苯丙氨酸(F)酪氨酸(Y)色氨酸(W)組氨酸(H)。
肽中的氨基酸被同組的另外的氨基酸取代(替代)稱為保守取代。保守取代有助于保持原有肽的理化特性。相反，肽中的氨基酸被不同組的另外的氨基酸取代通常更有可能改變原有肽的理化特性。
在本發(fā)明的實施中所用的類似物的實例包括，但不限于，表1和表2中所示的芳香族陽離子肽。
表1






Dab＝二氨基丁酸Dap＝二氨基丙酸Dmt＝二甲基酪氨酸Mmt＝2’-甲基酪氨酸Tmt＝N，2’，6’-三甲基酪氨酸Hmt＝2’-羥基，6’-甲基酪氨酸dnsDap＝β-丹磺?；?L-α，β-二氨基丙酸atnDap＝β-鄰氨基苯甲?；?L-α，β-二氨基丙酸Bio＝生物素表2



Cha＝環(huán)己基表1和表2中所示的肽中的氨基酸可以是L-構(gòu)型或者D-構(gòu)型。
更多的陽離子肽可以在2003年2月4日提交的美國臨時申請第60/444,777號中找到，其以引用方式結(jié)合于本文。
分子該分子可以是生物分子或者小分子。優(yōu)選地，該生物分子或者小分子是具有藥物活性的分子。這里所用的具有藥物活性的分子，是能夠在體內(nèi)施加有益的影響的任何分子。
生物分子是包含核酸或者氨基酸序列的任何分子，并且分子量大于450。這樣的核酸和氨基酸序列在本文中分別指的是“多(聚)核苷酸”和“多(聚)氨基酸”。
生物分子包括多聚核苷酸、肽核苷酸、以及多聚氨基酸，如肽、多肽，以及蛋白質(zhì)。具有藥物活性的生物分子的實例包括內(nèi)源性肽(如，血管加壓素、谷胱甘肽)、蛋白質(zhì)(如，干擾素)、激素(如，人類生長激素)、酶(如，α-半乳糖苷酶)、抗體(如，抗β-淀粉狀蛋白的抗體，其可以用于治療阿爾茨海默氏病)、神經(jīng)生長因子(如，神經(jīng)生長因子NGF，腦部起源的神經(jīng)因子BDNF)、細(xì)胞因子(如，血小板起源的生長因子PDGF，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF)、以及低聚核苷酸。
該低聚核苷酸可以包括任何序列的多核苷酸，如DNA或者RNA。該DNA和RNA序列可以是單鏈或者雙鏈的。例如，編碼有利于在應(yīng)激期間幫助細(xì)胞存活的蛋白的DNA可以與本發(fā)明的多肽結(jié)合。這樣的蛋白的實例包括熱休克蛋白(如，hsp60、hsp70等)。
單鏈的RNA分子的實例包括核酶、RNA誘餌(decoy)、核酶的外部指導(dǎo)序列、反義RNA和mRNA。對于這些單鏈RNA分子的評述，參見Sullenger等(Nature 2002，418252-247)。Sullenger披露的對這些單鏈DNA分子的描述，以及對可以用核酶、RNA誘餌、核酶的外部指導(dǎo)序列、反義RNA和mRNA分子治療的疾病和病變的描述以引用方式結(jié)合于本文。
雙鏈RNA的實例是RNA干擾分子(即，RNAi，例如，siRNA，(即，小干擾RNA))。該siRNA可以是任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。
該siRNA可以，例如，與mRNA充分地互補，以便抑制與疾病、病癥或者病變相關(guān)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。這樣的蛋白質(zhì)的實例包括，例如，與阿爾茨海默氏病相關(guān)的β-淀粉狀蛋白和與癌相關(guān)的ras蛋白。
可選地，該siRNA可以，例如，與由病毒產(chǎn)生的RNA充分地互補。該由病毒產(chǎn)生的RNA可以是病毒感染宿主細(xì)胞、病毒的存活、和/或病毒的繁殖通常需要的任何RNA。這樣的RNA的實例包括內(nèi)部核糖體進入位點、RNA依賴的聚合酶起始位點、以及編碼病毒包膜蛋白、病毒核酸酶、和病毒蛋白酶(的RNA)。
病毒的實例包括，例如，肝炎病毒，如A(甲)、B(乙)、C(丙)型肝炎、人類免疫缺陷病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、以及人類乳頭瘤病毒。
針對病毒RNA的siRNA對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的。例如，針對C型肝炎病毒的RNA的siRNA對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的，參見Randall等，PNAS，2003，100235-240。
該分子可以是小分子。小分子包括有機化合物、有機金屬化合物、有機化合物和有機金屬化合物的鹽、單糖、氨基酸、以及核苷酸。小分子可以進一步包括不被認(rèn)為是生物分子的分子，只要它們的分子量不大于450。因此，小分子可以是分子量為450或更小的脂質(zhì)、低聚糖、低聚肽、和低聚核苷酸、以及它們的衍生物。
要強調(diào)的是小分子可以具有任何分子量。它們被稱作小分子僅僅因為它們不被稱作生物分子，并且通常具有小于450的分子量。小分子包括自然界發(fā)現(xiàn)的化合物，也包括合成的化合物。具有藥物活性的小分子的實例包括抗生素(如，四環(huán)素、青霉素、紅霉素)、細(xì)胞毒性劑(如，鏈霉素、阿霉素)、以及抗氧化劑(如，維生素E、維生素C、β-胡蘿卜素)。
載體復(fù)合物至少一個上述分子，以及至少一個上述芳香族陽離子肽，結(jié)合(締合)形成載體復(fù)合物。該分子和芳香族陽離子肽可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法結(jié)合。合適的結(jié)合類型包括化學(xué)性結(jié)合和物理性結(jié)合?；瘜W(xué)性結(jié)合包括，例如通過共價鍵結(jié)合和通過配位鍵結(jié)合。物理性結(jié)合包括，例如，通過氫鍵、偶極相互作用、范瓦耳斯力、靜電相互作用、疏水性相互作用和芳香族的堆積作用(aromatic stacking)結(jié)合。
該分子和芳香族陽離子肽之間的結(jié)合的類型通常依賴于，例如，該分子上可利用的官能團和該芳香族陽離子肽上可利用的官能團。
對于物理性結(jié)合或者化學(xué)性結(jié)合，該分子上的官能團通常與該芳香族陽離子肽上的官能團結(jié)合?？蛇x地，該芳香族陽離子肽上的官能團與該分子上的官能團締合。
該分子和芳香族陽離子肽上的官能團可以直接結(jié)合。例如，分子上的官能團(如，巰基)與芳香族陽離子肽上的官能團(如，巰基)結(jié)合，以便形成二硫化物。
可選地，該官能團可以通過交聯(lián)劑(如，連接劑)結(jié)合。交聯(lián)劑的一些實例如下所述。交聯(lián)劑可以連接到該分子或者芳香族陽離子肽中的任意一個。
該連接劑可以影響也可以不影響芳香族陽離子肽的凈電荷的數(shù)目。該連接劑通常不影響芳香族陽離子肽的凈電荷。存在于連接劑中的每個氨基，如果有的話，將影響芳香族陽離子肽的凈正電荷。存在于連接劑中的每個羧基，如果有的話，將影響芳香族陽離子肽的凈負(fù)電荷。
該載體復(fù)合物中分子或者芳香族陽離子肽的數(shù)目受限于該肽容納多個分子的能力或者該分子容納多個肽的能力。例如，空間位阻可以妨礙該肽容納尤其是大分子的能力?？蛇x地，空間位阻可以妨礙該分子容納相對較大的(如，長度為七、八、九或十個氨基酸)芳香族陽離子肽的能力。
該載體復(fù)合物中分子或者芳香族陽離子肽的數(shù)目還受限于存在于對方上的官能團的數(shù)目。例如，與肽結(jié)合的分子的最大數(shù)目取決于存在于該肽上的官能團的數(shù)目?？蛇x地，與分子結(jié)合的肽的最大數(shù)目取決于存在于該分子上的官能團的數(shù)目。
在一個具體實施例中，該載體復(fù)合物包括至少一個與芳香族陽離子肽結(jié)合的分子，并且優(yōu)選的情況是至少兩個分子。包含多個(如，3，4，5或者更多)官能團的相對較大的肽(如，長度為八個、十個氨基酸)可以與多個(如，3，4，5或者更多)分子結(jié)合。
在另一具體實施例中，該載體復(fù)合物包括至少一個與分子結(jié)合的芳香族-陽離子肽，并且優(yōu)選的情況是至少兩個芳香族陽離子肽。例如，包含多個(如，3，4，5或者更多)官能基團的分子可以與多個(如，3，4，5或者更多)肽結(jié)合。
在另一具體實施例中，該載體復(fù)合物包括一個與一個分子結(jié)合的芳香族-陽離子肽。
在一個具體實施例中，載體復(fù)合物包括至少一個與至少一個芳香族陽離子肽化學(xué)結(jié)合(如，共軛結(jié)合)的分子。該分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與芳香族陽離子肽化學(xué)性結(jié)合。例如，該分子上的官能團可以直接連接到芳香族陽離子肽上的官能團。合適的官能團的一些實例包括，例如，氨基、羧基、巰基、馬來酰亞胺基、異氰酸基、異硫氰酸基以及羥基。
該分子還可以借助交聯(lián)劑，如二醛、碳二亞胺、二馬來酰亞胺、以及類似物，與芳香族陽離子肽化學(xué)性結(jié)合。交聯(lián)劑可以，例如，從伊利諾斯州羅克福德市的Pierce生物技術(shù)公司獲得。PierceBiotechnology公司，網(wǎng)址為URLhttp//www.piercenet.com/products/browse.cfm？fldID＝26436A16-60A0-4A56-85F7-213A50830440，可以提供幫助。另外的交聯(lián)劑包括荷蘭阿姆斯特丹市Kreatech Biotechnology B.V.的美國專利第5,580,990號、5,985,566號和6,133,028號中描述的鉑交聯(lián)劑。
該分子的官能團可以不同于肽的官能團。例如，如果巰基存在于該分子上，如在β-半乳糖苷酶內(nèi)或者在5’-和/或3’-末端硫醇基修飾的DNA和RNA低聚核苷酸內(nèi)，該分子可以借助來自PierceBiotechnology的交聯(lián)試劑SMCC(即，琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基-1-羧酸酯(鹽))，通過賴氨酸的4-氨基交聯(lián)到肽上，如，[Dmt1]DALDA(參見下面的實施例10)。在另一實例中，DALDA的賴氨酸的4-氨基可以借助來自Pierce Biotechnology的交聯(lián)劑EDC(即，(N-[3-二甲基氨基丙基-N’-乙基碳酰亞胺])，直接共軛結(jié)合到位于RNA或者DNA的5’-末端的α-磷酸基上(參見下面的實施例13)。
可選地，該分子和肽的官能團可以相同。同型雙官能(homobifunctional)交聯(lián)劑通常可以用于交聯(lián)同樣的官能團。同型雙官能交聯(lián)劑的實例包括EGS(即，乙二醇二[琥珀酰亞胺基琥珀酸酯])、DSS(即，二琥珀酰亞胺基辛二酸鹽)、DMA(即，二甲基己二酰亞胺鹽·2HCl)、DTSSP(即，3，3’-聯(lián)硫基[硫代琥珀酰亞胺基丙酸鹽])、DPDBP(即，1，4-二-[3’-(2’-吡啶基聯(lián)硫基)-丙酰胺基]丁烷、以及BMH(即，二-馬來酰亞胺己烷)。這樣的同型雙官能交聯(lián)劑也可以從Pierce Biotechnology公司得到。
