專利名稱：用于診斷和治療哮喘或者其他變應(yīng)性或炎性疾病的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷或治療哮喘或者其他變應(yīng)性或炎性痰病的組合物和方法。
背景哮喘是呼吸道的慢性炎癥痰病，其特征是可逆的呼吸道阻塞的反復(fù)發(fā)作和呼吸道高反應(yīng)性(AHR)。一般的臨床表現(xiàn)包括氣促、喘息、咳嗽和胸悶，其可以變成危險生命的或者致命的。盡管現(xiàn)有療法集中在減輕癥狀性支氣管痙攣和肺部炎癥，但越來越了解長期呼吸道重塑在哮喘中加速的肺惡化中的作用。呼吸道重塑指許多病理學(xué)特征，包括上皮平滑肌和肌成纖維細(xì)胞增生和/或組織轉(zhuǎn)化、上皮下纖維化和基質(zhì)沉積。對于致命性哮喘，這些過程共同導(dǎo)致呼吸道最多約300％的增厚。盡管在闡明哮喘的病理生理學(xué)中已經(jīng)取得了巨大進(jìn)步，但是在過去20年中該疾病的流行、發(fā)病率和死亡率已經(jīng)增加了。1995年，僅在美國就有接近一百八十萬例急診室就診，466,000例住院，和5,429例死亡直接歸因于哮喘。
通常認(rèn)為變應(yīng)性哮喘由對空氣傳播的變應(yīng)原的不適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)引起。哮喘患者的肺表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的大量浸潤。大量證據(jù)已經(jīng)證明該免疫應(yīng)答由表達(dá)TH2細(xì)胞因子譜(profile)的CD4+T細(xì)胞驅(qū)動。哮喘的一種鼠模型包括動物對卵清蛋白(OVA)的敏化，然后氣管內(nèi)遞送OVA攻擊。該方法在小鼠肺中產(chǎn)生TH2免疫反應(yīng)并模擬在人類哮喘中看到的四種主要病理生理應(yīng)答，包括上調(diào)的血清IgE(特應(yīng)性)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、粘液分泌過多和AHR。嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子IL-13在小鼠肺中針對OVA的炎癥應(yīng)答中起重要作用。直接肺滴注鼠IL-13引起所有四種哮喘相關(guān)的病理，并且相反地，可溶性IL-13拮抗劑(sIL-13Rα2-Fc)的存在完全阻斷OVA-攻擊誘導(dǎo)的杯形細(xì)胞粘液合成和針對乙酰膽堿的AHR。從而，IL-13介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)足夠引起所有四種哮喘相關(guān)的病理生理表型并且是小鼠模型中粘液的過多分泌和誘導(dǎo)AHR所需的。
生物活性IL-13特異結(jié)合低親和性結(jié)合鏈IL-13Rα1和由IL-13Rα1與IL-4R組成的高親和性多聚體復(fù)合體，所述IL-4R是IL-4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體的共同組分。高親和性復(fù)合體在多種細(xì)胞型中表達(dá)，所述細(xì)胞型包括單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞群體、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、呼吸道平滑肌和呼吸道上皮細(xì)胞。功能受體復(fù)合體的IL-13介導(dǎo)的連接導(dǎo)致JAK1和JAK2或者Tyk-2激酶和IRS1/2蛋白的依賴磷酸化的活化。IL-13途徑級聯(lián)的活化觸發(fā)轉(zhuǎn)錄激活物Stat6的募集、磷酸化和最終核轉(zhuǎn)運。許多生理學(xué)研究表明肺OVA攻擊不能引起主要病理學(xué)相關(guān)表型，包括Stat6-/-無效等位基因純合的小鼠中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、粘液分泌過多和呼吸道高反應(yīng)性。最近的遺傳學(xué)研究已經(jīng)表明IL-13及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分的特定人等位基因與哮喘和特應(yīng)性之間連鎖，表明該途徑在該人類疾病中的關(guān)鍵作用。
IL-13也結(jié)合人和小鼠中表達(dá)的其他尚未確定生物學(xué)功能的受體鏈IL-13Rα2。鼠IL-13Rα2以比IL-13Rα1高大約100倍的親和力(Kd為0.5到1.2nM)結(jié)合IL-13，使得能夠構(gòu)建強的可溶性IL-13拮抗劑sIL-13Rα2-Fc。sIL-13Rα2-Fc已經(jīng)用作多種痰病模型中的拮抗劑以闡明IL-13在血吸蟲病誘導(dǎo)的肝臟纖維化和肉芽腫形成、腫瘤免疫監(jiān)視，以及OVA-攻擊哮喘模型中的作用。
慢性阻塞性肺病(COPD)是總括性術(shù)語，其用于描述主要與肺氣腫和慢性支氣管炎相關(guān)的氣流阻塞。肺氣腫通過使肺內(nèi)氣囊衰弱和破裂導(dǎo)致不可逆的肺損傷。結(jié)果，肺組織的彈性喪失，導(dǎo)致發(fā)生呼吸道萎陷和氣流阻塞。慢性支氣管炎是在肺內(nèi)的較小的呼吸道中開始并且逐漸發(fā)展到更大呼吸道的炎性痰病。其增加呼吸道中的粘液和支氣管中的細(xì)菌感染，它們又可以阻礙氣流。
COPD侵襲數(shù)千萬美國人并且是美國的嚴(yán)重健康問題。1998年的流行率調(diào)查表明3百萬美國人已經(jīng)診斷為肺氣腫和9百萬受到慢性支氣管炎的侵襲。1998年COPD是美國第四位主要死亡原因，并且在1998年導(dǎo)致112,584例死亡。1998年COPD還占估計的668,362例出院病例。
當(dāng)前對哮喘和COPD的治療包括使用支氣管擴張藥、皮質(zhì)類固醇和白三烯抑制劑。這些治療具有相同的治療目標(biāo)，即支氣管擴張、減輕炎癥，和促進(jìn)咳痰。然而，許多這些治療包括不希望的副作用和使用一段時間后失去有效性。此外，僅僅有限的治療干預(yù)試劑可用于減小哮喘患者中發(fā)生的呼吸道重塑過程。因此，仍然需要增加對哮喘和COPD在分子水平上的了解，還需要鑒定新的治療策略以抵抗這些復(fù)雜的痰病。
發(fā)明概述本發(fā)明鑒定了與非哮喘肺組織相比在哮喘肺組織中差異表達(dá)的多種基因。所鑒定的基因包括精氨酸代謝途徑的成員，如陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白2基因(CAT2)和精氨酸酶I型基因(ARG1)。這些基因是治療哮喘或其他變應(yīng)性或炎性疾病的潛在藥物靶。
一方面，本發(fā)明提供了治療變應(yīng)性或炎性痰病的方法。這些方法包括對患有變應(yīng)性或炎性疾病的哺乳動物施用治療有效量的試劑，其中所述試劑抑制所述疾病侵襲的組織中精氨酸代謝途徑的組分的活性或者表達(dá)。所述受抑制的組分不是氧化氮合酶(NOS)。在許多實施方案中，受抑制的組分是精氨酸酶(例如，I型精氨酸酶)或者其下游蛋白。下游蛋白的實例包括，但不限于，鳥氨酸脫羧酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、亞精胺合酶和精胺合酶。在一個實例中，還可以抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶，其參與多胺的生物合成。在另一實施方案中，受抑制的組分是陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(例如，陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白2)。
適用于本發(fā)明的變應(yīng)性或者炎性痰病包括，但不限于，哮喘、呼吸道高反應(yīng)性、慢性呼吸道重塑、慢性阻塞性肺病(COPD)和關(guān)節(jié)炎。與精氨酸代謝中功能障礙或者異常有關(guān)的其他疾病也可以由本發(fā)明治療。在許多實施方案中，變應(yīng)性或者炎性痰病為呼吸痰病。施用本發(fā)明的治療劑抑制肺組織中精氨酸代謝途徑組分的活性或者表達(dá)，從而改善或者消除與所述疾病有關(guān)的綜合征。
適于本發(fā)明的治療劑包括但不限于，能夠通過RNA干涉或者反義機制抑制靶組分表達(dá)的多核苷酸、與靶組分反應(yīng)的抗體、靶組分的生物功能的抑制劑或者可以結(jié)合靶組分或者編碼靶組分的多核苷酸(例如，mRNA或者基因組序列，包括3’或者5’非翻譯的調(diào)節(jié)序列)的其他調(diào)節(jié)劑。在許多實施方案中，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平或者翻譯后水平抑制活性或者表達(dá)。在許多其他實施方案中，抑制劑可以使靶組分的活性或者表達(dá)與最初活性或者表達(dá)水平相比減少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或以上。
在一個實施方案中，本發(fā)明的治療劑編碼或者含有針對CAT2、ARG1的siRNA序列，或者編碼精氨酸酶的下游組分的其他基因。在另一實施方案中，治療劑從基因治療載體表達(dá)。在許多實例中，基因治療載體處于組織或者細(xì)胞特異啟動子的控制下。在一個實例中，啟動子是肺特異的。肺特異的啟動子的實例包括，但不限于，肺上皮細(xì)胞特異的表面活性劑蛋白B基因啟動子和克拉拉(Clara)細(xì)胞特異的啟動子CC10。在另一實例中，啟動子為單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞特異的。巨噬細(xì)胞特異的啟動子的實例包括，但不限于，人乙酰基-LDL受體(SRA)基因的近側(cè)啟動子和Ross等人，J.Biol.Chem.，2736662-6669，1998中描述的那些啟動子。
在再一個實施方案中，本發(fā)明的治療劑選自賴氨酸、聚-L-賴氨酸、聚-L-精氨酸或者可以抑制陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的其他陽離子多肽。在另一實施方案中，治療劑為α-二氟甲基鳥氨酸，其抑制鳥氨酸脫羧酶的功能。在再一個實施方案中，治療劑為IL-13拮抗劑或者拮抗性抗-IL-13抗體。在一個實例中，治療劑為可溶性IL-13受體。
可以配制本發(fā)明的治療劑以與它們計劃的施用途徑相容。施用途徑的實例包括，但不限于，腸胃外、經(jīng)腸和局部施用。例如，本發(fā)明的治療劑可以經(jīng)皮內(nèi)、上表皮(epicutaneous)、吸入、經(jīng)口、直腸、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)皮、跨粘膜或者其他適宜的途徑施用。在一個實施方案中，通過吸入施用治療劑。例如，治療劑可以以來自含有適宜的推進(jìn)劑(例如，二氧化碳)的受壓容器或者分配器或者噴霧器的氣溶膠噴霧的形式遞送。
在一個實施方案中，所治療的哺乳動物是患有哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性疾病的人。
在另一方面，本發(fā)明提供了可用于鑒定或者評估治療哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性疾病的藥物的方法。所述方法包括將候選分子與受哮喘或者另一種變應(yīng)性或者炎性疾病侵襲的組織接觸，并確定所述候選分子是否能夠改善或者消除該組織中的疾病綜合征或者表型。候選分子抑制所述組織中精氨酸代謝途徑的非-NOS組分的活性或表達(dá)。示例性非-NOS組分包括，但不限于，精氨酸酶或者陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白。適于用于本發(fā)明的組織包括，但不限于，所述疾病的動物模型中的組織/細(xì)胞、從該痰病的動物模型分離的組織/細(xì)胞，或者模擬疾病侵襲的組織/細(xì)胞的某些方面(例如，表達(dá)譜)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一個實例中，通過人臨床試驗評估候選分子的療效。
在一個實施方案中，根據(jù)基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計選擇或者產(chǎn)生候選分子。鑒定了能夠與精氨酸代謝途徑的非-NOS組分相互作用的分子。然后將這些分子與受哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性疾病侵襲的組織接觸以確定它們是否改善或者消除疾病綜合征或者表型。在另一實施方案中，用高通量篩選方法或者化合物文庫鑒定候選藥物。
本發(fā)明還描述了用于檢測、診斷或者監(jiān)控哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性痰病的方法。這些方法包括檢測哺乳動物生物樣品中至少一種基因的表達(dá)譜，并將該表達(dá)譜與該基因的參考表達(dá)譜比較以確定該哺乳動物是否患有或者有危險患有變應(yīng)性或者炎性疾病。在許多情況中，所述基因編碼精氨酸代謝途徑的非NOS組分。
在一個實施方案中，變應(yīng)性或者炎性疾病是哮喘或者COPD。所述生物樣品可以是肺樣品。還可以使用粘液、血液或者其他類型的樣品。在另一實施方案中，參考表達(dá)譜是無疾病的組織中精氨酸代謝基因的平均表達(dá)譜。參考表達(dá)譜還可以是受痰病侵襲的組織中精氨酸代謝基因的表達(dá)譜。在再一個實施方案中，精氨酸代謝基因選自ARG1或者CAT2。用于檢測或者診斷哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性疾病的材料可以包括在試劑盒中。
在再一方面，本發(fā)明提供了可用于治療哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性痰病的藥物組合物。所述藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體和治療有效量的一種試劑，所述試劑能夠抑制精氨酸代謝途徑的非NOS組分的活性或者表達(dá)。在許多實施方案中，所述試劑結(jié)合非NOS組分，或者編碼該非NOS組分的多核苷酸。在一個實例中，非NOS組分由ARG1或者CAT2編碼。
根據(jù)下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。所述詳細(xì)描述和特定實例盡管指出優(yōu)選的實施方案，但是僅僅為了闡明給出，因為根據(jù)該詳細(xì)描述可以得到本發(fā)明范圍內(nèi)的許多改變和修飾，這些改變和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。此外，這些實例闡明本發(fā)明的原理并且不應(yīng)該期望具體闡明本發(fā)明應(yīng)用于感染的所有實例，其中其顯然對于現(xiàn)有技術(shù)中技術(shù)人員是有用的。
附圖簡述提供附圖用于闡明而不是限制。本申請將2004年3月4日提交的名稱為“Compositions and Methods for Diagnosing and TreatingAsthma or other Allergic or Inflammatory Diseases”的美國專利申請(Michael R.Bowman，等人)的

圖1、6、8和9并入作為參考。
圖1是圖解表示，其表明通過變應(yīng)原(OVA)和重組鼠IL-13(IL-13)在Balb/c小鼠中共誘導(dǎo)CAT2和I型精氨酸酶(ARG1)。簡言之，通過在第0天腹膜內(nèi)注射使Balb/c小鼠對OVA敏化，通過在第14和25天氣管內(nèi)(IT)注射載體(磷酸緩沖鹽水(PBS))或者OVA進(jìn)行攻擊，并在第28天收獲肺。此外，將首次用于試驗的Balb/c小鼠用PBS或者IL-13氣管內(nèi)連續(xù)處理3天，并在第72小時收獲肺。如實施例1所述，分離總肺RNA并用GeneChip技術(shù)(Affymetrix)分析mRNA表達(dá)。mRNA頻率表達(dá)為百萬分之幾。
圖2是圖解表示，其表明通過變應(yīng)原(OVA)和重組鼠IL-13(IL-13)在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)ARG1表達(dá)。簡言之，通過在第0天腹膜內(nèi)注射使Balb/c小鼠對OVA敏化，通過在第14和25天氣管內(nèi)(IT)注射載體(磷酸緩沖鹽水(PBS))或者OVA進(jìn)行攻擊，并在第28天收獲肺。此外，將首次用于試驗的Balb/c小鼠用PBS或者IL-13氣管內(nèi)連續(xù)處理3天，并在第72小時收獲肺。如實施例1所述，分離總肺RNA并用GeneChip技術(shù)(Affymetrix)分析mRNA表達(dá)。mRNA頻率表達(dá)為百萬分之幾。
圖3是圖解表示，其表明通過OVA或者腺病毒介導(dǎo)的IL-13表達(dá)在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)ARG1基因。簡言之，在第0天對Balb/c小鼠氣管內(nèi)接種重組腺病毒表達(dá)鼠IL-13或者鼠分泌的堿性磷酸酶(SEAP)，并在第3天收獲肺。如圖1中描述的用PBS、OVA或IL-13處理對照小鼠。mRNA頻率表達(dá)為百萬分之幾。
圖4是圖解表示，其表明通過腺病毒介導(dǎo)的IL-13表達(dá)在C57b1/6小鼠中誘導(dǎo)ARG1基因。簡言之，在第0天對C57b1/6小鼠氣管內(nèi)接種重組腺病毒表達(dá)鼠IL-13或者鼠分泌的堿性磷酸酶(SEAP)，并在第3天收獲肺。mRNA頻率表達(dá)為百萬分之幾。
圖5是圖解表示，其表明精氨酸攝入由鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7中LPS/IL-13最佳誘導(dǎo)。簡言之，通過用LPS和/或IL-13處理24小時誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞表達(dá)多種水平的CAT2。如實施例3中描述的，在3分鐘時間段內(nèi)評估存在或不存在競爭性L-賴氨酸時精氨酸的轉(zhuǎn)運，最終精氨酸濃度為400μM。特定精氨酸攝入(CPM/mg蛋白裂解物)表達(dá)為在未受刺激的細(xì)胞中測量的百分?jǐn)?shù)。
圖6是圖解表示，其表明在鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7中通過脂多糖(LPS)/IL-13共誘導(dǎo)CAT2和ARG1。簡言之，將RAW264.7細(xì)胞用10ng/ml IL-13和/或1μg/ml LPS處理。處理后24小時后從細(xì)胞分離的總RNA，并通過使用如實施例2中描述的TaqMan實時定量RT-PCR分析ARG1和CAT同種型特異的mRNA表達(dá)。使用Fink等人(Fink等人，Nat.Medicine，41329-1333，1998)的方法從閾值循環(huán)數(shù)估計葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(GAPDH)規(guī)格化的mRNA頻率并將其表達(dá)為GAPDH的拷貝。
