專利名稱：變體枯草桿菌蛋白酶(枯草桿菌酶)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)污漬，尤其卵污漬具有改良性能的新枯草桿菌酶(subtilase)。當(dāng)這些枯草桿菌酶用于如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣組合物和洗盤組合物中，包括自動(dòng)洗盤組合物中時(shí)，對(duì)卵污漬表現(xiàn)出優(yōu)良的或改進(jìn)的性能。
本發(fā)明也涉及編碼該枯草桿菌酶地分離的多核苷酸、核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、包含該核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用本發(fā)明的枯草桿菌酶的方法。而且，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明枯草桿菌酶的清潔和洗滌劑組合物，以及這些酶在洗滌劑組合物中的用途和用于除去卵污漬的用途。
背景技術(shù)：
在洗滌劑工業(yè)，酶已在洗滌配方中使用了30年以上。用于這些配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、甘露糖苷酶和其它酶或它們的混合物。商業(yè)上最為重要的酶是蛋白酶。
數(shù)量不斷增長(zhǎng)的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程化變體，如DURAZYM(Novozymes A/S)、RELASE(NovozymesA/S)、MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT(GenencorInternational，Inc.)。
此外，本領(lǐng)域，如EP 130756(GENENTECH)(對(duì)應(yīng)于美國(guó)重新發(fā)行(Reissue)專利號(hào)34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell，和Fersht(1985)Nature 318 375-376；Thomas，Russell，和Fersht(1987)J.Mol.Biol.193 803-813；Russel和Fersht Nature 328 496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO88/08033(Amgen)；WO 95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER&GAMBLE COMPANY)；WO 95/30010(PROCTER&GAMBLE COMPANY)；WO95/29979(PROCTER&GAMBLECOMPANY)；US 5.543.302(SOLVAY S.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO89/06279(NOVOZYMES A/S)；WO91/00345(NOVOZYMES A/S)；EP 525 610 A1(SOLVAY)；WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.)中描述了許多蛋白酶變體。
在WO 02/42740(NOVOZYMES A/S)中描述了用于篩選(AMSA)的試驗(yàn)方法。
WO 01/75087(MAXYGEN，INC./NOVOZYMES A/S)描述了枯草桿菌蛋白酶同系物，其改進(jìn)了多種特定性質(zhì)，包括熱穩(wěn)定性、低溫下的活性和堿性穩(wěn)定性。
WO 01/68821(NOVOZYMES A/S)描述了枯草桿菌酶，其適于從例如衣物和/或硬表面除去卵污漬。
然而，盡管已經(jīng)描述了許多有用的蛋白酶和蛋白酶變體，仍然需要對(duì)許多工業(yè)用途進(jìn)一步改進(jìn)蛋白酶或蛋白酶變體。
具體地，由于存在于卵白中的物質(zhì)抑制許多絲氨酸蛋白酶這一事實(shí)，從例如衣物或者硬表面除去卵污漬的問(wèn)題已經(jīng)變得突出。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供改良的枯草桿菌酶，其適于例如從衣物或者硬表面除去卵污漬。
發(fā)明概述
從而，一方面，本發(fā)明涉及對(duì)卵污漬具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶，所述枯草桿菌酶選自
(a)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1到269所示氨基酸序列具有99.26％以上同一性；和
(b)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)MT173 DSM15575中存在的質(zhì)粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有至少99.26％同一性的所述枯草桿菌酶的變體；和
(c)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO4的氨基酸1到269所示氨基酸序列具有97.40％以上同一性；和
(d)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質(zhì)粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有97.40％以上同一性的所述枯草桿菌酶的變體。
在第二方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其含有編碼本發(fā)明的枯草桿菌酶的核酸序列。
在第三方面，本發(fā)明涉及編碼枯草桿菌酶的分離的多核苷酸，其選自
(a)與SEQ ID NO1的核苷酸1到807所示核酸序列具有至少88％同一性的多核苷酸；和
(b)已經(jīng)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質(zhì)粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88％同一性的變體，
(c)與SEQ ID NO3的核苷酸1到807所示核酸序列具有至少88％同一性的多核苷酸；和
(d)已經(jīng)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質(zhì)粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88％同一性的變體。
在第四方面，本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體，其含有根據(jù)本發(fā)明的核酸序列，其有效連接到指導(dǎo)枯草桿菌酶在適宜的宿主中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列。
在第五方面，本發(fā)明涉及重組表達(dá)載體，其含有根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。
在第六方面，本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。
在第七方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶的方法，該方法包括
(a)在有助于產(chǎn)生枯草桿菌酶的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；和(b)回收枯草桿菌酶。
在第八方面，本發(fā)明涉及清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選洗衣和洗盤組合物，其含有本發(fā)明的枯草桿菌酶。
本發(fā)明的其他方面涉及本發(fā)明的枯草桿菌酶用于清潔或洗滌劑組合物中的用途；本發(fā)明的枯草桿菌酶或組合物用于除去卵污漬的用途；清除或洗滌的方法，其包括從硬表面或者衣物除去卵污漬的方法，該方法包括將硬表面或者衣物與本發(fā)明的組合物接觸。


圖1進(jìn)行了相關(guān)比對(duì)和編號(hào)參考，所述圖1顯示了枯草桿菌蛋白酶BPN’(a)(BASBPN)和本發(fā)明的新的枯草桿菌酶(b)和(c)之間的比對(duì)。
這些比對(duì)在本專利申請(qǐng)中用作對(duì)殘基編號(hào)的參照。
定義
在更詳細(xì)地討論本發(fā)明之前，首先定義以下的術(shù)語(yǔ)和慣用語(yǔ)。
氨基酸命名法
A＝Ala＝丙氨酸
V＝Val＝纈氨酸
L＝Leu＝亮氨酸
I＝Ile＝異亮氨酸
P＝Pro＝脯氨酸
F＝Phe＝苯丙氨酸
W＝Trp＝色氨酸
M＝Met＝甲硫氨酸
G＝Gly＝甘氨酸
S＝Ser＝絲氨酸
T＝Thr＝蘇氨酸
C＝Cys＝半胱氨酸
Y＝Tyr＝酪氨酸
N＝Asn＝天冬酰胺
Q＝Gln＝谷氨酰胺
D＝Asp＝天冬氨酸
E＝Glu＝谷氨酸
K＝Lys＝賴氨酸
R＝Arg＝精氨酸
H＝His＝組氨酸
X＝Xaa＝任意氨基酸
核酸命名法
A＝腺嘌呤
G＝鳥嘌呤
C＝胞嘧啶
T＝胸腺嘧啶(僅在DNA中)
U＝尿嘧啶(僅在RNA中)
變體命名的命名法和慣用語(yǔ)
在描述本發(fā)明的產(chǎn)生的或期待的多種枯草桿菌酶變體時(shí)，采用以下的命名法和慣用語(yǔ)以易于參照
首先通過(guò)將分離的或親本酶與枯草桿菌蛋白酶BPN′(BASBPN)對(duì)比來(lái)定義參考框。
在本發(fā)明上下文中，“同源性”或“同源的”以其常規(guī)意思理解，兩種氨基酸序列之間的“同源性”用University of Wisconsin Genetics ComputerGroup(GCG)包的GAP程序，對(duì)比對(duì)參數(shù)、比較矩陣、缺口和缺口延伸罰分使用默認(rèn)設(shè)置定義的“相似性”來(lái)確定。缺口(GAP)罰分的默認(rèn)值即缺口產(chǎn)生罰分3.0，缺口延伸罰分0.1(Wisconsin Package，版本8，1994年8月的程序手冊(cè)，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)。該方法還描述于S.B.Needleman和C.D.Wunsch，Journal of Molecular Biology，48，443-445(1970)?？梢詮南嗤?jì)算提取同一性。兩種氨基酸序列之間同源性還可以用GCG包9.1版的GAP常規(guī)方法，對(duì)比對(duì)參數(shù)、比較矩陣使用默認(rèn)參數(shù)通過(guò)“同一性”或者“相似性”確定，還可以應(yīng)用缺口和缺口延伸罰分，使用下面的參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分＝8，缺口延伸罰分＝8并且所有其他參數(shù)保持默認(rèn)值。除了氨基酸比對(duì)，該方法還輸出兩條序列之間“同一性百分率”和“相似性”的計(jì)算。使用GCG軟件包9.1版計(jì)算的數(shù)目與8.0計(jì)算的略有不同。
另一種方法是使用公知的枯草蛋白酶之間的比對(duì)，如WO 91/00345中指出的比對(duì)。在多數(shù)情況中，方法之間差異將不重要。
枯草桿菌蛋白酶BPN′(BASBPN)和本發(fā)明的新枯草桿菌酶之間的序列對(duì)比如圖1所示。
因此，將定義許多與BASBPN相關(guān)的缺失和插入。在圖1中，本發(fā)明的新枯草桿菌酶與BASBPN相比，在36、58、158、162、163和164位有6處缺失。這些缺失在圖1中由星號(hào)(*)表示。
一般采用以下的三個(gè)成分來(lái)表示對(duì)親本酶所進(jìn)行的多種修飾
原始氨基酸位置替換的氨基酸
符號(hào)G195E意指195位的甘氨酸被谷氨酸替換。
位置替換的氨基酸
在原始氨基酸殘基可以是任意氨基酸殘基的情況下，有時(shí)可以用簡(jiǎn)略表達(dá)方式僅表示位置和替換的氨基酸170Ser或者170S。
這種符號(hào)尤其與同源枯草桿菌酶的修飾相關(guān)(見下文)。
原始氨基酸位置
當(dāng)鑒定替換氨基酸殘基不重要時(shí)，這種符號(hào)尤其相關(guān)。用任意氨基酸殘基替換195位的甘氨酸表示為Gly195或者G195。
位置
當(dāng)原始氨基酸和替換氨基酸均可以包含任意氨基酸時(shí)，則只指出位置，如170。
原始氨基酸位置{替換的氨基酸1，...，替換的氨基酸n}
當(dāng)原始氨基酸和/或替換的氨基酸可以包含一種以上但不是所有的氨基酸時(shí)，所選擇的氨基酸表示在括號(hào){}內(nèi)
對(duì)于特定的變體，使用特定的三個(gè)或一個(gè)字母代碼，包括代碼Xaa和X用來(lái)表示任何氨基酸殘基。
替換
用谷氨酸替換195位的甘氨酸表示為
Gly195Glu或G195E
或者用任意氨基酸殘基酸替換195位的甘氨酸表示為
Gly195Xaa或G195X
或
Gly195或G195
因此用絲氨酸替換170位的任意氨基酸殘基表示為
Xaa170Ser或X170S
或
170Ser或170S
這種符號(hào)尤其與同源枯草桿菌酶的修飾相關(guān)(見下文)。因此170Ser意指包含例如BASBPN中的Lys170Ser修飾和本發(fā)明枯草桿菌酶的Arg170Ser的修飾(參見圖1)。
對(duì)于其中的原始氨基酸和/或替換的氨基酸可以包含一種以上但不是所有的氨基酸的修飾而言，由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸替換170位的精氨酸表示為
Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G， A，S，T}
以表示變體
R170G、R170A、R170S和R170T。
缺失
195位甘氨酸的缺失表示為
Gly195*或G195*
相應(yīng)地，一個(gè)以上氨基酸殘基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示為
Gly195*+Leu196*或G195*+L196*
插入
額外的氨基酸殘基的插入，如在G195后插入賴氨酸表示為
Gly195GlyLys或G195GK；
或者，當(dāng)插入一個(gè)以上的氨基酸殘基，如在G195后插入Lys和Ala時(shí)，這種插入表示為
Gly195GlyLysAla或G195GKA
在這些情況下，通過(guò)將小寫字母加到插入氨基酸殘基之前的氨基酸殘基的位置號(hào)來(lái)對(duì)插入氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。在以上的實(shí)施例中，序列194-196因此為
194 195 196
BLSAVI A-G-L
194 195 195a 195b 196
變體 A-G-K-A-L
當(dāng)插入與所存在的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基時(shí)，顯然是在命名中出現(xiàn)了簡(jiǎn)并。如果例如在以上的實(shí)施例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，則將它表示為G195GG。對(duì)從
194 195 196
BLSAVIA-G-L
194 195 195a 196
至變體A-G-G-L
194 194a 195 196的同一現(xiàn)行變化還可以表示為A194AG。
這些例子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，且表示法G195GG和這種類型插入的相應(yīng)表示法因此是指包含此類等同的簡(jiǎn)并表示法。
填補(bǔ)缺口
當(dāng)與用于編號(hào)的枯草桿菌蛋白酶BPN′序列進(jìn)行比較，在參照的酶中存在缺失時(shí)，則對(duì)于在36位天冬氨酸的插入而言，這種位置處的插入表示為
*36Asp或*36D
多重修飾
用加號(hào)分隔含多重修飾的變體，如
Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E
代表在170和195位分別用酪氨酸和谷氨酸替換精氨酸和甘氨酸的修飾。
因此，Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示以下變體
ryr167Gly+Arg170Gly， Tyr167Gly+Arg170Ala，
Tyr167Gly+Arg170Ser， Tyr167Gly+Arg170Thr，
Tyr167Ala+Arg170Gly， Tyr167Ala+Arg170Ala，
Tyr167Ala+Arg170Ser， Tyr167Ala+Arg170Thr，
Tyr167Ser+Arg170Gly， Tyr167Ser+Arg170Ala，
Tyr167Ser+Arg170Ser， Tyr167Ser+Arg170Thr，
Tyr167Thr+Arg170Gly， Tyr167Thr+Arg170Ala，
Tyr167Thr+Arg170Ser和Tyr167Thr+Arg170Thr。
這種命名法與針對(duì)替換、取代、插入或缺失具有特定共同性質(zhì)的氨基酸殘基，如帶正電荷(K、R、H)、帶負(fù)電荷(D、E)的殘基的修飾，或用一種小氨基酸替換另一種小氨基酸的諸如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}的保守氨基酸的修飾特別相關(guān)。進(jìn)一步的詳細(xì)描述參見“發(fā)明詳述”部分。
蛋白酶
分解蛋白質(zhì)底物中的酰胺鍵的酶歸類為蛋白酶，或(可互換地)肽酶(見Walsh，1979，酶反應(yīng)機(jī)理(Enzymatic Reaction Mechanisms).W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。
氨基酸位置/殘基的編號(hào)
如果沒有另外指出，本文所用的氨基酸編號(hào)對(duì)應(yīng)于枯草桿菌酶BPN′(BASBPN)序列的氨基酸編號(hào)。對(duì)BPN′序列的詳細(xì)描述，參見圖1或Siezen等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Engng.)4(1991)719-737。
絲氨酸蛋白酶
絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，其中在活性部位存在必需的絲氨酸殘基(White，Handler和Smith，1973“生物化學(xué)原理(Principles of Biochemistry)，”第五版，McGraw-Hill Book公司，紐約，第271-272頁(yè))。
細(xì)菌絲氨酸蛋白酶的分子量在20,000-45,000道爾頓的范圍內(nèi)。它們被二異丙基氟代磷酸酯抑制。它們水解簡(jiǎn)單末端脂類，且其活性與真核生物糜蛋白酶(也是一種絲氨酸蛋白酶)相似。一個(gè)更為狹義的術(shù)語(yǔ)包括在一個(gè)亞組的堿性蛋白酶反映某些絲氨酸蛋白酶的高pH最佳值，為pH 9.0-11.0(綜述參見Priest(1977)細(xì)菌學(xué)評(píng)論(BacteriologicalRev.)41711-753)。
枯草桿菌酶
Siezen等人提出絲氨酸蛋白酶的一個(gè)亞組，其暫稱為枯草桿菌酶(subtilase)，見蛋白質(zhì)工程，4(1991)719-737和Siezen等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)6(1997)501-523。它們是通過(guò)對(duì)170多個(gè)先前稱為枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析而定義的?？莶輻U菌蛋白酶以前通常被定義為由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)Siezen等人則為枯草桿菌酶的一個(gè)亞組。已鑒定了大量的枯草桿菌酶，并已測(cè)定了一些枯草桿菌酶的氨基酸序列。對(duì)此類枯草桿菌酶及其氨基酸序列的更詳細(xì)描述參見Siezen等人(1997)。
枯草桿菌酶的一個(gè)亞組，I-S1或″真″枯草桿菌蛋白酶，包含“標(biāo)準(zhǔn)的”枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168(BSS168)、枯草桿菌蛋白酶BPN′、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE，Novozymes A/S)和枯草桿菌蛋白酶DY(BSSDY)。
Siezen等人(見上文)識(shí)別了枯草桿菌酶的另一亞組，I-S2或強(qiáng)堿性枯草桿菌蛋白酶。亞組I-S2蛋白酶被描述為強(qiáng)堿性枯草桿菌蛋白酶并包括枯草桿菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL，Gist-BrocadesNV)、枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI)(SAVINASE，Novozymes A/S)、枯草桿菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE，Novozymes A/S)和堿性彈性蛋白酶YaB(BSEYAB)。
親本枯草桿菌酶
術(shù)語(yǔ)“親本枯草桿菌酶”描述一種根據(jù)Siezen等人(1991和1997)定義的枯草桿菌酶。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見上述對(duì)“枯草桿菌酶”的描述。親本枯草桿菌酶也可以是從天然來(lái)源分離的枯草桿菌酶，其中，在保持枯草桿菌酶特性的情況下經(jīng)過(guò)進(jìn)一步修飾。而且，親本枯草桿菌酶還可以是通過(guò)如以下文獻(xiàn)所述的DNA改組技術(shù)制備的枯草桿菌酶J.E.Ness等人，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，17，893-896(1999)。
術(shù)語(yǔ)“親本枯草桿菌酶”可另外稱為“野生型枯草桿菌酶”。
枯草桿菌酶的修飾
本文所用的術(shù)語(yǔ)“修飾”定義為包括枯草桿菌酶的化學(xué)修飾以及對(duì)編碼枯草桿菌酶的DNA所進(jìn)行的遺傳操作。修飾可以是氨基酸側(cè)鏈的取代、目標(biāo)氨基酸處的替換、缺失和/或插入。
枯草桿菌酶變體
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)枯草桿菌酶變體或突變的枯草桿菌酶指由表達(dá)突變基因的生物體產(chǎn)生的枯草桿菌酶，該突變基因來(lái)源于含原始或親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)親本酶的親本微生物，所述親本基因已發(fā)生突變以產(chǎn)生突變基因，這種突變基因在適宜的宿主中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生所述的突變枯草桿菌酶。類似地，所述突變基因還可以來(lái)自通過(guò)DNA改組技術(shù)產(chǎn)生的親本基因。
同源枯草桿菌酶序列
在本上下文中，兩種氨基酸序列之間的同源性用參數(shù)“同一性”描述。
為了確定兩種枯草桿菌酶之間的同一性程度，可以使用相同的設(shè)置應(yīng)用(下文)GCG程序包9.1版的GAP方法。此方法的計(jì)算結(jié)果除了氨基酸序列對(duì)比外，還有兩個(gè)序列之間的“同一性百分率”的計(jì)算結(jié)果。
根據(jù)此說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地鑒定適宜的同源性枯草桿菌酶和相應(yīng)的同源活性部位環(huán)區(qū)，它們可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾。
分離的多核苷酸
本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”指經(jīng)分離和純化并因此為適用于遺傳工程化的蛋白質(zhì)產(chǎn)生體系的形式的多核苷酸。這些分離的分子可以從其自然環(huán)境中分離，并包括cDNA和基因組克隆以及來(lái)自DNA改組實(shí)驗(yàn)或定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)的多核苷酸。本發(fā)明的分離的多核苷酸不含其它通常與之相關(guān)的基因，但可包括5′和3′非翻譯區(qū)如啟動(dòng)子和終止子。相關(guān)區(qū)域的鑒定對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的(例如，參見Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。術(shù)語(yǔ)“分離的核酸序列”另外可稱為“分離的DNA序列”、“克隆的核酸序列”或“克隆的DNA序列”。
分離的蛋白質(zhì)
術(shù)語(yǔ)“分離的”在應(yīng)用于蛋白質(zhì)時(shí)指此蛋白質(zhì)已從其自然環(huán)境中分離出。
在優(yōu)選的形式中，分離的蛋白質(zhì)基本上不含其它蛋白質(zhì)，特別是其它同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(參見以下))。
通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定分離的蛋白質(zhì)的純度大于10％，優(yōu)選大于20％，更優(yōu)選大于30％。還優(yōu)選提供通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定純度大于40％，大于60％，大于80％，更優(yōu)選大于95％，并最優(yōu)選大于99％的高度純化形式的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“分離的蛋白質(zhì)”可另稱為“純化的蛋白質(zhì)”。
同源雜質(zhì)
術(shù)語(yǔ)“同源雜質(zhì)”意指任何來(lái)源于最初獲得本發(fā)明枯草桿菌酶的同源細(xì)胞的雜質(zhì)(如除了本發(fā)明枯草桿菌酶之外的另一多肽)。
自......獲得
本文所用與特定的微生物源相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“自......獲得”意指該多核苷酸和/或枯草桿菌酶是由特定來(lái)源或由細(xì)胞產(chǎn)生，其中所述細(xì)胞中已插入來(lái)自于所述來(lái)源的基因。
底物
本文所用的與蛋白酶的底物相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“底物”應(yīng)以其最廣義的形式解釋為包括含有至少一個(gè)易于被枯草桿菌蛋白酶水解的肽鍵的化合物。
產(chǎn)物
本文所用的與來(lái)自蛋白酶酶促反應(yīng)的產(chǎn)物有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)物”在本發(fā)明的上下文中應(yīng)解釋為包括涉及蛋白酶枯草桿菌酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。產(chǎn)物可以是在隨后的水解反應(yīng)中的底物。
洗滌性能
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)“洗滌性能”用作酶在例如洗滌或硬表面清潔過(guò)程中除去存在于目標(biāo)上的污漬，尤其卵污漬至清潔的能力。還參見實(shí)施例2中的“標(biāo)準(zhǔn)的洗滌劑洗滌性能試驗(yàn)”。
％除去的蛋白質(zhì)膜
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)“％除去的蛋白質(zhì)膜”用作酶在自動(dòng)洗盤期間除去所要清洗的目標(biāo)上存在的污漬，尤其卵污漬的能力。性能數(shù)據(jù)來(lái)自干凈、臟的和洗過(guò)的鋼盤的重力測(cè)量
將該數(shù)據(jù)擬合四參數(shù)邏輯斯諦模型(logistic model)，其可以寫做
F(z)＝Y(jié)0+Vmax*Cλ(ksλ+Cλ)
其中F(z)為從作為截距的Y0計(jì)算的響應(yīng)值，Y0+Vmax為最大響應(yīng)，C為酶劑量，Ks為半飽和值。λ為陡度參數(shù)，其在米氏(Michaelis-Menten)模型中為1，但是在這里它等于或不等于1，因?yàn)槲覀冊(cè)试S擬合S形曲線。將每個(gè)曲線擬合與參考酶的性能相比較。
對(duì)于進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見本文實(shí)施例4中的“小規(guī)模自動(dòng)盤洗滌(ADW小洗滌)”。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示了使用上文提到的GAP方法對(duì)枯草桿菌蛋白酶BPN’(a)和本發(fā)明的新枯草桿菌酶(b)和(c)的氨基酸序列之間的比對(duì)。
圖2示意性描繪了實(shí)施例4中描述的ADW小洗滌的設(shè)置。
圖3顯示了對(duì)卵黃污漬的ADW小洗滌試驗(yàn)方法的結(jié)果。
圖4顯示了AMSA試驗(yàn)方法(實(shí)施例5)聯(lián)合通過(guò)商業(yè)途徑可得的方法的結(jié)果。
發(fā)明詳述
在本發(fā)明的第一個(gè)有趣的方面，對(duì)卵污漬具有改進(jìn)的洗滌性能的枯草桿菌酶是分離的枯草桿菌酶，其與SEQ ID NO2(即成熟枯草桿菌酶)的氨基酸1-269所示氨基酸序列具有99.26％以上的同一性。在本發(fā)明的有趣的實(shí)施方案中，所述枯草桿菌酶與SEQ ID NO2的氨基酸1-269所示氨基酸序列具有99.26％以上或者99.63％以上的同一性(下文中稱作“同源枯草桿菌酶”)。在本發(fā)明的另一有趣的實(shí)施方案中，所分離的枯草桿菌酶由SEQ ID NO2的氨基酸1-269所示氨基酸序列組成。
在本發(fā)明的另一有趣的實(shí)施方案中，對(duì)卵污漬具有改進(jìn)的洗滌性能的枯草桿菌酶是分離的枯草桿菌酶，其與SEQ ID NO4(即成熟枯草桿菌酶)的氨基酸1-269所示氨基酸序列具有97.40％以上的同一性。在本發(fā)明的有趣的實(shí)施方案中，所述枯草桿菌酶與SEQ ID NO4的氨基酸1-269所示氨基酸序列具有97.40％以上，或者97.77％以上，或者98.14％以上，或者98.51％以上，或者98.89％以上，或者99.26％以上，或者99.63％以上同源性。在本發(fā)明的另一有趣的實(shí)施方案中，所分離的枯草桿菌酶由SEQ ID NO4的氨基酸1-269所示氨基酸序列組成。
可以使用完全Smith-Waterman比對(duì)進(jìn)行序列比對(duì)和同一性得分計(jì)算，完全Smith-Waterman比對(duì)可用于蛋白質(zhì)和DNA比對(duì)。對(duì)蛋白質(zhì)和DNA比對(duì)分別使用默認(rèn)得分矩陣BLOSUM50和同一性矩陣。缺口中第一個(gè)殘基的罰分對(duì)于蛋白質(zhì)為-12，對(duì)于DNA為-16，而對(duì)于缺口中額外殘基的罰分對(duì)于蛋白質(zhì)為-2，對(duì)于DNA為-4。比對(duì)來(lái)自Fasta包版本v3.1t11(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools forBiological Sequence Analysis″，PNAS 852444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA″Methods in Enzymology 18363-98)。
通過(guò)進(jìn)行此類比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列的枯草桿菌酶和多種已知的枯草桿菌酶的氨基酸序列之間下面的同一性(百分?jǐn)?shù))。
1)BLAP(遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶)已經(jīng)在US 5,352,604中描述。
公知所稱作的一個(gè)氨基酸殘基向一個(gè)相似氨基酸殘基的保守替換預(yù)期在酶的特征中僅產(chǎn)生微小改變。
下表I列出了保守氨基酸替換組。
表I
因此，在本發(fā)明的另一有趣的實(shí)施方案中，具有SEQ ID NO2和SEQID NO4的氨基酸序列的枯草桿菌酶組合一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失和/或插入。
特別地，設(shè)想與本領(lǐng)域公知的其他修飾組合以為酶提供改進(jìn)的性質(zhì)。本領(lǐng)域描述了具有不同的改進(jìn)性質(zhì)的許多枯草桿菌酶變體并且它們中的許多在本文的“發(fā)明背景”部分提及(見上文)。
這些組合包括位置222(提高氧化穩(wěn)定性)、218(提高熱穩(wěn)定性)、Ca2+結(jié)合位點(diǎn)中的替換，其穩(wěn)定該酶，例如，76位，和現(xiàn)有技術(shù)中許多其他顯而易見的位置。
在其他實(shí)施方案中，本文描述的枯草桿菌變體可以有利地與任一如下位置的一個(gè)或多個(gè)修飾組合
27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(BPN’編號(hào))。
特別地，認(rèn)為下面的BLSAVI、BLSUBL、BSKSMK、和BAALKP修飾也適于組合
K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K和T274A。
此外，含有任一種如下修飾S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或者N76D+V104A或者修飾K27R、N76D、S101G、S103A、V104N、V104Y、V104I、V104A、N123S、G159D、A232V、Q236H、Q245R、N248D、N252K、T274A聯(lián)合上面提及的任意一個(gè)或多個(gè)修飾的組合顯示出改進(jìn)的性質(zhì)。
一種尤其有趣的變體是這樣的變體，其除了根據(jù)本發(fā)明的修飾之外還含有下面的替換
S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K。
此外，本發(fā)明的主要方面的枯草桿菌酶變體優(yōu)選與129、131和194位的一個(gè)或多個(gè)修飾，優(yōu)選作為129K、131H和194P修飾，最優(yōu)選作為P129K、P131H和A194P修飾聯(lián)合。預(yù)期這些修飾的任意一種在枯草桿菌酶變體生產(chǎn)中提供枯草桿菌酶變體的更高表達(dá)水平。
此外，預(yù)期在活性位點(diǎn)(b)環(huán)區(qū)域中插入至少一個(gè)額外的氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)于從95位到103位(BASBPN編號(hào))插入至少一個(gè)氨基酸殘基，將賦予本發(fā)明的枯草桿菌酶的額外的洗滌性能。具體地，優(yōu)選在下面的位置98和99位，和99和100位之間插入至少一個(gè)額外的氨基酸殘基，如一個(gè)額外的氨基酸殘基。