為了使該分子和肽化學(xué)性地結(jié)合，通常將該分子、肽、和交聯(lián)劑混合在一起。該分子、肽、和交聯(lián)劑的加入順序是不重要的。例如，可以先將該肽與交聯(lián)劑混合，隨后加入該分子?？蛇x地，可以先將該分子與交聯(lián)劑混合，隨后加入該肽。最佳地，可以先將該分子與肽混合，隨后加入交聯(lián)劑。
該化學(xué)性結(jié)合的載體復(fù)合物可以將分子遞送到細(xì)胞。在一些實例中，該分子在細(xì)胞內(nèi)起作用時沒有與芳香族陽離子肽分開。例如，如果該芳香族陽離子肽不妨礙分子的催化位點，那么將分子與芳香族陽離子肽分開不是必需的(參見下面的實施例11)。
在另一些實施例中，將該分子與芳香族化合物分開可能是有利的。上述Pierce Biotechnology公司的網(wǎng)址還在選擇合適的能夠被，例如，細(xì)胞內(nèi)的酶，分開的交聯(lián)劑方面為本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供幫助。因此，該分子可以與芳香族陽離子肽分開?？杀环珠_的連接劑的實例包括SMPT(即，4-琥珀酰亞胺基氧化羰基-甲基-a-[2-吡啶基聯(lián)硫基]甲苯、Sulfo-LC-SPDP(即，硫代琥珀酰亞胺基6-(3-[2-吡啶基聯(lián)硫基]-丙酰胺基)己酸鹽)、LC-SPDP(即，琥珀酰亞胺基6-(3-[2-吡啶基聯(lián)硫基]-丙酰胺基)己酸鹽)、Sulfo-LC-SPDP(即，硫代琥珀酰亞胺基6-(3-[2-吡啶基聯(lián)硫基]-丙酰胺基)己酸鹽)、SPDP(即，N-琥珀酰亞胺基3-[2-吡啶基聯(lián)硫基]-丙酰胺基己酸鹽)、以及AEDP(即，3-[(2-氨基乙基)聯(lián)硫基]-丙酸·HCl)。
在另一具體實施例中，載體復(fù)合物包括至少一個與至少一個芳香族陽離子肽物理性結(jié)合的分子。該分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與芳香族陽離子肽物理性結(jié)合。
例如，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將該芳香族陽離子肽與分子混合在一起。混合順序是不重要的。例如，分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與修飾過或未修飾過的芳香族陽離子肽物理性混合?？蛇x地，該修飾過或未修飾過的芳香族陽離子肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與分子物理性混合。
例如，可以將該芳香族-陽離子肽和分子置于容器中，并且通過，例如，搖動該容器來攪拌，以便混合該芳香族-陽離子肽和分子。
該芳香族陽離子肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法被修飾。例如，該芳香族陽離子肽可以借助如上所述的交聯(lián)劑或者官能基團而被修飾。該連接劑可以影響也可以不影響芳香族陽離子肽的凈電荷的數(shù)目。典型地，該連接劑不會影響芳香族陽離子肽的凈電荷。存在于連接劑中的每個氨基，如果有的話，將影響(增加)芳香族陽離子肽的凈正電荷。存在于連接劑中的每個羧基，如果有的話，將影響芳香族陽離子肽的凈負(fù)電荷。
例如，[Dmt1]DALDA可以通過來自Pierce Biotechnology的交聯(lián)試劑SMCC(即，琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基-1-羧酸鹽)，通過賴氨酸的4-氨基而被修飾(參見下面的實施例10)。為了形成載體復(fù)合物，該修飾后的芳香族-陽離子肽通常首先形成，然后與該分子混合。
物理性結(jié)合的載體復(fù)合物的一個優(yōu)點是該分子在細(xì)胞內(nèi)起作用時不需要除去芳香族陽離子肽，如那些其中分子與芳香族陽離子肽化學(xué)性結(jié)合的載體復(fù)合物。此外，如果該芳香族陽離子肽不妨礙分子的催化位點，那么該復(fù)合物的解離也不是必需的(參見下面的實施例12)。
芳香族陽離子肽的合成本發(fā)明的方法中所用的肽可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法化學(xué)合成。用于合成該蛋白的合適的方法包括，例如，通過Stuart andYoung in“Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，”secondEdition，Pierce Chemical Company(1984)，and in“Solid PhasePeptide Synthesis(固相肽合成)，”Methods Enzymol，289，AcademicPress，Inc，New York(1997)中描述的那些方法。
施用方式在一個具體實施例中，本發(fā)明涉及將分子遞送到細(xì)胞的方法。本方法包括將分子和芳香族陽離子肽與細(xì)胞接觸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將該分子和芳香族陽離子肽與細(xì)胞接觸。例如，細(xì)胞可以與分子和芳香族陽離子肽在體外孵育。一方面，該細(xì)胞和芳香族陽離子肽可以以載體復(fù)合物的形式存在，如上述那些載體復(fù)合物，包括化學(xué)性結(jié)合或者物理性結(jié)合的分子和芳香族陽離子肽。
在另一具體實施例中，將分子遞送到細(xì)胞的方法包括將載體復(fù)合物與細(xì)胞接觸。通過將包括該分子和芳香族陽離子肽的載體復(fù)合物與細(xì)胞接觸，該分子被遞送到細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將載體復(fù)合物與細(xì)胞接觸。
例如，可以在體外將細(xì)胞與該載體復(fù)合物孵育。該細(xì)胞可以是任何細(xì)胞。細(xì)胞可以來源于植物、動物、或者細(xì)菌。植物細(xì)胞的實例包括阿布屬細(xì)胞。細(xì)菌的細(xì)胞的實例包括酵母菌屬和乳酸桿菌屬。動物細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞的實例是血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞。
可選的，該載體復(fù)合物可以在體內(nèi)被施用于哺乳動物。有效劑量的載體復(fù)合物，優(yōu)選藥用組合物，可以在其需要時，通過多種用于施用藥用化合物的公知的方法中的任何一種來施用于哺乳動物。
該載體復(fù)合物可以全身或局部施用。在一個具體實施例中，該載體復(fù)合物通過靜脈施用。例如，該載體復(fù)合物可以經(jīng)由快速的靜脈推注施用。然而，優(yōu)選地，該載體復(fù)合物以恒速靜脈注射施用。
該載體復(fù)合物可以被局部施用于哺乳動物的組織。例如，通過注射進入注射器易于到達(dá)的組織。例如，如果該載體復(fù)合物包含將被遞送到哺乳動物的腫瘤處的細(xì)胞毒性劑，優(yōu)選地，該腫瘤易于局部施用。這樣的腫瘤包括，例如，皮膚癌和乳腺癌。
該載體復(fù)合物還可以口服施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、皮下施用、或者透皮施用。在一優(yōu)選的具體實施例中，載體復(fù)合物的透皮施用是通過離子電滲療法，其中該載體復(fù)合物通過電流透皮遞送。
其它的施用途徑包括腦室內(nèi)或者鞘內(nèi)施用。腦室內(nèi)施用涉及施用入腦的腦室系統(tǒng)。鞘內(nèi)施用涉及施用入腦或脊髓的蛛網(wǎng)膜下的空間。因而腦室內(nèi)或鞘內(nèi)施用可以優(yōu)選用于影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的器官或組織的那些疾病或病變。
本發(fā)明的方法中所用的載體復(fù)合物可以通過持續(xù)釋放的方式給哺乳動物施用，這在本領(lǐng)域是已知的。持續(xù)釋放施用是藥物遞送的方法，其可以使該藥物在特定時間段達(dá)到某個水平。該水平通常通過血清濃度測定。
藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何劑型均適用于該載體復(fù)合物的施用。對于口服施用，可以使用液體或固體劑型。劑型的一些實例包括片劑、膠囊、丸劑、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑(wafer)、口嚼劑(chewing gum)及類似的劑型。該肽可以與合適的藥物載體(媒介物)或賦形劑混合，這一點為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解。載體和賦形劑的實例包括淀粉、乳劑、糖、某些種類的粘土、膠、乳酸、硬脂酸或其鹽，包括硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物油脂或植物油、樹膠及乙二醇。
對于全身施用、腦室內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、皮下施用、或者透皮施用，該載體復(fù)合物的劑型可以利用傳統(tǒng)的稀釋劑、載體、或賦形劑等，這在本領(lǐng)域是已知的，其可以用來遞送該載體復(fù)合物。例如，該劑型可以包括下面的一種或多種穩(wěn)定劑、表面活性劑，優(yōu)選非離子性的表面活性劑、以及可選的鹽和/或緩沖劑。該載體復(fù)合物可以以水溶液的形式、或以凍干的形式被遞送。
該穩(wěn)定劑可以是，例如，氨基酸，如舉例來說，甘氨酸；或者低聚糖，如舉例來說，蔗糖、四糖、乳糖或葡聚糖?？蛇x地，穩(wěn)定劑還可以是糖醇，如舉例來說，甘露醇；或其組合物。優(yōu)選地，該穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑的組合物的構(gòu)成占該載體復(fù)合物的重量的約0.1％到約10％。
該表面活性劑優(yōu)選非離子性的表面活性劑，例如聚山梨醇酯。合適的表面活性劑的一些實例包括吐溫20、吐溫80；聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇，如從約0.001％(w/v)到約10％(w/v)的Pluronic F-68。
該鹽或緩沖劑可以是任何鹽或緩沖劑，如舉例來說，分別為，氯化鈉、或者磷酸鈉/磷酸鉀。優(yōu)選地，該緩沖劑將藥物組合物的pH維持在約5.5到約7.5的范圍內(nèi)。該鹽和/或緩沖劑也用于將摩爾滲透壓濃度維持在適合于給人或動物施用的水平。優(yōu)選地，該鹽或緩沖劑以約150mM到約300mM的粗略的等滲濃度存在。