圖7是圖解表示，其表明通過20mM賴氨酸在LPS/IL-13處理的RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞中抑制了精氨酸攝入。簡言之，將RAW264.7細(xì)胞僅暴露于介質(zhì)(對照)或者CAT2-誘導(dǎo)條件(LPS/IL-13)24小時，然后在最終精氨酸濃度為100μM條件下評估3分鐘時間段內(nèi)的精氨酸轉(zhuǎn)運。向轉(zhuǎn)運緩沖液中加入競爭性CAT抑制劑20mM賴氨酸消除了對照和LPS/IL-13處理的細(xì)胞中所有可飽和的精氨酸轉(zhuǎn)運。
圖8是圖解表示，其表明通過20mM賴氨酸抑制鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7中尿素的產(chǎn)生。簡言之，將RAW264.7巨噬細(xì)胞僅暴露于介質(zhì)(對照)或者CAT2-誘導(dǎo)條件(LPS/IL-13)24小時，然后將所述細(xì)胞在精氨酸轉(zhuǎn)運緩沖液中平衡2小時。在400μM的最終精氨酸濃度的精氨酸轉(zhuǎn)運緩沖液中競爭性L-賴氨酸存在或不存在下溫育24小時后，如實施例4中描述的評價尿素產(chǎn)生。尿素產(chǎn)生表達(dá)為上清液中μg尿素/mg細(xì)胞裂解蛋白。
圖9是圖解表示，其表明100mM賴氨酸抑制氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的大鼠氣管收縮。簡言之，將大鼠氣管外植塊用介質(zhì)或者含有100mM L-賴氨酸的介質(zhì)預(yù)溫育15到20小時。然后洗滌氣管并在存在或不存在100mM L-賴氨酸時在Krebs-Henseleit溶液中測量收縮。張力計算為mg張力/mg氣管并表達(dá)為％最大收縮(即不存在賴氨酸時10-5M氨甲酰膽堿引起的收縮)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖10是圖解表示，其表明ARG1表達(dá)的誘導(dǎo)需要IL-4受體。簡言之，如圖1描述的，將IL-4受體基因敲除小鼠(IL4R-/-)和IL-4基因敲除小鼠(IL4-/-)對OVA敏化，或者用PBS或者IL-13處理。分離總肺RNA并使用如實施例1中描述的GeneChip技術(shù)(Affymetrix)分析mRNA表達(dá)。mRNA頻率表達(dá)為百萬分之幾。
圖11比較了CAT-2基因敲除小鼠和野生型小鼠中的氣管收縮。GATS2-KO表示CAT2基因敲除小鼠。
圖12是圖解表示，其表明直接肺部滴注rIL-13或者氣管內(nèi)卵清蛋白變應(yīng)原攻擊后ARG1mRNA表達(dá)增強。通過施用sIL13Rα2.Fc所阻斷的IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了67％誘導(dǎo)的Arg1 mRNA表達(dá)。用可溶性受體sIL13Rα2.Fc阻斷IL-13抑制了變應(yīng)原誘導(dǎo)的粘液產(chǎn)生和呼吸道高反應(yīng)性(AHR)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于診斷和治療哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性疾病的組合物和方法。一方面，本發(fā)明的方法包括抑制受哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性疾病侵襲的組織中精氨酸代謝途徑組分的活性或者表達(dá)。在許多實施方案中，受抑制的組分為陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，精氨酸酶，或者精氨酸酶的下游組分。這些組分的活性或表達(dá)的抑制減小或者消除了受侵襲的組織中疾病綜合征或者表型。本發(fā)明還提供了用于鑒定治療哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性痰病的治療劑的方法。
在下面的小節(jié)中還更詳細(xì)描述了本發(fā)明的多個方面。這些小節(jié)不是用于限制本發(fā)明；這些小節(jié)可應(yīng)用于本發(fā)明的任意方面。在本申請中，除非另外指出，“或者”指“和/或”。
CAT2、ARG1和炎性痰病在敏化的小鼠中通過氣管內(nèi)OVA攻擊可以在肺中產(chǎn)生TH2免疫反應(yīng)，其模擬人變應(yīng)性哮喘的若干生理學(xué)特征。有重要的證據(jù)表明該動物疾病模型中IL-13介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要作用。用寡核苷酸陣列描繪氣管內(nèi)OVA攻擊或者IL-13的直接肺滴注后小鼠肺組織中的轉(zhuǎn)錄變化。如圖1-4中所示，當(dāng)用OVA或者IL-13處理小鼠時CAT2和/或ARG1的mRNA頻率顯著增加。同樣，在脂多糖(LPS)和IL-13聯(lián)合處理的鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中共誘導(dǎo)CAT2和ARG1(圖5和6)。所誘導(dǎo)的CAT2和ARG1表達(dá)與精氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的增加有關(guān)(圖7)，但是也與RAW264.7細(xì)胞中尿素的生產(chǎn)增加有關(guān)(圖8)，表明精氨酸酶途徑的活化。其他研究揭示施用CAT2的競爭性抑制劑賴氨酸可以抑制精氨酸攝入和尿素生產(chǎn)的增加(圖7和8)。此外，氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的氣管收縮也受到賴氨酸(圖9)或者CAT2基因的遺傳缺失的抑制(圖11)，進(jìn)一步表明CAT2參與炎性疾病的病理生理。此外，ARG1表達(dá)的誘導(dǎo)需要IL-4受體在圖10中闡明。最后，施用可溶性IL13Rα2.Fc阻斷了IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這又抑制了ARG1 mRNA表達(dá)。
精氨酸是半-必需氨基酸，其代謝成重要的調(diào)節(jié)分子。精氨酸通過蛋白的陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(CAT)家族轉(zhuǎn)運到血管平滑肌細(xì)胞(SMC)，在其中精氨酸被代謝成氧化氮(NO)、多胺或者脯氨酸。炎性介質(zhì)、生長因子和血流動力學(xué)力通過誘導(dǎo)CAT基因表達(dá)刺激血管SMC中精氨酸的轉(zhuǎn)運。炎性細(xì)胞因子也誘導(dǎo)可誘導(dǎo)的NO合酶(iNOS)的表達(dá)并指導(dǎo)精氨酸代謝成抗增殖氣體NO。相反，循環(huán)機械應(yīng)激阻斷iNOS和ODC活性并刺激精氨酸酶I基因表達(dá)，從而指導(dǎo)精氨酸代謝以形成L-脯氨酸和膠原。
在不能再循環(huán)精氨酸的非肝組織中，上調(diào)的CAT2轉(zhuǎn)運蛋白為增強的精氨酸酶活性提供充足的底物精氨酸。該精氨酸酶活性的增強是對于諸如纖維化、呼吸道高反應(yīng)性、杯狀細(xì)胞增生、與細(xì)胞凋亡相關(guān)的氧化應(yīng)激和呼吸道炎癥的致病過程關(guān)鍵的生物化學(xué)途徑，這些致病過程通常在炎性疾病中發(fā)現(xiàn)。因此，抑制精氨酸的CAT2轉(zhuǎn)運將阻斷所誘導(dǎo)的非肝精氨酸酶途徑而不影響肝尿素循環(huán)，所述肝尿素循環(huán)也利用精氨酸但能夠再循環(huán)作為底物的精氨酸。
CAT2的生物化學(xué)和生物學(xué)特征人CAT2(也稱作SLC7A2)的核苷酸和氨基酸序列分別在SEQ IDNOS1和2中給出。鼠CAT2的核苷酸和氨基酸序列分別在SEQ ID NOS3和4中給出。
從人類腸cDNA文庫分離人CAT2 cDNA(SEQ ID NO1)。編碼區(qū)的核苷酸序列預(yù)測為658個氨基酸的蛋白(SEQ ID NO2)，其計算分子量為71,669。由于91％的殘基與小鼠CAT2的殘基相同，所以人CAT2似乎是小鼠CAT2的人對應(yīng)物。在RNA印跡分析中，單一(9.0kb)人CAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄物存在于多種組織中。在骨骼肌中觀察到最高的表達(dá)水平，在腎中觀察到最低水平。親水性圖表明所翻譯的蛋白據(jù)測具有14個跨膜結(jié)構(gòu)域，其上有三個潛在的N-糖基化位點。人CAT2基因分配于人染色體8p21.3-p22。
對基因組組織的分析表明人CAT2由12個翻譯的外顯子和最可能2個未翻譯的外顯子組成。CAT2基因編碼兩種蛋白同種型CAT2A和CAT2B，它們來源于相互排斥的可變剪接(CAT2A中為外顯子7，CAT2B中為外顯子6)。人CAT2基因結(jié)構(gòu)與人CAT1的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，表明它們屬于共同的基因家族。
在小鼠中，CAT2基因從分散于18kb上的5個不同的啟動子轉(zhuǎn)錄，這導(dǎo)致由于轉(zhuǎn)錄起始于不同啟動子而產(chǎn)生了幾種不同的CAT2 mRNA同種型。在前面介紹的表達(dá)小鼠CAT2的所有組織和細(xì)胞型中發(fā)現(xiàn)與最遠(yuǎn)端啟動子相接近的同種型，而其他5’UTR同種型在它們的表達(dá)中更具組織特異性。已有記載表明在淋巴瘤細(xì)胞克隆、肝臟和骨骼肌中利用一些或所有5種推定的啟動子。含有TATA和富含(G+C)而TATA較少的啟動子表現(xiàn)為可控制小鼠CAT2基因表達(dá)。有人提出CAT2 mRNA的多種同種型允許該陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的靈活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
因為CAT2在NO產(chǎn)生中起重要作用，而NO是與包括癌癥的多種疾病有關(guān)的高度反應(yīng)性自由基，所以已經(jīng)提出通過抑制CAT2治療以非所需NO水平為特征的疾病。例如，MacLeod的美國專利號5,866,123描述了通過產(chǎn)生抗小鼠CAT2蛋白的抗體抑制CAT2表達(dá)。國際專利申請WO 00/44766也描述了通過反義和抗體技術(shù)抑制CAT2表達(dá)的方法。
ARG1的生物化學(xué)和生物學(xué)特征人ARG1的核苷酸和氨基酸序列分別在SEQ ID NOS5和6中給出。鼠ARG1的核苷酸和氨基酸序列分別在SEQ ID NOS7和8中給出。
精氨酸酶催化精氨酸水解成鳥氨酸和尿素。存在至少兩種哺乳動物精氨酸酶同種型(I型和II型)，它們在組織分布、亞細(xì)胞定位、免疫交叉反應(yīng)性和生理功能中不同。ARG1編碼I型同種型，其是胞質(zhì)酶并且主要在肝臟中作為尿素循環(huán)的組分表達(dá)。ARG1作為三個相同亞基的三聚體起作用。該酶的遺傳缺陷導(dǎo)致精氨酸血癥，其是一種特征為高氨血的常染色體隱性痰病。
已經(jīng)在2.1-A分辨率下確定了三聚體大鼠ARG1的結(jié)構(gòu)(Kanyo等人，Nature 383554-55，1996)。該結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵特征是該蛋白的羧基末端的新的S-形寡聚化基序，其介導(dǎo)約54％的單體間接觸。位于該寡聚化基序內(nèi)的Arg-308使一系列單體內(nèi)和單體間鹽鍵成核。如通過凝膠過濾和分析性超速離心所確定的，與三聚體野生型酶相反，大鼠ARG1的R308A、R308E和R308K變體作為單體種類存在，表明Arg-308的突變使三聚體解離的平衡偏移了至少105倍。這些單體精氨酸酶變體具有催化活性，其Kcat/Km值為野生型酶值的13-17％。大鼠ARG1變體的特征是相對于野生型酶溫度穩(wěn)定性降低。已經(jīng)在1.7A分辨率下確定了人精氨酸酶和L-精氨酸的硼酸類似物2(S)-氨基-6-硼己酸(ABH)之間復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(Cox等人，Nat.Struct.Biol.61043-1047，1999)。突變分析已經(jīng)揭示氨基酸殘基Lys-141、Glu-256、和Gly-235對于人ARG1的功能是關(guān)鍵的。
已經(jīng)克隆了人ARG1基因并且確定了其結(jié)構(gòu)。人ARG1基因長為11.5kb并且分成8個外顯子。通過核酸酶S1作圖和引物延伸確定加帽位點。“TATA框”類似序列位于加帽位點上游的28個堿基處，類似于轉(zhuǎn)錄因子CTF/NF1——“CAAT框”結(jié)合蛋白的結(jié)合位點的序列位于上游72個堿基處。在5’末端區(qū)存在類似糖皮質(zhì)激素效應(yīng)元件的序列——cAMP效應(yīng)元件，和增強子核心序列。人ARG1基因最上至-105位的緊接的5’側(cè)翼區(qū)與大鼠基因的相應(yīng)節(jié)段有84％相同。在人ARG1基因的該區(qū)域中，通過足跡分析檢測到一個DNA酶I-保護(hù)區(qū)和幾個超敏切割位點。受保護(hù)的區(qū)域含有類似于CTF/NF1的結(jié)合位點的序列并且也與類似糖皮質(zhì)激素效應(yīng)元件的序列重疊。
已經(jīng)開發(fā)了許多測定方法以測量精氨酸酶活性。例如，Greenberg在Arginase，The Enzymes 4，P.Boyer，H.Lardy，和K.Myrback編著，Academic Press，NY，257，1960中描述了酶測定法。Geyer等人描述了組織勻漿物中精氨酸酶的測定法(Geyer等人，Anal.Biochem.39412，1971)。Nishibe和Makino報導(dǎo)了紅細(xì)胞精氨酸酶的自動化測定方法(Nishibe等人，Anal.Biochem.43357，1971)。還描述了微測定(Hirsch-Kolb等人，Anal.Biochem.3560，1970)。多數(shù)方法基于精氨酸水解期間釋放的尿素氮的比色測定。
已經(jīng)在患有結(jié)腸直腸癌的患者中檢測到精氨酸酶的超表達(dá)(Porembska等人，Cancer 942930-2934，2002)。增加的精氨酸酶活性與變應(yīng)原誘導(dǎo)的cNOS-來源的氧化氮不足和呼吸道高反應(yīng)性有關(guān)(Meurs等人，Br.J.Pharmacol.136391-398，2002)。
精氨酸酶活性的抑制精氨酸酶活性可被許多氨基酸，如纈氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和蘇氨酸，以及精氨酸類似物和衍生物，如L-刀豆氨酸(Can)和L-鳥氨酸(Orn)抑制。所有這些氨基酸都作為競爭性抑制劑起作用。精氨酸酶催化的反應(yīng)產(chǎn)物鳥氨酸和尿素也作為精氨酸酶的競爭性抑制劑起作用。產(chǎn)物鳥氨酸和尿素的競爭性抑制表明該酶的快速平衡隨機機制。
精氨酸酶活性與緊密結(jié)合的Mn++有關(guān)，通過加入更松散結(jié)合的Mn++可以刺激Mn++的催化作用，以產(chǎn)生完全活化的酶形式。然而，盡管需要加入二價陽離子以活化精氨酸酶，但是金屬螯合劑，如EDTA和檸檬酸鹽不抑制該酶。從而表現(xiàn)出金屬結(jié)合位點不容易被溶劑接近。另一方面，精氨酸酶活性受到硼酸鹽抑制，硼酸鹽作為S-雙曲線I-雙曲線反競爭性抑制劑起作用并且對該酶與競爭性抑制劑L-鳥氨酸(Ki＝2+/-0.5mM)、L-賴氨酸(Ki＝2.5+/-0.4mM)、和氯化胍(Ki ＝100+/-10mM)的相互作用沒有影響。已經(jīng)提出硼酸鹽很近地結(jié)合松散結(jié)合的Mn++，并且干擾其刺激作用。還提出硼酸鹽抑制來自于雙核Mn++中心Mn++的螯合，從而代替負(fù)責(zé)對胍基碳的親核攻擊的金屬結(jié)合的水分子(Carvajal等人，J.Inorg.Biochem.77163-167，1999)。其他實驗也表明硼酸鹽和尿素以相互排斥的方式結(jié)合精氨酸酶，然而L-鳥氨酸和硼酸鹽可以同時結(jié)合該酶。
已經(jīng)研究了陰離子，如N3-、NO2-、BO43-、SCN-、CH3COO-、SO42-、ClO4-、H2PO4-、CN-、I-、Br-、Cl-和F-對通過大鼠肝精氨酸酶(RLA)對L-精氨酸(L-Arg)水解的抑制作用(Pethe等人，J.Inorg.Biochem.88397-402，2002)。在所有這些陰離子中，僅F-在mM水平上顯示出明顯的抑制作用。F-對RLA的抑制是可逆的并且對L-Arg結(jié)合是反競爭性的，在pH 7.4下K(i)值為1.3+/-0.5mM。該作用依賴于pH，這是因為當(dāng)pH從7增加到10時F-對RLA的IC50值從1.2增加到19mM。另一個研究已經(jīng)證實氟化物是大鼠肝精氨酸酶的反競爭性抑制劑。該研究還表明在底物濃度高于4mM時氟化物導(dǎo)致大鼠肝精氨酸酶的底物抑制(Tormanen CD，J.Inorg.Biochem.93243-246，2003)。
N(ω)-羥基-L-精氨酸(L-NOHA)是迄今為止報導(dǎo)的最強的精氨酸酶抑制劑之一(Ki＝150μM)。NO合酶的其他產(chǎn)物對精氨酸酶或者沒有影響(NO2-，NO3-)或者是很弱的抑制劑(L-Cit和NO)。來源于L-Arg的可能的水解產(chǎn)物(L-Orn和尿素)和L-NOHA的可能的水解產(chǎn)物(L-Cit、羥基脲和羥胺)在最高達(dá)2mM的濃度對精氨酸酶也是無活性的。L-NOHA的構(gòu)型是重要的，因為D-NOHA活性低得多，并且其游離的-COOH和α-NH2功能是識別肝精氨酸酶所需的。L-NOHA也是大鼠肝勻漿物和鼠巨噬細(xì)胞的精氨酸酶活性的強抑制劑(IC50分別為150和450μM)(Buga等人，Am.J.Physiol.，271H1988-1998，1996)。
精氨酸酶的另一種特異抑制劑N-(ω)-羥基-L-正-精氨酸(nor-NOHA)對由未受剌激的鼠巨噬細(xì)胞催化的L-精氨酸水解為L-鳥氨酸的抑制比L-NOHA強約40倍(IC50值分別為12+/-5和400+/-50μM)。用γ干擾素和脂多糖(IFN-γ+LPS)剌激鼠巨噬細(xì)胞導(dǎo)致可誘導(dǎo)的NOS(iNOS)的明顯表達(dá)和精氨酸酶活性增加。Nor-NOHA也是IFN-γ+LPS-剌激的巨噬細(xì)胞中精氨酸酶的強抑制劑(IC50值10+/-3μM)。與NOHA相比，nor-NOHA既不是iNOS的底物也不是抑制劑，并且成為研究精氨酸酶和NOS之間相互作用的有用工具。(Tenu等人，Nitric Oxide，3427-438，1999)。
最近幾年發(fā)現(xiàn)的其他精氨酸酶抑制劑包括N-ω-羥基-D，L-穗花木蘭氨酸和4-羥基脒基-D，L-苯丙氨酸，它們抑制肝精氨酸酶和肺泡巨噬細(xì)胞中的精氨酸酶(Hey等人，Br.J.Pharmacol.121395-400，1997)；2(S)-氨基-6-硼己酸(ABH)，發(fā)現(xiàn)其在抑制內(nèi)部肛門括約肌中精氨酸酶活性方面比L-NOHA強約250倍(Baggio等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.2901409-1416，1999)；和α-二氟甲基鳥氨酸(DFMO)，其通常用作特異鳥氨酸脫羧酶不可逆的抑制劑，但是也表現(xiàn)出對L-精氨酸通過完整細(xì)胞中精氨酸酶流動的抑制作用(Selamnia等人，Biochem.Pharmacol.551241-1245，1998)。這些精氨酸酶抑制劑在與上升的精氨酸酶活性有關(guān)的疾病中具有重要的病理生理和治療含義。
