專利名稱：擔(dān)子菌、擔(dān)子菌提取組合物、保健食品和免疫強(qiáng)化劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及擔(dān)子菌，其是一種新的蘑菇(蘑菇和其它真菌在本文中統(tǒng)稱為蘑菇)并具有諸如免疫調(diào)節(jié)作用的特性，以及提供了擔(dān)子菌提取組合物、以及使用了擔(dān)子菌提取組合物的保健食品和免疫強(qiáng)化劑。
背景技術(shù)：
蘑菇自古以來即被用作具有獨(dú)特風(fēng)味和氣味的食物原料。它們也用作具有生理功能激活作用的中草藥，如增強(qiáng)免疫力、抗微生物活性、控制生物節(jié)律、并預(yù)防衰老、或用作某些類型疾病的民間藥物。進(jìn)行的研究涉及蘑菇的藥理學(xué)成分，從而發(fā)現(xiàn)了顯示出抗菌和抗病毒活性、強(qiáng)心活性、降低血糖活性、降低膽固醇活性、抗血栓活性、和抗高血壓活性的成分。
已提出了組合物可用作藥物、保健食品等，而且組合物包括了脫水產(chǎn)品的混合物或兩種或更多蘑菇的提取物，所述蘑菇選自擔(dān)子菌類中的可食用蘑菇，尤其是Lentinus edodes(Berk.)Sing.，Pleurotus ostreatus(Jacq.ex Fr.)Quel.，Pholiota nameko(T.Ito)S.Ito et Imai，Grifola frondosa，F(xiàn)lammulina velutipes(Curt.ex Fr.)Sing.，和Hypsizigus marmoreus(參見日本專利申請(qǐng)公開No.1999-152230)。
近年來，傘菌屬(Blazei murill)(下文中稱作傘菌屬蘑菇)、裂蹄木層孔菌(Phellinus linteus)(Berk.et Curt)Tehg(下文中稱作mesimacobu)等由于具有抗癌活性而引起了人們的關(guān)注。
例如，已經(jīng)提出了高產(chǎn)量培養(yǎng)諸如mesimacobu的木層孔菌屬蘑菇的方法(參見日本專利申請(qǐng)公開No.1999-262329)、培養(yǎng)mesimacobu菌絲體來獲得大量mesimacobu菌絲體的方法(參見日本專利申請(qǐng)公開No.2001-178448)、以及用超聲波高效提取傘菌屬蘑菇所含成分的方法(參見日本專利申請(qǐng)公開No.2001-278805)。
如上所述，由于具有抗癌活性等而使各種蘑菇引起了關(guān)注。然而，它們并未確證有效，而且期望具有更好效果的蘑菇出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述情況完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供擔(dān)子菌，其是一種具有極好免疫強(qiáng)化作用等的新蘑菇，以及本發(fā)明提供了擔(dān)子菌提取組合物、和使用了擔(dān)子菌提取組合物的保健食品和免疫強(qiáng)化劑。
為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的第一個(gè)方面在于擔(dān)子菌，其特征在于其沒有擔(dān)子形成潛力。
本發(fā)明的第二個(gè)方面在于第一個(gè)方面的擔(dān)子菌，其特征在于擔(dān)子菌是擔(dān)子菌-X FERM BP-10011。
本發(fā)明的第三個(gè)方面在于擔(dān)子菌提取組合物，其特征在于用包含選自水和親水溶劑中至少一種溶劑的提取溶劑從擔(dān)子菌中提取，所述擔(dān)子菌沒有擔(dān)子形成潛力。
本發(fā)明的第四個(gè)方面在于第三個(gè)方面的擔(dān)子菌提取組合物，其特征在于擔(dān)子菌是擔(dān)子菌-X FERM BP-10011。
本發(fā)明的第五個(gè)方面在于第三個(gè)或第四個(gè)方面的擔(dān)子菌提取組合物，其特征在于通過加熱和提取來獲得擔(dān)子菌提取組合物。
本發(fā)明的第六個(gè)方面在于第三至第五個(gè)方面的任一個(gè)方面的擔(dān)子菌提取組合物，其特征在于通過加壓和提取來獲得擔(dān)子菌提取組合物。
本發(fā)明的第七個(gè)方面在于保健食品，其特征在于其包含作為活性成分的提取自沒有擔(dān)子形成潛力的擔(dān)子菌的擔(dān)子菌提取組合物。
本發(fā)明的第八個(gè)方面在于第七個(gè)方面的保健食品，其特征在于擔(dān)子菌是擔(dān)子菌-X FERM BP-10011。
本發(fā)明的第九介方面在于第七個(gè)方面或第八個(gè)方面的保健食品，其特征在于保健食品是選自飲料形式、點(diǎn)心形式、濃縮提取物形式、粉末、顆粒、片劑、和膠囊的形式。
本發(fā)明的第十個(gè)方面在于免疫強(qiáng)化劑，其特征在于其包含作為活性成分的提取自沒有擔(dān)子形成潛力的擔(dān)子菌的擔(dān)子菌提取組合物。
本發(fā)明的第十一個(gè)方面在于第十個(gè)方面的免疫強(qiáng)化劑，其特征在于擔(dān)子菌是擔(dān)子菌-X FERM BP-10011。
本發(fā)明的第十二個(gè)方面在于包含菌絲體的可食用的擔(dān)子菌，所述的菌絲體是通過培養(yǎng)第一或第二方面的擔(dān)子菌形成的。
上述本發(fā)明的擔(dān)子菌-X包含大量多糖(β-D-葡聚糖)，并有高抗氧化活性、OH基團(tuán)消除活性，和免疫調(diào)節(jié)作用。該生物體優(yōu)選在用于保健食品和免疫強(qiáng)化劑時(shí)，能預(yù)期顯示出藥理學(xué)功效，如預(yù)防衰老。