本發(fā)明的方法中所用的載體復(fù)合物的組分還可以包含一種或多種傳統(tǒng)的添加劑。這樣的添加劑的一些實例包括增溶劑，如，舉例來說，甘油；抗氧化劑，如舉例來說，苯扎氯銨(季銨化合物的混合物，稱為“季銨化合物組(quats)”)，苯甲醇、氯惹酮或氯丁醇；麻醉劑，如舉例來說，嗎啡衍生物；或者等滲劑等，如上述的等滲劑。作為進一步防止氧化或其它腐敗的預(yù)防措施，該藥物組合物可以用不滲透的塞子封裝在小瓶中在氮氣下貯存。
該哺乳動物可以是任何哺乳動物，包括，例如，家畜，如羊、豬、牛、及馬；玩賞動物，如狗和貓；實驗動物，如大鼠、小鼠和兔。在優(yōu)選的具體實施例中，該哺乳動物是人。
應(yīng)用由于該載體復(fù)合物能夠以不依賴能量的機制穿過細(xì)胞膜，因此在體內(nèi)和體外可以有很多應(yīng)用。
該載體復(fù)合物能夠，例如，在體外用作研究工具。例如，該載體復(fù)合物可以將分子，如蛋白質(zhì)，遞送至細(xì)胞內(nèi)，以便研究該分子的功能角色。這樣的分子包括，例如，細(xì)胞信號蛋白(如，細(xì)胞核因子NF-κB、激酶，如JAK)。
體外的另一應(yīng)用包括，例如，將標(biāo)記物，如β-半乳糖苷酶，遞送至細(xì)胞內(nèi)，如干細(xì)胞、造血細(xì)胞、或者胚細(xì)胞，以便確定細(xì)胞的后代(譜系)。
體外的其它應(yīng)用包括，例如，將檢測性抗體遞送至細(xì)胞內(nèi)，以便確定該細(xì)胞內(nèi)特定蛋白的存在。
該載體復(fù)合物還在體內(nèi)具有治療性用途。例如，該芳香族陽離子肽可以用于將反義多聚核苷酸遞送至哺乳動物的細(xì)胞內(nèi)，以便下調(diào)蛋白質(zhì)的過度表達(dá)。此外，該芳香族陽離子肽可以用于遞送低聚核苷酸，該低聚核苷酸可以用于RNA干擾(RNAi)。
這里所用的RNAi涉及細(xì)胞機制，該細(xì)胞機制用于調(diào)節(jié)基因的表達(dá)或者病毒或細(xì)菌的復(fù)制。該機制包括導(dǎo)入雙鏈RNA(如，siRNA)至目標(biāo)基因的產(chǎn)物(通常為RNA)。
血腦屏障具有特殊的選擇性。因此，體內(nèi)的另一應(yīng)用包括遞送分子穿過血腦屏障。這樣的分子可以包括，例如，在阿爾茨海默氏病患者的治療中針對β-淀粉狀蛋白的抗體。
與化學(xué)治療劑相關(guān)的典型的問題是在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到足夠的水平。例如，該化學(xué)治療劑可能太大或者不是芳香族化合物，不足以穿過細(xì)胞膜。因此，體內(nèi)的又一應(yīng)用包括將化學(xué)治療劑，如上述細(xì)胞毒性劑，遞送至細(xì)胞內(nèi)。
實施例實施例1材料和方法藥物和化學(xué)制品。[Dmt1]DALDA和[3H][Dmt1]DALDA(47Ci/mmol)按照先前描述的方法合成(Schiller等，Eur.J.Med.Chem.2000，35895-901；Zhao等，J. Phermacol.Exp.Ther.2002，302188-196)。[14C]Gly-Sar(56.7mCi/mmol)和[3H][D-Ala2，N-Me-Phe4，Gly5-ol]-腦啡肽(50Ci/mmol)購自AmershamBiosciences(皮斯卡塔韋市，新澤西州)。所有的其它藥品和化學(xué)制品來自Sigma-Aldrich(圣路易斯市，密蘇里州)。
細(xì)胞培養(yǎng)。所有的細(xì)胞系來自美國典型培養(yǎng)物收集中心(American Type Culture Collection)(馬納薩斯鎮(zhèn)，弗吉尼亞州)，而細(xì)胞培養(yǎng)所需的供給物品來自Invitrogen(卡爾斯巴德市，加利福尼亞州)。Caco-2細(xì)胞在MEM中生長，而SH-SY5Y、HEK293、和Huh7細(xì)胞在Dulbecco的改良的Eagle培養(yǎng)基中生長。生長培養(yǎng)基中添加了10％胎牛血清、200μg/ml青霉素、以及100μg/ml硫酸鏈霉素。CRFK細(xì)胞在MEM+10％馬血清、非必需氨基酸、以及青霉素/鏈霉素中生長。所有的細(xì)胞系維持在37℃、含95％空氣和5％CO2的濕潤氣體中。
肽攝取實驗。首先利用Caco-2細(xì)胞研究肽的內(nèi)在化，隨后利用SH-SY5Y、HEK293、和CRFK細(xì)胞確認(rèn)。細(xì)胞的單層在覆蓋有膠原蛋白的12孔板上(5×105個細(xì)胞/孔)生長3天。第4天，用預(yù)熱的HBSS將細(xì)胞洗兩次，隨后在37℃將細(xì)胞與包含250nM[3H][Dmt1]DALDA或者50μM[14C]Gly-Sar的0.2ml HBSS孵育不同的時間至1小時。在一分開的實驗中，在未標(biāo)記的[Dmt1]DALDA(1μM-3mM)存在的情況下，將細(xì)胞與同樣濃度的[3H][Dmt1]DALDA在37℃孵育1小時。為了研究在4℃時的攝取，在細(xì)胞與[3H][Dmt1]DALDA或者[14C]Gly-Sar孵育前，將細(xì)胞放在冰上20分鐘。該孵育期結(jié)束后，用HBSS將細(xì)胞洗四次，并且將具有1％SDS的0.2ml 0.1N NaOH加到每個孔中。隨后將細(xì)胞內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到閃爍管中，并且計算放射性。細(xì)胞溶解產(chǎn)物的等分試樣用于借助Bradford(Bio-Rad，Hercules，加利福尼亞州)的方法測定蛋白質(zhì)含量。為了區(qū)分內(nèi)在的放射性和表面結(jié)合的放射性，包括了酸洗步驟。細(xì)胞溶解前，將細(xì)胞與0.2ml 0.2M乙酸/0.05M NaCl在冰上孵育5分鐘。
源自CaCo-2細(xì)胞的肽的泄漏實驗。單層Caco-2細(xì)胞在12孔板上(5×105個細(xì)胞/孔)生長3天。第4天，在37℃利用[3H][Dmt1]DALDA或者[14C]Gly-Sar將細(xì)胞預(yù)載(preload)1小時。然后用1ml冰冷的孵育液將細(xì)胞洗四次，以便終止攝取，隨后在37℃或4℃將細(xì)胞與0.5ml MEM孵育1小時，以便測定肽從細(xì)胞到該孵育培養(yǎng)基的泄漏量。在細(xì)胞溶解產(chǎn)物和孵育培養(yǎng)基中測定放射性的數(shù)量。為了檢測P-糖蛋白在肽攝取和從細(xì)胞中泄漏出時所起的作用，還在100μM異搏定存在時測定了[Dmt1]DALDA的攝取和泄漏量。
肽穿過Caco-2單層的易位實驗。如前所述制備Caco-2細(xì)胞的單層(Irie等，J. Pharmacol.Exp.Ther.2001，298711-717)。將Caco-2細(xì)胞(2×105)接種在轉(zhuǎn)孔細(xì)胞培養(yǎng)容器(Corning Glassworks，科寧市，紐約州)內(nèi)的多微孔膜過濾器上(24mm，0.4μm)。每個轉(zhuǎn)孔容器在其頂部隔間充有1.5ml培養(yǎng)基，在其底側(cè)隔間充有2.5ml培養(yǎng)基。每1到2天給予該細(xì)胞單層新鮮的培養(yǎng)基，在第28天將細(xì)胞單層用于轉(zhuǎn)運實驗。通過將0.2μM[3H][Dmt1]DALDA或者100μM[14C]Gly-Sar加入到頂部隔間來測定肽從頂部隔間到底側(cè)隔間的轉(zhuǎn)運，并且在加入肽后的不同時間將50-μl等分試樣從頂部和底側(cè)隔間除去，以便測定放射性計數(shù)。
按照下面的公式計算表觀滲透系數(shù)Papp＝X/(t·A·Co)，其中X/t是接收隔間內(nèi)的攝取率，A是擴散面積(4.72cm2)，而Co是供體隔間內(nèi)的初始濃度。
激光共聚焦掃描顯微鏡。芳香族-陽離子肽被攝取入細(xì)胞通過激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)利用兩種熒光肽來確認(rèn)，該熒光肽為[Dmt1，dnsDap4]DALDA(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-dnsDap-NH2，其中dnsDap是β-丹酰-1-α，β-二氨基-丙酸)和[Dmt1，atnDap4]DALDA(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-atnDap-NH2，其中atnDap是β-鄰氨基苯甲?；?L-α，β-二氨基丙酸)。Caco-2細(xì)胞或SH-SY5Y細(xì)胞如上所述的那樣生長，然后被平鋪在(35-mm)玻璃底盤上(MatTek，阿什蘭市，馬薩諸塞州)持續(xù)兩天。隨后此培養(yǎng)基被移除，并且細(xì)胞與包含0.1μM熒光肽的1ml HBSS在4℃或37℃孵育15分鐘。然后用冰冷的HBSS將細(xì)胞洗三次，接著用200μl PBS覆蓋細(xì)胞，隨后在室溫下用具有C-復(fù)消色差透鏡63×/1.2W校正物鏡的激光共聚焦掃描顯微鏡(Nikon，東京，日本)在10分鐘內(nèi)進行顯微鏡檢查。[Dmt1，dnsDap4]DALDA和[Dmt1，atnDap4]DALDA的激發(fā)/發(fā)射波長分別設(shè)定在340/520nm和320/420nm。對于z軸的光學(xué)切片，每2.0μm切5-10幀。
利用細(xì)胞膜的放射性配體結(jié)合實驗。[3H][Dmt1]DALDA與細(xì)包表面受體的特異性結(jié)合是利用制備自Caco-2和SH-SY5Y細(xì)胞的膜測定的。培養(yǎng)4天后，用PBS緩沖液將細(xì)胞洗2次，隨后刮下細(xì)胞。在500g將細(xì)胞離心5分鐘，隨后將沉淀貯存在-80℃。在冰冷的50mM Tris-HCl緩沖液中(5μg/ml亮肽素、2μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制劑、10μg/ml苯丁抑制素、以及1mM EGTA，pH7.4)勻化細(xì)胞。在36,000g將勻漿離心20分鐘。將沉淀重新懸浮在50mM Tris-HCl中。在25℃將膜勻漿的等分試樣(～140μg蛋白質(zhì))與[3H][Dmt1]DALDA(15-960pM)孵育60分鐘。非特異性結(jié)合通過混入1μM未標(biāo)記的[Dmt1]DALDA來評估。借助具有細(xì)胞收集器(Brandel公司，蓋瑟斯堡市，馬里蘭州)的GF/B過濾器(Whatman，梅德斯通市，英國)，通過快速的過濾將游離的放射性配體與結(jié)合的放射性配體分離開。用10ml Tris緩沖液將過濾器洗三次，隨后通過液體閃爍計數(shù)測定放射性。利用非線性回歸(GraphPad Software，圣地亞哥市，加利福尼亞州)測定結(jié)合親和性(Kd)和受體數(shù)目(Bmax)。