此外，優(yōu)選純化形式的、與具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列的枯草桿菌酶具有免疫化學(xué)同一性或者部分免疫化學(xué)同一性的分離的枯草桿菌酶也認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過(guò)免疫學(xué)交叉反應(yīng)同一性試驗(yàn)通過(guò)眾所周知的烏赫特朗尼氏雙向免疫擴(kuò)散方法測(cè)定免疫化學(xué)性質(zhì)。具體地，通過(guò)Harboe和Ingild，在N.H.Axelsen，J.Kroll，和B.Weeks，編者，A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell ScientificPublications，1973，23章，或者Johnstone和Thorpe，Immunochemistryin Practice，Blackwell Scientific Publications，1982(更具體地27-31頁(yè))描述的方法通過(guò)免疫兔(或者其他嚙齒動(dòng)物)制備含有與具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列的枯草桿菌酶的表位免疫反應(yīng)或者結(jié)合所述表位的多克隆抗體的抗血清。使用特定免疫化學(xué)技術(shù)，具有免疫化學(xué)同一性的枯草桿菌酶是這樣的枯草桿菌酶，其與抗血清以相同的方式反應(yīng)，如沉淀的總?cè)诤?total fusion)、相同的沉淀形態(tài)，和/或相同的電泳遷移率。Axelsen，Bock，和Krll在N.H.Axelsen，J.Krll，和B.Weeks，編者，A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell ScientificPublications，1973，第10章中描述了免疫化學(xué)同一性的進(jìn)一步解釋。使用特定免疫化學(xué)技術(shù)，具有部分免疫化學(xué)同一性的枯草桿菌酶是這樣的枯草桿菌酶，其與抗血清以部分相同的方式反應(yīng)，如沉淀的部分融合、部分相同的沉淀形態(tài)、和/或部分相同的電泳遷移率。Bock和Axelsen在N.H.Axelsen，J.Krll，和B.Weeks，編者，A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，第11章中描述了部分免疫化學(xué)同一性。
抗體也可以是單克隆抗體?？梢愿鶕?jù)例如E.Harlow和D.Lane，編者，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，New York描述的方法制備和使用單克隆抗體。
本發(fā)明人已經(jīng)分離了編碼具有SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的枯草桿菌酶的基因并將其插入到大腸桿菌MT173中。含有該基因的大腸桿菌MT173菌株根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏(InternationalRecognition of the Deposits of Microorganisms for the Purpose of PatentProcedures)布達(dá)佩斯條約于2000年2月8日保藏在德國(guó)不倫瑞克的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig)，保藏號(hào)為DSM 15575。
本發(fā)明人已經(jīng)分離了編碼具有SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的枯草桿菌酶的基因并將其插入到大腸桿菌MT173中。含有該基因的大腸桿菌MT173菌株根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約于2000年2月8日保藏在德國(guó)不倫瑞克的德意志微生物保藏中心，保藏號(hào)為DSM 15574。
在本發(fā)明的一個(gè)有趣的實(shí)施方案中，所述枯草桿菌酶與克隆到保藏號(hào)為DSM 15575的大腸桿菌MT173中存在的質(zhì)粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶具有99.26％以上或者99.63％以上的同一性。
在本發(fā)明的另一個(gè)有趣的實(shí)施方案中，所述枯草桿菌酶與克隆到保藏號(hào)為DSM 15574的大腸桿菌MT173中存在的質(zhì)粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶具有97.40％以上，或者97.77％以上，或者98.14％以上，或者98.51％以上，或者98.89％以上，或者99.26％以上，或者99.63％以上的同一性。
如上文提到的，本發(fā)明的枯草桿菌酶顯示出對(duì)卵污漬的極佳的洗滌性能。因此，為了技術(shù)人員在其研發(fā)工作早期能夠選擇用于該目的的有效而優(yōu)選的枯草桿菌酶，本發(fā)明人已經(jīng)提供了許多適宜的早期試驗(yàn)，其可以通過(guò)技術(shù)人員容易地進(jìn)行以初步評(píng)估所討論的枯草桿菌酶的性能。
從而，實(shí)施例2中公開的“標(biāo)準(zhǔn)的洗滌劑洗滌性能試驗(yàn)”可以用于評(píng)估所選枯草桿菌酶的效率。換句話說(shuō)，“標(biāo)準(zhǔn)的洗滌劑洗滌性能試驗(yàn)”可以用于評(píng)估枯草桿菌酶當(dāng)摻入到標(biāo)準(zhǔn)洗滌組合物中時(shí)與參照系統(tǒng)(摻入到相同標(biāo)準(zhǔn)洗滌系統(tǒng)并且在相同條件下試驗(yàn))相比從織物表面除去卵污漬的能力。使用該試驗(yàn)，可以初步研究所選的枯草桿菌酶除去卵污漬的適合性，基本理論是如果所選的枯草桿菌酶與參照酶相比在測(cè)試中不顯示出顯著改進(jìn)，那么通常不必進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試實(shí)驗(yàn)。
因此，尤其令人感興趣的用于衣物洗滌目的的枯草桿菌酶是這樣的枯草桿菌酶，其當(dāng)在含有的標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑組合物中如本文“標(biāo)準(zhǔn)的洗滌劑洗滌性能試驗(yàn)”中描述的進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，與在相同條件下試驗(yàn)的參考酶相比對(duì)卵污漬具有提高的洗滌性能。
可以采用在本文的實(shí)施例2中定義的所稱作的“性能因子”對(duì)洗滌性能的改進(jìn)進(jìn)行定量。
在本發(fā)明的一個(gè)非常令人感興趣的實(shí)施方案中，本發(fā)明的枯草桿菌酶在“洗滌性能試驗(yàn)”測(cè)試時(shí)，其性能因子至少為1，如至少為1.5，例如至少為2，優(yōu)選至少為2.5，如至少為3，例如至少為3.5，特別是至少為4，如至少為4.5，例如至少為5。
明顯地，優(yōu)選本發(fā)明的枯草桿菌酶在所述的最低水平上，更優(yōu)選在所述的中等水平上，最優(yōu)選在所述的最高水平上符合上述標(biāo)準(zhǔn)。
本文中實(shí)施例3中公開的“完整規(guī)模自動(dòng)盤洗滌(ADW)試驗(yàn)”或者實(shí)施例4中公開的“小規(guī)模自動(dòng)盤洗滌(ADW小洗滌)”或者實(shí)施例5中公開的“自動(dòng)機(jī)械壓力測(cè)定(AMSA)”可以用于評(píng)估所選枯草桿菌酶在自動(dòng)盤洗滌中的效率。換句話說(shuō)，這些試驗(yàn)可以用于評(píng)估枯草桿菌酶當(dāng)摻入到洗滌組合物(商業(yè)的或標(biāo)準(zhǔn)的)中時(shí)與參照系統(tǒng)(摻入到相同標(biāo)準(zhǔn)洗滌系統(tǒng)并且在相同條件下試驗(yàn))相比從硬表面除去卵污漬的能力。使用該試驗(yàn)，可以初步研究所選的枯草桿菌酶除去卵污漬的適合性，基本理論是如果所選的枯草桿菌酶與參照酶相比在測(cè)試中不顯示出顯著改進(jìn)，那么通常不必進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試實(shí)驗(yàn)。
因此，尤其令人感興趣的用于自動(dòng)盤洗滌目的的枯草桿菌酶是這樣的枯草桿菌酶，其當(dāng)在含有的標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑組合物中如本文實(shí)施例3、4或5中描述的進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，與在相同條件下試驗(yàn)的參考酶相比對(duì)卵污漬具有提高的性能。
通過(guò)用于人工產(chǎn)生多樣性的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如通過(guò)不同枯草桿菌酶基因的DNA改組(見WO95/22625和J.E.Ness等人，Nature Biotechnology，17，893-896(1999))可以構(gòu)建本發(fā)明的枯草桿菌酶。
本發(fā)明的枯草桿菌酶顯然還可以從天然來(lái)源中分離，即本發(fā)明的枯草桿菌酶可以是例如細(xì)菌枯草桿菌酶，例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌枯草桿菌酶，例如，芽孢桿菌屬多肽，如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結(jié)牙孢桿菌(Bacilluscoagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)枯草桿菌酶；或者鏈霉菌屬枯草桿菌酶，如變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)枯草桿菌酶；或者革蘭氏陰性細(xì)菌枯草桿菌酶，如大腸桿菌或假單胞菌(Pseudomonas)sp枯草桿菌酶。
本發(fā)明的枯草桿菌酶也可為真菌多肽，更優(yōu)選酵母枯草桿菌酶如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia枯草桿菌酶；或者更優(yōu)選的絲狀真菌枯草桿菌酶如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短柄霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、線黑粉菌科(Filibasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、鏈孢霉屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、草根霉菌屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)枯草桿菌酶。
在一個(gè)令人感興趣的實(shí)施方案中，枯草桿菌酶為卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasii、可魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)枯草桿菌酶。
在另一個(gè)有趣的實(shí)施方案中，枯草桿菌酶為棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporium)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichodermakoningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉(Trichoderma viride)枯草桿菌酶。
可以理解，對(duì)于上述的種，本發(fā)明包含理想和不理想狀態(tài)和其它分類學(xué)等同物，如變形物，而不管它們已知的種名如何。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于認(rèn)識(shí)到適當(dāng)?shù)韧锏耐恍浴?br> 這些種的菌株對(duì)公眾來(lái)說(shuō)是易于在一些培養(yǎng)物保藏中心得到的，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物保藏所，北方地區(qū)研究中心(NRRL)。
而且，可以采用上述的探針從包括自自然界(如土壤、堆肥、水等)分離的微生物的其它來(lái)源中鑒定并獲得此類枯草桿菌酶。用于從天然棲所分離微生物的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。類似地篩選另一種微生物的基因組或cDNA文庫(kù)可獲得所述多核苷酸。一旦用探針檢測(cè)到編碼枯草桿菌酶的多核苷酸，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)分離或克隆該序列(例如，參見Sambrook等人，1989，上文)。
用于克隆本發(fā)明枯草桿菌酶的許多方法和用于將插入物導(dǎo)入基因(如枯草桿菌酶基因)的許多方法在本領(lǐng)域是熟知的，參見在“發(fā)明背景”部分引用的參考文獻(xiàn)。
通常可以采用用于克隆基因和向該基因引入插入物(隨機(jī)和/或定點(diǎn))的標(biāo)準(zhǔn)方法以獲得本發(fā)明的枯草桿菌酶。為了進(jìn)一步描述適宜的技術(shù)，參照本文的實(shí)施例(見下文)和(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；Ausubel，F(xiàn).M.等人(編輯)“分子生物學(xué)最新方法”(“Current protocols in Molecular Biology”)，JohnWiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編輯)“用于芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”(“Molecular Biological Methods for Bacillus”)，John Wiley和Sons，1990)；和WO 96/34946。
而且，本發(fā)明的枯草桿菌酶可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建，用于人為地產(chǎn)生多樣性，如通過(guò)不同枯草桿菌酶基因的DNA改組技術(shù)(參見WO95/22625；Stemmer WPC，自然370389-91(1994))。例如將編碼Savinase的基因與實(shí)際上已鑒定的一種或多種部分枯草桿菌酶序列進(jìn)行DNA改組，在隨后篩選改進(jìn)的洗滌性能后，提供本發(fā)明的枯草桿菌酶。
多核苷酸
本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的枯草桿菌酶。
在一個(gè)有趣的實(shí)施方案中，所述多核苷酸與SEQ ID NO1的核苷酸1到807所示的多核苷酸具有至少88％、或至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性，或者與SEQ ID NO3的核苷酸1到807所示的多核苷酸具有至少88％、或至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。在本發(fā)明的另一個(gè)有趣的實(shí)施方案中，所述多核苷酸含有SEQ ID NO1或者SEQ ID NO3的核苷酸1到807所示的多核苷酸、其等位基因變體、或者其能夠編碼本發(fā)明枯草桿菌酶的片段。顯然，所述多核苷酸可以由SEQ ID NO1或者SEQ IDNO3的核苷酸1到807所示的多核苷酸組成。
本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID NO2不同；本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID NO4不同。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO1的子序列，其編碼具有蛋白酶解活性的SEQ ID NO2的片段，還涉及SEQID NO3的子序列，其編碼具有蛋白酶解活性的SEQ ID NO4的片段。
SEQ ID NO1的子序列為SEQ ID NO1的核苷酸1到807包括的多核苷酸，只是5’和/或3’末端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸已經(jīng)被缺失；SEQ IDNO3的子序列為SEQ ID NO3的核苷酸1到807包括的多核苷酸，只是5’和/或3’末端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸已經(jīng)被缺失；
用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，它包括從基因組DNA中分離、由cDNA制備、或它們的組合?？梢詮倪@些基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸，例如通過(guò)使用已知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢測(cè)具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。例如，參見Innis等人，1990，PCR方法和應(yīng)用指南(PCRA Guide to Methods and Application)，Academic Press，紐約?？梢允褂闷渌暮怂釘U(kuò)增方法如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、連接激活的轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。
分離的多核苷酸可以例如通過(guò)遺傳工程中所用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得，以便將該多核苷酸從其天然位置重新定位到可使其復(fù)制的不同位點(diǎn)處?？寺》椒砂ㄇ谐头蛛x含編碼枯草桿菌酶的多核苷酸的所需核酸片段，將此片段插入到載體分子，并將此重組載體整合到宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中復(fù)制出該多核苷酸的多個(gè)拷貝或克隆。此多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成來(lái)源、合成來(lái)源或它們的任一組合。
為本發(fā)明的目的，兩個(gè)核酸序列之間的同一性程度如上述測(cè)定。