圖1顯示了在測(cè)試實(shí)施例1中測(cè)量的結(jié)果圖。
圖2顯示了在測(cè)試實(shí)施例2中測(cè)量的結(jié)果圖。
圖3顯示了在測(cè)試實(shí)施例3中測(cè)量的結(jié)果圖。
圖4顯示了在測(cè)試實(shí)施例4中的給藥方式示意圖。
圖5顯示了在測(cè)試實(shí)施例4中測(cè)量的結(jié)果圖。。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式盡管觀察到了鳥嘴狀過程(鉗形)，但是本發(fā)明所稱的擔(dān)子菌為一種擔(dān)子菌，其具有這樣的性質(zhì)，即其沒有擔(dān)子形成潛力。在這些方面，該擔(dān)子菌不同于其它擔(dān)子菌。即，甚至在培養(yǎng)時(shí)，擔(dān)子菌也不形成擔(dān)子，僅形成菌核(菌絲體)。
該擔(dān)子菌是從自然界微生物篩選而獲得的。其分離并作為擔(dān)子菌-X(登記號(hào)FERM BP-10011)而保藏于國(guó)際專利生物體保藏機(jī)構(gòu)，國(guó)家先進(jìn)工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所。
本發(fā)明所述的生物體不形成分生孢子，即沒有無性傳代。
即，當(dāng)該生物體培養(yǎng)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上時(shí)，培養(yǎng)的菌絲呈鉗形、光滑，但不形成分生孢子，不形成子實(shí)體。當(dāng)觀察菌落表面的形狀和顏色時(shí)，菌落中形成了淺粉色菌絲體。如果從接種位置環(huán)形生長(zhǎng)的菌落中形成了許多菌絲體，菌絲體會(huì)通過菌絲束相互連接。菌落背部顏色為淺粉色。
當(dāng)該生物體培養(yǎng)在葡萄糖-干酵母瓊脂培養(yǎng)基上時(shí)，培養(yǎng)的菌絲呈鉗形、光滑，但不形成分生孢子，不形成子實(shí)體。當(dāng)觀察菌落表面的形狀和顏色時(shí)，菌落中形成了淺粉色到白色的菌絲體。以接種位置為中心形成了厚度5至6mm的菌絲體。菌落背部顏色為淺粉色到白色。
例如，本發(fā)明生物體的最佳生長(zhǎng)條件為pH 5.0至6.0，溫度22至26℃。例如，生長(zhǎng)范圍為pH 4.0至7.5，溫度5至30℃。
本發(fā)明所述的生物體擔(dān)子菌可由普通方法培養(yǎng)，而其培養(yǎng)方法并不局限于此。
本發(fā)明的擔(dān)子菌提取組合物可以是提取自培養(yǎng)擔(dān)子菌而獲得的菌絲體的任何細(xì)胞內(nèi)容物，而提取方法并不局限于此。要從菌絲體高效提取細(xì)胞內(nèi)容物，優(yōu)選破壞細(xì)胞壁，如通過冷凍菌絲體，如果需要，融化冷凍體，然后通過攪拌器等工具壓碎它們，隨后提取。提取方法并不局限于此，但提取優(yōu)選于室溫，或在加熱條件下、或加壓，用水、低級(jí)醇等，或者進(jìn)一步包括酸、堿或其它添加劑的提取溶劑來進(jìn)行。一般而言，壓碎的產(chǎn)物在熱水中慢慢煮沸提取，或者壓碎的產(chǎn)物與水或醇、或包含堿的水混合加壓提取，如以100MPa至700MPa的等級(jí)加壓，優(yōu)選300MPa至600MPa。
將會(huì)描述在熱水中提取的實(shí)例。例如，冷凍的擔(dān)子菌-X菌絲體在室溫解凍，用攪拌器壓碎。例如，壓碎的擔(dān)子菌-X菌絲體與用作提取溶劑的水的比例設(shè)為1∶5。例如，將50g壓碎的擔(dān)子菌-X菌絲體置于玻璃瓶中，加入250ml水，用蓋子蓋上玻璃瓶。盤底鋪毛巾，將水澆在毛巾上，將充滿壓碎菌絲體的玻璃瓶置于毛巾上，接著加熱沸騰。沸騰后，持續(xù)加熱90分鐘。冷卻后，固液分離從而獲得擔(dān)子菌-X提取物。例如，提取物的pH為6.3至6.5。
必要時(shí)濃縮所得提取物，從而獲得擔(dān)子菌提取組合物。濃縮提取物并不受限制但可以如以下方式進(jìn)行將所得擔(dān)子菌-X提取物移入燒杯，加熱并蒸發(fā)濃縮。此時(shí)，提取物顯示出淺米色至褐色，并開始劇烈冒泡。然而，繼續(xù)進(jìn)一步蒸發(fā)濃縮，在如濃縮提取物變成pH 4.9、密度1.25g/cm3的焦油狀時(shí)完成濃縮。濃縮提取物發(fā)出醬油般的氣味。其時(shí)在該點(diǎn)，來自擔(dān)子菌-X菌絲體的濃縮提取物的產(chǎn)率平均為12％。
冷卻時(shí)，由此獲得的濃縮提取物變得非常粘。因此，濃縮提取物需要在濃縮完成的同時(shí)轉(zhuǎn)移進(jìn)入儲(chǔ)存容器。實(shí)際上優(yōu)選冷卻轉(zhuǎn)移進(jìn)入儲(chǔ)存容器的濃縮提取物，然后儲(chǔ)存在冷凍或冰凍狀態(tài)。
本發(fā)明的擔(dān)子菌提取組合物可用于保健食品或藥物，如免疫強(qiáng)化劑，以飲料、點(diǎn)心、濃縮提取物、粉末、顆粒、片劑、或膠囊的形式。加入擔(dān)子菌提取組合物的量可以按需根據(jù)應(yīng)用來設(shè)定，其并不受限制。
另外，培養(yǎng)本發(fā)明所述生物體擔(dān)子菌獲得的菌絲體可用于食用目的，其有極好的味道和感官感覺。
本發(fā)明的擔(dān)子菌在培養(yǎng)時(shí)根據(jù)其培養(yǎng)所在環(huán)境來形成菌絲體。即，當(dāng)擔(dān)子菌培養(yǎng)于預(yù)定形狀的容器中時(shí)，能得到容器形狀的菌絲體。因此，能獲得易用于食用目的的可食用的擔(dān)子菌。所得可食用擔(dān)子菌可用作生的食品原料，或可以冷凍或干燥狀態(tài)用作食品原料，但優(yōu)選用作生原料或冷凍原料。
關(guān)于培養(yǎng)方法，如前述通過普通方法能培養(yǎng)擔(dān)子菌，而培養(yǎng)方法不局限于此。例如，瓊脂培養(yǎng)基、鋸屑培養(yǎng)基、或液體培養(yǎng)基，其添加了合適的營(yíng)養(yǎng)源并滅菌，用本發(fā)明的生物體所培養(yǎng)的菌株或生物體種子液無菌接種，并在合適的溫度條件下培養(yǎng)接種物，由此可獲得擔(dān)子菌-X的菌絲體。
烹調(diào)用作食品原料的可食用擔(dān)子菌的方法并不局限于此。然而，可以與普通蘑菇相同的各種方式烹調(diào)可食用擔(dān)子菌，如燉、煎、烤、炸，而不受任何限制。由于可食用擔(dān)子菌帶來極好的感官感受而且沒有特有的味道，它可廣泛用在各種制成的食品中。
毫無疑問，可以設(shè)想食用可食用擔(dān)子菌能達(dá)到食用擔(dān)子菌提取組合物一樣的效果。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在將參考以下提供的實(shí)施例來更具體的描述本發(fā)明。實(shí)施例1至4為擔(dān)子菌-X的培養(yǎng)實(shí)例，而實(shí)施例5至9為提取實(shí)例。
實(shí)施例1.菌絲體分離(1)制備培養(yǎng)基根據(jù)表1所示的配方制備PSA和PDA培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基分裝于試管或錐形燒瓶中。然后使用硅蓋(或棉花塞)，塞住的容器在高壓鍋中于121℃進(jìn)行高壓蒸汽滅菌20分鐘。然后，滅菌后趁熱傾斜試管以形成斜面培養(yǎng)基。另一方面，讓錐形燒瓶直立形成平面培養(yǎng)基。
表1