蛋白質(zhì)共軛結(jié)合到[Dmt1]DALDA上。利用交聯(lián)劑SMCC(琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己基-1-羧酸鹽)(Pierce)將[Dmt1]DALDA交聯(lián)到β-半乳糖苷酶(recombinant E.coli，Sigma-Aldrich)。SMCC與含胺的分子([Dmt1]DALDA的Lys4)反應(yīng)，以便形成穩(wěn)定的酰胺鍵。隨后它的馬來酰亞胺基末端可以被共軛結(jié)合到含巰基的化合物上，以便形成硫醚鍵合(BioconjugateTechniques by Greg T.Hermanson，Academic Press，Page 234-237)。β-半乳糖苷酶在其天然狀態(tài)時包含大量自由巰基。β-半乳糖苷酶的攝取提供了利用X-gal的便利的讀取。簡單地說，在室溫下將1ml 5×10-3M[Dmt1]DALDA與1mg SMCC在磷酸鹽緩沖液中混合1小時。這將形成“活化的肽”。用磷酸鹽緩沖液將“活化的肽”按1∶10稀釋。將1mg β-半乳糖苷酶加入到1ml該1∶10的“活化的肽”中，并且在4℃混合2小時或一整夜。
將[Dmt1]DALDA連接到交聯(lián)劑SMCC上，并且通過質(zhì)譜分析確認(rèn)。將SMCC(1μg)和[Dmt1]DALDA(5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室溫下孵育30分鐘、然后在4℃貯存。將該樣品的等分試樣與基質(zhì)(50％的乙腈中飽和的3-羥基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的檸檬酸銨)以1∶10的比率混合，然后將其點樣在不銹鋼的靶平板(target plate)上。通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜分析(MALDI-TOF MS)(Applied Biosystems(Voyager DE Pro))以正向反射模式分析。
將RNA結(jié)合到[Dmt1]DALDA上，并且通過凝膠電泳確認(rèn)。利用γ-32P-ATP和多聚核苷酸激酶在5’末端將合成的RNA低聚物(長度為40個核苷酸)磷酸化。通過凝膠將產(chǎn)物純化。在1mg EDC(N-[3-二甲氨基丙基-N’-乙基碳酰亞胺])存在時，將500,000cpm的凝膠-純化的RNA低聚物與[Dmt1]DALDA結(jié)合。將結(jié)合的產(chǎn)物([Dmt1]DALDA-RNA低聚物)在15％的聚丙烯酰胺基脲凝膠上單獨分析。
將DNA結(jié)合到[Dmt1]DALDA上，并且通過質(zhì)譜分析確認(rèn)。將SMCC(1μg)和[Dmt1]DALDA(5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室溫下孵育30分鐘、并且在4℃與去保護的3’-硫醇基DNA低聚物混合24小時。孵育后，將該樣品的等分試樣與基質(zhì)(50％的乙腈中飽和的3-羥基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的檸檬酸銨)以1∶10的比率混合，并且將其點樣在不銹鋼的靶平板上。通過MALDI-TOFMS分析樣品。
通過物理性混合RNA和[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物形成載體復(fù)合物。如上該制備[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物。在用于細(xì)胞攝取研究前，在室溫下將該RNA分子與[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物在PBS中混合15分鐘。
通過物理性混合蛋白質(zhì)和[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物形成載體復(fù)合物。如上所述制備[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物。在用于細(xì)胞攝取研究前，在室溫下將該蛋白質(zhì)分子(即，綠色熒光蛋白，GFP)與[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物混合15分鐘。
DALDA-RNA結(jié)合物被攝取進入細(xì)胞的實驗。利用γ-32P-ATP和多聚核苷酸激酶在5’末端將合成的RNA低聚物磷酸化，并且通過凝膠電泳將產(chǎn)物純化。在1mg N-(3-二甲氨基丙基-N’-乙基碳酰亞胺)(EDC)存在時，將500,000cpm的凝膠-純化的RNA低聚物與[Dmt1]DALDA結(jié)合(偶合)。將Caco-2細(xì)胞(1×106)在DMEM培養(yǎng)基中洗三次，并且在DMEM中預(yù)先孵育5分鐘。隨后在37℃將細(xì)胞與[Dmt1]DALDA-[32P]RNA低聚物結(jié)合物或非結(jié)合的RNA(接近20,000cpm)孵育60分鐘。孵育后，將該細(xì)胞在DMEM中洗三次，與溶解緩沖液共同稀釋，隨后在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中測定放射性。
RNA在與[Dmt1]DALDA-交聯(lián)劑結(jié)合物混合后被攝取入細(xì)胞實驗。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃或4℃將細(xì)胞與1.0ml DMEM孵育60分鐘，該DMEM中僅包含[32P]RNA低聚物，或者包含[32P]RNA低聚物和40μl[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物。隨后將細(xì)胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以便在溶解緩沖液中孵育30分鐘之前減少非特異性結(jié)合，隨后在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中測定放射性。
DALDA-蛋白質(zhì)結(jié)合物被攝取入細(xì)胞的實驗。將細(xì)胞(N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞或Caco-2)平鋪在96孔板內(nèi)(2×104個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃將細(xì)胞與交聯(lián)有β-半乳糖苷酶的[Dmt1]DALDA或僅與β-半乳糖苷酶孵育1小時。然后用PBS將細(xì)胞洗4次。隨后在37℃用β-半乳糖苷酶染色系統(tǒng)(Roche)將細(xì)胞染色至少2小時，隨后在顯微鏡下檢查。
蛋白質(zhì)與[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物孵育后被攝取入細(xì)胞的實驗。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃將細(xì)胞與0.5ml DMEM孵育60分鐘，該DMEM僅包含3μg綠色熒光蛋白(GFP)(A)；包含3μg GFP和40μl[Dmt1]DALDA(B)；或者包含3μg GFP和40μl與SMCC結(jié)合的[Dmt1]DALDA(C)。隨后將2ml的細(xì)胞培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中，在細(xì)胞培養(yǎng)孵育器中孵育了額外的24小時。孵育后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中將細(xì)胞沖洗四次，隨后通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察保留在活細(xì)胞中的GFP。在340nm處進行激發(fā)，而在520nm處測量發(fā)射。
凋亡實驗。利用Hoechst染料(Molecular Probes，尤金市，俄勒岡州)將凋亡的細(xì)胞核染色來確定凋亡。將Hoechst染料加載到細(xì)胞培養(yǎng)物中并且孵育15分鐘。通過用細(xì)胞培養(yǎng)基(不含pH指示劑)沖洗細(xì)胞除去過多的Hoechst染料，然后利用熒光顯微鏡檢查細(xì)胞(在350nm處激發(fā)，而在461nm處(測量)發(fā)射)。
實施例2[Dmt1]DALDA和Gly-Sar被攝取入Caco-2細(xì)胞的時間過程。
當(dāng)[3H][Dmt1]DALDA與Caco-2細(xì)胞在37℃孵育時，早在5分鐘時就觀察到了細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的[3H][Dmt1]DALDA，而到30分鐘時達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平(圖1A)。1小時的孵育后，細(xì)胞溶解產(chǎn)物中回收的[3H][Dmt1]DALDA的總量占全部藥物的約1％。與之相比，在同樣的實驗條件下，[14C]Gly-Sar在5到45分鐘時持續(xù)增加(圖1B)。可以相信測定的放射性可以反映[Dmt1]DALDA的水平，因為先前已經(jīng)證實[Dmt1]DALDA可以防止肽酶的下降(Szeto等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2001，29857-61)。為了確定測定的放射性是否與細(xì)胞膜相關(guān)，將細(xì)胞酸洗，以便除去表面結(jié)合。圖1C顯示80.8％的[3H][Dmt1]DALDA可以耐受酸洗，因此判定其存在于細(xì)胞內(nèi)部。已發(fā)現(xiàn)[Dmt1]DALDA的攝取在較廣的濃度范圍內(nèi)是濃度依賴性的(圖1D)。
實施例3DH對于[Dmt1]DALDA和Gly-Sar的攝取的溫度依賴性和影響。
當(dāng)在4℃進行孵育時，[3H][Dmt1]DALDA的攝取與在37℃時相比較慢，但是在45分鐘時達(dá)到76.5％(圖1A)，并且在1小時時達(dá)到86.3％(圖1A)。與之相比，[14C]Gly-Sar的攝取在4℃時完全消除了(圖1B)。已知PEPT1對Gly-Sar的攝取是pH依賴性的，在pH6.0時進行的攝取最佳(Terada等，1999，Am.J.Physiol.276G1435-G1441)。這在我們的研究中得到了證實(圖2B)。與之相比，當(dāng)pH從4.0到7.4變化時，[3H][Dmt1]DALDA的攝取沒有變化(圖2A)。這種溫度和pH依賴性缺乏表明Caco-2細(xì)胞內(nèi)的[Dmt1]DALDA的攝取不是經(jīng)由PEPT1(肽的轉(zhuǎn)運體1)介導(dǎo)的。
實施例4DEPC對于[Dmt1]DALDA和Gly-Sar攝取的影響。