編碼本發(fā)明的枯草桿菌酶的多核苷酸的修飾對(duì)于合成與該枯草桿菌酶基本類似的枯草桿菌酶的合成是必需的。術(shù)語(yǔ)“基本上類似的”枯草桿菌酶指非天然存在的枯草桿菌酶的形式。這些枯草桿菌酶在某些設(shè)計(jì)方式上可與從其天然來(lái)源分離得到的枯草桿菌酶不同，如在比活、熱穩(wěn)定性、pH最佳值等方面存在不同的變體?？梢栽诔尸F(xiàn)為SEQ ID NO1一部分如其子序列所編碼的多肽的多核苷酸的基礎(chǔ)上或者在呈現(xiàn)為SEQ ID NO3一部分如其子序列所編碼的多肽的多核苷酸的基礎(chǔ)上構(gòu)建變體序列，和/或通過(guò)引入核苷酸替換來(lái)構(gòu)建變體序列，其中引入的核苷酸替換不產(chǎn)生另一種由該多核苷酸編碼的枯草桿菌酶的氨基酸序列，但其與欲用于生產(chǎn)這種酶的宿主生物體的密碼子使用相匹配；或者通過(guò)引入可產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸替換。核苷酸替換的一般性描述，參見Ford等人，1991，蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化(Protein Expressionand Purification)295-107。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯然這種取代可以在所述分子的關(guān)鍵功能區(qū)之外進(jìn)行并仍產(chǎn)生活性枯草桿菌酶。對(duì)本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基，優(yōu)選其不發(fā)生替換，可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法鑒定，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(例如，參見Cunningham和Wells，1989，科學(xué)(Science)2441081-1085)。在后一技術(shù)中，在此分子的每一個(gè)帶正電荷的殘基處引入突變，并試驗(yàn)所得突變分子的蛋白水解活性，以鑒定此分子活性的關(guān)鍵氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)也可以通過(guò)三維結(jié)構(gòu)分析測(cè)定，這種三維結(jié)構(gòu)是由諸如核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親合標(biāo)記技術(shù)而測(cè)定的(例如，參見de Vos等人，1992，科學(xué)255306-312；Smith等人，1992，分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biology)224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBS Letters 30959-64)。
核酸構(gòu)建體
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的核酸核建體，所述核酸與一種或多種能夠指導(dǎo)多肽在適宜的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列有效連接。
可以多種方式操作編碼本發(fā)明枯草桿菌酶的分離多核苷酸以提供枯草桿菌酶的表達(dá)。在插入載體之前對(duì)多核苷酸操作的適當(dāng)性和必需性取決于表達(dá)載體。采用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。
所述調(diào)控序列包括所有表達(dá)本發(fā)明枯草桿菌酶所必需或有利的組分。每一種調(diào)控序列對(duì)于編碼枯草桿菌酶的多核苷酸來(lái)說(shuō)可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于先導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，所述調(diào)控序列包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。可以為此調(diào)控序列提供用于引入特定限制性位點(diǎn)的接頭，促進(jìn)此調(diào)控序列與編碼枯草桿菌酶的多核苷酸編碼區(qū)連接。
所述調(diào)控序列可以是適宜的啟動(dòng)子序列，其為被宿主細(xì)胞識(shí)別用于表達(dá)核酸序列的多核苷酸。所述的啟動(dòng)子序列含介導(dǎo)枯草桿菌酶表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。所述的啟動(dòng)子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變體、截短和雜合啟動(dòng)子，并可以由與宿主細(xì)胞同源或異源的編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)枯草桿菌酶的基因獲得。
用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適宜的啟動(dòng)子的實(shí)例為得自以下的啟動(dòng)子大腸桿菌乳糖操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)753727-3731)，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等人，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)8021-25)。其它的啟動(dòng)子如在以下文獻(xiàn)中所述“來(lái)自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)(Useful proteins from recombinant bacteria)”，科學(xué)美國(guó)人(Scientific American)，1980，24274-94；和Sambrook等人，1989，見上文。
用于指導(dǎo)在絲狀真菌宿主細(xì)胞中本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的適宜的啟動(dòng)子的實(shí)例為得自以下的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、Rhiomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhiomucor miehei脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)，以及Na2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)和它們的突變體、截短和雜合啟動(dòng)子。
在酵母宿主中，有用啟動(dòng)子得自以下來(lái)源的基因釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它酵母宿主細(xì)胞的有用啟動(dòng)子如Romanos等人，1992，酵母(Yeast)8423-488所述。
所述調(diào)控序列還可以是一種適宜的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其為由宿主細(xì)胞識(shí)別用于終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列有效連接到編碼枯草桿菌酶的多核苷酸的3’末端。任何在所選擇的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的終止子可以用于本發(fā)明。
優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的終止子得自以下來(lái)源的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。
優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞終止子得自以下來(lái)源的基因釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的酵母宿主細(xì)胞的終止子。
所述調(diào)控序列還可以是適宜的先導(dǎo)序列，為對(duì)宿主細(xì)胞翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。所述先導(dǎo)序列有效連接到編碼多肽的多核苷酸的5’末端。任何在所選擇的宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的先導(dǎo)序列可以用于本發(fā)明。
優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的先導(dǎo)序列得自以下來(lái)源的基因米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。
適宜的酵母宿主細(xì)胞先導(dǎo)序列得自以下來(lái)源的基因釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。
所述調(diào)控序列還可以是聚腺苷酸化序列，該序列有效連接到多核苷酸的3’末端且在轉(zhuǎn)錄時(shí)被宿主細(xì)胞識(shí)別為一種將聚腺苷殘基加至被轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)的序列。任何在所選擇的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的聚腺苷酸化序列可以用于本發(fā)明。
優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的聚腺苷酸化序列得自以下來(lái)源的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
酵母宿主細(xì)胞的有用的聚腺苷酸化序列如由Guo和Sherman，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)(Molecular Cellular Biology)155983-5990所描述。
所述的調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼連接到枯草桿菌酶的氨基末端的氨基酸序列并指導(dǎo)所編碼的枯草桿菌酶進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。所述多核苷酸的編碼序列的5’端本身可以包含一個(gè)天然連接在具有編碼所分泌的枯草桿菌酶的編碼區(qū)節(jié)段的翻譯讀框上的信號(hào)肽編碼區(qū)?？蛇x擇地，所述編碼序列的5’端可以包含此編碼序列的外源信號(hào)肽編碼區(qū)。當(dāng)所述的編碼序列并不天然包含一個(gè)信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要外源信號(hào)肽編碼區(qū)。可選擇地，所述的天然信號(hào)肽編碼區(qū)可用外源信號(hào)肽編碼區(qū)簡(jiǎn)單替換以促進(jìn)枯草桿菌酶的分泌。但任何可指導(dǎo)所表達(dá)的枯草桿菌酶進(jìn)入所選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。
細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是得自以下來(lái)源的基因的信號(hào)肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB 11837麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。其它的信號(hào)肽如在以下文獻(xiàn)中所述Simonen和Palva，1993，微生物學(xué)評(píng)論(Microbiological Reviews)57109-137。
絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是得自以下基因的信號(hào)肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶。
酵母宿主細(xì)胞的有用信號(hào)肽得自以下來(lái)源的基因釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的信號(hào)肽編碼區(qū)。
所述調(diào)控序列還可以是編碼位于枯草桿菌酶氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。所得的多肽已知是一種酶原或前多肽(或在某些情況下為酶原)。前多肽一般沒有活性，并可以通過(guò)催化切割或自身催化切割來(lái)自前多肽的前肽而轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。所述的前肽編碼區(qū)可以得自以下來(lái)源的基因枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(WO 95/33836)。
當(dāng)在枯草桿菌酶的氨基末端存在信號(hào)肽和前肽區(qū)兩者時(shí)，所述的前肽區(qū)與枯草桿菌酶的氨基末端相鄰，所述的信號(hào)肽區(qū)與所述前肽區(qū)的氨基末端相鄰。
加入對(duì)與宿主細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的多肽的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的調(diào)控序列也是有利的。那些調(diào)控系統(tǒng)的實(shí)例是其對(duì)化學(xué)或物理刺激物(包括存在的調(diào)節(jié)化合物)的應(yīng)答可以使得基因的表達(dá)被開啟或關(guān)閉的系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可以用作調(diào)控序列。調(diào)控序列的其它實(shí)例為允許基因擴(kuò)增的調(diào)控序列。在真核系統(tǒng)中，它們包括在甲氨蝶呤存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因和用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸與調(diào)控序列有效連接。
表達(dá)載體
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄與翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。
包含編碼本發(fā)明酶的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體可以是任何可方便地進(jìn)行重組DNA操作的載體。
載體的選擇一般取決于它將被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體而存在的載體，這種載體的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒。另外，所述載體可以是在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，被部分或全部整合入宿主細(xì)胞基因組，并與將其整合進(jìn)去的染色體一起復(fù)制。
所述載體優(yōu)選為這樣的表達(dá)載體，其中，編碼本發(fā)明的酶的DNA序列與其它的DNA轉(zhuǎn)錄所需的節(jié)段有效連接。一般來(lái)說(shuō)，所述表達(dá)載體來(lái)自質(zhì)粒或病毒DNA，或可以含有兩者的元件。術(shù)語(yǔ)“有效連接”指將所述諸節(jié)段以使其按它們的預(yù)期目的發(fā)揮功能的方式排列，如轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子中引發(fā)并通過(guò)編碼此酶的DNA序列而前行。
所述的啟動(dòng)子可以是任何在所選擇的宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)編碼基因。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的適宜的啟動(dòng)子的實(shí)例包括以下基因的啟動(dòng)子嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或噬菌體λ-PR或PL啟動(dòng)子或大腸桿菌lac、trp或tac啟動(dòng)子。
如果需要，編碼本發(fā)明酶的DNA序列還可以有效連接到適宜的終止子上。
本發(fā)明的重組載體還可包含能夠使所述載體在所討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
所述載體還可以包含可選擇的標(biāo)記，例如其產(chǎn)物彌補(bǔ)宿主細(xì)胞缺陷的基因，或編碼如對(duì)抗生素像卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等的抗性，或?qū)χ亟饘倩虺輨┑目剐缘幕颉?br> 為了指導(dǎo)本發(fā)明的酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號(hào)序列(也公知為先導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。可以將分泌信號(hào)序列以正確讀框連接到編碼酶的DNA序列。分泌信號(hào)序列一般位于編碼此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信號(hào)序列可以是通常與該酶相關(guān)的或來(lái)自編碼另一種分泌蛋白質(zhì)的基因。