精氨酸酶活性的直接抑制的備選方案是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制，導(dǎo)致精氨酸酶活性或精氨酸酶表達(dá)的激活。例如，與升高的精氨酸酶活性有關(guān)的發(fā)病機理可通過施用IL-13受體(IL-13R)得到改善。如前面描述的，IL-13是主要由激活的TH2細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。在過去幾年里，已經(jīng)很清楚IL-13是變應(yīng)性炎癥的發(fā)病機理中的關(guān)鍵介質(zhì)。在小鼠中，IL-13介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)足夠引起所有四種哮喘相關(guān)的病理生理表型并且是粘液分泌過多和誘導(dǎo)的AHR所需的?？紤]到IL-13作為效應(yīng)分子的重要性，在其受體水平上的調(diào)節(jié)可能是調(diào)節(jié)IL-13應(yīng)答并且因此增強變應(yīng)性應(yīng)答的重要機理。
IL-13與IL-4具有共同的受體亞基，即IL-4受體的α亞基(IL-4Rα)。IL-13缺陷小鼠、IL-4缺陷小鼠和IL-4受體α缺陷(IL-4Rα(-/-))小鼠的表征表明了IL-13的非冗余作用。IL-13通過與一種復(fù)雜的受體系統(tǒng)相互作用介導(dǎo)其作用，所述受體系統(tǒng)由IL-4Rα和兩種IL-13結(jié)合蛋白IL-13Rα1和IL-13Rα2組成。IL-13受體在人B細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、呼吸上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上表達(dá)。
然而，還沒有在人或者小鼠T細(xì)胞上闡明功能IL-13受體。與IL-4不同，IL-3在CD4 T細(xì)胞最初分化成TH2型細(xì)胞中表現(xiàn)得不重要，但是在變應(yīng)性炎癥的效應(yīng)期中是重要的。該評估通過許多體內(nèi)現(xiàn)察進(jìn)一步證實，所述觀察包括施用IL-13導(dǎo)致變應(yīng)性炎癥、在轉(zhuǎn)基因小鼠的肺中IL-13的組織特異超表達(dá)導(dǎo)致呼吸道炎癥和粘液分泌過多，IL-13阻斷消除了獨立于IL-4的變應(yīng)性炎癥，并且IL-13在粘液分泌過多中表現(xiàn)得比IL-4更重要。因此，IL-13是變應(yīng)性痰病的藥學(xué)干預(yù)中吸引人的新的治療靶。施用IL-13R可以潛在抑制或者甚至阻斷IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，阻止IL-13誘導(dǎo)的ARG1表達(dá)，和減輕哮喘相關(guān)的病理。
ARG1和CAT2作為炎性痰病的標(biāo)記本發(fā)明確定CAT2和ARG1在哮喘的動物模型的肺組織中超表達(dá)。因此，這些基因或者它們的表達(dá)產(chǎn)物可以用作炎性疾病如哮喘或者COPD的標(biāo)記。這些基因的表達(dá)水平可以通過使用例如，RT-PCR、核酸陣列，或者免疫測定來檢測。免疫測定形式的實例包括，但不限于，膠乳或者其他顆粒凝集、電化學(xué)發(fā)光、ELISA、RIA、夾心測定法或者免疫測量測定(immunometric assay)、時間分辨熒光、側(cè)向流動測定法、熒光偏振、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)測定法、蛋白印跡和蛋白組芯片?？梢詸z測體液或者組織樣品中CAT2和ARG1蛋白或者mRNA水平。
標(biāo)記可用于提供具體受試者樣品中診斷或者預(yù)后信息或者用于評估炎性疾病的治療功效。例如，比較疾病發(fā)展的不同階段的CAT2和ARG1的表達(dá)水平可以提供長期預(yù)后，包括存活的方法。CAT2和ARG1基因多態(tài)性也可指示受試者對炎性疾病的易感性。
在另一實例中，可以評估具體治療方案的功效，包括具體藥物是否會改善具體患者中的長期預(yù)后。哮喘、COPD和關(guān)節(jié)炎是復(fù)雜疾病，它們的臨床表現(xiàn)多樣且多變?；颊邔μ挡∵^程和可利用的治療的應(yīng)答不同，這些不同很可能反映了痰病類型的不同。因此，本發(fā)明的額外實用性是提供鑒定最可能應(yīng)答治療過程的患者的方法。
盡管在小鼠模型中實施最初分化表達(dá)分析，但眾所周知在動物中導(dǎo)致疾病的功能異?；虍?dāng)在人體中是功能異常時可以導(dǎo)致相似的綜合征。因此這是本發(fā)明特別希望的且應(yīng)理解為本發(fā)明特別包括人CAT2和ARG1基因。來自其他生物的CAT2和ARG1同系物也可以用于動物模型中以研究哮喘、COPD或者其他炎性疾病。通過使用本領(lǐng)域中公知的任意方法可以得到來自其他生物的ARG1和CAT2同系物。
通過抑制CAT2或者ARC1活性治療炎性疾病CAT2或者ARG1基因組序列、啟動子、外顯子、內(nèi)含子、RNA轉(zhuǎn)錄物或者編碼的蛋白可以是治療或治療劑的靶。它們也可以用于產(chǎn)生抑制CAT2和/或ARG1表達(dá)或者CAT2和/或ARG1蛋白活性的基因治療載體。
不對機理作出限制，本發(fā)明部分基于如下原理，即抑制CAT2和/或ARG1表達(dá)或者活性可以改善炎性疾病如哮喘或者COPD。CAT2和/或ARG1抑制劑也可以有效治療纖維化、呼吸道高反應(yīng)性、杯形細(xì)胞增生、呼吸道炎癥和氧化應(yīng)激。所述抑制可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯或翻譯后水平上。例如，可以靶定CAT2或者ARG1啟動子或者mRNA以分別抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯。也可以靶定CAT2或者ARG1蛋白的翻譯后加工，如糖基化和二聚體化。
在哮喘的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)CAT2和ARG1表達(dá)模式使得能夠篩選測試試劑，其目的是調(diào)節(jié)CAT2和/或ARG1表達(dá)或者CAT2和/或ARG1活性。受試試劑可以通過它們對CAT2和/或ARG1在mRNA或者蛋白水平上表達(dá)的影響，或者通過它們對CAT2和/或ARG1基因產(chǎn)物活性的影響來篩選。
在另一實施方案中，CAT2和/或ARG1表達(dá)或者CAT2和/或ARG1活性的調(diào)節(jié)劑可用作哮喘、COPD和其他炎性痰病的治療劑。調(diào)節(jié)劑可以是多核苷酸，如核酶或者RNAi，多肽，如對野生型CAT2和/或ARG1的活性具有顯性負(fù)作用的CAT2和/或ARG1突變體、病毒或者非病毒基因治療載體、或者能夠抑制CAT2和/或ARG1活性或者CAT2和/或ARG1基因表達(dá)的任意其他小分子或者生物分子。這種調(diào)節(jié)劑可以配制成用于本發(fā)明的藥物組合物。
探針、引物、反義和RNAi序列本發(fā)明的一方面涉及用于檢測或定量生物樣品中CAT2或ARG1基因產(chǎn)物的多核苷酸探針或者引物。CAT2或ARG1探針/引物可以來源于CAT2或ARG1基因的任意部分。所述探針/引物可以具有任意所需的長度。例如，探針可以具有15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、400或更多連續(xù)核苷酸。在許多實施方案中，探針可以在嚴(yán)格或者高度嚴(yán)格條件下與CAT2或者ARG1基因的RNA轉(zhuǎn)錄物或者其互補序列雜交。
不同雜交嚴(yán)格性條件的實例在表1中列出。高度嚴(yán)格條件是至少和條件A-F一樣嚴(yán)格的條件，嚴(yán)格條件是至少和條件G-L一樣嚴(yán)格的條件；降低的嚴(yán)格條件是至少和條件M-R一樣嚴(yán)格的條件。如表1中所用的，在給定雜交條件下實施雜交至少約2小時，然后在相應(yīng)洗滌條件下洗滌兩次，每次15分鐘。
表1嚴(yán)格條件

1雜交體長度為對雜交多核苷酸的雜交區(qū)域所預(yù)期的。當(dāng)多核苷酸與未知序列的靶多核苷酸雜交時，假定雜交體長度即是雜交多核苷酸的長度。當(dāng)已知序列的多核苷酸雜交時，通過多核苷酸的序列比對并鑒定具有最佳序列互補性的一個或多個區(qū)域可以確定雜交體長度。
H在雜交和洗滌緩沖液中，SSPE(1×SSPE為0.15M NaCl，10mMNaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可以代替SSC(1×SSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)。
TB*-TR*預(yù)期長度小于50個堿基對的雜交體的雜交溫度應(yīng)該比該雜交體的解鏈溫度(Tm)小5-10℃，其中根據(jù)下面的方程式確定Tm。對于長度小于18個堿基對的雜交體，Tm(℃)＝2(#A+T堿基)+4(#G+C堿基)。對于長度為18到49個堿基對的雜交體，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N為雜交體中的堿基數(shù)，Na+為雜交緩沖液中的鈉離子摩爾濃度(1×SSC的Na+＝0.165M)。
本發(fā)明的另一方面涉及編碼含有氨基酸殘基改變的CAT2和ARG1突變體的多核苷酸。這些突變體可以與野生型CAT2和ARG1蛋白競爭并且抑制野生型CAT2和ARG1蛋白的活性。通過導(dǎo)入一個或多個核苷酸替換、加入或缺失到多核苷酸的核苷酸序列中，可以產(chǎn)生編碼突變型CAT2和ARG1基因的分離的多核苷酸分子，從而向所編碼的蛋白中導(dǎo)入一個或多個氨基酸替換、加入或缺失。這些技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變可以向CAT2和ARG1基因中導(dǎo)入突變。備選地，如通過飽和誘變可以將突變隨機導(dǎo)入CAT2和ARG1基因或cDNA的編碼序列的所有或者部分序列中，并且可以篩選所得突變體的生物活性以鑒定能夠抑制野生型蛋白活性的突變體(顯性負(fù)突變體)。誘變后，可以重組表達(dá)所編碼的蛋白并且可以確定該蛋白的活性。
可以進(jìn)一步修飾多核苷酸以增加體內(nèi)穩(wěn)定性。可能的修飾包括，但不限于，在5’和/或3’末端加入側(cè)翼序列；在主鏈中使用硫代磷酸酯或者2-O-甲基而不是磷酸二酯酶鍵；和/或包括非常規(guī)堿基，如肌苷、queosine和wybutosine，以及腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙?；?、甲基-、硫代-和其他修飾形式。
本發(fā)明的另一方面涉及分離的多核苷酸分子，其與CAT2或ARG1基因或者它們的轉(zhuǎn)錄物為反義的?！胺戳x”多核苷酸包括與編碼蛋白的“有義”多核苷酸互補的核苷酸序列，例如，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或者與mRNA序列互補的核苷酸序列。因此，反義多核苷酸可以與有義多核苷酸形成氫鍵。反義多核苷酸可以與本發(fā)明的CAT2或ARG1基因的完整編碼鏈或者僅其部分互補。在一個實施方案中，反義多核苷酸分子與本發(fā)明的核苷酸序列的編碼鏈的“編碼區(qū)”為反義的。在另一實施方案中，反義多核苷酸分子與本發(fā)明的核苷酸序列的編碼鏈的“非編碼區(qū)”為反義的。
根據(jù)Watson和Crick堿基配對規(guī)則可以設(shè)計本發(fā)明的反義多核苷酸。反義多核苷酸分子可以與相應(yīng)于本發(fā)明基因的mRNA的完整編碼區(qū)互補。它還可以是與編碼區(qū)或非編碼區(qū)的部分反義的寡核苷酸。反義寡核苷酸長度可以為例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸。使用本領(lǐng)域中公知的方法使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)可以構(gòu)建本發(fā)明的反義多核苷酸。例如，使用天然存在的核苷酸或者多種經(jīng)修飾的核苷酸可以化學(xué)合成反義多核苷酸(例如，反義寡核苷酸)，所述經(jīng)修飾的核苷酸設(shè)計為用于增加所述分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或者增加反義和有義多核苷酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸?？梢杂糜诋a(chǎn)生反義多核苷酸的經(jīng)修飾的核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺苷、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。備選地，使用表達(dá)載體可以通過生物學(xué)方法產(chǎn)生反義多核苷酸，其中已經(jīng)在反義方向?qū)⒍嗪塑账醽喛寺〉剿霰磉_(dá)載體中(即，從所插入的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的RNA將與目標(biāo)靶多核苷酸為反義方向，在下面小節(jié)中進(jìn)一步描述)。
本發(fā)明的反義多核苷酸分子通常施用于受試者或者原位產(chǎn)生，從而它們與編碼CAT2和ARG1蛋白的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或者結(jié)合，從而例如，通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而抑制所述蛋白的表達(dá)。雜交可以是通過常規(guī)核苷酸互補以形成穩(wěn)定的雙鏈體或者，例如，對于結(jié)合DNA雙鏈體的反義多核苷酸分子，通過雙螺旋的大溝中的特定相互作用。本發(fā)明的反義多核苷酸分子的施用途徑的實例包括在組織部位(例如，腸或者血液)直接注射。備選地，可以修飾反義多核苷酸分子以靶定所選細(xì)胞，然后全身施用。例如，對于全身施用，可以修飾反義分子從而它們特異結(jié)合在所選細(xì)胞表面上表達(dá)的受體或者抗原，所述特異結(jié)合可以例如通過將該反義多核苷酸分子連接到與細(xì)胞表面受體或者抗原結(jié)合的肽或者抗體。用文中描述的載體也可以將反義多核苷酸分子遞送到細(xì)胞。為了實現(xiàn)反義分子的足夠細(xì)胞內(nèi)濃度，可以使用載體構(gòu)建體，其中反義多核苷酸分子置于強polII或polIII啟動子的控制下。
本發(fā)明的另一方面涉及α-異頭物多核苷酸分子。α-異頭物多核苷酸分子能夠與CAT2和ARG1 RNA形成特異雙鏈雜交體，其中與通常的β-單位相反，所述鏈相互平行。α-異頭物多核苷酸分子還可以含有2-o-甲基核糖核苷酸或者嵌合RNA-DNA類似物。
在另一實施方案中，所分離的多核苷酸是核酶。核酶是具有RNA酶活性的催化性RNA分子，其能夠切割與它們具有互補區(qū)域的單鏈多核苷酸，如mRNA。從而，核酶可用于催化性切割CAT2和/或ARG1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物，從而抑制所述mRNA的翻譯?？梢曰贑AT2和ARG1基因的核苷酸序列設(shè)計具有對CAT2和ARG1基因特異性的核酶。從CAT2和ARG1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA可以用于從RNA分子庫選擇具有特異RNA酶活性的催化性RNA。備選地，CAT2和ARG1基因的表達(dá)可以通過靶定與這些基因的調(diào)節(jié)區(qū)(例如，啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列以形成防止所述基因在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行抑制。
用RNA干涉(RNAi)也可以抑制CAT2和ARG1基因的表達(dá)。該技術(shù)是用于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(“PTGS”)的技術(shù)，其中用同源雙鏈RNA(“dsRNA”)可以特異除去靶基因活性。在許多實施方案中，將與靶基因同源的約21個核苷酸的dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞并觀察基因活性中序列特異性的減小。RNA干涉提供了在mRNA水平上基因沉默的機制。其為基因敲除和治療目的提供了有效的和應(yīng)用廣泛的方法。
能夠通過RNA干涉抑制基因表達(dá)的序列可以具有任何所需的長度。例如，該序列可以具有至少15、20、25或更多連續(xù)核苷酸。該序列可以是dsRNA或者任何其他類型的多核苷酸，前提條件是該序列能夠形成功能性沉默復(fù)合物以降解靶mRNA轉(zhuǎn)錄物。
在一個實施方案中，所述序列含有短干涉RNA(siRNA)或者由該短干涉RNA(siRNA)組成。siRNA可以為例如，具有19到25個核苷酸的dsRNA。通過稱為Dicer的RNA酶III相關(guān)核酸酶降解較長的dsRNA分子可以內(nèi)源產(chǎn)生siRNA。也可以將siRNA外源地或者通超表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)入細(xì)胞。siRNA一旦形成就與蛋白組分裝配成含有內(nèi)切核糖核酸酶的復(fù)合體，其稱作RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISCs)。siRNA的ATP產(chǎn)生的解旋激活RISC，其依次通過Watson-Crick堿基配對靶定互補的mRNA轉(zhuǎn)錄物，從而切割和破壞mRNA。mRNA的切割在siRNA鏈結(jié)合的區(qū)域的中間附近發(fā)生。該序列特異的mRNA降解導(dǎo)致基因沉默。
至少兩種方法可用于實現(xiàn)siRNA介導(dǎo)的基因沉默。首先，可以體外合成siRNA并導(dǎo)入細(xì)胞以暫時抑制基因表達(dá)。合成的siRNA提供了實現(xiàn)RNAi的容易而有效的途徑。siRNA是短的混合寡核苷酸的雙鏈體，其可以包括，例如，具有對稱二核苷酸3’突出端的19個核苷酸。使用合成的21bp siRNA雙鏈體(例如，19個RNA堿基后為UU或者dTdT 3’突出端)，可以在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)序列特異的基因沉默。這些siRNAs可以特異抑制哺乳動物細(xì)胞中靶定的基因翻譯而不通過更長dsRNA激活依賴DNA的蛋白激酶(PKR)，所述激活可能導(dǎo)致許多蛋白翻譯的非特異阻抑。