為了進一步表明PEPT1沒有涉及[Dmt1]DALDA的轉(zhuǎn)運，我們研究了DEPC(焦碳酸二乙酯；0.2mM)對于[3H][Dmt1]DALDA和[14C]Gly-Sar攝取的影響。DEPC是一種組氨酸殘基的修飾試劑，已顯示其可以抑制Caco-2細(xì)胞內(nèi)的PEPT1(Terada等，F(xiàn)EBS.Lett.，1996，394196-200)。將DEPC添加到孵育培養(yǎng)基中顯著抑制了[14C]Gly-Sar攝取(圖2D)。令人驚奇的是，DEPC不僅沒有抑制[3H][Dmt1]DALDA攝取，而且它居然將[3H][Dmt1]DALDA攝取提高了34倍(圖2C)。
實施例5[Dmt1]DALDA在不同的細(xì)胞類型中的內(nèi)在化。
為了證明[Dmt1]DALDA的內(nèi)在化不限于Caco-2細(xì)胞，我們在許多不同的細(xì)胞系中比較了[Dmt1]DALDA的內(nèi)在化。加入了酸洗步驟以便將內(nèi)在的放射性(耐酸的)與表面結(jié)合的放射性(對酸敏感的)區(qū)分開來。圖3A比較了Caco-2細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、及CRFK細(xì)胞中的耐酸的放射性的水平。結(jié)果顯示[3H][Dmt1]DALDA在所有的細(xì)胞類型中都被大量地攝取。
實施例6與[3H][Dmt1]DALDA的放射性配體結(jié)合實驗。
為了確定[Dmt1]DALDA的內(nèi)在化是否經(jīng)由受體介導(dǎo)的機制，我們進行了放射性配體([3H][Dmt1]DALDA)與制備自Caco-2細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的膜的結(jié)合實驗。圖3B顯示了[3H][Dmt1]DALDA與SH-SY5Y細(xì)胞膜的特異性結(jié)合。計算出的Kd值是118pM(范圍是87-149)，而計算出的Bmax值是96fmol/mg蛋白質(zhì)(范圍是88-104)。這相當(dāng)于利用中國倉鼠卵巢細(xì)胞上表達(dá)的重組的人類μ-阿片樣受體得到的值(G.-M.Zhao和H.H.Szeto，未公開的數(shù)據(jù))。沒有觀察到與Caco-2細(xì)胞膜的高度親和性的特異性結(jié)合(圖3B)。已知HEK293細(xì)胞沒有阿片樣受體(Blake等，J.Biol.Chem.，1997，272782-790)。
實施例7[Dmt1]DALDA和Gly-Sar從Caco-2細(xì)胞中的泄漏。
Caco-2細(xì)胞中的[3H][Dmt1]DALDA在＜30分鐘的孵育后達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平，這表明此時該肽從細(xì)胞中泄漏的速率與攝取的速率相等。為了測定Gly-Sar和[Dmt1]DALDA從細(xì)包中的泄漏量，用[14C]Gly-Sar或[3H][Dmt1]DALDA將Caco-2細(xì)胞預(yù)載，然后給該細(xì)胞換上不包含肽的新鮮培養(yǎng)基。圖4A顯示37℃時1小時后在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了39％的[14C]Gly-Sar。[14C]Gly-Sar的泄漏量在4℃時顯著減少了。源自Caco-2細(xì)胞的[3H][Dmt1]DALDA的泄漏要快得多，在1小時時該肽的80％泄漏到培養(yǎng)基中(圖4A)。與[3H][Dmt1]DALDA的內(nèi)在化相反(圖1A)，溫度對于[3H][Dmt1]DALDA從細(xì)胞中的泄漏具有重大的影響(圖4A)。在用DEPC處理過的細(xì)胞中，[Dmt1]DALDA的泄漏減少了(圖4B)。由DEPC所致的[3H][Dmt1]DALDA泄漏量的減少與DEPC存在時[3H][Dmt1]DALDA攝取的顯著增加(圖2C)相一致。另一方面，[3H][Dmt1]DALDA的泄漏不受異搏定(一種P-糖蛋白的抑制劑)的影響(圖4C)。異搏定對于[3H][Dmt1]DALDA的細(xì)胞攝取也沒有影響(圖4D)。
如果在[Dmt1]DALDA-蛋白質(zhì)結(jié)合物被細(xì)胞攝取后，其被酶切開，[Dmt1]DALDA泄漏出細(xì)胞，而蛋白質(zhì)裝載物仍在細(xì)胞內(nèi)，那么這種[Dmt1]DALDA泄漏出細(xì)胞就是有利的。
實例8[Dmt1]DALDA和Gly-Sar的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運。
在轉(zhuǎn)孔(transwell)中生長的Caco-2單層被用于研究[3H][Dmt1]DALDA和[14C]Gly-Sar的從頂部到底側(cè)部的轉(zhuǎn)運。圖5顯示在轉(zhuǎn)孔的頂部面加載了該肽后，在不同的時間時底側(cè)面中的[14C]Gly-Sar和[3H][Dmt1]DALDA 的轉(zhuǎn)運。在60分鐘內(nèi)[3H][Dmt1]DALDA從頂部面轉(zhuǎn)移到底側(cè)面的百分?jǐn)?shù)(10.4％)與轉(zhuǎn)移的[14C]Gly-Sar的百分?jǐn)?shù)(11.9％)相當(dāng)。據(jù)推算，[Dmt1]DALDA的表觀滲透系數(shù)是1.24×10-5cm/s，而Gly-Sar的表觀滲透系數(shù)是1.26×10-5cm/s.
實施例9利用CLSM觀察芳香族-陽離子肽的細(xì)胞攝取。
為了觀察芳香族-陽離子肽的細(xì)胞內(nèi)在化的攝取和模式，借助CLSM研究了兩種熒光肽([Dmt1，dnsDap4]DALDA和[Dmt1，atnDap4]DALDA)。圖6顯示了在Caco-2細(xì)胞與0.1μM[Dmt1，dnsDap4]DALDA在37℃孵育15分鐘后，該熒光肽的內(nèi)在化進入Caco-2細(xì)胞。出現(xiàn)的熒光彌散于整個細(xì)胞質(zhì)，而沒有明顯的泡狀分布，表明該肽的攝取沒有涉及內(nèi)吞作用，并且該肽沒有被封閉在內(nèi)涵體內(nèi)。還注意到，該肽被完全排除于細(xì)胞核外。在SH-SY5Y細(xì)胞與0.1μM[Dmt1，atnDap4]DALDA在4℃孵育30分鐘后，[Dmt1，atnDap4]DALDA內(nèi)在化進入SH-SY5Y細(xì)胞，這清楚地支持非能量依賴性的非內(nèi)吞的攝取機制，原因是內(nèi)吞是一種依賴能量的過程。
實施例10肽連接到交聯(lián)劑SMCC上，并且通過質(zhì)譜分析確認(rèn)。
將SMCC(1μg)和5μg的[Dmt1]DALDA，[Phe1]DALDA、或者[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]一起溶解在2ml PBS中、在室溫下孵育30分鐘、然后在4℃貯存。將該樣品的等分試樣與基質(zhì)(50％的乙腈中飽和的3-羥基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的檸檬酸銨)以1∶10的比率混合，然后將其點樣在不銹鋼的靶平板上。通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜分析(MALDI-TOF MS)(Applied Biosystems(Voyager DE Pro))以正向反射模式分析樣品。該肽的分子量和它們各自的肽-SMCC共軛結(jié)合物顯示在質(zhì)譜上(圖7)。
實施例11與蛋白質(zhì)裝載物結(jié)合的肽將蛋白質(zhì)裝載物帶入細(xì)胞。
利用交聯(lián)劑SMCC(Pierce)將各種肽交聯(lián)到β-半乳糖苷酶上(recombinant E.coli，Sigma-Aldrich)。SMCC與含胺的分子([Dmt1]DALDA的Lys4)反應(yīng)，以便形成穩(wěn)定的酰胺鍵。通過質(zhì)譜分析確認(rèn)肽-SMCC共軛結(jié)合物的形成(圖7)。隨后它的馬來酰亞胺基末端可以被共軛結(jié)合到含巰基的化合物上，以便形成硫醚鍵(Greg T.Hermanson的Bioconjugate Techniques，Academic出版社，234-237頁)。β-半乳糖苷酶在其天然狀態(tài)時包含大量自由巰基。β-半乳糖苷酶的攝取提供了利用X-gal的便利的讀取。
簡單地說，室溫下將1ml 5×10-3M[Dmt1]DALDA、[Phe1]DALDA、或者[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]與1mg SMCC在磷酸鹽緩沖液中混合1小時。這形成“活化的肽”。用磷酸鹽緩沖液將“活化的肽”按1∶10稀釋。將1mg β-半乳糖苷酶加入到1ml該1∶10的“活化的肽”中，并且在4℃混合2小時或一整夜。
將細(xì)胞(N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞或Caco-2)平鋪在96孔板內(nèi)(2×104個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃將細(xì)胞與β-半乳糖苷酶或與[Dmt1]DALDA交聯(lián)的β-半乳糖苷酶、[Phe1]DALDA或者[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]孵育1小時。然后用磷酸鹽緩沖液將細(xì)胞洗4次。隨后在37℃用β-半乳糖苷酶染色系統(tǒng)(Roche)將細(xì)胞染色至少2小時，隨后在顯微鏡下檢查。
當(dāng)Caco-2細(xì)胞與β-半乳糖苷酶孵育時，沒有觀察到β-半乳糖苷酶的攝取(圖8A)。藍(lán)色細(xì)胞的存在表明Caco-2細(xì)胞內(nèi)與[Dmt1]DALDA共軛結(jié)合的β-半乳糖苷酶的攝取(圖8B)。在β-半乳糖苷酶與[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2](圖8C)或[Phe1]DALDA(圖8D)共軛結(jié)合時，也發(fā)現(xiàn)了β-半乳糖苷酶的攝取增加。β-半乳糖苷酶僅與SMCC的共軛結(jié)合沒有增加攝取。
在利用神經(jīng)N2A細(xì)胞或CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)時，也得到了同樣的結(jié)果。
實施例12與[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物的孵育增加了綠色熒光蛋白(GFP)進入Huh7細(xì)胞的攝取。