用于分別連接編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動(dòng)子和任選地終止子和/或分泌信號(hào)序列，或通過(guò)適宜的PCR擴(kuò)增方案裝配這些序列和將它們插入至含有復(fù)制或整合所需信息的適宜的載體的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的(參見例如，Sambrook等人，在所引述的文章中)。
宿主細(xì)胞
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的編碼本發(fā)明的酶的DNA序列可以與所討論的宿主同源或異源。如果與所述宿主細(xì)胞同源，即由該宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生，編碼本發(fā)明的酶的DNA序列一般與非天然環(huán)境中存在的另一啟動(dòng)子序列有效連接，或者在可應(yīng)用的情況下與另一分泌信號(hào)序列和/或終止子序列相連接。所用術(shù)語(yǔ)″同源″指包括編碼天然存在于所討論的宿主生物體中的酶的DNA序列。所用術(shù)語(yǔ)“異源的”包括所述宿主細(xì)胞中本身不表達(dá)的酶的DNA序列。因此所述的DNA序列可以來(lái)源于另一生物體或者是合成的序列。
導(dǎo)入本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或重組載體的宿主細(xì)胞包括任何能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞，包括植物。
通過(guò)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如芽孢桿菌屬菌株，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)或蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)，特別是遲緩芽孢桿菌，或鏈霉菌屬菌株，如變鉛青鏈霉菌(S.lividans)或鼠灰鏈霉菌(S.murinus)，或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌。
所述細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)已知的方式用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或使用感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行(參見Sambrook等人，見上)。
當(dāng)在細(xì)菌如大腸桿菌中表達(dá)所述的酶時(shí)，該酶一般以非溶解性顆粒駐留于細(xì)胞質(zhì)中(已知稱作包涵體)，或由細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)間隙。在前一種情況下，將細(xì)胞裂解，回收所述顆粒，變性，其后通過(guò)稀釋變性試劑使酶重新折疊。后一種情況下，該酶通過(guò)以下操作回收如超聲或滲透壓休克破壞細(xì)胞，使所述的周質(zhì)間隙的內(nèi)容物釋放，再回收該酶。
當(dāng)在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬菌株中表達(dá)該酶時(shí)，該酶可以駐留于細(xì)胞質(zhì)中，或由細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到胞外培養(yǎng)基中。在后一種情況下，該酶可按下述方法從培養(yǎng)基中回收。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。文中所用“酵母”包括產(chǎn)子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔(dān)子孢子酵母和屬于半知菌的酵母(芽孢綱)。因?yàn)榻湍傅姆诸愒趯?lái)可以改變，所以對(duì)于本發(fā)明，酵母將如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，編者，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所描述的定義。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia細(xì)胞。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、可魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是Yarrowia lipolytica細(xì)胞。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門和卵菌門亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等人，1995，上文定義)。絲狀真菌特征是由菌絲體壁，其由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其他復(fù)雜多糖組成。營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲延長(zhǎng)，碳代謝是專性需氧的。相比，酵母，如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽，碳代謝是發(fā)酵的。
在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是但不限于，枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、毛霉(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、草根霉菌屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)的細(xì)胞。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusarium heterosporium)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum細(xì)胞。在甚至最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌親本細(xì)胞是Fusariumvenenatum(Nirenberg sp.nov.)。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichodermakoningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉(Trichoderma viride)細(xì)胞。
通過(guò)一種本身已知方法可以轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，所述方法包括原生質(zhì)體形成、轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體和再生細(xì)胞壁。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的適宜的方法在EP 238 023和Yelton等人1984，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 811470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬的適宜方法由Malardier等人，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787描述。使用Becker和Guarente，Abelson，J.N.和Simon，M.I.，編者，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，卷194，182-187頁(yè)，Academic Press Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal ofBacteriology 153163；和Hinnen等人，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751920所描述的方法轉(zhuǎn)化酵母。
產(chǎn)生本發(fā)明的枯草桿菌酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生本發(fā)明的枯草桿菌酶的方法，該方法包括
a)在有助于所述枯草桿菌酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；和
b)回收所述的枯草桿菌酶。
當(dāng)含編碼所述酶的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入異源宿主細(xì)胞中時(shí)即可使本發(fā)明的該酶異源重組產(chǎn)生。
由此可以產(chǎn)生以不含同源雜質(zhì)為特征的高度純化的枯草桿菌酶組合物。
本文中，同源雜質(zhì)是指來(lái)源于最初獲得本發(fā)明的酶的同源細(xì)胞的任何雜質(zhì)(例如除本發(fā)明的酶之外的其他多肽)。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適合于所討論的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基。所表達(dá)的枯草桿菌酶可方便地分泌到培養(yǎng)基中，然后可以通過(guò)已知的方法回收，所述方法包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，再利用鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組分，接下來(lái)進(jìn)行層析，如離子交換層析、親和層析等。
本發(fā)明的枯草桿菌酶的用途
本發(fā)明的枯草桿菌酶可以有多種工業(yè)用途，尤其是在洗滌劑工業(yè)中。因此本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明枯草桿菌酶的清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選地為包含本發(fā)明枯草桿菌酶的洗衣或洗盤組合物。
含有本發(fā)明的枯草桿菌酶的洗滌劑組合物
一般來(lái)說(shuō)，清潔和洗滌劑組合物已在本領(lǐng)域中有所描述，對(duì)合適的清潔和洗滌劑組合物的進(jìn)一步描述可以參見WO 96/34946；WO97/07202；WO 95/30011。
而且此處所述的實(shí)例表明本發(fā)明的枯草桿菌酶對(duì)卵污漬所表現(xiàn)出的改進(jìn)的洗滌性能。
洗滌劑組合物
本發(fā)明的酶可以添加到清潔或洗滌劑組合物中而成為其中的組分。
例如，本發(fā)明的洗滌劑組合物可以制成用于手洗或機(jī)洗的洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理污染織物的洗滌添加劑組合物和漂洗添加的纖維軟化劑組合物，或制成用于清潔普通家具硬表面的洗滌劑組合物，或被制成用于手洗或機(jī)洗的洗盤操作。
在一特定的方面，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的枯草桿菌酶的洗滌添加劑。所述的洗滌添加劑和洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它的酶如另一種蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶、例如漆酶，和/或過(guò)氧化物酶。
一般來(lái)說(shuō)，所選擇的酶的性能應(yīng)當(dāng)與所選擇的洗滌劑相適應(yīng)(即pH-最適宜，與其它酶或非酶組分具相容性等)，且所述的酶應(yīng)以有效劑量存在。
蛋白酶合適的蛋白酶包括來(lái)自動(dòng)物、植物、微生物的蛋白酶。來(lái)源于微生物的蛋白酶是優(yōu)選的。也包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。所述的蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例為枯草桿菌蛋白酶，特別是來(lái)自芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例為胰蛋白酶(例如來(lái)自豬或牛的)和如WO 89/06270和WO 94/25583中所公開的鐮孢霉屬的蛋白酶。
有用的蛋白酶的實(shí)例是如WO 92/19729，WO 98/20115，WO98/20116和WO 98/34946所描述的變體，特別是在一個(gè)或多個(gè)下述位置發(fā)生替換的變體27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(BPN’編號(hào))。
優(yōu)選的可商購(gòu)的蛋白酶包括AlcalaseTM，SavinaseTM，PrimaseTM，DuralaseTM，EsperaseTM和KannaseTM(Novozymes A/S)，MaxataseTM，MaxacalTM，MaxapemTM，ProperaseTM，PurafectTM，Purafect OxPTM，F(xiàn)N2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶合適的脂肪酶包括那些來(lái)源于細(xì)菌或真菌的脂肪酶。也包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括如EP258 068和EP 305 216中所公開的來(lái)自腐質(zhì)霉屬(Thermomyces與之同物異名)，例如來(lái)自H.1anuginosa(T.1anuginosus)的脂肪酶或如WO96/13580中所公開的來(lái)自H.Insolens的脂肪酶，假單胞菌脂肪酶，例如來(lái)自產(chǎn)堿假單胞菌(P.Alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.Pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋蔥假單胞菌(P.Cepacia)(EP 331376)，施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，熒光假單胞菌(P.Fluorescens)，假單胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)，芽孢桿菌脂肪酶，例如來(lái)自枯草芽孢桿菌(Dartois等人(1993)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochemica etBiophysica Acta)，1131，253-360)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)。
其它的實(shí)例為如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 407 225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所公開的脂肪酶變體。
優(yōu)選的可商購(gòu)的脂肪酶包括LipolaseTM和LipolaseUltraTM(Novozymes A/S)。
淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括那些來(lái)源于細(xì)菌或真菌的淀粉酶。也包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。淀粉酶包括例如來(lái)源于芽孢桿菌的α-淀粉酶，例如來(lái)自地衣芽孢桿菌的特定菌株，詳細(xì)內(nèi)容參見GB 1,296,839。
有用的淀粉酶的實(shí)例是如WO 94/02597，WO 94/18314，WO96/23873和WO 97/43424中所描述的變體，尤其是那些在一個(gè)或多個(gè)下列位置發(fā)生替換的變體15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。
可商購(gòu)的淀粉酶是DuramylTM，TermamylTM，F(xiàn)ungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(來(lái)自GenencorInternational Inc.)。
纖維素酶合適的纖維素酶包括來(lái)源于細(xì)菌或真菌的纖維素酶。也包括其經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白工程突變體。合適的纖維素酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢霉屬、草根霉屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如可由在US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US5,776,757和WO 89/09259中公開的Humicola insolens、嗜熱毀絲霉和尖孢鐮孢產(chǎn)生的所述真菌纖維素酶。
特別合適的纖維素酶是具有顏色保護(hù)優(yōu)勢(shì)的堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的實(shí)例為如EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中所公開的纖維素酶。其它的實(shí)例為如那些在WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所公開的纖維素酶變體。
可商購(gòu)的纖維素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(NovozymesA/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