其次，可以從載體體內(nèi)表達(dá)siRNA。該方法可用于在細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動物中穩(wěn)定表達(dá)siRNA。在一個實施方案中，將siRNA表達(dá)載體工程化以驅(qū)動從聚合酶III(pol III)轉(zhuǎn)錄單位的siRNA轉(zhuǎn)錄。polIII轉(zhuǎn)錄單位適于發(fā)夾型siRNA表達(dá)，因為它們使用短的富含AT的轉(zhuǎn)錄終止位點，其導(dǎo)致在發(fā)央型siRNA加入2bp突出端(例如，UU)，該特征有助于siRNA功能。polIII表達(dá)載體也可以用于產(chǎn)生表達(dá)siRNA的轉(zhuǎn)基因小鼠。
在另一實施方案中，siRNA可以以組織特異的方式表達(dá)。在該方法中，長的雙鏈RNA(dsRNA)首先在所選細(xì)胞系或者轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞核中組織特異的啟動子表達(dá)。在細(xì)胞核中長dsRNA被加工成siRNA(例如，通過Dicer)。siRNA從細(xì)胞核出來并介導(dǎo)基因特異沉默。類似的方法可以與組織特異啟動子結(jié)合使用以產(chǎn)生組織特異的擊倒(knockdown)小鼠。任意3’二核苷酸突出端，如UU，可用于siRNA設(shè)計。在一些情況中，因為siRNA在單鏈G殘基處有可能被RNA酶切割，所以避免了突出端中的G殘基。對于siRNA序列自身，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些情況中具有30-50％GC含量的siRNA比具有更高G/C含量的siRNA更具活性。此外，因為4-6個核苷酸多胸苷酸序列可以作為RNA polIII的終止信號，所以當(dāng)設(shè)計從RNA polIII啟動子表達(dá)的序列時，可以在某些情況中避免靶序列中＞4T或A的一段序列。此外，mRNA的某些區(qū)域可以高度結(jié)構(gòu)化或者被調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合。從而，有用的是在基因序列長度上的不同位置選擇siRNA靶定位點。最后，潛在的靶定位點可以與適宜的基因組數(shù)據(jù)庫(人、小鼠、大鼠，等等)比較。從某些情況考慮，可以除去具有與其他編碼序列同源的16-17個以上的鄰接堿基對的任意靶序列。
在一個實施方案中，siRNA被設(shè)計成具有兩個通過短的間隔序列分割的反向重復(fù)序列和以作為轉(zhuǎn)錄終止位點的一串T結(jié)束。該設(shè)計產(chǎn)生了預(yù)測折疊成短的發(fā)夾型siRNA的RNA轉(zhuǎn)錄物。siRNA靶序列的選擇、編碼推定的發(fā)夾莖的反向重復(fù)序列的長度、反向重復(fù)序列的順序、編碼發(fā)夾環(huán)的間隔序列的長度和組成和5’-突出端的存在或缺乏可以進(jìn)行改變以得到所需的結(jié)果。
通過掃描mRNA序列以尋找AA二核苷酸并記錄緊在AA下游的19個核苷酸可以選擇siRNA靶。其他方法也可用于選擇siRNA靶。在一個實施方案中，siRNA靶序列的選擇完全根據(jù)經(jīng)驗確定(見，例如，Sui等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 995515-5520，2002)，只要靶序列以GG開始并且如通過BLAST搜索分析的不與其他基因具有顯著序列同源性。在另一個實施方案中，用更詳細(xì)的方法選擇siRNA靶序列。該方法利用如下論點，即內(nèi)源mRNA的任何可接近的位點都可以被靶定以通過合成寡脫氧核糖核苷酸/RNA酶H方法降解(Lee等人，Nature Biotechnol.20500-505，2002)。
在另一實施方案中，構(gòu)建發(fā)夾型siRNA表達(dá)盒以含有靶的有義鏈，其后是短的間隔序列、靶的反義鏈，和作為轉(zhuǎn)錄終止子的5-6個T。siRNA表達(dá)構(gòu)建體內(nèi)有義鏈和反義鏈的順序可以改變而不影響發(fā)夾型siRNA的基因沉默活性。在某些情況中，順序的顛倒可以導(dǎo)致基因沉默活性的部分降低。
用作siRNA表達(dá)盒莖的核苷酸序列的長度可以，例如，為19到29。環(huán)大小可以為3到23個核苷酸。也可以使用其他長度和/或環(huán)大小。
在另一實施方案中，可以使用發(fā)夾型siRNA構(gòu)建體中的5’突出端，前提條件是發(fā)夾型siRNA在基因沉默中是有功能的。在一個實施方案中，5’突出端包括約6個核苷酸殘基。
在再一個實施方案中，RNAi的靶序列為選自CAT2和ARG1編碼序列的約21聚體序列片段，如SEQ ID NOS1和5。靶序列可以選自O(shè)RF區(qū)或者非ORF區(qū)。每個靶序列的5’末端都具有二核苷酸“NA”，其中“N”可以是任意堿基，“A”代表腺嘌呤。剩余的19聚體序列具有30％到65％的GC含量。在許多實例中，剩余的19聚體序列不包括任何四個連續(xù)的A或T(即，AAAA或TTTT)、三個連續(xù)的G或C(即，GGG或CCC)，或者排成一行的七個“GC”。使用上述標(biāo)準(zhǔn)(“不嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)(Relaxed Criteria)”)制備的靶序列的實例在表2中闡明。表2中每個靶序列具有SEQ ID NO3n；相應(yīng)的siRNA有義鏈和反義鏈分別具有SEQ ID NO3n+1和SEQ ID NO3n+2，其中n為正整數(shù)。對于每個CAT2和ARG1編碼序列(例如，分別為SEQ ID NOS1和5)，可以選擇多個靶序列。
可以使用其他標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計RNAi靶序列。在一個實例中，剩余19聚體序列的GC含量限于35％到55％，并且排除任何具有三個連續(xù)A或T(即，AAA或TTT)或者具有5個或更多堿基的回文序列的19聚體序列。此外，可以選擇19聚體序列以與其他的人基因具有低序列同源性。在一個實施方案中，通過BLASTN對NCBI人UniGene簇序列數(shù)據(jù)庫搜索潛在的靶序列。人UniGene數(shù)據(jù)庫含有基因定向簇的非冗余組。每個UniGene簇包括代表一個獨特基因的序列。可以選擇在BLASTN搜索下不命中其他人基因的19聚體序列。在該搜索中，e值可以設(shè)定為嚴(yán)格值(如“1”)。此外，靶序列可以選自O(shè)RF區(qū)，并且從起始密碼子到終止密碼子至少75bp。使用這些標(biāo)準(zhǔn)(“嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)(Stringent Criteria)”)制備的靶序列的實例在表2中闡明(SEQID NO3n，其中n為正整數(shù))。還提供了每個靶序列(SEQ ID NO3n)的siRNA有義和反義序列(分別為SEQ ID NO3n+1和SEQ ID NO3n+2)。
表2.RNAi靶序列和siRNA序列

使用本領(lǐng)域中公知的多種方法可以評估siRNA序列的有效性。例如，本發(fā)明的siRNA序列可以導(dǎo)入超表達(dá)CAT2或者ARG1基因的細(xì)胞?？梢詸z測細(xì)胞中CAT2或者ARG1的多肽或者mRNA水平。siRNA序列導(dǎo)入之前和之后LRG的表達(dá)水平的顯著改變表明siRNA序列在抑制CAT2或者ARG1基因表達(dá)中的有效性。在一個實例中，還監(jiān)控siRNA序列導(dǎo)入之前和之后其他基因的表達(dá)水平。可以選擇對CAT2或者ARG1表達(dá)具有抑制效果但不顯著影響其他基因的表達(dá)的siRNA序列。在另一實例中，可以將多種siRNA或者其他RNAi序列導(dǎo)入相同靶細(xì)胞中。這些siRNA或者RNAi序列特異抑制CAT2或者ARG1基因表達(dá)但是不抑制其他基因表達(dá)。在再一個實例中，可以使用抑制CAT2或者ARG1基因和其他一種或多種基因表達(dá)的siRNA或者其他RNAi序列。
在再一個實施方案中，可以在堿基部分、糖部分或者磷酸酯主鏈修飾本發(fā)明的多核苷酸分子，以提高例如，該分子的穩(wěn)定性、雜交或者溶解性。例如，可以修飾多核苷酸分子的脫氧核糖磷酸酯主鏈以產(chǎn)生肽多核苷酸。文中所用的術(shù)語“肽多核苷酸”或者“PNAs”是指多核苷酸模擬物，例如，DNA模擬物，其中脫氧核糖磷酸酯主鏈被假肽主鏈代替并且僅保留四種天然核堿基(nucleobase)。已經(jīng)表明PNAs的中性主鏈允許在低離子強度條件下特異雜交DNA和RNA。使用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方案可以實施PNA寡聚體的合成。
PNAs可用于治療和診斷應(yīng)用中。例如，PNAs可通過例如，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯阻滯或者抑制復(fù)制可以用作CAT2或者ARG1表達(dá)的序列特異抑制的反義試劑。本發(fā)明多核苷酸分子的PNAs也可以例如通過PNA指導(dǎo)的PCR夾緊(clamping)，用于分析基因中單個堿基對突變，當(dāng)與其他酶(例如，S1核酸酶)聯(lián)合使用時，作為人工限制酶或者作為DNA測序或者雜交的探針或者引物。
在另一實施方案中，可以修飾PNAs(例如，以增強它們的穩(wěn)定性或者細(xì)胞攝入)，這所述修飾可以通過將親脂或者其他輔助基團(tuán)附著到PNA，或者通過形成PNA-DNA嵌合體，或者通過使用脂質(zhì)體或者本領(lǐng)域中公知的藥物遞送的其他技術(shù)來實現(xiàn)。例如，可以產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸分子的PNA-DNA嵌合體，其可以組合PNA和DNA的有利性質(zhì)。這些嵌合體允許DNA識別酶(例如，DNA聚合酶)與DNA部分相互作用而PNA部分將提供高結(jié)合親和力和特異性?？梢允褂酶鶕?jù)堿基堆積、核堿基之間鍵的數(shù)目和方向選擇的適宜長度的接頭來連接PNA-DNA嵌合體?？梢詫嵤㏄NA-DNA嵌合體合成。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺偶聯(lián)化學(xué)方法可以在固體支持物上合成DNA鏈，且經(jīng)修飾的核苷類似物，例如，5’-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5’-脫氧-胸苷亞磷酰胺可以用作PNA和DNA的5’末端之間的間隔區(qū)。然后將PNA單體逐步偶聯(lián)以產(chǎn)生具有5’PNA節(jié)段和3’DNA節(jié)段的嵌合分子。備選地，用5’DNA節(jié)段和3’PNA節(jié)段可以合成嵌合分子。
CAT2和ARG1多肽本發(fā)明的一些方面涉及能夠抑制正常CAT2或ARG1多肽活性的突變CAT2和ARG1多肽，以及適宜用作免疫原以產(chǎn)生抗-CAT2或者抗-ARG1抗體的多肽片段。在一個實施方案中，通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生突變的CAT2和ARG1多肽(例如，顯性負(fù)突變體)。備選地，使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)可以化學(xué)合成突變的CAT2和ARG1多肽。
本發(fā)明還涉及CAT2或ARG1多肽的變體，其作為CAT2或者ARG1多肽的拮抗劑起作用。在一個實施方案中，CAT2或者ARG1多肽的拮抗劑或激動劑用作治療劑。例如，CAT2或者ARG1多肽的拮抗劑可以降低CAT2或者ARG1蛋白的活性并且改善受試者中炎性痰病，在該痰病中CAT2或者ARG1蛋白超表達(dá)。通過誘變，例如，CAT2或者ARG1基因的離散點突變或者截短可以產(chǎn)生CAT2或者ARG1多肽的變體。
在某些實施方案中，CAT2或者ARG1多肽的拮抗劑通過例如，競爭性調(diào)節(jié)CAT2或者ARG1多肽的活性，可以抑制CAT2或者ARG1多肽的天然存在形式的一種或多種活性。從而，通過用有限功能的變體治療可以引起特定生物學(xué)效應(yīng)。
通過篩選突變體的組合文庫可以鑒定或者作為CAT2或者ARG1多肽激動劑或者作為CAT2或者ARG1多肽拮抗劑起作用的CAT2或者ARG1多肽的突變體。在某些實施方案中，這些變體可以用作例如，本發(fā)明的治療蛋白。通過例如，將合成寡核苷酸混合物酶促連接到基因序列從而潛在的CAT2或者ARG1多肽序列的簡并組可以作為單獨的多肽進(jìn)行表達(dá)，或者備選地，作為其中含有該組CAT2或者ARG1多肽序列的一組更大的融合蛋白進(jìn)行表達(dá)(例如，用于噬菌體展示)，可以產(chǎn)生CAT2或者ARG1多肽變體的多樣化文庫。有多種方法可用于從簡并寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在CAT2或者ARG1多肽變體文庫?？梢栽谧詣踊疍NA合成儀中進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成的基因連接到適宜的表達(dá)載體中。使用基因簡并組使得能夠在一種混合物中提供編碼潛在CAT2或者ARG1多肽序列所需組的所有序列。合成簡并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域中公知的。
此外，相應(yīng)于CAT2或者ARG1基因的蛋白編碼序列的片段文庫可用于產(chǎn)生CAT2或者ARG1多肽片段的多樣化群體，以篩選和隨后選擇CAT2或者ARG1多肽的變體。在一個實施方案中，通過如下方法可以產(chǎn)生編碼序列片段文庫，即在其中每個分子僅發(fā)生約一次切割的條件下用核酸酶處理CAT2或者ARG1基因編碼序列的雙鏈PCR片段，將該雙鏈DNA變性、復(fù)性DNA形成雙鏈DNA，其可以包括來自不同切割產(chǎn)物的有義/反義對，通過用S1核酸酶處理從再形成的雙鏈體除去單鏈部分，并將所得片段文庫連接到表達(dá)載體。通過該方法，可以得到表達(dá)文庫，其編碼CAT2或者ARG1多肽的多種大小的N-末端、C-末端和內(nèi)部片段。
本領(lǐng)域中公知幾種技術(shù)可用于篩選通過點突變或者截短產(chǎn)生的組合文庫的基因產(chǎn)物，和篩選具有所選性質(zhì)的基因產(chǎn)物的cDNA文庫。用于篩選大基因文庫，可以進(jìn)行高通量分析的最廣泛使用的技術(shù)一般包括將基因文庫克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用載體的所得文庫轉(zhuǎn)化適宜的細(xì)胞，并在一定條件下表達(dá)組合基因，在所述條件下目的活性的檢測有利于分離編碼其產(chǎn)物被檢測的基因的載體。遞歸整體誘變(REM)是增強文庫中功能突變體頻率的一種技術(shù)，其可以與篩選測定法聯(lián)合使用以鑒定CAT2或者ARG1多肽變體(Delgrave等人，Protein Engineering 6327-331，1993)。
具有少于約100個氨基酸，通常小于約50個氨基酸的CAT2或者ARG1多肽或者CAT2或者ARG1多肽的變體的部分可以通過合成方法，使用本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，使用任意一種通過商業(yè)途徑可獲得的固相技術(shù)，如Merrifield固相合成方法可以合成這些多肽，在Merrifield固相合成方法中，氨基酸順序加到增長的氨基酸鏈。自動化合成多肽的設(shè)備可以通過商業(yè)途徑從供應(yīng)商如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division(FosterCity，Calif.)，并且可以根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明探作。
用于篩選蛋白抑制劑或者激活劑的方法和組合物是本領(lǐng)域中公知的。見美國專利號4,980,281、5,266,464、5,688,635和5,877,007，將它們并入本文作為參考。
抗體根據(jù)另一方面，可以制備CAT2或者ARG1蛋白的特異抗體。在許多實施方案中，本發(fā)明的抗體可以以不小于105M-1的結(jié)合親和力結(jié)合CAT2或者ARG1蛋白。不作為限制，這些抗體可以是單克隆的、多克隆的、嵌合的、人源化的、scFv、Fv、Fab’、Fab或者F(ab’)2。
可以使用全長CAT2或者ARG1蛋白，或者備選地，本發(fā)明提供了用作免疫原的CAT2或者ARG1蛋白的抗原肽片段。在許多實施方案中，CAT2或者ARG1蛋白的抗原肽含有至少8個氨基酸殘基，并且包括CAT2或者ARG1蛋白的表位，從而針對該肽產(chǎn)生的抗體與CAT2或者ARG1蛋白形成特異免疫復(fù)合體。在許多其他實施方案中，抗原肽含有至少8、12、16、20或更多氨基酸殘基。
使用公知的技術(shù)可以鑒定免疫原性部分(表位)。這些技術(shù)包括篩選多肽與抗原特異抗體、抗血清和/或T細(xì)胞系或者克隆反應(yīng)的能力。可以如文中描述的并使用熟知的技術(shù)制備這些抗血清和抗體。CAT2或者ARG1蛋白的表位是以基本上不小于全長多肽的反應(yīng)性(例如，在ELISA和/或T細(xì)胞反應(yīng)性測定中)的水平與這些抗血清和/或T細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的部分。這些表位可以在這些測定中以相似于或者大于全長多肽的反應(yīng)性發(fā)生反應(yīng)。通常使用本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員熟知的方法可以實施這些篩選。例如，多肽可以固定在固體支持體上并與患者血清接觸以允許血清內(nèi)的抗體結(jié)合所固定的多肽。然后除去未結(jié)合的血清并使用例如，125I標(biāo)記的A蛋白檢測結(jié)合的抗體。
抗原肽包括的示例性表位是位于該多肽的表面的CAT2或者ARG1蛋白的區(qū)域，例如，親水區(qū)，以及具有高抗原性的區(qū)域。
CAT2或者ARG1免疫原(例如，CAT2或者ARG1蛋白、其片段，或者CAT2-或者ARG1-融合蛋白)通常用于通過用所述免疫原免疫適宜的受試者(例如，兔、山羊、小鼠或其他哺乳動物)制備抗體。適宜的免疫原制劑可以含有例如，重組表達(dá)的CAT2或者ARG1免疫原或者化學(xué)合成的CAT2或者ARG1免疫原。該制劑可以還包括佐劑，如弗氏完全或不完全位劑，或者類似的免疫剌激劑。用免疫原性制劑免疫適宜的受試者誘導(dǎo)抗-CAT2或者抗ARG1抗體應(yīng)答。制備、分離和使用單克隆和多克隆抗-CAT2或者抗-ARG1抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及單克隆或多克隆抗-CAT2或者抗-ARG1抗體。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實例包括F(ab)和F(ab’)2片段，其可以通過用酶如胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生。本發(fā)明提供了結(jié)合CAT2或者ARG1蛋白的多克隆和單克隆抗體。