(2)菌絲體分離較大的擔(dān)子菌-X菌絲體手工破碎，用經(jīng)過火焰滅菌并冷卻的解剖刀將擔(dān)子菌-X部分切片。用經(jīng)過火焰滅菌并冷卻的鑷子將擔(dān)子菌-X薄片各自接種到(1)的PSA和PDA斜面培養(yǎng)基上。該步驟在無菌箱或超凈臺(tái)中在無菌條件下進(jìn)行。
(3)培養(yǎng)在溫箱中24℃培養(yǎng)接種物，在24至48小時(shí)中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了生物體。生物體產(chǎn)生之后，繼續(xù)于24℃培養(yǎng)。菌絲在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14天。
實(shí)施例2.在鋸屑培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生菌絲體(1)培養(yǎng)生物體種子液向1升鋸屑、15g脫脂糠、15g麥麩和5g SANPEARL(菌絲活化劑，Nippon紙業(yè))中加水，劇烈攪動(dòng)混合物。調(diào)節(jié)該培養(yǎng)混合物使之在緊抓時(shí)有水滲出(混合物中的含水量約70％)，由此制備鋸屑培養(yǎng)基。將該培養(yǎng)基裝入錐形燒瓶中，用硅蓋蓋上。然后，將錐形燒瓶在高壓鍋中于121℃進(jìn)行高壓蒸汽滅菌40分鐘。滅菌后24小時(shí)，在無菌箱中通過無菌操作，將實(shí)施例1中斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)的擔(dān)子菌-X菌絲接種到鋸屑培養(yǎng)基中。用滅菌的三角刀切下斜面培養(yǎng)基的一部分來進(jìn)行接種使得不對(duì)菌絲造成損傷。接種密度為鋸屑培養(yǎng)基表面積的20至30％。接種物于24℃培養(yǎng)，3天內(nèi)(最遲5天內(nèi))產(chǎn)生生物體。過了30天后，錐形燒瓶中的鋸屑培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿了生物體。
(3)產(chǎn)生菌絲體用與(1)中相同的方式制備鋸屑培養(yǎng)基。將該培養(yǎng)基置于聚丙烯瓶中，塞住，在高壓鍋中于121℃進(jìn)行高壓蒸汽滅菌40分鐘。滅菌后24小時(shí)，無菌處理后在無菌箱中通過無菌操作，將(1)中培養(yǎng)的生物體種子液接種于聚丙烯瓶中的鋸屑培養(yǎng)基中。接種密度是使鋸屑培養(yǎng)基表面幾乎被接種物覆蓋。接種物于24℃培養(yǎng)，48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生生物體。過了60天后，聚丙烯瓶中的鋸屑培養(yǎng)基全部長(zhǎng)滿了菌絲。又過了40至50天后，菌絲擴(kuò)散到了聚丙烯瓶的內(nèi)壁上，形成菌絲束。進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，形成了菌絲體。
實(shí)施例3.在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生菌絲體將馬鈴薯(200g)切成1平方厘米大小，用純水煮沸，接著加熱20分鐘。冷卻后，固液分離，將蒸餾水加入到所得的馬鈴薯瀝出物和20g蔗糖中以達(dá)到1升的總量，由此制備液本培養(yǎng)基。該液體培養(yǎng)基以各5ml的量分裝于試管中。用硅蓋蓋位試管，滅菌(于121℃用高壓蒸汽滅菌20分鐘或于100℃用氣壓蒸汽滅菌8小時(shí))。然后，無菌處理后在無菌箱中通過無菌操作接種液體培養(yǎng)基，使得實(shí)施例1中斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)的擔(dān)子菌-X的較低端薄片接觸液體培養(yǎng)基。接種物于24℃培養(yǎng)時(shí)，48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生生物體。經(jīng)過進(jìn)一步培養(yǎng)，與液體培養(yǎng)基接觸形成了菌絲體。
實(shí)施例4.在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生菌絲體將馬鈴薯(200g)切成1平方厘米大小，用純水煮沸，接著加熱20分鐘。冷卻后，固液分離，將蒸餾水加入到所得的馬鈴薯瀝出物、20g蔗糖和1g(0.1％)瓊脂中以達(dá)到1升的總量，由此制備瓊脂培養(yǎng)基。通常，要制備瓊脂培養(yǎng)基，加入1.5至2.0％瓊脂(根據(jù)1升最終的培養(yǎng)基要15至20g)，而加入0.1％瓊脂使培養(yǎng)后菌絲體和瓊脂培養(yǎng)基容易分離，并保持液體培養(yǎng)基的物理強(qiáng)度，這是因?yàn)閾?dān)子菌-X薄片傾向于從液體培養(yǎng)基中沉淀出來。該0.1％瓊脂培養(yǎng)基以各5ml的量分裝于試管中。用硅蓋蓋住試管，然后于121℃用高壓蒸汽滅菌20分鐘。然后，將實(shí)施例1中斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)的擔(dān)子菌-X切片，無菌處理后在無菌箱中通過無菌操作接種到0.1％瓊脂培養(yǎng)基中。接種物于24℃培養(yǎng)時(shí)，48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生生物體。經(jīng)過進(jìn)一步培養(yǎng)，形成了菌絲體。
實(shí)施例5.通過煎煮制備濃縮的擔(dān)子菌-X提取組合物要使菌絲細(xì)胞壁破碎并使細(xì)胞內(nèi)容物容易濾出，冷凍或冰凍新鮮擔(dān)子菌-X的菌絲體。室溫融化冰凍的擔(dān)子菌-X菌絲體，并用攪拌器壓碎。將壓碎的擔(dān)子菌-X菌絲體(50g)置于玻璃瓶中，加入250ml水，用蓋子蓋上玻璃瓶。盤底鋪毛巾，將水澆在毛巾上，將充滿壓碎菌絲體的玻璃瓶置于毛巾上，接著加熱沸騰。沸騰后，持續(xù)加熱90分鐘。冷卻后，固液分離從而獲得擔(dān)子菌-X提取組合物。提取物的pH為6.3至6.5。
將所得擔(dān)子菌-X提取組合物移入燒杯，通過加熱蒸發(fā)濃縮。提取組合物顯示出淺米色至褐色，并開始劇烈冒泡。然而，繼續(xù)進(jìn)一步蒸發(fā)濃縮，在濃縮提取組合物變成pH 4.9、密度1.25g/cm3的焦油狀時(shí)完成濃縮。濃縮擔(dān)子菌-X提取物發(fā)出醬油般的氣味。其時(shí)在該點(diǎn)，來自擔(dān)子菌-X菌絲體的濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物的產(chǎn)率平均為12％。擔(dān)子菌-X提取組合物在其冷卻時(shí)變得很粘。因此，在濃縮完成的同時(shí)，將濃縮物轉(zhuǎn)移進(jìn)入儲(chǔ)存容器，冷卻后，儲(chǔ)存在冷凍或冰凍狀態(tài)。
實(shí)施例6.通過煎煮制備擔(dān)子菌-X提取組合物要使菌絲細(xì)胞壁破碎并使細(xì)胞內(nèi)容物容易濾出，冷凍或冰凍新鮮擔(dān)子菌-X的菌絲體。然后在室溫融化冰凍的擔(dān)子菌-X菌絲體。
融化后將擔(dān)子菌-X菌絲體(20g濕重)稱重，切成0.5平方厘米大小，置于燒杯中。加入100ml水后，燒杯中的內(nèi)容物在90℃緩慢蒸煮，煮沸溶液直至剩下原始總量的一半。然后，加水恢復(fù)原始總量。紗布過濾混合物以除去固體。然后，封存濾出液并儲(chǔ)存在冰箱中以用作實(shí)施例6的擔(dān)子菌-X提取組合物。