過(guò)氧化物酶/氧化酶合適的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括那些來(lái)源于植物、細(xì)菌或真菌的過(guò)氧化物酶/氧化酶。也包括化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。有用的過(guò)氧化物酶的實(shí)例包括如WO 93/24618，WO95/10602和WO 98/15257所述的來(lái)自鬼傘屬(Coprinus)(例如來(lái)自灰蓋鬼傘(C.cinereus))和其變體的過(guò)氧化物酶。
所述的洗滌劑酶可以通過(guò)添加含一種或多種酶的獨(dú)立添加劑，或通過(guò)添加含所有這些酶的組合添加劑而被包含于洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，也就是獨(dú)立添加劑或組合添加劑可以制成例如顆粒狀、液體、漿狀等等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑形式為顆粒狀(特別是非粉末化顆粒)、液體(特別是穩(wěn)定的液體)或漿。
非粉末化顆?？梢勒绽鏤S 4,106,991和4,661,452所述進(jìn)行生產(chǎn)并可任選地用已知的方法包被。蠟狀包被材料的實(shí)例是平均分子量為1000到20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中，醇含12到20個(gè)碳原子且其中存在15到80個(gè)環(huán)氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中給出了適合于通過(guò)流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包被材料的實(shí)例。液體酶制劑可以依照現(xiàn)成的方法通過(guò)例如添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以穩(wěn)定。受保護(hù)的酶可依照EP 238,216中所公開的方法進(jìn)行制備。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如棒狀、片狀、粉末、顆粒、粘團(tuán)或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般含高達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑，或不含水的。
所述的洗滌劑組合物一般包含一種或多種表面活性劑，它們可以是非離子表面活性劑，包括半極性的和/或陰離子和/或陽(yáng)離子和/或兩性離子表面活性劑。所述的表面活性劑一般占到0.1％到60％的重量。
當(dāng)包含在所述洗滌劑中時(shí)，通常包含約1％到約40％的陰離子表面活性劑，如直鏈烷基苯磺酸酯、α-烯屬磺酸酯、硫酸烷基酯(硫酸脂肪醇酯)、乙氧基硫酸醇酯、仲鏈烷磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或鏈烯基琥珀酸或皂。
當(dāng)包含在所述洗滌劑中時(shí)，通常含有約0.2％到約40％的非離子表面活性劑例如脂肪醇乙氧基化物、乙氧基化壬基酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
所述的洗滌劑可以包含0-65％的洗滌劑增潔劑或絡(luò)合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)盈B式硅酸鹽(例如購(gòu)自Hoechst的SKS-6)。
所述的洗滌劑還可以包含一種或多種聚合物。實(shí)例為羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。
所述的洗滌劑還可以含有可能包含H2O2來(lái)源的漂白體系，如可以與形成過(guò)酸的漂白活化劑如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ趸交撬猁}結(jié)合的過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽。可選擇地，所述的漂白體系可以包含例如酰胺、二酰亞胺或砜類的過(guò)氧酸。
本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶可以通過(guò)諸如以下的常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲?；交鹚?，且所述的組合物也可制備為如WO 92/19709和WO 92/19708中所述的組合物。
所述的洗滌劑還可以包含其它的常規(guī)洗滌劑成分例如纖維調(diào)節(jié)劑包括黏土、增泡劑、泡沫抑制劑、抗腐蝕劑、污漬懸浮劑、抗污漬再沉淀劑、染料、殺菌劑、光學(xué)增白劑、助溶劑、失澤抑制劑或香料。
目前認(rèn)為在所述洗滌劑組合物中任何酶，特別是本發(fā)明的酶可以以相當(dāng)于每升洗滌液中具有0.01-100mg酶蛋白質(zhì)，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選每升洗滌液中具有0.1-1mg酶蛋白質(zhì)的量加入。
本發(fā)明的酶可以添加到如WO 97/07202所公開的洗滌劑配方中，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
通過(guò)下述的實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行較詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)例不作為對(duì)本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)范圍的任何限制。
在洗滌劑組合物中，簡(jiǎn)寫成分的意義如下
LAS 直鏈C12烷基苯磺酸鈉
TAS 牛油烷基硫酸鈉
XYASC1x-C1y烷基硫酸鈉
SS 式2-丁基辛酸的仲皂化表面活性劑
25EY與平均為Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的主要為C12-C15的
直鏈伯醇
45EY與平均為Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的主要為C14-C15
的直鏈伯醇
XYEZS 每摩爾與平均Z摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的C1x-C1y烷基
硫酸鈉
非離子 平均乙氧基化程度3.8而平均丙氧基化程度為4.5
的C13-C15混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，由
BASF GmbH售出，商品名為Plurafax LF404
CFAAC12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺
TFAAC16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺
硅酸鹽 無(wú)定型硅酸鈉(SiO2∶Na2O比率＝2.0)
NaSKS-6 分子式為δ-Na2Si2O5的晶狀多層硅酸鹽
碳酸鹽 無(wú)水碳酸鈉
磷酸鹽 三磷酸鈉
MA/AA 1∶4馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物，平均分子量約為80,000
聚丙烯酸酯 平均分子量為8,000的聚丙烯酸酯均聚物，由BASF
GmbH銷售，商品名為PA30
沸石A 基本顆粒大小在1-10微米范圍內(nèi)的分子式為Na12
(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅鋁酸鈉
檸檬酸鹽 二水合三檸檬酸鈉
Citric檸檬酸
過(guò)硼酸鹽 無(wú)水一水合過(guò)硼酸鈉漂白劑，經(jīng)驗(yàn)式為NaBO2·H2O2
PB4 無(wú)水過(guò)硼酸鈉四水合物
過(guò)碳酸鹽 經(jīng)驗(yàn)式為2Na2CO3·3H2O2的無(wú)水過(guò)碳酸鈉漂白劑
TAED 四乙?；叶?br> CMC 羧甲基纖維素鈉
DETPMP二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)，由Monsanto出售，
商品名為Dequest 2060
PVP 聚乙烯吡咯烷酮聚合物
EDDS 鈉鹽形式的乙二胺-N，N′-二琥珀酸[S，S]異構(gòu)體
抑泡劑25％固體石蠟，熔點(diǎn)溫度50℃，17％疏水硅石，
58％石蠟油
粒狀抑泡劑12％硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％粒狀淀粉
硫酸鹽無(wú)水硫酸鈉
HMWPEO高分子量聚環(huán)氧乙烷
TAE25 乙氧基化牛油醇(25)
洗滌劑實(shí)例I
本發(fā)明的粒狀纖維清潔組合物可如下制備
洗滌劑實(shí)例II
本發(fā)明的致密顆粒纖維清潔組合物(密度800g/1)可依照下述制備
洗滌劑實(shí)例III
本發(fā)明的對(duì)洗滌彩色織物特別有用的粒狀織物清潔組合物可依照下述制備
洗滌劑實(shí)例IV
本發(fā)明的提供“洗滌過(guò)程中的軟化處理”能力的粒狀織物清潔組合物可依照下述制備
洗滌劑實(shí)例V
本發(fā)明的強(qiáng)力液體織物清潔組合物可依照下述制備
粉末自動(dòng)洗盤組合物I
粉末自動(dòng)洗盤組合物II
粉末自動(dòng)洗盤組合物III
粉末自動(dòng)洗盤組合物IV
粉末自動(dòng)洗盤組合物V
粉末和液體的具洗滌表面活性劑系統(tǒng)的洗盤組合物VI
非水的液態(tài)自動(dòng)洗盤組合物VII
非水的液態(tài)洗盤組合物VIII
觸變性液體自動(dòng)洗盤組合物IX
液體自動(dòng)洗盤組合物X
含被保護(hù)的漂白顆粒的液體自動(dòng)洗盤組合物XI
XII如I、II、III、IV、VI和X所述的自動(dòng)洗盤組合物，其中，由過(guò)碳酸鹽替代過(guò)硼酸鹽。
XIII如I-VI所述的自動(dòng)洗盤組合物，其還含有錳催化劑。所述的錳催化劑可以是例如，在“用于低溫漂白的高效錳催化劑”(“Efficientmanganese catalysts for low-temperature bleaching”)，自然，(1994)，369，637-639中所述的化合物中的一種。
材料和方法
蛋白水解活性
在本發(fā)明的上下文中蛋白水解活性是用Kilo NOVO蛋白酶單位(KNPU)表示的。所述的活性相對(duì)于酶標(biāo)準(zhǔn)品(SAVINASE)而確定，所述的測(cè)定是基于在標(biāo)準(zhǔn)條件下蛋白水解酶對(duì)二甲基酪蛋白(DMC)溶液的消化進(jìn)行的，所述的標(biāo)準(zhǔn)條件為50℃，pH 8.3，反應(yīng)時(shí)間9分鐘，測(cè)定時(shí)間3分鐘。需要時(shí)可向Novozymes A/S，Denmark索取AF 220/1文件夾，該文件夾包括在此作為參考。
GU是甘氨酸單位，定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下，N-乙?；业鞍鬃鳛榈孜镌?0℃溫育15分鐘，產(chǎn)生相當(dāng)于1毫摩爾甘氨酸的NH2-基團(tuán)量的蛋白水解酶活性。
也可以用PNA試驗(yàn)根據(jù)與在美國(guó)油脂化學(xué)家學(xué)會(huì)會(huì)志(Journal ofAmerican Oil Chemists Society)，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，L.A.，(1988)中描述的底物琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-對(duì)硝基苯酚反應(yīng)測(cè)定酶活性。
實(shí)施例1-構(gòu)建和表達(dá)本發(fā)明的枯草桿菌酶
實(shí)施例1包括SEQ ID NO2和SEQ ID NO4。應(yīng)該理解術(shù)語(yǔ)SEQ IDNO2在任何時(shí)候可以被術(shù)語(yǔ)SEQ ID NO4替代。
具有SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的枯草桿菌蛋白酶位于載體pJRoC112中，所述載體與質(zhì)粒pKH400(以前在WO98/41623中描述)非常相似。所述質(zhì)粒與編碼成熟枯草桿菌蛋白酶的區(qū)域外面即復(fù)制起點(diǎn)相似，賦予氯霉素抗性的cat基因、指導(dǎo)枯草桿菌蛋白酶轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子和來(lái)自Savinase的前/原區(qū)在這些質(zhì)粒中相同。不同之處僅存在于編碼成熟枯草桿菌蛋白酶的基因部分內(nèi)。
該質(zhì)粒在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中都復(fù)制。在枯草芽孢桿菌中，本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶從該質(zhì)粒表達(dá)。下面描述蛋白酶的發(fā)酵和純化。
通過(guò)在1841和3730位導(dǎo)入兩個(gè)BamHI位點(diǎn)從pJS3(如J.Schidt等人在Protein and Peptide Letters，3，39-44(1996))中描述的，含有編碼枯草桿菌酶309(Savinase)的合成基因的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體)構(gòu)建PKH400。
已經(jīng)將成熟基因亞克隆到質(zhì)粒pzero-2(Invitrogen，Groningen，荷蘭)。將含有具有SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的枯草桿菌酶的完整成熟區(qū)的約1240bp PmeI-BamHI片段與載體pZero-2連接并用限制性內(nèi)切酶BamHI-EcoRV消化。將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。通過(guò)PCR分析轉(zhuǎn)化體以證實(shí)插入片段的存在并對(duì)編碼成熟枯草桿菌蛋白酶的該片段測(cè)序。所得質(zhì)粒稱作pTVB364，于2000年2月10日保藏在DSMZ，保藏號(hào)為DSM 13306。
發(fā)酵
產(chǎn)生枯草桿菌酶的發(fā)酵是通過(guò)將含有100ml BPX培養(yǎng)基的500ml帶擋板的三角瓶在回轉(zhuǎn)式搖床上(300轉(zhuǎn)/分鐘)于30℃培養(yǎng)5天而進(jìn)行的。
因此，為了制備如2升的肉湯，同時(shí)發(fā)酵了20個(gè)三角瓶。
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基中的淀粉用α-淀粉酶液化，并將培養(yǎng)基于120℃加熱滅菌45分鐘。滅菌后通過(guò)加入NaHCO3至0.1M，將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至9。
純化
該過(guò)程涉及到對(duì)在芽孢桿菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生本發(fā)明的枯草桿菌酶的2升規(guī)模發(fā)酵物進(jìn)行純化。
用1升的燒杯于5000轉(zhuǎn)/分鐘離心約1.6升發(fā)酵液35分鐘。用10％醋酸將上清調(diào)節(jié)至pH 6.5，并通過(guò)Seitz Supra S100過(guò)濾板過(guò)濾。
用配備有Amicon S1Y10 UF柱體的Amicon CH2A UF單元濃縮濾液至約400ml。室溫下離心并過(guò)濾該UF濃縮物，然后吸附于pH 7的桿菌肽親和柱上。使用25％異丙醇和1M氯化鈉(在具有0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化鈣的pH調(diào)節(jié)至7的緩沖液中)將枯草桿菌酶從該桿菌肽柱上室溫洗脫下來(lái)。
合并來(lái)自桿菌肽純化步驟的具蛋白酶活性的級(jí)分，并加至用pH調(diào)節(jié)至6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖液平衡過(guò)的750ml Sephadex G25柱(直徑為5cm)。
合并來(lái)自Sephadex G25柱的具蛋白水解活性的級(jí)分，并加至用pH調(diào)節(jié)至6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖液平衡過(guò)的150ml CM Sepharose CL 6B陽(yáng)離子交換柱(直徑為5cm)。
使用在2升同一緩沖液中的0-0.1M氯化鈉線性梯度洗脫蛋白酶。
在最后的純化步驟中，合并來(lái)自CM Sepharose柱的含蛋白酶的級(jí)分，并在配備有GR81PP膜(來(lái)自Danish Sugar Factories Inc.)的Amicon超濾室中濃縮。
通過(guò)使用上述構(gòu)建和發(fā)酵技術(shù)，和上面的分離步驟，產(chǎn)生和分離了具有SEQ ID NO2中給出的氨基酸序列的新的枯草桿菌酶。
實(shí)施例2-“標(biāo)準(zhǔn)的洗滌劑洗滌性能試驗(yàn)”
為評(píng)估枯草桿菌酶在標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑組合物中的洗滌性能，用下述的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)洗滌實(shí)驗(yàn)
所述的標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑的組分如下
通過(guò)添加HCl或NaOH將洗滌劑溶液的pH調(diào)節(jié)到10.1。通過(guò)添加CaCl2和MgCl2(Ca2+∶Mg2+＝4∶1)將水硬度調(diào)節(jié)到15°dH。洗滌后將織物用自來(lái)水沖洗并于空氣中干燥。