通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，使用固定化CAT2或者ARG1蛋白或者CAT2或者ARG1蛋白的片段可以隨時間進(jìn)展監(jiān)控所免疫的受試者中抗-CAT2或者抗-ARG1抗體效價。如果希望，可以從哺乳動物(例如，從血液)分離針對CAT2或者ARG1蛋白的抗體分子并通過眾所周知的技術(shù)，如A蛋白層析進(jìn)一步純化，以得到IgG級分。在免疫后的適宜時間，例如，當(dāng)抗-CAT2或者抗-ARG1抗體效價最高時，可以從受試者得到產(chǎn)生抗體的細(xì)胞并用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備單克隆抗體，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)為例如，雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)、EBV-雜交瘤技術(shù)，或者三體瘤(trioma)技術(shù)。用于產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)是眾所周知的。
用于融合淋巴細(xì)胞和無限增殖化細(xì)胞系的許多眾所周知的方案的任一種可以用于產(chǎn)生抗-CAT2或者抗-ARG1單克隆抗體。通常，無限增殖化細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系)可以來源于與淋巴細(xì)胞相同的哺乳動物物種。例如，通過將來自用本發(fā)明的免疫原性制劑免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞與無限增殖化小鼠細(xì)胞系融合可以產(chǎn)生鼠雜交瘤。無限增殖化細(xì)胞系的實例包括對含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基)敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。許多骨髓瘤細(xì)胞系的任意一種可用作根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的融合配偶體，例如，P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp210-Ag14骨髓瘤株系。這些骨髓瘤株系可以從ATCC得到。通常，使用聚乙二醇(“PEG”)將HAT敏感小鼠骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞融合。然后使用HAT培養(yǎng)基選擇融合得到的雜交瘤細(xì)胞，所述培養(yǎng)基殺死未融合的和非生產(chǎn)性融合的骨髓瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞因為未受轉(zhuǎn)化而在數(shù)天后死亡)。通過對雜交瘤培養(yǎng)物上清液篩選特異結(jié)合CAT2或者ARG1多肽的抗體，例如，使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測定法，檢測產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的備選方法是通過用CAT2或者ARG1蛋白篩選重組組合免疫球蛋白文庫(例如，抗體噬菌體展示文庫)從而分離結(jié)合CAT2或者ARG1蛋白的免疫球蛋白文庫成員，可以鑒定和分離單克隆抗-CAT2或者抗-ARG1抗體。產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒可通過商業(yè)途徑獲得(例如，PharmaciaRecombinant Phage Antibody System，目錄號27-9400-01；和Stratagene SurfZApTMPhage Display Kit，目錄號240612)。
抗-CAT2或者抗-ARG1抗體還包括“單鏈Fv”或者“scFv”抗體片段。scFv片段含有抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽還包括VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其使得scFv形成抗原結(jié)合所希望的結(jié)構(gòu)。
此外，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括含有人和非人部分的重組抗-CAT2或者抗-ARG1抗體，如嵌合的和人源化的單克隆抗體，所述抗體可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備。這些嵌合和人源化單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域中公知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。
人源化抗體是人受試者的治療性治療中所希望的。非人(例如，鼠)抗體的人源化形式是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白鏈或者其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或者抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)，其含有來源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中形成受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基由來自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠或者兔的具有所需特異性、親和性和能力的CDR的殘基替換。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架殘基由相應(yīng)非人殘基替換。人源化抗體可以還含有既不在受體抗體也不在輸入的CDR或者構(gòu)架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體將含有基本上所有或至少一個，且通常兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有CDR區(qū)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些CDR區(qū)，并且所有或基本上所有恒定區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些恒定區(qū)。人源化抗體也可以包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，如人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
這些人源化抗體可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因小鼠不能表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但是可以表達(dá)人重鏈和輕鏈基因。用所選抗原，例如，CAT2或者ARG1蛋白的全部或部分以正常方式免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。用常規(guī)雜交瘤技術(shù)可以得到針對該抗原的單克隆抗體。該轉(zhuǎn)基因小鼠含有的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因可以在B細(xì)胞分化期間重排，并隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。從而，使用這種技術(shù)，可能產(chǎn)生治療上有用的IgG、IgA和IgE抗體。
用稱作“引導(dǎo)選擇”的技術(shù)可以產(chǎn)生識別所選表位的人源化抗體。在該方法中，所選的非人單克隆抗體，例如，鼠抗體，用于引導(dǎo)識別相同表位的人源化抗體的選擇。
在一個實施方案中，針對CAT2或ARG1蛋白的抗體能夠減弱或者除去CAT2或ARG1蛋白的生物學(xué)功能。在許多情況中，可以得到活性中至少25％的降低。在許多其他情況中，可以實現(xiàn)活性中降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或以上。
抗-CAT2或者抗-ARG1抗體可以用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如親和層析或者免疫沉淀分離CAT2或ARG1蛋白或CAT2或ARG1蛋白的突變體?？?CAT2或者抗-ARG1抗體有利于從細(xì)胞純化天然或突變的CAT2或ARG1蛋白和純化宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的CAT2或ARG1蛋白。此外，抗-CAT2或者抗-ARG1抗體可以用于檢測CAT2或ARG1蛋白(例如，在細(xì)胞表面上的細(xì)胞裂解物中或者細(xì)胞上清液中)以便評估CAT2或ARG1蛋白表達(dá)的豐度和模式?？?CAT2或者抗-ARG1抗體可診斷性用于監(jiān)控組織中蛋白水平作為臨床檢測步驟的一部分，以用于例如，確定給定治療方案的功效。將抗體偶聯(lián)(例如，物理連接)可檢測的物質(zhì)可以促進(jìn)檢測?？蓹z測物質(zhì)的實例包括多種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料，或者放射性材料。適宜的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶，或者乙酰膽堿酯酶；適宜的輔基復(fù)合體的實例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適宜的熒光材料的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或者藻紅蛋白；發(fā)光材料的實例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；適宜的放射性材料的實例包括125I、131I、35S和3H。
本發(fā)明的抗-CAT2或者抗-ARG1抗體還可以用于將治療劑靶向具有升高的CAT2或ARG1表達(dá)的細(xì)胞或組織。例如，治療劑如小分子CAT2或ARG1拮抗劑可以連接到抗-CAT2或者抗-ARG1抗體以便將該治療劑靶向具有升高的CAT2或ARG1表達(dá)的細(xì)胞或組織。
治療劑可以直接或間接(例如通過接頭基團(tuán))偶聯(lián)(例如，共價連接)到適宜的單克隆抗體。當(dāng)試劑和抗體的每一種都具有與另一種反應(yīng)的取代基時，該試劑和抗體之間的直接反應(yīng)是可能的。例如，試劑和抗體其一之上的親核基團(tuán)，如氨基或者巰基能夠與試劑和抗體兩者另一種上的含有羰基的基團(tuán)，如酸酐或者酸性鹵化物，或者是含有良好離去基團(tuán)(例如，鹵化物)的烷基反應(yīng)。
備選地，可以希望通過接頭基團(tuán)將治療劑與抗體偶聯(lián)。接頭基團(tuán)可以作為間隔區(qū)起作用，以使抗體與試劑遠(yuǎn)離以便避免干擾結(jié)合能力。接頭基團(tuán)也可以用于增加試劑或者抗體上取代基的化學(xué)反應(yīng)性，從而增加偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的增加可以促進(jìn)試劑，或者試劑上官能團(tuán)的使用，其否則將是不可能的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是多種同功能或異功能雙功能或者多功能試劑(如Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.的目錄中描述的那些)可以用作接頭基團(tuán)。例如，通過氨基、羧基、巰基或者氧化的糖殘基可以實現(xiàn)偶聯(lián)。有許多參考文獻(xiàn)描述這些方法，例如，Rodwell等人的美國專利號4,671,958。
當(dāng)治療劑在沒有本發(fā)明的免疫綴合物的抗體部分時更有效時，可以希望使用接頭基團(tuán)，其在內(nèi)化到細(xì)胞期間或之后是可切割的。已經(jīng)描述了許多不同的可切割的接頭基團(tuán)。試劑從這些接頭基團(tuán)細(xì)胞內(nèi)釋放的機制包括通過二硫鍵還原(例如，Spitler的美國專利號4,489,710)，通過光不穩(wěn)定鍵的照射(例如，Senter等人的美國專利號4,625,014)，通過衍生化氨基酸側(cè)鏈的水解(例如，Kohn等人的美國專利號4,638,045)，通過血清補體介導(dǎo)的水解(例如，Rodwell等人的美國專利號4,671,958)，和酸催化的水解(例如，Blattler等人的美國專利號4,569,789)進(jìn)行的切割。
可能希望將一個以上的試劑偶聯(lián)到抗體。在一個實施方案中，一種試劑的多個分子偶聯(lián)到一個抗體分子。在另一實施方案中，一種以上類型的試劑偶聯(lián)到一個抗體。不管具體實施方案如何，可以以多種方法制備具有一個以上試劑的免疫綴合物。例如，一個以上的試劑可以直接偶聯(lián)到抗體分子，或者可以使用提供用于附著的多個位點的接頭。
載體本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼CAT2和ARG1多肽或者其部分的多核苷酸的載體。載體可以是質(zhì)粒或者病毒載體。
本發(fā)明的表達(dá)載體可設(shè)計成在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)CAT2和ARG1多肽。例如，CAT2和ARG1多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或者哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。在某些實施方案中，這些蛋白可用作例如本發(fā)明的治療蛋白。備選地，例如，使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶，表達(dá)載體可以在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。
在另一實施方案中，使用包括組織特異調(diào)節(jié)元件的哺乳動物表達(dá)載體表達(dá)目標(biāo)多核苷酸。組織特異調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域中公知的并且可以包括上皮細(xì)胞特異的啟動子。適宜的組織特異的啟動子的其他非限制性實例包括肝特異的清蛋白啟動子、淋巴樣特異啟動子、T細(xì)胞受體和免疫球蛋白的啟動子、神經(jīng)元特異啟動子(例如，神經(jīng)絲啟動子)、胰特異啟動子，和乳腺特異啟動子(例如，乳清啟動子)。還包括發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子，例如，甲胎蛋白啟動子。
本發(fā)明還提供了重組表達(dá)啟動子，其含有以反義方向克隆到表達(dá)載體中的編碼CAT2或ARG1多肽的多核苷酸。即，DNA分子以一定方式可探作地連接調(diào)節(jié)序列，所述方式允許表達(dá)(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)與相應(yīng)于本發(fā)明的CAT2或ARG1基因的mRNA反義的RNA分子?？梢赃x擇可操作地連接以反義方向克隆的多核苷酸的調(diào)節(jié)序列，以指導(dǎo)該反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中連續(xù)表達(dá)。例如，可以選擇病毒啟動子或增強子，或者調(diào)節(jié)序列以指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異的或者細(xì)胞類型特異的表達(dá)。反義表達(dá)載體可以為重組質(zhì)粒、噬菌?；蛘邷p毒病毒的形式，其中在高效調(diào)節(jié)區(qū)的控制下產(chǎn)生反義多核苷酸。通過載體所導(dǎo)入的細(xì)胞類型可以確定啟動子/增強子的活性。
本發(fā)明還提供基因遞送載體，用于將多核苷酸遞送到細(xì)胞、組織或者哺乳動物中進(jìn)行表達(dá)。例如，本發(fā)明的多核苷酸序列可以在基因遞送載體中局部或全身施用。這些構(gòu)建體可以以體內(nèi)或者轉(zhuǎn)體內(nèi)(exvivo)形式利用病毒或者非病毒載體方法。使用內(nèi)源哺乳動物或者異源啟動子可以誘導(dǎo)這些編碼序列的表達(dá)。編碼序列的體內(nèi)表達(dá)可以是組成型的或者受調(diào)節(jié)的。本發(fā)明包括能夠表達(dá)預(yù)期的多核苷酸的基因遞送載體?；蜻f送載體可以為例如，病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒或者甲病毒載體。病毒載體還可以為星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細(xì)小病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、痘病毒或者批膜病毒載體。
本發(fā)明的基因治療構(gòu)建體向細(xì)胞的遞送不限于上面提及的病毒載體。還可以使用其他遞送方法和介質(zhì)，例如，核酸表達(dá)載體、連接或不連接到殺死的腺病毒自身的聚陽離子縮合的DNA、配體連接的DNA、脂質(zhì)體-DNA復(fù)合體、真核細(xì)胞遞送載體細(xì)胞、光聚合的水凝膠材料的沉積、手握式基因轉(zhuǎn)移顆粒槍、電離輻射、核電荷中和或者與細(xì)胞膜的融合?？梢允褂妙w粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。簡言之，序列可以插入到含有用于高水平表達(dá)的常規(guī)控制序列的常規(guī)載體中，然后該載體與合成的基因轉(zhuǎn)移分子，如聚合DNA-結(jié)合陽離子，像聚賴氨酸、魚精蛋白和清蛋白一起溫育，所述基因轉(zhuǎn)移分子連接到細(xì)胞靶定配體，如脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖或者運鐵蛋白。也可以使用裸露DNA。使用生物可降解的乳膠珠可以提高攝入效率。珠子的胞吞啟動后DNA包被的乳膠珠可以有效運輸?shù)郊?xì)胞中。通過處理珠子以增加疏水性從而促進(jìn)內(nèi)體的破壞和DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中可以進(jìn)一步改進(jìn)該方法。