實(shí)施例7.通過高壓處理制備擔(dān)子菌-X提取組合物將用與實(shí)施例6中相同方式處理的擔(dān)子菌-X菌絲體(20g濕重)裝入乙烯袋，并加入100ml水。然后，將乙烯袋減壓抽氣并密封。將乙烯袋置于超高壓設(shè)備(產(chǎn)自Kobe鋼鐵；能在700MPa下進(jìn)行處理)中，用400MPa液體靜壓處理10分鐘。紗布過濾處理的混合物，濾出液儲(chǔ)存在冷凍狀態(tài)下以用作實(shí)施例7的擔(dān)子菌-X提取組合物。
實(shí)施例8.通過高壓處理制備擔(dān)子菌-X提取組合物用與實(shí)施例7中相同方式制備組合物，不同之處在于在600Ma液體靜壓下處理，該組合物用作實(shí)施例8的擔(dān)子菌-X提取組合物。
實(shí)施例9.通過高壓處理制備擔(dān)子菌-X提取組合物用與實(shí)施例8中相同方式制備組合物，不同之處在于用100ml 0.1％KCl水溶液代替100ml水，該組合物用作實(shí)施例9的擔(dān)子菌-X提取組合物。
測(cè)試實(shí)施例1.測(cè)量活性氧(羥基基團(tuán))消除活性利用H2O2/UV作為羥基基團(tuán)產(chǎn)生源并將二甲基吡咯啉-N-氧化物(DMPO)作為旋轉(zhuǎn)陷波器，通過ESR(電子旋轉(zhuǎn)共振)測(cè)量消除羥基基團(tuán)的活性。
將DMPO(400mM)和20mM過氧化氫加入到恒定量的實(shí)施例6至9中每一種擔(dān)子菌-X提取組合物中，加入純水以達(dá)到300μl總量。混合物用245nm波長(zhǎng)的UV(帶寬20nm)照射，觀察所得DMPO羥基基團(tuán)加成產(chǎn)物的ESR信號(hào)。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度的改變，確定了提取組合物的羥基基團(tuán)消除活性。結(jié)果如圖1所示。
如圖1所示，擔(dān)子菌-X提取組合物的量越大，羥基基團(tuán)消除率變得越高。實(shí)施例7獲得了最高的羥基基團(tuán)消除率，該實(shí)施例涉及通過在水溶劑中以400MPa高壓處理而提取。
測(cè)試實(shí)施例2.測(cè)量活性氧(超氧化物陰離子基團(tuán))消除活性利用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)作為超氧化物陰離子基團(tuán)產(chǎn)生源并將DMPO作為旋轉(zhuǎn)陷波器，根據(jù)旋轉(zhuǎn)陷波法通過ESR(電子旋轉(zhuǎn)共振)測(cè)量消除超氧化物陰離子基團(tuán)的活性。
將DMPO(0.3mM)、0.5mM次黃嘌呤和1mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)加入到恒定量的實(shí)施例6至9中每一種擔(dān)子菌-X提取組合物中，加入0.2M PBS以達(dá)到300μl總量。以0.1單位/ml的濃度加入黃嘌呤氧化酶，觀察所得DMPO-OOH(DMPO的超氧化物陰離子基團(tuán)加成產(chǎn)物)的ESR信號(hào)。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度的改變，確定了提取組合物的消除活性。結(jié)果如圖2所示。
如圖2所示，提取組合物的量越大，超氧化物陰離子基團(tuán)消除率變得越高。實(shí)施例7獲得了最高的超氧化物陰離子基團(tuán)消除率，該實(shí)施例涉及通過在水溶液中以400MPa高壓處理而提取。這些結(jié)果與測(cè)試實(shí)施例1的結(jié)果相似。
測(cè)試實(shí)施例3.測(cè)量活性氧(羥基基團(tuán))消除活性利用Fenton反應(yīng)作為羥基基團(tuán)產(chǎn)生源并將DMPO作為旋轉(zhuǎn)陷波器，通過ESR旋轉(zhuǎn)陷波法測(cè)量消除羥基基團(tuán)的活性。
將二甲基吡咯啉N-氧化物(DMPO)(20mM)、10mM過氧化氫和0.1mM FeSO4加入到恒定量(10或20μl)的以在實(shí)施例6相同條件下煎煮提取干燥的傘菌(塊菌產(chǎn)物，日本)而得的提取物、以在實(shí)施例6相同條件下煎煮提取干燥的reishi蘑菇(Ganoderma lucidum(leyss.ex Fr)Karst.；塊菌產(chǎn)物，日本)而得的提取物、和實(shí)施例6至9中每一種擔(dān)子菌-X提取組合物中的每一種中。進(jìn)一步加入純水以達(dá)到300μl總量，所得的混合物用作測(cè)定樣品。根據(jù)添加FeSO4后一分鐘DMPO-OH(DMPO的羥基基團(tuán)加成產(chǎn)物)信號(hào)強(qiáng)度的改變，確定了消除活性。結(jié)果如圖3所示。
如圖3所示，涉及通過煎煮提取的實(shí)施例6沒有成功評(píng)估出具體的消除活性，因?yàn)閷?shí)施例6的提取物在低濃度時(shí)與鐵離子相互作用，reishi蘑菇提取物也一樣，這造成增加而不是消除DMPO-OH信號(hào)。當(dāng)實(shí)施例6的提取物在以對(duì)信號(hào)產(chǎn)生最低影響的高濃度使用，并與其它提取物比較時(shí)，實(shí)施例6的提取物顯示出與傘菌提取物相當(dāng)?shù)南钚?。涉及高壓處理而提取的?shí)施例7至9比傘菌和reishi蘑菇得到更高的消除活性。
測(cè)試實(shí)施例4.測(cè)量免疫調(diào)節(jié)作用使用的小鼠是CLEA日本C3H/HeJ小鼠。C3H/HeJ小鼠在衰老時(shí)會(huì)顯出退化的免疫力。在本研究中，“退休鼠”(20至30周齡)被用作老年鼠。實(shí)施例5的濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物被用作擔(dān)子菌-X。對(duì)于該測(cè)定，來自St.Marianna大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所第3學(xué)部應(yīng)用藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室的副教授Akira Yanagawa參與合作并進(jìn)行了無償?shù)墓ぷ鳌?br> 將退休鼠分成10只鼠的組，并分成每日一次以0.2ml劑量給予擔(dān)子菌-X提取組合物的擔(dān)子菌-X治療組，和每日一次接受0.2ml生理鹽水的對(duì)照組。用胃管連續(xù)14天口服給予擔(dān)子菌-X或生理鹽水。
治療開始后十天，0.1ml 10％用磷酸緩沖生理鹽水(PBS)稀釋的羊紅血細(xì)胞(SRBC)(即，細(xì)胞計(jì)數(shù)2×108)腹膜內(nèi)給予小鼠。過了4.5天后，去除鼠脾細(xì)胞，并用Jerne法計(jì)數(shù)空斑形成細(xì)胞(PFC)。PFC計(jì)數(shù)與對(duì)照組的作比較。對(duì)照組的PFC計(jì)數(shù)測(cè)量結(jié)果如表2所示，擔(dān)子菌-X治療組的PFC計(jì)數(shù)測(cè)量結(jié)果如表3所示。擔(dān)子菌-X或生理鹽水和SRBC的給藥方式示意圖如圖4所示。測(cè)定結(jié)果如圖5所示。
表2