對(duì)試驗(yàn)材料反射能力(R枯草桿菌酶)的測(cè)定是用Macbeth ColorEye 7000光度計(jì)(Macbeth，Division of Kollmorgen Instruments Corporation，德國(guó))在460nm下進(jìn)行的。測(cè)定方法依制造商的建議進(jìn)行。
為確定空白值，進(jìn)行了不添加酶的類似洗滌實(shí)驗(yàn)。接下來(lái)如上述進(jìn)行反射能力(R空白)的測(cè)定。
然后如上所述進(jìn)行參考實(shí)驗(yàn)，其中測(cè)定了Savinase的洗滌性能。接下來(lái)，如上所述測(cè)定了反射能力(Rsavinase)。
所述的洗滌性能是用根據(jù)下述公式定義的性能因子(P)進(jìn)行評(píng)估的
P＝(R枯草桿菌酶-R空白)-(Rsavinase-R空白)
＝R枯草桿菌酶-Rsavinase
實(shí)施例3-完整規(guī)模自動(dòng)盤洗滌(ADW)試驗(yàn)
以家用盤洗滌組合物使用標(biāo)準(zhǔn)條件試驗(yàn)了本發(fā)明的枯草桿菌酶在完整規(guī)模ADW中的性能。所用的污漬是涂在鋼盤上的卵/奶混合物。此外，加入含有多種食物的穩(wěn)定污漬(ballast soil)。
實(shí)例
洗滌程序
使用自來(lái)水；應(yīng)用下面的步驟
1)在所指示的時(shí)間間隔期間加熱自來(lái)水。
2)加熱自來(lái)水時(shí)的最后溫度。
用于完整規(guī)模ADW試驗(yàn)的卵/奶弄臟
材料
220ml全脂奶
15個(gè)卵，中等大小
鋼盤，直徑18cm
將盤洗滌組合物在微波爐中以85℃加熱5分鐘以失活組合物中的酶活性。
鋼盤的弄臟
將220ml全脂奶與15個(gè)生卵在Braun UK 20廚房機(jī)器中混合2分鐘。過(guò)濾后，通過(guò)浸沒在混合物中將不銹鋼盤弄臟。
將盤子以直立位置在室溫中干燥過(guò)夜。然后將干燥的盤子在120℃加熱45分鐘以便變性表面上的蛋白質(zhì)。
用于完整規(guī)模ADW試驗(yàn)的卵黃弄臟
材料
3dL巴氏消毒的卵黃。
鋼盤，直徑18cm
將盤洗滌組合物在微波爐中以85℃加熱5分鐘以失活組合物中的酶活性。
鋼盤的弄臟
在精確到3位小數(shù)的天平上對(duì)鋼盤稱重。
約3dL巴氏消毒的卵黃充分混合并通過(guò)廚房篩過(guò)濾。
將卵黃液在盤子上滾上一薄層，例如，使用油漆滾筒。進(jìn)行兩次(兩次滾動(dòng)期間不干燥，并且第二次也將滾筒浸泡在卵黃中)。
所得卵黃層應(yīng)該約1g。
將盤子放置在室溫干燥最少4小時(shí)。
然后將弄臟的盤子和支架下降到煮沸去礦物質(zhì)水中恰好30秒。
將盤子在室溫放置干燥30分鐘。
室溫干燥后，將盤子在烘箱中80℃干燥30分鐘。
將盤子在室溫冷卻30-60分鐘，之后將它們?cè)俅畏Q重。
洗滌和室溫下干燥時(shí)，將盤子在烘箱中80℃干燥30分鐘。
再次在室溫冷卻30-60分鐘后將盤子稱重。
ADW實(shí)驗(yàn)
對(duì)于每次實(shí)驗(yàn)，根據(jù)上面所列條件洗滌10個(gè)弄臟的盤子。除了弄臟的盤子，機(jī)器還裝有10個(gè)瓷盤、4個(gè)玻璃杯、4個(gè)茶杯和16副刀具。
此外，將50g穩(wěn)定漿液(ballast slurry)加入到機(jī)器。漿液的成分如下制作3000g，并且稱出下面的組分
1.將人造奶油、豬油和油炸油在低溫熔解。之后在良好攪拌下加入篩過(guò)的肉湯粉并冷卻到40℃。
2.混合油菜籽油和卵。
3.向油/卵物質(zhì)加入調(diào)味蕃茄醬和芥末，然后混合5分鐘。
4.將1)中產(chǎn)生的脂肪/肉湯(冷卻)緩慢加入到3)中產(chǎn)生的混合物并繼續(xù)混合5分鐘。
5.向混合物加入高脂肪乳脂和全脂奶并混合5分鐘。
6.加入最后的面粉和粉末(表中步驟5)。將穩(wěn)定漿液混合成光滑物質(zhì)。
7.稱出50g穩(wěn)定漿液。
卵/奶的測(cè)量和計(jì)算
使用Minolta Chroma Meter(型號(hào)CR-300)在6個(gè)不同位置測(cè)量光反射值(R值)。在干凈盤子(R干凈)上、加熱后臟盤子(R臟)上和洗滌后盤子(R洗滌后)上進(jìn)行測(cè)量。
根據(jù)下面的公式計(jì)算除去的蛋白質(zhì)膜(％RPF)
％RPF＝100％×(R洗滌后-R臟)/(R干凈-R臟)
卵/奶的測(cè)量和計(jì)算
性能數(shù)據(jù)來(lái)自干凈的、臟的和洗滌的鋼盤的重力測(cè)量。性能計(jì)算為
數(shù)據(jù)分析
將％RPF擬合為所加入的mg酶蛋白的函數(shù)。
將該數(shù)據(jù)擬合四參數(shù)邏輯斯諦模型，其可以寫做
F(z)＝Y(jié)0+Vmax*Cλ(ksλ+Cλ)
其中F(z)為從作為截距的Y0計(jì)算的響應(yīng)值，Y0+Vmax為最大響應(yīng)，C為酶劑量，Ks為半飽和值。λ為陡度參數(shù)，其在米氏(Michaelis-Menten)模型中為1，但是在這里它等于或不等于1，因?yàn)槲覀冊(cè)试S擬合S形曲線。
將每個(gè)曲線擬合與參照酶的性能比較。
實(shí)施例4小規(guī)模自動(dòng)盤洗滌(ADW小洗滌)
ADW小洗滌描述
小洗滌開發(fā)為計(jì)算機(jī)化機(jī)器人。每個(gè)機(jī)器人攜帶具有8個(gè)支架的框架。每個(gè)支架含有將要弄臟和洗滌的6個(gè)35×45mm鋼盤。如果需要，6個(gè)位置可以代表劑量范圍中的6個(gè)點(diǎn)，例如，如下文所示的0-20-40-75-100-160nM酶。一個(gè)洗滌單位由分別為卵黃和卵/奶弄臟的兩個(gè)盤和具有150ml wash float的恒溫容器組成。機(jī)器人一次對(duì)24個(gè)容器進(jìn)行操作。
如所提到的，對(duì)于待測(cè)的每種酶需要兩個(gè)支架，一個(gè)支架用卵黃弄臟，另一個(gè)用卵/奶弄臟。在每一次試驗(yàn)中包括參考酶，并且每種酶劑量重復(fù)兩次。
設(shè)置在圖2中示意性描繪。
如下制備卵/奶污漬
將10個(gè)卵和167ml奶在食物處理器中低速混合2分鐘。混合物在使用前通過(guò)一次性布過(guò)濾。將支架安裝兩個(gè)小盤子并浸入過(guò)濾的污漬中。將盤子直立在吸收性桌布上。將它們放置干燥4小時(shí)或者直到第二天，將它們通過(guò)在熱空氣烘箱中以120℃熱處理變性35分鐘。
如下制備卵黃污漬
將20個(gè)卵黃～400ml巴氏消毒的給養(yǎng)(catering)卵黃(～420g)+167ml去離子水在食物處理器中以最低速混合2分鐘，然后在使用前通過(guò)一次性布過(guò)濾。將支架安裝兩個(gè)小盤子并浸入過(guò)濾的污漬中。將盤子直立在吸收性桌布上。將它們放置干燥4小時(shí)或者直到第二天，然后將它們?cè)诜兴凶冃?0秒。變性后，將盤子在熱空氣烘箱中以80℃熱處理變性30分鐘。
洗滌劑
通過(guò)在市場(chǎng)上購(gòu)買完全配制的商業(yè)洗滌劑并隨后通過(guò)熱處理(85℃水溶液中5分鐘)使酶組分失活可以得到用于本發(fā)明的改組蛋白酶的洗滌性能試驗(yàn)的洗滌劑。此外，沒有酶的商業(yè)洗滌劑基質(zhì)可以直接從生產(chǎn)商購(gòu)買。此外，可以購(gòu)買適宜的標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑并用于洗滌性能試驗(yàn)。
可以在標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑組合物中測(cè)試蛋白酶，所述洗滌劑含有
洗滌floats通過(guò)將CaCl2、MgSO4和NaHCO3、去離子水混合以配制多種水硬度值來(lái)制備。加入洗滌劑18-25g/4L。
評(píng)估
性能數(shù)據(jù)來(lái)自干凈的、臟的和洗滌的鋼盤的重力測(cè)量。性能計(jì)算為
數(shù)據(jù)分析
將％RPF擬合為所加入的mg酶蛋白的函數(shù)。
將該數(shù)據(jù)擬合四參數(shù)邏輯斯諦模型，其可以寫做
F(z)＝Y(jié)0+Vmax*Cλ(ksλ+Cλ)
其中F(z)為從作為截距的Y0計(jì)算的響應(yīng)值，Y0+Vmax為最大響應(yīng)，C為酶劑量，Ks為半飽和值。λ為陡度參數(shù)，其在米氏(Michaelis-Menten)模型中為1，但是在這里它等于或不等于1，因?yàn)槲覀冊(cè)试S擬合S形曲線。將每個(gè)曲線擬合與參考酶的性能相比較。
使用上面對(duì)卵黃污漬的試驗(yàn)方法，得到了圖3中所示結(jié)果(％RPF為mg酶蛋白的函數(shù))。如所看到的，本發(fā)明的枯草桿菌酶與SEQ IDNO6(稱作PH004)相比顯示出對(duì)卵污漬的改進(jìn)的洗滌性能。
實(shí)施例5自動(dòng)化機(jī)械壓力測(cè)定(AMSA)
AMSA試驗(yàn)方法描述
進(jìn)行洗滌實(shí)驗(yàn)以評(píng)估洗滌組合物中所選改組蛋白酶變體的洗滌性能。使用自動(dòng)機(jī)械壓力測(cè)定(AMSA)測(cè)試本申請(qǐng)的蛋白酶。使用AMSA，可以檢查大量小體積酶洗滌劑溶液的洗滌性能。AMSA盤具有許多用于試驗(yàn)溶液的縫和蓋子，蓋子將待洗滌的織物樣品對(duì)所有縫開口強(qiáng)力擠壓。在洗滌時(shí)間期間，盤子、試驗(yàn)溶液、織物和蓋子劇烈振動(dòng)從而使受試溶液與織物接觸并以規(guī)則、周期性擺動(dòng)方式應(yīng)用機(jī)械壓力。關(guān)于進(jìn)一步描述見WO 02/42740，特別是第23-24頁(yè)的“特定方法實(shí)施方案”段落。
在下面的特定實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
通過(guò)向試驗(yàn)系統(tǒng)加入CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+∶Mg2+＝4∶1)調(diào)節(jié)水硬度。洗滌后，將織物用自來(lái)水沖洗并干燥。
酶變體的性能測(cè)量為用該特定蛋白酶洗滌的織物樣品的顏色的亮度。亮度也可以表達(dá)為當(dāng)用白光照亮?xí)r從織物樣品反射的光的強(qiáng)度。當(dāng)織物受到污染時(shí)，反射光的強(qiáng)度低于干凈織物的強(qiáng)度。因此，反射光的強(qiáng)度可用于測(cè)量改組蛋白酶的洗滌性能。
使用專業(yè)平板掃描儀(PFU DL2400pro，可以從J.M.Thomsen，Dorfgade 2，Dorf，Dronninglund，DK-9330得到)測(cè)色，該掃描儀用于捕獲洗滌的織物樣品的圖像。該掃描儀可以具有200dpi的分辨率并輸出24位的輸出色深(color depth)。為了得到準(zhǔn)確結(jié)果，經(jīng)常用Kodakreflective IT8 target校準(zhǔn)掃描儀。
為了從掃描的圖像提取光強(qiáng)度值，使用專門設(shè)計(jì)的軟件應(yīng)用程序(Novozymes Color Vector Analyzer)。該程序從圖像接受24位象素值并將它們轉(zhuǎn)化成紅、綠和藍(lán)色(RGB)的值。通過(guò)將RGB值作為向量相加并考慮所得向量的長(zhǎng)度可以計(jì)算強(qiáng)度值(Int)
洗滌劑
通過(guò)在市場(chǎng)上購(gòu)買完全配制的商業(yè)洗滌劑并隨后通過(guò)熱處理(85℃水溶液中5分鐘)使酶組分失活可以得到用于本發(fā)明的改組蛋白酶的洗滌性能試驗(yàn)的洗滌劑。此外，沒有酶的商業(yè)洗滌劑基質(zhì)可以直接從生產(chǎn)商購(gòu)買。此外，可以購(gòu)買適宜的標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑并用于洗滌性能試驗(yàn)。
可以在標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑組合物中測(cè)試蛋白酶，所述洗滌劑組合物含有
織物
從wfk-Cleaning Technology Research Institute，Christenfeld 10，D-41379 Brüggen-Bracht，德國(guó)可以得到標(biāo)準(zhǔn)織物。特別是wfk10N(用卵/色素污染的棉織物)、wfk10eggEG(用卵黃污染的棉織物)型。在高壓滅菌鍋中進(jìn)行wfk10N的變性。
使用上面的試驗(yàn)方法聯(lián)合通過(guò)商業(yè)途徑可得到的洗滌劑，得到了圖4中顯示的結(jié)果?？梢钥吹剑景l(fā)明的枯草桿菌酶與SEQ ID NO6的蛋白酶(稱作PH004)相比顯示出對(duì)卵污漬的改進(jìn)的洗滌性能。
生物材料的保藏
下面的生物材料已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德國(guó)不倫瑞克的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig)，其具有下面的保藏號(hào)
序列表
<110>諾和酶股份有限公司
麥克西根公司
<120>枯草桿菌酶
<130>10414.003-US
<160>6
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>807
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>通過(guò)DNA改組制備
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(807)
<223>通過(guò)DNA改組制備
<400>1
gcg caa tcg gta cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc cca gct gcc 48
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
cat aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat 96
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
aca ggg ata tcc act cat cca gat cta aat att cgt ggt ggc gca agc144
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
ttt gta cca ggg gaa ccg tcg act caa gat ggg aac ggg cat ggg acg192
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
cac gtt gca gga acg att gcg gct ctt gat aat tca atc ggt gtg att240
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Ser Ile Gly Val Ile
65 70 75 80
ggt gtg gca cca agt gct gat cta tac gct gta aaa gta ctt gga gca288
Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
aat ggt aga gga agc gtt agt gga att gct caa ggt cta gag tgg gct336
Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
gca gcg aat aac atg cat att gct aac atg agt ctc ggt agt gat gca384
Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala
115 120 125
cct agt act aca ctt gag cgt gca gtc aac tac gcg aca agc caa ggt432
Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly
130 135 140
gta cta gtt att gca gcg act ggt aac aac ggt tct ggt tca gtt ggc480
Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
tat cct gct cgt tat gca aac gca atg gct gta gga gcg act gac caa528
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
aac aac aga cgt gca aac ttt tct cag tac ggt aca gga att gac atc576
Asn Asn Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile
180 185 190
gta gca cct gga gtt aac gta caa agt acg tat cca gga aac cgt tat624
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr
195 200 205
gtg agt atg aat ggt aca tct atg gcc act cca cac gtc gcc ggc gtc672
Val Ser Met Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val
210 215 220
gcc gcc ctt gtt aaa caa aag aac cca tct tgg tct aat gta caa att720
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
cga aat cat cta aag aat acg gca act agt tta gga agc acg aac ttg768
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
tat gga agc gga ctt gtt aac gca gaa gcg gca acg cgt807