用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃將細(xì)胞與0.5ml DMEM孵育60分鐘，該DMEM僅包含3μgGFP；包含3μg GFP和40μl[Dmt1]DALDA；或者包含3μg GFP和40μl與SMCC結(jié)合的[Dmt1]DALDA。隨后將2ml細(xì)胞培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中，并在細(xì)胞培養(yǎng)孵育器中孵育額外的24小時。孵育后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中將細(xì)胞沖洗四次，隨后通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察保留在活細(xì)胞中的GFP。在340nm處進行激發(fā)，而在520nm處測量發(fā)射。
圖9(頂部的板塊)代表通過Huh7細(xì)胞的0.8μm厚的中部的水平光學(xué)部分的GFP的圖像。圖9(底部的板塊)代表同一區(qū)域內(nèi)的不同界面的對比圖像。
GFP與[Dmt1]DALDA的孵育顯示與僅與GFP孵育相比，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的綠色熒光適中地增加(圖9B)。在細(xì)胞核內(nèi)沒有觀察到綠色熒光。GFP與[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物的孵育甚至顯示了更多的GFP的攝取(圖9C)。這些數(shù)據(jù)表明[Dmt1]DALDA可以僅通過修飾的肽與蛋白質(zhì)的物理性混合增加蛋白質(zhì)進入細(xì)胞的攝取，而該肽與蛋白質(zhì)之間的化學(xué)性結(jié)合不是必需的。
實施例13[Dmt1]DALDA與RNA裝載物的結(jié)合。
在與多聚核苷酸激酶的反應(yīng)中，利用γ-32P-ATP在5’末端將合成的RNA低聚物(長度為40個核苷酸)磷酸化。通過凝膠將產(chǎn)物純化。在1mg EDC(N-[3-二甲氨基丙基-N’-乙基碳酰亞胺])存在時，500,000計數(shù)/分鐘的凝膠-純化的RNA低聚物在與10mM[Dmt1]DALDA的反應(yīng)中與其共軛連接。將結(jié)合反應(yīng)的產(chǎn)物([Dmt1]DALDA-RNA低聚物)與單獨的對照RNA低聚物在15％的聚丙烯酰胺基脲凝膠上分析。在該凝膠上的兩條獨立的帶表示單獨的RNA低聚物和[Dmt1]DALDA-RNA低聚物的結(jié)合物(圖10)。
實施例14[Dmt1]DALDA-RNA低聚物的結(jié)合物被攝取入Caco-2細(xì)胞。
將Caco-2細(xì)胞(1×106)在DMEM培養(yǎng)基中洗三次，并且在加入低聚物之前在DMEM中預(yù)先孵育5分鐘。隨后，將[Dmt1]DALDA-RNA低聚物的結(jié)合物或非結(jié)合的RNA(每個接近20,000計數(shù)/每分鐘)加入到該細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且在37℃孵育60分鐘。
孵育后，除去反應(yīng)培養(yǎng)基，用DMEM將細(xì)胞洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以便減少非特異性結(jié)合。最后，將細(xì)胞在溶解緩沖液中孵育30分鐘，隨后在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中測定放射性。
Caco-2細(xì)胞顯示對[Dmt1]DALDA-RNA低聚物的結(jié)合物的攝取比對單獨的非共軛結(jié)合的RNA低聚物的攝取多了三倍多(圖11)。因此，[Dmt1]DALDA可以促進RNA低聚物穿過細(xì)胞膜。
實施例15RNA與[Dmt1]DALDA-SMCC連接劑的混合增強了RNA被攝取入細(xì)胞。
通過將RNA和[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物物理性混合形成該載體復(fù)合物。如下所述，通過將[Dmt1]DALDA與交聯(lián)劑SMCC混合來制備[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物。在用于細(xì)胞攝取研究前，將單鏈的11-mer[32P]RNA低聚物與[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物在室溫下混合15分鐘。
用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)，隨后在37℃或4℃將該細(xì)胞與1.0ml DMEM孵育，該DMEM中僅包含[32P]RNA低聚物(～100,000cpm)，或者包含[32P]RNA低聚物和40μl[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物。隨后將細(xì)胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以便將其在溶解緩沖液中孵育30分鐘之前除去非特異性結(jié)合，隨后測定保留的放射性。
RNA低聚物與[Dmt1]DALDA-SMCC在37℃孵育提高了作為時間函數(shù)的RNA低聚物的攝取(圖12A)。在一小時時，RNA低聚物的攝取在[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物存在時與單獨的RNA孵育相比提高了～20倍。RNA的攝取被[Dmt1]DALDA-SMCC顯著地提高了(圖12B)。這些數(shù)據(jù)表明可以不經(jīng)過與[Dmt1]DALDA的化學(xué)結(jié)合物提高RNA的攝取。4℃時的攝取提高了非能量依賴性的非胞吞過程，與[Dmt1]DALDA通過被動擴散進入細(xì)胞膜的能力一致。
除了[Dmt1]DALDA-SMCC，與[Phe1]DALDA-SMCC結(jié)合物的孵育也可以提高11-mer RNA低聚物的攝取。圖12C顯示RNA攝取的增加，在37℃與三種不同的肽-SMCC結(jié)合物孵育15分鐘。
如圖13所示，與[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物的孵育也可以促進大的多的RNA分子(1350-mer)的細(xì)胞攝取，雖然沒有對較小的低聚物那么多。
實施例16[Dmt1]DALDA與DNA低聚物的結(jié)合。
將SMCC(1μg)和[Dmt1]DALDA(SS002；5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室溫下孵育30分鐘、隨后在4℃與去保護的3’-硫醇基DNA低聚物混合24小時。孵育后，將樣品的等分試樣與基質(zhì)(50％的乙腈中飽和的3-羥基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的檸檬酸銨)以1∶10的比率混合，并且將其點樣在不銹鋼的靶向平板上。
通過MALDI-TOF MS確認(rèn)DNA-[Dmt1]DALDA結(jié)合物的形成。已發(fā)現(xiàn)3’-硫醇基DNA低聚物和[Dmt1]DALDA-DNA共價復(fù)合物的分子量分別為6392和7171(圖14A)。
實施例17[Dmt1]DALDA-DNA低聚物的結(jié)合物被攝取入細(xì)胞。
利用SMCC將3’-硫醇修飾的20-mer DNA共軛結(jié)合到[Dmt1]DALDA上，并且通過質(zhì)譜分析確認(rèn)結(jié)合物的形成。用32P將結(jié)合和非結(jié)合的DNA低聚物在其5’-末端用放射性同位素標(biāo)記(圖14B)。
用DMEM沖洗神經(jīng)N2A(1×106個細(xì)胞/孔)細(xì)胞，然后在37℃和5％CO2的條件下將該細(xì)胞與1ml DMEM孵育2小時或19小時，該DMEM中包含有或沒有與DNA低聚物(～100,000cpm)結(jié)合的[Dmt1]DALDA。然后將細(xì)胞在DMEM中沖洗四次，在醋酸鈉溶液中沖洗一次，以便減少非特異性結(jié)合。隨后將該細(xì)胞在溶解緩沖液中孵育30分鐘，隨后確定保留的放射性。
19小時的孵育后，與[Dmt1]DALDA結(jié)合的DNA的攝取多于沒有結(jié)合的DNA(圖15)，表明與[Dmt1]DALDA的結(jié)合可以增加DNA的攝取。
實施例18肽和肽-SMCC結(jié)合物對細(xì)胞沒有毒性。
不管是該肽還是肽-SMCC結(jié)合物對培養(yǎng)的細(xì)胞是沒有毒性的。用[Dmt1]DALDA(1nM到10μM)處理24小時對細(xì)胞的生存能力沒有影響，這一點通過對N2A細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞或Caco-2細(xì)胞的MTT實驗測定(MTS assay，Promega，麥迪遜市，威斯康星州)(圖16)。對[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]的同樣的研究也表明對細(xì)胞生存能力沒有影響。
將培養(yǎng)的細(xì)胞與肽-SMCC結(jié)合物孵育對細(xì)胞的生存能力也沒有影響，這一點通過臺盼藍(lán)的攝取測定。臺盼藍(lán)僅被細(xì)胞膜通透性增加的細(xì)胞攝取。在DMEM、和1ml新鮮的培養(yǎng)基、或包含50μl的1mM [Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物、[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]-SMCC結(jié)合物、或[Phe1]DALDA-SMCC結(jié)合物中將Huh7細(xì)胞(1×106)沖洗三次，并且在37℃和5％CO2的條件下孵育24小時。隨后用DMEM將細(xì)胞沖洗三次，然后將1ml 0.4％臺盼藍(lán)加入到該細(xì)胞中達(dá)2分鐘。通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中沖洗細(xì)胞除去過多的染料，通過光學(xué)顯微鏡檢查該細(xì)胞。
通過光學(xué)顯微鏡對細(xì)胞的檢查表明僅與介質(zhì)孵育的細(xì)胞顯示了最小的臺盼藍(lán)攝取。在與[Dmt1]DALDA-SMCC、[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]-SMCC、或[Phe1]DALDA孵育的細(xì)胞中沒有觀察到臺盼藍(lán)的攝取增加。與之相比，與DEPC(焦碳酸二乙酯)孵育的細(xì)胞產(chǎn)生臺盼藍(lán)攝取的顯著增加。