*PFC/皮氏培養(yǎng)皿/(接種于皮氏培養(yǎng)皿的細(xì)胞懸液×細(xì)胞懸液中的細(xì)胞計(jì)數(shù))＝PFC個(gè)數(shù)表3

如表2和3所示，擔(dān)子菌-X治療組顯示PFC值為1345.9而且SD值為1495.324，其約為對(duì)照組的20倍，對(duì)照組顯示PFC平均值為75.399而且SD值為62.98075。根據(jù)斯氏T檢驗(yàn)中等量分布的兩側(cè)檢驗(yàn)顯示擔(dān)子菌-X顯著增加了PFC計(jì)數(shù)，其P＝0.023363(p＜0.05)。
本研究的實(shí)驗(yàn)證實(shí)濃縮的擔(dān)子菌-X提取組合物相對(duì)于用生理鹽水的對(duì)照組，顯著增加了PFC計(jì)數(shù)。使用C3H/HeJ小鼠的PFC實(shí)驗(yàn)方法為通常使用的方法，其用作標(biāo)準(zhǔn)的篩選方法以測(cè)試免疫調(diào)節(jié)潛力。在年老鼠中PFC計(jì)數(shù)的增加顯示濃縮的擔(dān)子菌-X提取組合物增強(qiáng)了缺乏免疫時(shí)的免疫活性。
測(cè)試實(shí)施例5.癌癥患者中免疫活性參數(shù)的進(jìn)程在用實(shí)施例5的濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物治療期間監(jiān)視癌癥患者(病例1至病例6)中免疫活性參數(shù)的進(jìn)程，從而調(diào)查濃縮的擔(dān)子菌-X提取組合物的免疫強(qiáng)化效果。對(duì)于本研究，來自St.Marianna大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所第3學(xué)部應(yīng)用藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室的副數(shù)授Akira Yanagawa參與合作并進(jìn)行了無償?shù)墓ぷ鳌?br> 具體來說，將1ml純水加入1ml濃縮的擔(dān)子菌-X提取組合物中，并且每日在每餐后口服給藥該混合物3次。該治療持續(xù)3周。
對(duì)于免疫活性參數(shù)，在治療前后以雙盲為基礎(chǔ)，讓BML(BML公司)測(cè)量以下項(xiàng)目。結(jié)果如表4至15所示。患癌癥的6個(gè)病人都出現(xiàn)不同的癌癥下疳。由于計(jì)算這六個(gè)患者的平均值沒有意義，因此枚舉這些患者個(gè)體的值。
對(duì)于NK細(xì)胞兩種顏色(表示NK細(xì)胞的活性估計(jì)值)CD57+CD16+(％)NK活性 中等CD57+CD16-(％)NK活性 微弱CD57-CD16+(％)NK活性 強(qiáng)CD57-CD16-(％)對(duì)于全活化的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)CD3+HLA-DR+(％)活化的CD3細(xì)胞除此之外，白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞(％)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)也進(jìn)行了測(cè)量。另外，要求合作的患者在治療期間每天記錄癥狀的變化。
病例1.2000年7月，對(duì)乙狀結(jié)腸癌患者進(jìn)行全乙狀結(jié)腸切除術(shù)。2002年，在對(duì)腔壁瘢痕疝手術(shù)期間確認(rèn)有復(fù)發(fā)的癌。然后，經(jīng)常發(fā)生腸梗阻。
表4NK細(xì)胞系統(tǒng)兩種顏色(NK細(xì)胞的活性估計(jì)值)