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210>2
<211>269
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成構(gòu)建體
<400>2
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Ser Ile Gly Val Ile
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala
115 120 125
Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly
130 135 140
Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr
195 200 205
Val Ser Met Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210>3
<211>807
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>通過(guò)DNA改組制備
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(807)
<223>通過(guò)DNA改組制備
<400>3
gcg caa tcg gta cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc cca gct gcc 48
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly lle Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
cat aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat 96
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
aca ggg ata tcc act cat cca gat cta aat att cgt ggt ggc gca agc144
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
ttt gta cca ggg gaa ccg tcg act caa gat ggg aat ggg cac ggg acg192
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly Hi s Gly Thr
50 55 60
cac gtt gca gga aca gtg gca gct ctt aat aat tca atc ggt gtg att240
His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile
65 70 75 80
ggt gtg gca cca agt gct gat cta tac gct gta aaa gta ctt gga gca288
Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
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Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
gca gcg aat aac atg cat att gct aac atg agt ctc ggt agt gat gca384
Ala A1a Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala
115 120 125
cct agt act aca ctt gag cgt gca gtc aac tac gcg aca agc caa ggt432
Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly
130 135 140
gta cta gtt att gca gcg act ggt aac aac ggt tcc ggt tca gta ggc480
Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
tat ccg gcc cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga gct act gat cga528
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
aac aac aac cgc gct agc ttt tca cag tat ggc gca ggc ctt gac att576
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
gtc gca ccc ggg gta aac gtg cag agc aca tac cca ggt tca aca tat624
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
gcc agc tta aac ggt aca tcg atg gct act cct cat gtt gca ggt gcg672
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
gcc gcc ctt gtt aaa caa aag aac cca tct tgg tct aat gta caa att720
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
cga aat cat cta aag aat acg gca act agt tta gga agc acg aac ttg768
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
tat gga agc gga ctt gtt aac gca gaa gcg gca acg cgt807
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210>4
<211>269
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成構(gòu)建體
<400>4
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala
115 120 125
Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly
130 135 140
Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210>5
<211>275
<212>PRT
<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>5
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Ash Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275
<210>6
<211>269
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>通過(guò)DNA改組制備
<400>6
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
l 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala
115 120 125
Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly
130 135 140
Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Glu Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Ser Tyr
195 200 205
Asp Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 26權(quán)利要求
1.枯草桿菌酶，其選自
(a)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1到269所示氨基酸序列具有99.26％以上同一性；或
(b)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)MT173 DSM15575中存在的質(zhì)粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有99.26％以上同一性的所述枯草桿菌酶的變體；或
(c)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO4的氨基酸1到269所示氨基酸序列具有97.40％以上同一性；或
(d)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質(zhì)粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有97.40％以上同一性的所述枯草桿菌酶的變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的枯草桿菌酶，其具有
I)與1a)或者1b)中描述的氨基酸序列具有99.26％以上，或者99.63％以上同一性的氨基酸序列；或者
II)與1c)或者1d)中描述的氨基酸序列具有97.40％以上，或者97.77％以上，或者98.14％以上，或者98.51％以上，或者98.89％以上，或者99.26％以上，或者99.63％以上同一性的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的枯草桿菌酶，其由SEQ ID NO2的氨基酸1到269所示氨基酸序列組成，或者由SEQ ID NO4的氨基酸1到269所示氨基酸序列組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的枯草桿菌酶，其具有
I)與克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質(zhì)粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶具有99.26％以上，或者99.63％以上同一性的氨基酸序列；或者
II)與克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質(zhì)粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶具有97.40％以上，或者97.77％以上，或者98.14％以上，或者98.51％以上，或者98.89％以上，或者99.26％以上，或者99.63％以上同一性的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的枯草桿菌酶，其由
I)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質(zhì)粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶；或
II)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質(zhì)粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶組成。
6.前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是
I)具有如SEQ ID NO2的氨基酸1到269所示氨基酸序列的枯草桿菌酶變體，其含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、缺失和/或插入；或
II)具有如SEQ ID NO4的氨基酸1到269所示氨基酸序列的枯草桿菌酶變體，其含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、缺失和/或插入。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的枯草桿菌酶，其含有如下位置之一的至少一種修飾27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(BASBPN編號(hào))。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的枯草桿菌酶，其中所述修飾選自K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K和T274A(BASBPN編號(hào))。
9.分離的多核苷酸，其含有編碼權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)中定義的枯草桿菌酶的多核苷酸。
10.分離的多核苷酸，其編碼枯草桿菌酶，所述多核苷酸選自
(a)與SEQ ID NO1的核苷酸1到807所示多核苷酸具有至少88％同一性的多核苷酸；或
(b)已經(jīng)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質(zhì)粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88％同一性的變體，
(c)與SEQ ID NO1的核苷酸1到807所示多核苷酸具有至少88％同一性的多核苷酸；或
(d)已經(jīng)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質(zhì)粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88％同一性的變體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的多核苷酸，其具有
I)與SEQ ID NO1的核苷酸1到807所示的多核苷酸具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；或
II)與SEQ ID NO3的核苷酸1到807所示的多核苷酸具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的多核苷酸，其具有
I)與已經(jīng)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質(zhì)粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；或
II)與已經(jīng)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質(zhì)粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
13.核酸構(gòu)建體，其含有權(quán)利要求9-12任意一項(xiàng)的核酸序列，所述核酸序列與指導(dǎo)枯草桿菌酶在適宜宿主中表達(dá)的一種或多種控制序列有效連接。
14.重組表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。
15.重組宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌，優(yōu)選芽孢桿菌屬，特別是遲緩芽孢桿菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其是真菌或酵母，優(yōu)選絲狀真菌，特別是曲霉屬。
18.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶的方法，該方法包括
(a)在有助于產(chǎn)生枯草桿菌酶的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求15-17任意一項(xiàng)中定義的重組宿主細(xì)胞；和
(b)回收枯草桿菌酶。
19.清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選洗衣或洗盤組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其還含有纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、其他蛋白酶、淀粉酶或者它們的混合物。
21.權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)中定義的枯草桿菌酶的用途，用于清潔或洗滌劑組合物中。
22.權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)中定義的枯草桿菌酶的用途，用于除去卵污漬。
23.權(quán)利要求19-20任意一項(xiàng)中定義的清潔或洗滌劑組合物的用途，用于除去卵污漬。
24.清潔或盤洗滌的、洗滌硬表面或者衣物的方法，所述方法包括將硬表面或者衣物與權(quán)利要求19-20中定義的組合物接觸。
25.從硬表面或者衣物除去卵污漬的方法，所述方法包括將含有卵污漬的硬表面或者含有卵污漬的衣物與權(quán)利要求19-20中定義的組合物接觸。
全文摘要
對(duì)卵污漬具有改良的洗滌性能的新的枯草桿菌酶。這些枯草桿菌酶當(dāng)用于例如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣組合物和洗盤組合物，包括自動(dòng)洗盤組合物中時(shí)對(duì)卵污漬具有優(yōu)秀的或者改進(jìn)的洗滌性能。
文檔編號(hào)C12N15/57GK1784490SQ20048001189
公開日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月7日
發(fā)明者S·米寧, J·C·F·克內(nèi)澤, N·H·澤倫森, J·E·內(nèi)斯, M·D·韋爾奇, L·J·吉韋爾, J·徹麗, T·維德爾博爾歇特, J·S·米舒爾 申請(qǐng)人:諾和酶股份有限公司, 麥克西根公司