培養(yǎng)的細(xì)胞與[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物的孵育也沒有引起培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞的凋亡。將Huh7細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)在DMEM中沖洗三次，并且加入1ml新鮮的培養(yǎng)基。隨后，將50μl PBS中經(jīng)修飾的[Dmt1]DALDA(1mM)或僅PBS(對照)加入到該細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且在37℃和5％CO2的條件下孵育24小時。孵育后，將1ml可以將凋亡的細(xì)胞核染色的Hoechst染料(Molecular Probes，尤金，俄勒岡州)加入到細(xì)胞中，并且再孵育15分鐘。通過用細(xì)胞培養(yǎng)基(不含pH指示劑)沖洗細(xì)胞除去過多的Hoechst染料，然后利用熒光顯微鏡(在350nm處激發(fā)，而在461nm處測量發(fā)射)比較經(jīng)[Dmt1]DALDA-SMCC結(jié)合物處理的細(xì)胞和對照細(xì)胞。通過細(xì)胞核中的熒光濃度顯示凋亡。圖17表明經(jīng)[Dmt1]DALDA-SMCC處理的Huh7細(xì)胞中凋亡的水平與對照細(xì)胞中的凋亡水平相同。
權(quán)利要求
1.一種將分子遞送到細(xì)胞的方法，所述方法包括將載體復(fù)合物與所述細(xì)胞接觸，其中所述載體復(fù)合物包括所述分子和芳香族陽離子肽，其中所述芳香族陽離子肽包括(a)至少一個凈正電荷；(b)最少三個氨基酸；(c)最多十個氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或者等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時，pt也可以為1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中2a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中a等于pt。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少兩個正電荷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少三個正電荷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽是包括兩個帶正電荷的氨基酸和一個芳香族氨基酸的三肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽是水溶性的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽包括一個或多個D-氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述氨基酸的位于C-末端的C-末端羧基被酰胺化。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽包括一個或多個非天然存在的氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少四個氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多約八個氨基酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多約六個氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有四個氨基酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(DALDA)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是2’，6’-Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmt1-DALDA)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Phe1-DALDA)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是右旋精氨酸-2’，6’Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是2’，6’-Dmp-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmp1-DALDA)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子是小分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述小分子是具有藥物活性的分子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是抗生素。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是細(xì)胞毒性劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是鏈霉素。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是阿霉素。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是抗氧化劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗氧化劑是維生素E。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗氧化劑是維生素C。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗氧化劑是β-胡蘿卜素。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子是生物分子。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述生物分子是聚氨基酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述生物分子是具有藥物活性的分子。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是內(nèi)源性的肽或蛋白質(zhì)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是抗體。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是神經(jīng)生長因子。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是細(xì)胞因子。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是多聚核苷酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是低聚核苷酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是RNA。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述RNA是雙鏈RNA。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述雙鏈RNA是siRNA。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是DNA。
44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是單鏈RNA。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述單鏈RNA是信使RNA(mRNA)。
46.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是核酶。
47.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是反義RNA。
48.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是核酶的外部指導(dǎo)序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是RNA誘餌。
50.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述生物分子是多聚氨基酸。
51.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌的細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是動物細(xì)胞。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述動物細(xì)胞是哺乳動物的細(xì)胞。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是腎上皮細(xì)胞。
57.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞。
58.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。
59.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞。
60.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
61.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是肝細(xì)胞。
62.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述芳香族-陽離子肽包括連接劑。
63.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子包括連接劑。
64.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子和芳香族陽離子肽是化學(xué)性結(jié)合。
65.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子和芳香族陽離子肽是物理性結(jié)合。