表5對(duì)于全活化的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)

在病例1中，相對(duì)于治療前水平，具有中等和微弱NK細(xì)胞活性的淋巴細(xì)胞顯著增加。具有強(qiáng)NK活性的CD57-CD16+細(xì)胞顯示治療后的值為4.1％，明顯顯示出百分比降低。然而，實(shí)際淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)從104增加到128。關(guān)于作為測(cè)定完整NK細(xì)胞譜對(duì)象的CD3+HLA-DR+細(xì)胞，治療后的值為10.6％(331)，顯示出相對(duì)于9.9％(223)的治療前值的增加。
病例2.在1999年10月進(jìn)行了左乳腺癌全切除術(shù)。然后，癌復(fù)發(fā)了并在當(dāng)時(shí)轉(zhuǎn)移到肺、骨、腦和腦膜。即使在對(duì)腦膜擴(kuò)散進(jìn)行放射性治療后，頭蓋神經(jīng)麻痹使患者臥床不起。脊髓轉(zhuǎn)移也造成進(jìn)行性右上肢麻痹。對(duì)于終末期癌來說身體組織狀況是非常差的。
表6NK細(xì)胞系統(tǒng)兩種顏色(作為NK細(xì)胞的活性估計(jì)值)

表7對(duì)于全活化的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)

在病例2中，沒有觀察到濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物對(duì)NK細(xì)胞的影響。
病例3.在2001年8月，粘質(zhì)囊腺癌和兩側(cè)轉(zhuǎn)移的卵巢腫瘤需要進(jìn)行切除。然后，癌的腹膜擴(kuò)散和癌性炎癥造成了大量腹積水。當(dāng)前，由于癌癥晚期，患者臥床不起。
表8NK細(xì)胞系統(tǒng)兩種顏色(作為NK細(xì)胞的活性估計(jì)值)

表9對(duì)于全活化的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)

在病例3中，觀察到了具有中等NK活性的CD57+CD16+淋巴細(xì)胞的輕微上升。
病例4.在2001年，對(duì)肺癌(鱗狀細(xì)胞癌，T2N3M0)進(jìn)行了化療和放療。然后，進(jìn)行了左肺完全切除手術(shù)。2002年，轉(zhuǎn)移的腦腫瘤(肺癌的腦轉(zhuǎn)移)迫使進(jìn)行了轉(zhuǎn)移腦腫瘤切除術(shù)。然而，同年發(fā)生了多發(fā)性腦轉(zhuǎn)移并發(fā)癥。
表10NK細(xì)胞系統(tǒng)兩種顏色(作為NK細(xì)胞的活性估計(jì)值)

表11對(duì)于全活化的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)