本發(fā)明的另一方面涉及使用可調(diào)節(jié)的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CAT2或者ARG1基因。這些系統(tǒng)包括，但不限于，Tet-開/關(guān)系統(tǒng)、蛻皮激素系統(tǒng)、孕酮系統(tǒng)和雷帕霉素系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一方面涉及宿主細(xì)胞的用途，所述宿主細(xì)胞經(jīng)編碼或者含有CAT2或者ARG1多肽或者其部分的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)。宿主細(xì)胞可以為原核或真核細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞可以用于表達(dá)任意希望的CAT2或者ARG1多肽。
檢測方法如前面討論的，CAT2或者ARG1基因的表達(dá)水平可以用作炎性痰病的標(biāo)記?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中公知的任意方法檢測和測量CAT2或者ARG1產(chǎn)物(多核苷酸或者多肽)的相對量。檢測或測量可以是定性或定量的。
檢測經(jīng)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸的一般方法包括從細(xì)胞或組織樣品提取RNA，然后將標(biāo)記探針與提取的RNA雜交并檢測標(biāo)記探針(例如，RNA印跡或者核酸陣列)。
用于肽檢測的一般方法包括從細(xì)胞或組織樣品提取蛋白，然后使靶蛋白特異的抗體與蛋白樣品結(jié)合，并檢測所述抗體。例如，CAT2或者ARG1多肽的檢測可以使用抗-CAT2或者抗-ARG1多克隆抗體完成。通常通過使用標(biāo)記的第二抗體來檢測抗體。標(biāo)記可以為放射性同位素、熒光化合物、酶、酶輔因子或者配體。這些方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。
在另一實施方案中，CAT2或者ARG1蛋白表達(dá)的檢測通過使用對CAT2或者ARG1蛋白產(chǎn)物具有高結(jié)合親和性的小分子完成。在許多實例中，小分子通常是容易檢測的。在許多其他實例中，通過其他可檢測的物質(zhì)可以直接或間接標(biāo)記小分子。這些可檢測物質(zhì)的實例包括，但不限于酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、顆粒材料，或者膠體金屬。
在某些實施方案中，CAT2或者ARG1基因自身可作為炎性疾病的標(biāo)記。例如，CAT2或者ARG1基因的基因組拷貝的增加或減少(如通過基因的復(fù)制或缺失)可能與炎性疾病相關(guān)。
還可以通過凝膠電泳、柱層析，或者直接測序、定量PCR、RT-PCR、嵌套PCR或者本領(lǐng)域中公知的其他技術(shù)來評估特定CAT2或者ARG1多核苷酸分子的檢測。
使用本領(lǐng)域中公知的任意方法可以檢測CAT2或者ARG1基因的全部或部分的存在或者拷貝數(shù)。在一個實施方案中，用DNA印跡分析評估CAT2或者ARG1基因的存在和/或基因組拷貝的量。用于DNA檢測和/或定量的其他有用的方法包括，但不限于，直接測序、凝膠電泳、柱層析、定量PCR，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其他方法。
篩選方法本發(fā)明還提供了用于鑒定調(diào)節(jié)劑的方法(文中也稱作“篩選測定法”)，所述調(diào)節(jié)劑即含有治療部分(例如，肽、肽模擬物(peptidomimetic)、類肽、多核苷酸、小分子或者其他藥物)的候選或者受試化合物或試劑，其(a)結(jié)合CAT2或者ARG1蛋白，或者(b)對CAT2或者ARG12蛋白的活性具有抑制作用，或者，更具體地，(c)對CAT2或者ARG1蛋白與其一種或多種天然底物(例如，肽、蛋白、激素、輔因子或者多核苷酸)的相互作用具有調(diào)節(jié)作用，或(d)對CAT2或者ARG1基因的表達(dá)具有抑制作用。這些測定法通常包括CAT2或者ARG1基因與一種或多種測定組分之間的反應(yīng)。其他組分可以是受試化合物自身，或者受試化合物與CAT2或者ARG1蛋白的結(jié)合配偶體的組合。
本發(fā)明的受試化合物通常為無機分子、小有機分子和生物分子。生物分子包括，但不限于氨基酸、核酸、脂質(zhì)、糖、類固醇、多肽、多核苷酸、多糖，以及在哺乳動物中具有生物活性的任何天然存在的或者合成的有機化合物。在一個實施方案中，受試化合物為小有機分子。在另一實施方案中，受試化合物為生物分子。
本發(fā)明的受試化合物可以從任意可利用的來源得到，所述來源包括天然和/或合成化合物的系統(tǒng)文庫。通過本領(lǐng)域中公知的組合文庫方法中許多方法的任一種可以得到受試化合物，所述方法包括生物文庫；類肽文庫(具有肽功能但是具有酶降解抗性的新的非肽主鏈但是仍然保持生物活性的分子文庫，見，例如，Zuckermann等人，J.Med.Chem.372678-85，1994)；空間可尋址的平行固相或者液相文庫；需要去卷積的合成文庫方法；“一珠一化合物”文庫方法；和使用親和層析選擇的合成文庫方法。生物文庫和類肽文庫方法局限于肽文庫，而其他四種方法可應(yīng)用于肽、非肽寡聚體或者小分子化合物的文庫(Lam，Anticancer Drug Des.12145，1997)。
如文中所用的術(shù)語“結(jié)合配偶體”指生物活性劑，其作為CAT2或者ARG1蛋白的底物，或者備選地，作為對CAT2或者ARG1蛋白具有結(jié)合親和性的配體。如上面提到的，生物活性劑可以是多種天然存在的或者合成化合物、氨基酸、多肽、多糖、核苷酸或者多核苷酸的任一種。
CAT2或者ARG1蛋白抑制劑的篩選本發(fā)明提供了篩選作為CAT2或者ARG1蛋白的抑制劑的受試化合物，和篩選含有所述受試化合物的藥物組合物的方法。所述篩選方法包括將表達(dá)CAT2或者ARG1的細(xì)胞樣品的等分試樣與多種受試化合物之一接觸，并比較每一等分試樣中CAT2的表達(dá)以確定相對于用其他受試化合物處理的樣品或相對于未處理的樣品或?qū)φ諛悠?，任一種受試化合物是否提供了CAT2或者ARG1的表達(dá)水平或者活性的顯著降低。此外，通過組合受試化合物與CAT2或者ARG1蛋白并從而確定受試化合物對CAT2或者ARG1蛋白的影響可以設(shè)計篩選方法。
此外，本發(fā)明還涉及篩選能夠調(diào)節(jié)CAT2或者ARG1蛋白與結(jié)合配偶體的結(jié)合的受試化合物的方法，所述方法通過將受試化合物、CAT2或者ARG1蛋白，和結(jié)合配偶體一起組合并確定是否發(fā)生結(jié)合配偶體和CAT2或者ARG1蛋白的結(jié)合來實現(xiàn)。受試化合物可以是小分子或者是生物分子。如下文討論的，從本領(lǐng)域中眾所周知的多種文庫可以提供受試化合物。
用于篩選蛋白抑制劑的其他方法和組合物是本領(lǐng)域中公知的。見美國專利號4,980,281、5,266,464、5,688,635和5,877,007，將它們并入作為參考。
CAT2或者ARG1表達(dá)、活性或者結(jié)合能力的抑制劑可用作本發(fā)明的治療組合物。CAT2-介導(dǎo)的精氨酸轉(zhuǎn)運的抑制劑之一是賴氨酸。這些抑制劑可以配制成藥物組合物，如下文描述。
高通量篩選測定法本發(fā)明提供了對能夠抑制CAT2或者ARG1的活性或表達(dá)的受試化合物進(jìn)行高通量篩選的方法。在一個實施方案中，高通量篩選方法包括組合受試化合物和CAT2或者ARG1蛋白并檢測受試化合物對CAT2或者ARG1蛋白的效應(yīng)。功能測定法，如細(xì)胞傳感器微生理儀(cytosensormi crophysiometer)、鈣通量測定法，如FLIPR(Molecular Devices Corp，Sunnyvale，CA)，或者TUNEL測定法可以用于測量細(xì)胞活性，如下文討論。
多種高通量功能測定法是本領(lǐng)域眾所周知的并且可聯(lián)合用于篩選和/或研究不同類型的激活受試化合物的反應(yīng)性。因為偶聯(lián)系統(tǒng)通常難以預(yù)測，所以需要配置許多測定法以檢測多種偶聯(lián)機制。多種基于熒光的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的并且能夠高通量和超高通量篩選活性，包括但不限于BRET或FRET(都由Packard Instrument Co.，Meriden，CT生產(chǎn))。還可以操作BIACORE系統(tǒng)以檢測受試化合物與治療靶的單獨組分的結(jié)合。
通過組合受試化合物與CAT2或者ARG1蛋白并確定它們之間的結(jié)合活性，可以進(jìn)行診斷分析以闡明偶聯(lián)系統(tǒng)。使用細(xì)胞傳感器微生理儀的一般測定法也可用于測量代謝活化，而鈣運動的變化可以通過使用基于熒光的技術(shù)，如FLIPR(Molecular Devices Corp，Sunnyvale，CA)進(jìn)行檢測。此外，通過TUNEL測定法可以確定細(xì)胞凋亡細(xì)胞的存在，所述測定法利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡期間基因組DNA的切割導(dǎo)致的游離3-OH末端。如上文提到的，本領(lǐng)域中眾所周知的多種功能測定法可聯(lián)合用于篩選和/研究不同類型的活化受試化合物的反應(yīng)性。在一個實施方案中，本發(fā)明的高通量篩選測定法利用如BIACORE系統(tǒng)(Biacore International AB，Uppsala，瑞典)提供的元標(biāo)記的等離子體共振技術(shù)。當(dāng)表面等離子體波在金屬/液體界面激發(fā)時發(fā)生無等離子體的共振。通過接觸樣品導(dǎo)致反射從表面直射的光，表面等離子體共振導(dǎo)致表面層折射率的變化。表面層質(zhì)量濃度的給定變化的折射率改變對于許多生物活性劑(包括蛋白、肽、脂質(zhì)和多核苷酸)是類似的，且因為BIACORE傳感器表面可以功能化以結(jié)合多種這些生物活性劑，所以可以檢測多種受試化合物。
因此，本發(fā)明提供了對受試化合物高通量篩選抑制CAT2或者ARG1蛋白的活性的能力，這通過將受試化合物與CAT2或者ARG1蛋白在高通量測定法，如BIACORE，或者在基于熒光的測定法，如BRET中組合來實現(xiàn)。此外，高通量測定法可用于鑒定結(jié)合CAT2或者ARG1蛋白的特定因子，或者備選地，鑒定防止CAT2或者ARG1蛋白與結(jié)合配偶體結(jié)合的受試化合物。此外，高通量篩選測定法可經(jīng)改進(jìn)用于確定受試化合物是否能夠結(jié)合CAT2或者ARG1蛋白或者結(jié)合CAT2或者ARG1蛋白的結(jié)合配偶體。
診斷測定法檢測生物樣品中CAT2或者ARG1或者編碼CAT2或者ARG1的多核苷酸的存在的示例性方法包括從受試者得到生物樣品，并將生物樣品與能夠檢測所述蛋白或者編碼CAT2或者ARG1的多核苷酸(例如，mRNA，基因組DNA)的化合物或者試劑接觸，從而在該生物樣品中檢測到CAT2或者ARG1多核苷酸的存在。檢測相應(yīng)于CAT2或ARG1基因或者CAT2或ARG1蛋白的mRNA或者基因組DNA的示例性試劑是能夠與CAT2或者ARG1 mRNA或者基因組DNA雜交的經(jīng)標(biāo)記的多核苷酸探針。用于本發(fā)明的診斷測定法的適宜的探針在本文中描述。檢測CAT2或者ARG1蛋白的示例性試劑是特異識別CAT2或者ARG1蛋白的抗體。
診斷測定法也可用于定量生物樣品中CAT2或者ARG1的表達(dá)量或者活性。這種定量可用于例如，確定炎性疾病，如哮喘、COPD、和關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展或者嚴(yán)重性。這種定量還可用于例如，確定治療后炎性疾病的嚴(yán)重性。
使用例如含有至少一種文中描述的探針多核苷酸或者抗體試劑的預(yù)包裝診斷試劑盒可以實施文中描述的方法，例如，所述試劑盒可以方便地用于臨床環(huán)境中以診斷顯示出炎性疾病如哮喘、COPD和關(guān)節(jié)炎的癥狀或者家族史的受試者。
此外，其中表達(dá)CAT2或者ARG1的任意細(xì)胞類型或者組織可以用于文中描述的預(yù)后或者診斷測定法中。
確定炎性疾病的嚴(yán)重性在診斷測定法領(lǐng)域中，本發(fā)明還提供了確定炎性疾病如哮喘、COPD和關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性的方法，該方法通過從受試者分離樣品，檢測相對于來自正常樣品或者對照樣品的第二樣品，所述受試者樣品中CAT2或者ARG1的存在、量和/或活性。在一個實施方案中，比較了兩種樣品中CAT2或者ARG1的表達(dá)水平，且受試樣品中CAT2或者ARG1提高的表達(dá)表明為炎性疾病如哮喘、COPD和關(guān)節(jié)炎。
檢測CAT2或者ARG1的示例性試劑是能夠結(jié)合CAT2或者ARG1的抗體。在一些情況中，抗體可以直接或者間接偶聯(lián)到可檢測標(biāo)記?？贵w可以是多克隆或單克隆的?？梢允褂猛暾贵w，或者其片段(例如，F(xiàn)ab或者F(ab’)2)。關(guān)于探針或者抗體，術(shù)語“標(biāo)記的”意在包括將可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(例如，物理連接)到探針或者抗體來直接標(biāo)記該探針或者抗體，以及通過與直接標(biāo)記的另一試劑的反應(yīng)性間接標(biāo)記探針或者抗體。間接標(biāo)記的實例包括使用熒光標(biāo)記的第二抗體來檢測第一抗體和用生物素末端標(biāo)記DNA探針從而其可以用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白檢測。術(shù)語“生物樣品”意在包括從受試者分離的組織、細(xì)胞和生物流體，以及受試者體內(nèi)的組織、細(xì)胞和流體。即，本發(fā)明的檢測方法可用于體外和體內(nèi)檢測生物樣品中的CAT2或者ARG1 mRNA、蛋白或者基因組DNA。例如，用于檢測CAT2或者ARG1 mRNA的體外技術(shù)包括RNA印跡雜交和原位雜交。用于檢測CAT2或者ARG1的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)、蛋白印跡、免疫沉淀和免疫熒光。用于檢測CAT2或者ARG1基因組DNA的體外技術(shù)包括DNA印跡雜交。此外，用于檢測CAT2或者ARG1的體內(nèi)技術(shù)包括向受試者導(dǎo)入標(biāo)記的抗-CAT2或者抗ARG1抗體。例如，可以用放射性標(biāo)記來標(biāo)記抗體，該放射性標(biāo)記在受試者中的存在和位置可以通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測。
在一個實施方案中，生物樣品含有來自受試者的蛋白分子。備選地，生物樣品可以含有來自受試者的mRNA分子或者來自受試者的基因組DNA分子。在一個實例中，生物樣品是通過常規(guī)方法從受試者分離的組織樣品，例如，活組織檢查。
預(yù)后測定法文中描述的診斷方法還可用于鑒定患有或者有危險發(fā)展為與異常CAT2或者ARG1表達(dá)或活性相關(guān)的炎性痰病如哮喘、COPD和關(guān)節(jié)炎的受試者。
此外，文中描述的預(yù)后測定法可以用于確定是否可以對實施者施用試劑(例如，激動劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白、肽、多核苷酸、小分子或者其他候選藥物)以治療或者預(yù)防與異常CAT2或者ARG1表達(dá)或活性相關(guān)的炎性疾病。從而，本發(fā)明提供了確定受試者是否可以用試劑有效治療與增加的CAT2或者ARG1表達(dá)或活性有關(guān)的炎性疾病。
可以設(shè)計預(yù)后方法以確定經(jīng)歷炎性疾病治療的受試者是否具有差的長期存活前景或者疾病進(jìn)展。在一個實施方案中，可以在診斷后短時間內(nèi)，即，數(shù)天內(nèi)確定預(yù)后。通過建立炎性痰病的從發(fā)作到較晚期的不同階段的CAT2或者ARG1表達(dá)譜，表達(dá)模式將顯現(xiàn)出具體表達(dá)譜與預(yù)后不佳的可能性增加相關(guān)聯(lián)。然后該預(yù)后可以用于設(shè)計更積極的治療方案和增加長期存活和良好狀態(tài)的可能性。
遺傳改變的檢測本發(fā)明的方法也可用于檢測CAT2或者ARG1基因中的遺傳改變，從而確定具有所改變的基因的受試者是否處于特征為CAT2或者ARG1活性或者多核苷酸表達(dá)中異常調(diào)節(jié)的破壞的危險中。在許多實施方案中，所述方法包括檢測來自受試者的細(xì)胞樣品中存在或者不存在遺傳改變，所述遺傳改變特征是影響CAT2或者ARG1基因的完整性的至少一種改變，或者CAT2或者ARG1基因的異常表達(dá)。例如，這些遺傳改變可以通過確定下面項目至少一種的存在來檢測1)從CAT2或者ARG1基因缺失一個或多個核苷酸；2)向CAT2或者ARG1基因加入一個或多個核苷酸；3)替換CAT2或者ARG1基因的一個或多個核苷酸；4)CAT2或者ARG1基因的染色體重排；5)CAT2或者ARG1基因的信使RNA轉(zhuǎn)錄物水平的改變；6)CAT2或者ARG1基因的異常修飾，如基因組DNA甲基化模式的異常修飾；7)CAT2或者ARG1基因的信使RNA轉(zhuǎn)錄物的非野生型剪接模式的存在；8)非野生型水平CAT2或者ARG1；9)CAT2或者ARG1基因的等位基因喪失；和10)CAT2或者ARG1的不適宜的翻譯后修飾。如文中描述的，本領(lǐng)域中有許多公知的測定法，它們可用于檢測CAT2或者ARG1基因中的改變。示例性生物樣品是通過常規(guī)方法從受試者分離的血液樣品。
在某些實施方案中，改變的檢測包括在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，如錨式PCR或者RACE PCR，或者備選地，在連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)中使用探針/引物，LCR可用于檢測CAT2或者ARG1基因中的點突變。該方法可以包括以下步驟從受試者收集細(xì)胞樣品，從該樣品的細(xì)胞分離多核苷酸(例如，基因組多核苷酸，mRNA或者兩者)，將所述多核苷酸樣品與在一定條件下與CAT2或者ARG1基因特異性雜交的一種或多種引物接觸，從而發(fā)生CAT2或者ARG1基因(如果存在)的雜交和擴增，并檢測擴增產(chǎn)物的存在或不存在，或者檢測擴增產(chǎn)物的大小并將其長度與對照樣品比較。可以理解希望將PCR和/或LCR與用于檢測文中描述的突變的任何技術(shù)結(jié)合用作初步擴增步驟。
備選擴增方法包括自動維持序列擴增、轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)、Q-β復(fù)制酶、或者任意其他多核苷酸擴增方法，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)檢測擴增的分子。這些檢測方案可用于檢測多核苷酸分子(如果這些分子以非常低的數(shù)目存在)。
在備選實施方案中，通過限制酶切割模式中的改變可以鑒定來自樣品細(xì)胞的CAT2或者ARG1基因中的突變。例如，分離樣品和對照DNA，將其擴增(任選地)，用一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶消化，并通過凝膠電泳確定片段長度大小并比較大小。樣品和對照DNA之間片段長度大小的差異表明樣品DNA存在突變。此外，序列特異的核酶可用于通過核酶切割位點的產(chǎn)生或者喪失來為特定突變的存在打分。