66.一種包括分子和芳香族陽離子肽的載體復(fù)合物，其中所述芳香族陽離子肽包括(a)至少一個凈正電荷；(b)最少三個氨基酸；(c)最多十個氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或者等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時，pt也可以為1。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中2a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中a等于pt。
69.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最少兩個正電荷。
70.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最少三個正電荷。
71.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽是包括兩個帶正電荷的氨基酸和一個芳香族氨基酸的三肽。
72.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽是水溶性的。
73.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽包括一個或多個D-氨基酸。
74.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述氨基酸的位于C-末端的C-末端羧基被酰胺化。
75.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽包括一個或多個非天然存在的氨基酸。
76.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最少四個氨基酸。
77.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最多約八個氨基酸。
78.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最多約六個氨基酸。
79.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有四個氨基酸。
80.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(DALDA)。
81.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是2’，6’-Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmt1-DALDA)。
82.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Phe1-DALDA)。
83.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是右旋精氨酸-2’，6’Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2。
84.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是2’，6’-Dmp-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmp1-DALDA)。
85.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述分子是小分子。
86.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述小分子是生物分子。
87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的載體復(fù)合物，其中所述生物分子是聚氨基酸。
88.根據(jù)權(quán)利要求85所述的載體復(fù)合物，其中所述小分子是具有藥物活性的分子。
89.根據(jù)權(quán)利要求88所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是抗生素。
90.根據(jù)權(quán)利要求88所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是細(xì)胞毒性劑。
91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的載體復(fù)合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是鏈霉素。
92.根據(jù)權(quán)利要求90所述的載體復(fù)合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是阿霉素。
93.根據(jù)權(quán)利要求88所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是抗氧化劑。
94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的載體復(fù)合物，其中所述抗氧化劑是維生素E。
95.根據(jù)權(quán)利要求93所述的載體復(fù)合物，其中所述抗氧化劑是維生素C。
96.根據(jù)權(quán)利要求93所述的載體復(fù)合物，其中所述抗氧化劑是β-胡蘿卜素。
97.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述分子是生物分子。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的載體復(fù)合物，其中所述生物分子是具有藥物活性的分子。
99.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是內(nèi)源性的肽或蛋白質(zhì)。
100.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是酶。
101.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是抗體。
102.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是神經(jīng)生長因子。
103.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是細(xì)胞因子。
104.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是多聚核苷酸。
105.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是低聚核苷酸。
106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是RNA。
107.根據(jù)權(quán)利要求106所述的載體復(fù)合物，其中所述RNA是雙鏈RNA。
108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的載體復(fù)合物，其中所述雙鏈RNA是siRNA。
109.根據(jù)權(quán)利要求106所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是DNA。
110.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是單鏈RNA。
111.根據(jù)權(quán)利要求110所述的載體復(fù)合物，其中所述單鏈RNA是信使RNA(mRNA)。
112.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是核酶。
113.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是反義RNA。
114.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是核酶的外部指導(dǎo)序列。
115.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是RNA誘餌。
116.根據(jù)權(quán)利要求97所述的載體復(fù)合物，其中所述生物分子是聚氨基酸。
117.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述芳香族陽離子肽包括連接劑。
118.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述分子包括連接劑。
119.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述分子和芳香族陽離子肽是化學(xué)性結(jié)合。
120.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述分子和芳香族陽離子肽是物理性結(jié)合。
121.一種將分子遞送到細(xì)胞的方法，所述方法包括將分子和芳香族陽離子肽與所述細(xì)胞接觸，其中所述芳香族陽離子肽包括(a)至少一個凈正電荷；(b)最少三個氨基酸；(c)最多十個氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為，其中3pm是小于或者等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為，其中3a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時，pt也可以為1。
122.根據(jù)權(quán)利要求121所述的方法，其中所述分子和芳香族陽離子肽是化學(xué)性結(jié)合。
123.根據(jù)權(quán)利要求121所述的方法，其中所述分子和芳香族陽離子肽是物理性結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于遞送分子到細(xì)胞的載體復(fù)合物和方法。根據(jù)本發(fā)明該載體復(fù)合物包括分子和芳香族陽離子肽。在一個具體實施方式
中，用于遞送分子到細(xì)胞的方法包括使載體復(fù)合物與細(xì)胞接觸。在另一個具體實施方式
中，該用于遞送分子到細(xì)胞的方法包括將分子和芳香族陽離子肽與細(xì)胞接觸。
文檔編號C12N15/85GK1780851SQ200480011701
公開日2006年5月31日 申請日期2004年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月1日
發(fā)明者黑茲爾·塞托, 趙克勝, 亞歷克斯·V·比爾克, 休·D·羅伯遜 申請人:科內(nèi)爾研究基金會