在該患者中，沒有觀察到濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物對(duì)NK細(xì)胞的增加作用。
病例5.在2001年10月，發(fā)現(xiàn)肺癌(腺癌)。診斷時(shí)，觀察到轉(zhuǎn)移到了右頸淋巴結(jié)，上腔靜脈綜合征更使向門淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移復(fù)雜化。治療包括右頸區(qū)域60Gy的放射和化療(CBDCA+TAy 4個(gè)療程)。上腔靜脈仍完全阻塞，而且并發(fā)了癌性肋膜炎。盡管頻繁向肺腔給藥，但是減少的損傷只是輕微的。另外，最近通過CT確證了向腦部的轉(zhuǎn)移。
表12NK細(xì)胞系統(tǒng)兩種顏色(作為NK細(xì)胞的活性估計(jì)值)

表13對(duì)于全活化的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)

在該病例中，所有NK細(xì)胞參數(shù)都增加了，口服給藥濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物增加了NK細(xì)胞活性和NK細(xì)胞數(shù)量。該病例被認(rèn)為是有極好反應(yīng)的病例。
病例6.在2002年7月，發(fā)現(xiàn)了胃癌(胃腔中的Borrmann I型胃癌)。然而，患者不希望進(jìn)行手術(shù)，進(jìn)入了癌癥晚期狀態(tài)。
表14NK細(xì)胞系統(tǒng)兩種顏色(作為NK細(xì)胞的活性估計(jì)值)

表15對(duì)于全活化的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)

在該病例中，CD57-CD16+(％)(NK活性強(qiáng))和CD57+CD16+(％)(NK活性中等)增加。
甚至在晚期癌癥患者中，出現(xiàn)了兩種類型，仍舊能正常日常生活的患者和晚期階段臥床不起的患者。濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物在攝取時(shí)，即使在前面的患者，即患有晚期癌癥能進(jìn)行日常生活的患者中也能預(yù)計(jì)可獲得顯著增強(qiáng)免疫力(增加NK細(xì)胞)的效果。在另一方面，猜想在癌癥的病理發(fā)現(xiàn)和濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物之間有一些關(guān)聯(lián)。在腺癌患者中，如病例1的結(jié)腸癌(腺癌)、病例3的粘質(zhì)囊腺癌(一種類型的腺癌)、病例5的肺癌(腺癌)、和病例6的胃癌(腺癌)，在用濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物治療后觀察到了NK細(xì)胞參數(shù)的一些動(dòng)向。然而，病例4同樣是肺癌的案例，但病理診斷為帶有鱗狀細(xì)胞癌。在該患者中，濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物對(duì)于任何NK動(dòng)態(tài)參數(shù)沒有影響。
測(cè)試實(shí)施例6.癌癥患者中免疫活性參數(shù)的進(jìn)程(8個(gè)月治療)測(cè)試實(shí)施例5的病例3和病例1中，接著測(cè)試實(shí)施例5，1ml濃縮擔(dān)子菌-X提取組合物和1ml純水的混合物每日每餐后口服給藥3次。在超過6個(gè)月治療后的免疫學(xué)參數(shù)進(jìn)程如表16和17所示。
病例3表16

在本患者中，中等至強(qiáng)的NK活性顯示了晚期癌癥的發(fā)展。
淋巴細(xì)胞逐漸減少。在另一方面，活化的淋巴細(xì)胞在3周治療后沒有顯著的改變，但在8個(gè)月內(nèi)增加至31.6％。因此，觀察到了淋巴細(xì)胞(活化的)的增加與LAK(淋巴因子活化殺傷細(xì)胞)治療后的相似。
病例1表17