在其他實施方案中，CAT2或者ARG1基因中的遺傳突變可以通過將樣品和對照多核苷酸，例如，DNA或者RNA，與含有數(shù)百或數(shù)千寡核苷酸探針的高密度陣列雜交來鑒定。例如，CAT2或者ARG1基因中的遺傳突變可以在含有光產(chǎn)生的DNA探針的二維陣列中鑒定。簡言之，探針的第一雜交陣列可用于掃描樣品和對照中一段長的DNA序列，以通過產(chǎn)生順序重疊的探針的線性陣列來鑒定序列之間的堿基改變。該步驟允許鑒定點突變。該步驟后為第二雜交陣列，其允許使用與所檢測的所有變體或突變互補的更小的特定探針陣列表征特定突變。每個突變陣列由平行的探針組組成，一個探針組與野生型基因互補，而另一組與突變基因互補。
在再一個實施方案中，本領(lǐng)域中公知的多種測序反應(yīng)的任一種可以用于直接測序CAT2或者ARG1基因和通過比較樣品CAT2或者ARG1基因的序列與相應(yīng)野生型(對照)序列來檢測突變。還預(yù)期當(dāng)進(jìn)行診斷測定時可以使用多種自動化測序方法的任意一種，包括通過質(zhì)譜法測序。
檢測CAT2或者ARG1基因中突變的其他方法包括這樣的方法，其中防止切割劑影響的保護(hù)用于檢測RNA/RNA或者RNA/DNA異源雙鏈體中的錯配堿基(Myers等人，Science，2301242，1985)。通常，“錯配切割”的本領(lǐng)域技術(shù)通過提供異源雙鏈體開始，其中通過使含有野生型CAT2或者ARG1基因序列的(標(biāo)記的)RNA或者DNA與來自組織樣品的潛在突變RNA或者DNA雜交得到所述異源雙鏈體。用試劑處理雙鏈的雙鏈體，所述試劑切割由于對照和樣品鏈之間的堿基對錯配而存在的雙鏈體的單鏈區(qū)。例如，RNA/DNA雙鏈體可以用RNA酶處理并且DNA/DNA雜交體用S1核酸酶處理以酶促消化錯配區(qū)。在其他實施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA雙鏈體可以經(jīng)羥胺或者四氧化鋨和哌啶處理以消化錯配的區(qū)域。在錯配區(qū)域消化后，在變性聚丙烯酰胺凝膠上通過大小分離所得材料以確定突變位點。在一個實施方案中，可以標(biāo)記對照DNA或者RNA用以檢測。
在再一實施方案中，錯配切割反應(yīng)使用一種或多種蛋白，其在確定的系統(tǒng)中識別雙鏈DNA中的錯配堿基對(所稱作的“DNA錯配修復(fù)”酶)以對從細(xì)胞樣品所得CAT2或者ARG1 cDNAs中的點突變進(jìn)行檢測和作圖。例如，大腸桿菌的mutY酶在在G/A錯配處切割A(yù)，而來自HeLa細(xì)胞的胸苷DNA糖基化酶切割G/T錯配處的T。根據(jù)示例性實施方案，基于CAT2或者ARG1基因序列，例如，野生型CAT2或者ARG1基因序列的探針與來自受試細(xì)胞的cDNA或者其他DNA產(chǎn)物雜交。將雙鏈體用DNA錯配修復(fù)酶處理，切割產(chǎn)物(如果存在)可以從電泳方案等檢測到。見，例如，美國專利號5,459,039。
在其他實施方案中，電泳遷移率的改變將用于鑒定CAT2或者ARG1基因中的突變。例如，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)可用于檢測突變和野生型多核苷酸之間電泳遷移率的不同。樣品和對照CAT2或者ARG1多核苷酸的單鏈DNA片段可以被變性并允許其復(fù)性。單鏈多核苷酸的二級結(jié)構(gòu)根據(jù)序列而變。電泳遷移率中所得改變使得可以檢測甚至單個堿基改變。DNA片段可以用經(jīng)標(biāo)記的探針標(biāo)記或者檢測。通過使用RNA(而不是DNA)可以增強該測定的靈敏度，其中二級結(jié)構(gòu)對序列的改變更敏感。在一個實施方案中，主題方法使用異源雙鏈體分析來基于電泳遷移率的改變分離雙鏈異源雙鏈體分子(Keen等人，Trends Genet.75-7，1991)。
在再一個實施方案中，使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)測定含有變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中突變體或野生型片段的運動。當(dāng)DGGE用作分析方法時，將修飾DNA以確保其不完全變性，這可以通過例如由PCR加入高熔點富含GC的DNA的約40bp的GC夾來實現(xiàn)。在另一實施方案中，用溫度梯度代替變性梯度以鑒定對照和樣品DNA的遷移率的不同(Rosenbaum和Reissner，Biophys.Chem.26512753，1987)。
檢測點突變的其他技術(shù)的實例包括，但不限于，選擇性寡核苷酸雜交、選擇性擴增或者選擇性引物延伸。例如，可以制備寡核苷酸引物，其中已知的突變置于中央，然后在一定條件下與靶DNA雜交，所述條件僅當(dāng)發(fā)現(xiàn)完全匹配時允許雜交(Saiki等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866230，1989)。當(dāng)這些等位基因特異的寡核苷酸附著到雜交膜，并與標(biāo)記的靶DNA雜交時，這些寡核苷酸與PCR擴增的靶或者許多不同的突變雜交。
備選地，依賴于選擇性PCR擴增的等位基因特異的擴增技術(shù)可以與本發(fā)明結(jié)合使用。用作特異擴增引物的寡核苷酸可以在該分子的中間(從而擴增依賴于不同的雜交)或者一種引物的最3’末端攜帶目標(biāo)突變，其中在適宜的條件下，錯配可以防止或者減小聚合酶延伸。此外，希望在突變區(qū)域中導(dǎo)入新的限制位點以產(chǎn)生基于切割的檢測。預(yù)期在某些實施方案中，使用用于擴增的Taq連接酶可以進(jìn)行擴增。在某些情況中，僅當(dāng)在5’序列的3’末端存在完全匹配時發(fā)生連接，使得可能通過尋找擴增的存在或不存在檢測特定位點已知突變的存在。
監(jiān)控臨床試驗期間的效果監(jiān)控試劑(例如，藥物、小分子、蛋白、核苷酸)對CAT2或者ARG1表達(dá)或者活性的影響不僅可應(yīng)用于基本藥物篩選中，而且可應(yīng)用于臨床試驗中。例如，通過如文中描述的篩選測定法確定試劑降低CAT2或者ARG1表達(dá)、蛋白水平或者下調(diào)CAT2或者ARG1活性的有效性可以在表現(xiàn)出增加的CAT2或者ARG1表達(dá)、蛋白水平或者上調(diào)的CAT2或者ARG1活性的受試者的臨床試驗中監(jiān)控。在這些臨床試驗中，CAT2或者ARG1的表達(dá)或者活性可以用作特定組織表型的“讀數(shù)”。
例如，為了研究試劑對臨床試驗中CAT2-或者ARG1相關(guān)傷害的影響，可以分離細(xì)胞并制備RNA及分析CAT2或者ARG1的表達(dá)水平。通過如文中描述的RNA印跡分析、RT-PCR、GeneChip或者Taqman分析，或者備選地通過多種文中描述的方法之一測量所產(chǎn)生的蛋白的量，或者通過測量CAT2或者ARG1的活性水平，可以定量基因表達(dá)水平。這樣，基因表達(dá)水平可以作為讀數(shù)，表明細(xì)胞對試劑的生理反應(yīng)。因此，該反應(yīng)狀態(tài)可以在治療之前和用該試劑治療該個體期間的多個時間點確定。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了監(jiān)控用試劑(例如，拮抗劑、肽模擬物、蛋白、肽、多核苷酸、小分子或者通過文中描述的篩選測定法鑒定的其他候選藥物)治療受試者的有效性的方法，其包括步驟(i)在施用所述試劑前從受試者得到施用前樣品；(ii)檢測施用前樣品中CAT2或者ARG1蛋白或者mRNA的表達(dá)水平；(iii)從受試者得到一個或多個施用后樣品；(iv)檢測施用后樣品中CAT2或者ARG1蛋白或者mRNA的表達(dá)水平或者活性；(v)比較施用前樣品中CAT2或者ARG12蛋白或者mRNA的表達(dá)水平或者活性與一個或幾個施用后樣品中CAT2或者ARG1蛋白或者mRNA的表達(dá)水平或活性，和(vi)因此改變該試劑對所述受試者的施用。例如，希望減少該試劑的施用以使CAT2或者ARG1的表達(dá)或者活性增加到比所檢測的表達(dá)或者活性更高的水平，即，減小該試劑的有效性。根據(jù)這種實施方案，CAT2或者ARG1表達(dá)或者活性可以甚至在可觀察到的表型應(yīng)答不存在時用作試劑有效性的指示劑。
治療方法本發(fā)明提供了治療有危險患有、易感或者診斷為炎性疾病，如哮喘、COPD和骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療方法。關(guān)于治療的預(yù)防和治療方法，可以基于從藥物基因組學(xué)(Pharmacogenomics)領(lǐng)域得到的知識特別定制或者改進(jìn)這些治療。文中所用“藥物基因組學(xué)”包括將基因組學(xué)技術(shù)，如基因測序、統(tǒng)計遺傳學(xué)和基因表達(dá)分析應(yīng)用于藥物的臨床開發(fā)和上市。更具體地，該術(shù)語指研究受試者的基因怎樣確定了他或她對藥物的應(yīng)答(例如，受試者的“藥物應(yīng)答表型”或者“藥物應(yīng)答基因型”)。從而，本發(fā)明的另一方面提供了根據(jù)個體的藥物應(yīng)答定制用CAT2或ARG1調(diào)節(jié)劑對該個體的預(yù)防或治療性治療的方法。藥物基因組學(xué)允許臨床醫(yī)生或者內(nèi)科醫(yī)生將預(yù)防或治療性治療靶向?qū)脑撝委熓芤孀疃嗟氖茉囌卟⑶冶苊馐故茉囌呓?jīng)歷毒性藥物相關(guān)的副作用的治療。
預(yù)防方法一方面，本發(fā)明提供了通過對受試者施用調(diào)節(jié)CAT2或者ARG1表達(dá)或者活性的試劑防止受試者中CAT2-或者ARG1-相關(guān)的病理過程的方法。
處于與異常CAT2或者ARG1表達(dá)或者活性相關(guān)的炎性痰病，如哮喘的危險中的受試者可以通過例如，文中描述的診斷或者預(yù)后測定法的任一種或者聯(lián)合來鑒定。
可以在特征為增加的CAT2或者ARG1蛋白表達(dá)的癥狀表現(xiàn)之前施用預(yù)防劑，從而該疾病得到預(yù)防，或者備選地，延遲其發(fā)展。依賴于CAT2或者ARG1異常的類型(例如，通常正常標(biāo)準(zhǔn)偏差之外的調(diào)節(jié))，可將例如CAT2或者ARG1突變蛋白、CAT2或者ARG1蛋白拮抗劑、抗-CAT2或者抗-ARG1抗體、或者CAT2或者ARG1反義多核苷酸用于治療受試者?？梢曰谖闹忻枋龅暮Y選測定法確定適宜的試劑。
治療方法本發(fā)明的另一方面涉及為了治療目的調(diào)節(jié)CAT2或者ARG1蛋白表達(dá)或者活性的方法。因此，在示例性實施方案中，用于本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法包括將細(xì)胞與抑制CAT2或者ARG1表達(dá)或者與該細(xì)胞相關(guān)的CAT2或者ARG1蛋白的一種或多種活性的試劑進(jìn)行接觸。調(diào)節(jié)CAT2或者ARG12表達(dá)或者蛋白活性的試劑可以為文中描述的試劑，如多核苷酸、多肽或者多糖、CAT2或者ARG1蛋白的天然存在的靶分子(例如，CAT2或者ARG1蛋白底物或者受體)、抗-CAT2或者抗-ARG1抗體、CAT2或者ARG1蛋白拮抗劑、CAT2或者ARG1蛋白拮抗劑的肽模擬物，或者其他小有機和元機分子。
這些調(diào)節(jié)方法可以在體內(nèi)進(jìn)行(例如，通過對受試者施用所述試劑)。同樣，本發(fā)明提供了治療診斷為患有或者有危險患有特征為CAT2或者ARG1的增強表達(dá)或活性的炎性疾病的個體的方法。在一個實施方案中，該方法包括施用下調(diào)CAT2或者ARG1表達(dá)或者活性的試劑(例如，通過文中描述的篩選測定法鑒定的試劑)或者試劑的組合。所述治療可以進(jìn)一步定位于受炎性痰病侵襲的組織或者細(xì)胞。
藥物基因組學(xué)結(jié)合使用CAT2或者ARG1調(diào)節(jié)劑治療炎性疾病，如哮喘、COPD和關(guān)節(jié)炎，可以考慮藥物基因組學(xué)(即，研究個體的基因型和該個體對外來化合物或者藥物應(yīng)答之間的關(guān)系)。治療劑代謝中的不同可以通過改變藥理學(xué)活性藥物的劑量和血液濃度之間的關(guān)系導(dǎo)致嚴(yán)重毒性或者治療失敗。從而，內(nèi)科醫(yī)生或者臨床醫(yī)生可以考慮應(yīng)用相關(guān)藥物基因組學(xué)研究中得到的知識確定是否施用CAT2或者ARG1調(diào)節(jié)劑以及定制用CAT2或者ARG1調(diào)節(jié)劑治療的劑量和/或治療方案。
藥物基因組學(xué)處理由于受侵襲的人中改變的藥物處置和異常作用導(dǎo)致對藥物應(yīng)答中的臨床上顯著的遺傳變異。通常，可以區(qū)分兩種類型的藥物遺傳學(xué)狀況。作為改變藥物作用于身體的方式(改變的藥物作用)的單因子傳遞的遺傳學(xué)狀況或者作為改變身體作用于藥物的方式(改變的藥物代謝)的單因子傳遞的遺傳學(xué)狀況。這些藥物遺傳學(xué)狀況可以作為罕見的遺傳缺陷或者作為天然存在的多態(tài)性出現(xiàn)。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷(G6PD)是常見遺傳酶病，其中主要臨床并發(fā)癥是攝入氧化性藥物(抗瘧藥、磺胺類藥物、鎮(zhèn)痛藥、硝基呋喃類藥物)和食用蠶豆后的溶血作用。
鑒定預(yù)測藥物應(yīng)答的基因的一種藥物基因組學(xué)方法(稱作“基因組范圍的關(guān)聯(lián)”)主要依賴于由已知的基因相關(guān)位點組成的人基因組的高分辨率圖(例如，由人基因組上60,000-100,000個多態(tài)性或者變異位點組成的“雙等位基因”基因標(biāo)記圖，每個基因具有兩種變體)。這種高分辨率遺傳圖可以與參與II/III期藥物試驗的統(tǒng)計學(xué)上顯著量受試者的每一個的基因組圖譜進(jìn)行比較以鑒定與具體所觀察到的藥物應(yīng)答或者副作用相關(guān)的基因。備選地，可以從人基因組中約數(shù)千萬已知的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的組合產(chǎn)生這種高分辨率圖。文中所用“SNP”是發(fā)生在一段DNA中單個核苷酸堿基中的常見改變。例如，DNA的每1000個堿基可以發(fā)生一個SNP。SNP可以參與疾病過程。然而，絕大多數(shù)SNP不是疾病相關(guān)的。給定基于這種SNPs發(fā)生的遺傳圖，可以將個體依賴于他們各自基因組中SNP的的具體模式分組成遺傳類別。以這種方式，可以將治療方案定制成遺傳上相似的個體，其中考慮這些遺傳相似的個體中可能是共同的性狀。
備選地，稱作“候選基因方法”的方法可以用于鑒定預(yù)測藥物應(yīng)答的基因。根據(jù)該方法，如果已知編碼藥物靶的基因(例如，CAT2或者ARG1基因)，則可以在群體中相當(dāng)容易地鑒定該基因的所有常見變體，并且可以確定具有該基因的一種形式對另一種形式是否與特定藥物應(yīng)答有關(guān)。
作為闡明性實施方案，藥物代謝酶的活性是藥物作用的強度和持續(xù)時間的主要確定因素。藥物代謝酶(例如，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)和細(xì)胞色素P450酶CYP2D6和CYPZC19)的遺傳多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)提供了關(guān)于施用藥物的標(biāo)準(zhǔn)和安全劑量后某些受試者得不到所預(yù)期的藥物效果或者表現(xiàn)出夸張的藥物應(yīng)答和嚴(yán)重毒性的解釋。這些多態(tài)性在群體中以兩種表型表達(dá)，所述表型為快代謝型(extensivemetablizer)和慢代謝型(poor metablizer)。慢代謝型基因型的流行在不同群體中不同。例如，編碼CYP2D6的基因是高度多態(tài)的并且在慢代謝型中已經(jīng)鑒定了幾種突變，它們都導(dǎo)致功能CYP2D6的不存在。CYP2D6和CYP2C19的慢代謝型當(dāng)接受標(biāo)準(zhǔn)劑量時經(jīng)常經(jīng)歷夸張的藥物應(yīng)答和副作用。如果代謝物是活性治療部分，那么慢代謝型不表現(xiàn)出治療應(yīng)答，如CYP2D6形成的代謝物嗎啡介導(dǎo)的可待因的鎮(zhèn)痛作用所闡明的。另一個極端是所稱作的超快代謝型，它們不應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)劑量。最近，超快代謝的分子基礎(chǔ)已經(jīng)鑒定為是由于CYP2D6基因擴增。
備選地，稱作“基因表達(dá)作圖”的方法可用于鑒定預(yù)測藥物應(yīng)答的基因。例如，施用藥物的動物的基因表達(dá)(例如，針對CAT2或者ARG1調(diào)節(jié)劑的CAT2或者ARG1表達(dá))可以指示與毒性相關(guān)的基因途徑是否已經(jīng)開啟。
從一種以上的上述藥物基因組學(xué)方法產(chǎn)生的信息可用于確定個體的預(yù)防或者治療性治療的適宜劑量和治療方案。該知識當(dāng)應(yīng)用于給藥和藥物選擇時，可以避免不利反應(yīng)或者治療失敗，從而當(dāng)用CAT2或者ARG1調(diào)節(jié)劑治療受試者時增強治療或者預(yù)防效率。
藥物組合物本發(fā)明還涉及含有CAT2或者ARG1調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
文中所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”意在包括與藥物施用相容的任意和所有溶劑、增溶劑、填充劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、基質(zhì)、緩沖劑、潤滑劑、控釋載體、稀釋劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑或者抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑，等等。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和試劑的用途是本領(lǐng)域中眾所周知的。除了與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或者試劑之外，可考慮將其用于組合物中。組合物中還可以摻入補充劑。
本發(fā)明的藥物組合物被配制成與其計劃的施用途徑相容。施用途徑的實例包括腸胃外，例如，靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口(例如，吸入、舌下、支氣管和肺)、經(jīng)皮(局部)、跨粘膜和直腸施用。用于腸胃外、皮內(nèi)或者皮下應(yīng)用的溶液或者懸浮液包括下面的組分無菌稀釋劑，如注射用水、鹽溶液、固定油類、聚乙二醇、甘油；丙二醇或者其他合成溶劑；抗細(xì)菌劑如苯甲醇或者羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或者硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或者磷酸鹽和用于調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或者葡萄糖?？梢杂盟峄蛘邏A，如鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。腸胃外制劑可以封閉在玻璃或者塑料制造的安瓿瓶、一次性注射器或者多劑量瓶中。