在本患者中，具有中等NK活性的CD57+CD16+在口服給藥3周后增加了。而且，具有微弱NK活性的CD57+CD16-在口服給藥8個(gè)月后增加了。另外，活化的CD3細(xì)胞在3周治療后增加到10.6％，在8個(gè)月治療后達(dá)到22.7％。
總之，相對(duì)于治療前，NK活性在治療后輕微增加。
值得注意的發(fā)現(xiàn)是CD3+HLA-DR+細(xì)胞，活化的T淋巴細(xì)胞標(biāo)記，在口服給藥后顯著增加了。該結(jié)果通常是在LAK治療后才能觀察到的，毫無疑問，它被認(rèn)為是擔(dān)子菌-X提取組合物超乎尋常的結(jié)果。
在接受擔(dān)子菌-X提取組合物長(zhǎng)期治療的患者中，活化的淋巴細(xì)胞顯著增加與LAK治療后所觀察到的相似，盡管這只是2個(gè)患者中的結(jié)果。基于該發(fā)現(xiàn)，對(duì)于更多數(shù)量的患者的進(jìn)一步研究似乎是必要的。然而擔(dān)子菌-X提取組合物被認(rèn)為有增加活化的T淋巴細(xì)胞和將免疫系統(tǒng)引導(dǎo)向排除晚期癌癥患者的癌的潛力。
實(shí)施例10按照以下菜譜使用可食用擔(dān)子菌來烹調(diào)食物。在所有的食品中，可食用擔(dān)子菌的感官感受是令人滿意的，其味道好并和食物搭配得好。
1.意大利面只要在橄欖油中微微煎炸剛剛煮過的意大利面和切片的可食用擔(dān)子菌。然后，優(yōu)選用諸如鹽或胡椒粉的調(diào)味品來調(diào)味該混合物。烹飪好可食用擔(dān)子菌，食物即成了。
2.比薩餅將生的可食用擔(dān)子菌薄片排在比薩餅生面團(tuán)上，灑上奶酪，爐中烘烤該組合物。一旦奶酪均勻融化后，食物即成了。
3.炸調(diào)了味的肉或魚雞肉或魚肉預(yù)先用醬油或調(diào)味日本甜米酒調(diào)味。預(yù)先調(diào)味的雞肉或魚肉上撒上Erythronium japonicum淀粉，并稍沾打碎的蛋液。然后將切片的生的可食用擔(dān)子菌均勻地壓在雞肉或魚肉上，然后在油中炸處理過的雞肉或魚肉。一旦可食用擔(dān)子菌變脆，食物即成了。
4.煎蛋卷打碎雞蛋，用諸如鹽或胡椒粉的調(diào)味品以期望的方式調(diào)味。加入精細(xì)切割的生的可食用擔(dān)子菌，接著進(jìn)一步攪拌。然后將含有其它物料的打碎的蛋液澆在足以使油輕微冒煙熱度的煎鍋中。攪動(dòng)打碎的蛋液使之不變成固體，關(guān)閉火焰。當(dāng)雞蛋表面用煎鍋余熱使之固化的時(shí)候，滾動(dòng)雞蛋材料。當(dāng)其表面呈黃褐色而且內(nèi)部五分熟時(shí)，食物即成了。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明可提供擔(dān)子菌，其是一種具有極好免疫強(qiáng)化作用的新蘑菇，以及提供擔(dān)子菌提取組合物和使用該擔(dān)子菌提取組合物的保健食品和免疫強(qiáng)化劑，及可食用擔(dān)子菌。
微生物的敘述保藏機(jī)構(gòu)名稱國(guó)際專利生物體保藏機(jī)構(gòu)，國(guó)家先進(jìn)工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所保藏機(jī)構(gòu)地址日本Ibaragi縣Tsukuba市Higashi 1-1-1 Chuo Dai-6(郵政編碼305-8566)在保藏機(jī)構(gòu)的保藏日期2003年2月27日保藏機(jī)構(gòu)在保藏時(shí)指定的登記號(hào)FERM BP-10011保藏人姓名Y.Tsuno，Mycology Techno Kabushiki Kaisha的代表人保藏人地址日本Niigata縣Niigata市Bandai 4-3-20(郵政編碼950-0088)保藏的微生物在2003年2月27日保存在本國(guó)國(guó)家先進(jìn)工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所的國(guó)際專利生物體保藏機(jī)構(gòu)(登記號(hào)FERM P-19241)，并在2004年4月15日轉(zhuǎn)移到國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)(登記號(hào)FERM BP-10011)。
有關(guān)微生物特征的其它信息微生物類型霉菌分類學(xué)位置擔(dān)子菌，菌核(菌絲體)未識(shí)別物種培養(yǎng)條件培養(yǎng)基名稱…馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成…200g馬鈴薯瀝出物，20g葡萄糖，每1000ml培養(yǎng)基20g瓊脂培養(yǎng)基pH值…5.6培養(yǎng)基滅菌條件…121℃，高壓鍋中20分鐘培養(yǎng)溫度…24℃培養(yǎng)時(shí)間…5天氧氣需求…好氧培養(yǎng)方法…好氧光線需求…不必需傳代培養(yǎng)條件…間隔3個(gè)月轉(zhuǎn)移，儲(chǔ)存于5℃溫度的黑暗陰冷處儲(chǔ)存條件凍干保存…否L-干燥保存…否冷凍(約-80℃)保存…否如果以上方法不可用則儲(chǔ)存…傳代培養(yǎng)保存(間隔3個(gè)月轉(zhuǎn)移，儲(chǔ)存于5℃溫度的黑暗陰冷處)孢子(分生孢子)形成無
權(quán)利要求
1.擔(dān)子菌，其特征在于其沒有擔(dān)子形成潛力。
2.權(quán)利要求1所述的擔(dān)子菌，其特征在于所述的擔(dān)子菌是擔(dān)子菌-X FERMBP-10011。
3.擔(dān)子菌提取組合物，其特征在于用包含選自水和親水溶劑中至少一種溶劑的提取溶劑從擔(dān)子菌中提取，所述擔(dān)子菌沒有擔(dān)子形成潛力。
4.權(quán)利要求3所述的擔(dān)子菌提取組合物，其特征在于所述的擔(dān)子菌是擔(dān)子菌-X FERM BP-10011。
5.權(quán)利要求3或4所述的擔(dān)子菌提取組合物，其特征在于通過加熱和提取來獲得擔(dān)子菌提取組合物。
6.權(quán)利要求3至5之任一項(xiàng)所述的擔(dān)子菌提取組合物，其特征在于通過加壓和提取來獲得擔(dān)子菌提取組合物。
7.保健食品，其特征在于其包含提取自沒有擔(dān)子形成潛力的擔(dān)子菌的擔(dān)子菌提取組合物作為活性成分。
8.權(quán)利要求7所述的保健食品，其特征在于所述的擔(dān)子菌是擔(dān)子菌-X FERMBP-10011。
9.權(quán)利要求7或8所述的保健食品，其特征在于保健食品是選自飲料形式、點(diǎn)心形式、濃縮提取物形式、粉末、顆粒、片劑、和膠囊的形式。
10.免疫強(qiáng)化劑，其特征在于其包含提取自沒有擔(dān)子形成潛力的擔(dān)子菌的擔(dān)子菌提取組合物作為活性成分。
11.權(quán)利要求10所述的免疫強(qiáng)化劑，其特征在于所述的擔(dān)子菌是擔(dān)子菌-XFERM BP-10011。
12.包含菌絲體的可食用的擔(dān)子菌，所述的菌絲體是通過培養(yǎng)權(quán)利要求1或2的擔(dān)子菌形成的。
全文摘要
本發(fā)明提供了擔(dān)子菌，其是一種具有極好免疫強(qiáng)化作用等的新蘑菇，以及提供了擔(dān)子菌提取組合物，和使用該擔(dān)子菌提取組合物的保健食品和免疫強(qiáng)化劑。擔(dān)子菌沒有擔(dān)子形成潛力。特別地，擔(dān)子菌是擔(dān)子菌－XFERM BP－10011。用包含選自水和親水溶劑中至少一種溶劑的提取溶劑來從它們提取擔(dān)子菌提取組合物。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1780906SQ20048001177
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月1日
發(fā)明者渡邊哲男 申請(qǐng)人:真菌學(xué)技術(shù)株式會(huì)社