適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(其中水可溶的)或者分散劑和用于臨時制備無菌注射液或者分散劑的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)施用，適宜的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或者磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況中，可注射組合物應(yīng)該是無菌的并且在一定程度上是流體從而可容易地注射。其必須在生產(chǎn)和儲存條件下穩(wěn)定并且必須在防止微生物如細(xì)菌和真菌污染作用的條件下保存。載體必須是溶劑或者分散介質(zhì)，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液態(tài)聚乙二醇，等等)，和它們的適宜的混合物。例如，通過使用涂層，如卵磷脂，對于分散劑而言通過保持所需的顆粒大小，和通過使用表面活性劑可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。通過多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等可以實現(xiàn)防止微生物的作用。在許多情況中，組合物中可以包括等滲劑，如氯化鈉、糖或者多元醇(例如，甘露糖醇、山梨糖醇)。通過在組合物中包括延遲吸收劑，例如，一硬脂酸鋁和明膠可以延長可注射組合物的吸收。
通過將活性CAT2或者ARG1調(diào)節(jié)劑以所需要的量與所需的上面列舉的一種成分和成分的組合摻入適宜的溶劑，然后通過過濾除菌制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入含有基本分散介質(zhì)和來自上面列舉的所需的其他成分的無菌載體中制備分散劑。對于可制備無菌注射液的無菌粉末，示例性制備方法是真空干燥和冰凍干燥，其產(chǎn)生帶有活性成分和來自前面的無菌過濾溶液的任意額外的所需要的成分的粉末。
經(jīng)口組合物通常包括情性稀釋劑或者可食用載體。它們可以封閉在明膠膠囊中或者壓縮成片劑。對于經(jīng)口治療施用，活性化合物可以摻入賦形劑并以片劑、錠劑或者膠囊的形式使用。還可以使用流體載體制備經(jīng)口組合物以用作漱口藥，其中流體載體中的化合物經(jīng)口應(yīng)用并發(fā)出嗖嗖聲且吐出或者吞下。藥學(xué)上相容的結(jié)合劑和/和佐劑材料可以包括在組合物中作為其一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等等可以含有任意下面的成分，或者具有相似性質(zhì)的化合物粘合劑，如微晶纖維素、黃著樹膠或者明膠；賦形劑，如淀粉或者乳糖；崩解劑，如藻酸、Primogel，或者玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或者Stertes；助流劑，如膠體二氧化硅；增甜劑，如蔗糖或者糖精；或者調(diào)味劑，如胡椒薄荷、水楊酸甲酯，或者橙調(diào)味劑。
對于通過吸入施用，化合物可以以從含有適宜推進(jìn)劑，例如，二氧化碳的受壓容器或者分配器、霧化器、支氣管吸入器產(chǎn)生的氣溶膠噴霧或者鼻滴劑的形式遞送。此外，化合物可以為液體溶液、凝膠或者干燥產(chǎn)物的形式。吸入制劑可以是水性溶液，其含有例如，聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽。如果需要，吸入制劑還可以含有賦形劑，如乳糖。霧化器可以是水性懸浮液或者溶液，其包括用于調(diào)節(jié)pH和/或張力的載體或者賦形劑。
在一個實施方案中，用載體制備可能含有生物活性化合物的治療部分，所述載體將保護(hù)化合物以免從身體快速除去，如控釋制劑，包括植入和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。所述材料還可以通過商業(yè)途徑，例如，從Alza Corporation and NovaPharmaceuticals，Inc獲得。脂質(zhì)體懸浮液(包括用針對病毒抗原的單克隆抗體靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)可以用作藥學(xué)上可接受的載體。這些脂質(zhì)體懸浮液可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備，例如，如美國專利號4,522,811中所述。
在一個實施方案中，以劑量單位形式制備的經(jīng)口或者腸胃外組合物用于簡便施用或者劑量的同一。文中所用的劑量單位形式包括適于作為所治療的受試者的單一劑量的物理上離散的單位；每一單位含有經(jīng)計算與所需的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生所需的治療效果的活性化合物的預(yù)定量。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由活性化合物的獨特特征和所要達(dá)到的具體治療效果，和本領(lǐng)域中配制這種活性化合物用于個體治療的內(nèi)在限制指定并直接依賴于這些條件。
這些化合物的毒性和治療功效可以由細(xì)胞培養(yǎng)物或者實驗動物中標(biāo)準(zhǔn)藥物方法確定，例如確定LD50(50％群體致死的劑量)和ED50(在50％群體中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比為治療指數(shù)并且可以表示為比率LD50/ED50。可以選擇表現(xiàn)大治療指數(shù)的化合物。盡管可以使用表現(xiàn)毒副作用的化合物，但應(yīng)該小心設(shè)計將所述化合物靶向受侵襲組織的部位的遞送系統(tǒng)，以便最小化對未受侵襲的細(xì)胞的潛在傷害，從而減小副作用。
從細(xì)胞培養(yǎng)物測定法和動物研究得到的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人的多種劑量。在許多情況中，這些化合物的劑量在循環(huán)濃度范圍內(nèi)，該循環(huán)濃度范圍包括具有很少或者沒有毒性的ED50。劑量可以在該范圍內(nèi)改變，這依賴于所用的劑型和所用的施用途徑。對于用于本發(fā)明方法的任意化合物，可以從細(xì)胞培養(yǎng)物測定法初步估計治療有效劑量。可以在動物模型中制備劑量以實現(xiàn)包括如在細(xì)胞培養(yǎng)物中確定的IC50(即實現(xiàn)癥狀的半最大抑制的受試化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度。這些信息可用于更準(zhǔn)確地確定人類中有用的劑量。例如，通過高效液相層析可以測量血漿中水平。
由主治醫(yī)生基于諸如疾病類型、病理部位、疾病的嚴(yán)重性、患者的年齡、性別和飲食、炎癥的嚴(yán)重性、施用時間和其他臨床因素的各種因素可以確定本發(fā)明的藥物組合物的施用的劑量方案。在一個實施方案中，吸入、全身或者可注射施用可以以最小有效劑量開始，并且劑量將在預(yù)定的時間過程內(nèi)增加，直到觀察到陽性結(jié)果。隨后，考慮到可能出現(xiàn)的任何不利影響，漸增劑量將限于將產(chǎn)生效果的相應(yīng)增加的水平。向最終組合物加入其他已知因子也可以影響劑量。通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法定期評估痰病發(fā)展可以監(jiān)控發(fā)展。
本發(fā)明的藥物組合物可以以一劑或者多劑施用。劑次可以以任意所需的間隔施用。在一個實施方案中，每一劑包括約0.1μg-100mg，1μg-10mg，10μg-1mg或者100μg-500μg活性治療劑?？梢允褂玫陀?.1μg或者高于100mg的劑量。每一劑的體積可以為例如，0.1ml到5ml，0.1ml到1ml或者0.2ml到0.5ml。
本發(fā)明的藥物組合物可以與施用的使用說明書一起包括在容器、包裝或者分配器中。
試劑盒本發(fā)明還包括用于檢測生物樣品中CAT2或者ARG1基因產(chǎn)物存在的試劑盒。該試劑盒可以含有在核苷酸或者蛋白水平上評估CAT2或者ARG1的表達(dá)的試劑。在一個實施方案中，所述試劑可以是抗體或者其片段，其中所述抗體或者其片段特異結(jié)合CAT2或者ARG1。例如，通過本領(lǐng)域中公知的方法可以制備目標(biāo)抗體。任選地，所述試劑盒可以含有多核苷酸探針，其中所述探針特異結(jié)合相應(yīng)于CAT2或者ARG1基因的經(jīng)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸。該試劑盒可以含有測定樣品中CAT2或者ARG1蛋白或mRNA的量的裝置和比較樣品與對照或者標(biāo)準(zhǔn)中CAT2或者ARG1蛋白或者mRNA的量的裝置?；衔锘蛘咴噭┛梢园b在適宜的容器中。該試劑盒可以還含有使用該試劑盒檢測CAT2或者ARG1蛋白或者多核苷酸的使用說明書。
本發(fā)明還提供了評估多種化合物的每一種抑制受試者中炎性疾病的適宜性的試劑盒。所述試劑盒包括所要測試的多種化合物，和用于評估CAT2或者ARG1表達(dá)的試劑(例如，對相應(yīng)蛋白特異的抗體、或者對相應(yīng)多核苷酸特異的探針或者引物)。
實施例實施例1與變應(yīng)性反應(yīng)相關(guān)的小鼠肺中的基因表達(dá)改變從Jackson Laboratories得到Balb/c小鼠(6-8周齡)。用于該研究中的所有動物都在環(huán)境受控的無病原體設(shè)施中于層流罩超凈臺下飼養(yǎng)。所有實驗都遵照關(guān)于動物的實驗室使用的Animal WelfareAct and the Department of Health，Education and Welfare(NIH)指導(dǎo)方針?biāo)械膶嶒瀯游镅芯繙?zhǔn)則。
在第0天通過腹膜內(nèi)(i.p.)注射溶于200μl PBS的10μgOVA(Sigma，St.Louis，MO)來免疫Balb/c小鼠。在第14和25天將小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪(分別為45和8mg/kg)的混合物麻醉，并用50μl OVA的1.5％溶液或者等體積PBS氣管內(nèi)攻擊。在第24、25和27天用100μl PBS、hIgG(400μg/ml)或者sIL-13Rα2-Fc(400μg/ml)腹膜內(nèi)注射小鼠。根據(jù)Urban等人，Immunity 8(2)255-645，1998實施hIgG的純化。在第28天收集肺并驟凍用于RNA分離。
為了鑒定依賴于IL-13介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的mRNA濃度的改變，在變應(yīng)性攻擊之前和期間，將兩只OVA-攻擊的小鼠用可溶IL-13受體融合蛋白sIL-13Rα2-Fc以3次腹膜內(nèi)注射進(jìn)行處理。作為受體融合蛋白的Fc部分的對照，對兩只OVA-攻擊的小鼠用腹膜內(nèi)施用hIgG進(jìn)行類似處理。第二組6只對照小鼠類似地對OVA進(jìn)行敏化而不隨后攻擊，并通過氣管內(nèi)單獨施用PBS緩沖液(n＝2)，或者連同腹膜內(nèi)注射hIgG(n＝2)或者sIL-13Rα2-Fc(n＝2)來在相同時間過程進(jìn)行處理。第二次肺抗原攻擊(第28天)后在第78小時收獲OVA攻擊的和僅緩沖液處理的對照小鼠的肺組織。
通過對用氯胺酮和甲苯噻嗪(分別為45和8mg/kg)的混合物麻醉的首次用于試驗的Balb/c小鼠或者Stat 6缺陷小鼠氣管內(nèi)滴注每天一次施用重組鼠IL-13(mIL-13；50μl終體積中5μg)，施用三天。在最初IL-13施用后72小時收集肺并在干冰上驟凍。
用液氮冷卻的研缽和研杵使驟凍的小鼠肺組織粉碎，懸浮在6ml4M異硫氰酸胍/0.7％β-巰基乙醇(GTC/ME)并脈沖超聲處理2分鐘。組織懸浮液經(jīng)酸平衡的苯酚(Promega Total RNA試劑盒)提取兩次并用等體積異丙醇沉淀核酸。將沉淀重懸在0.8ml GTC/ME中，用等體積酸化苯酚再提取兩次，并用氯仿提取1次。用乙醇沉淀RNA，將其懸浮在I DEPC處理的水中并通過OD280定量。
使用具有以前詳述的改進(jìn)的Superscript試劑盒(BRL)(Byrne等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.(New York)，2000)從10μg總RNA合成cDNA。在50℃進(jìn)行第一條鏈合成以防止從核糖體RNA錯誤引發(fā)并將含有多胸苷酸引物(T7T24)的T7RNA聚合酶啟動子用于進(jìn)行隨后體外反義RNA(cRNA)擴增和生物素標(biāo)記。用BioMag羧基末端化珠(Polysciences)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書純化cDNA，并在pH 7.8的48μl 10mM乙酸鈉中洗脫。
如所描述的(上文)實施體外T7聚合酶驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以合成和生物素標(biāo)記反義cRNA，Qiagen Rneasy旋轉(zhuǎn)柱純化及cRNA片段化。如生產(chǎn)商的使用說明書描述的，GeneChip雜交混合物含有溶于1×MES緩沖液中的10μg片段化cRNA、0.5mg/ml乙?；疊SA、0.1mg/ml鯡精DNA，其總體積為200μl。反應(yīng)混合物在45℃下與AffymetrixMullKsubA和MullKsubB寡核苷酸陣列雜交18小時。除去雜交混合物并洗滌陣列并用鏈霉抗生物素蛋白R-藻紅蛋白(Molecular Probes)使用GeneChip Fluiditics Station 400(Affymetrix)染色，并按照生產(chǎn)商的使用說明用Hewlett Packard GeneArray掃描儀掃描。收集熒光數(shù)據(jù)并用MicroArray Suite 4.0軟件轉(zhuǎn)化成基因特異差異平均值。
11成員的標(biāo)準(zhǔn)曲線由來自克隆的細(xì)菌和噬菌體序列的基因片段組成，這些曲線在濃度為0.5pM到150pM的每種雜交混合物中形成峰，代表約百萬分之(ppm)3.3到1000的RNA頻率，其中假定平均轉(zhuǎn)錄物大小為2kb。通過來自基于質(zhì)粒的模板(如前)的T7-聚合酶驅(qū)動的IVT反應(yīng)合成生物素化標(biāo)準(zhǔn)曲線片段。形成峰的生物素化RNA片段作為內(nèi)標(biāo)以評估芯片靈敏性和作為標(biāo)準(zhǔn)曲線將來自單個基因的所測量的熒光差異平均值轉(zhuǎn)化成以ppm表示的RNA頻率。含有基因特異寡核苷酸的完全匹配和一個錯配探針組之間的平均熒光差異用于確定關(guān)于形成峰的標(biāo)準(zhǔn)曲線的頻率。此外，主要基于單個陽性或者陰性應(yīng)答探針對的級分的第二組算法用于評估基因產(chǎn)物的絕對存在或者不存在(Lockhart等人，Nat.Biotechnol.141850-1856，1996)。單個微陣列芯片的靈敏度設(shè)置為最小濃度的一半，在該濃度下任意三個相鄰標(biāo)準(zhǔn)曲線峰所在的(spike-in)模板的兩個存在。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸強行通過0并且將最小報導(dǎo)的基因頻率設(shè)置為個體GeneChip的靈敏度。
測量了每一種治療或?qū)φ諏嶒灄l件的多個獨立的重復(fù)條件并將表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)統(tǒng)計學(xué)分析以期除去假陽性。從給定實驗組的個體測量測定的頻率值最初使用Excel軟件進(jìn)行比較。將治療和對照動物的平均值進(jìn)行比較以得到平均倍數(shù)改變(AFC)。用具有原始頻率值的不等協(xié)方差或者具有l(wèi)og轉(zhuǎn)化的頻率值的相等協(xié)方差計算雙尾(two-tailed)斯氏T檢驗。在該工作中，僅報告AFC改變大于2倍并且在至少一種實驗條件中斯氏t檢驗P＜0.05的那些基因。通過AFC＞2倍和t檢驗P＜0.05雙重標(biāo)準(zhǔn)確定的基因組隨后經(jīng)過編輯以除去在多數(shù)測試文件中不存在的調(diào)用基因并除去由于在MullKsubA和subB寡核苷酸陣列上基因覆蓋(tile)多次的冗余性。最后，除去所治療動物的平均表達(dá)頻率小于實驗間僅緩沖液對照的平均值2倍的那些基因。
鼠11K subA和subB GeneChip允許詢間超過13,000種鼠基因、ESTs和對照序列。寡核苷酸陣列響應(yīng)的平均靈敏度對于MullKsubA和subB寡核苷酸陣列分別為13ppm和12ppm。通過比較對肌動蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶計算的頻率比監(jiān)控所純化RNA和衍生的cDNA產(chǎn)物的質(zhì)量，所述肌動蛋白和甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶來源于獨立的探針組，所述頻率比代表來自各自基因的5’-末端對3’-末端的探針。從對照和治療動物的不同組分離的RNA的所測量的5’/3’比進(jìn)行平衡，平均值為0.81，范圍為0.77到0.90，如表3中報告。在組合的Mul1KsubA和subB GeneChip上總共13,179個覆蓋序列中，平均5294(+/-533)個基因經(jīng)調(diào)用存在于單獨分析的文件(表3)中，總的變異系數(shù)為10.1％。此外，對每個亞組報告至少一個文件中存在的所有調(diào)用基因的計算頻率的總和，平均值為485,000，總的變異系數(shù)為20.9％。芯片靈敏性和單獨GeneChip實驗的RNA質(zhì)量的相似性反映在所測量的基因表達(dá)的總體平衡中，從而為使用通常的形成峰的標(biāo)準(zhǔn)曲線格規(guī)化各個文件提供了支持(Hill，A.A.等人，Genome Biol.2(12)，2001)。
對用于鑒定變應(yīng)原攻擊誘導(dǎo)的基因表達(dá)的三個治療組的每一組測量的總體基因表達(dá)(如表3中所示)關(guān)于mRNA完整性、存在的調(diào)用基因數(shù)和在多種對照和治療文件之間計算的總mRNA頻率進(jìn)行了良好平衡。
表3.RNA平衡概述

1在至少一個文件中存在的所有調(diào)用基因的平均總頻率(×10-3)腹膜內(nèi)共同施用人IgG或者sIL-13Rα2-Fc不顯著改變對用PBS處理的對照小鼠測量的基因表達(dá)譜，從而在計算平均未處理的基線表達(dá)值時將來自6只對照小鼠的頻率值合并為一個集合。類似地，在計算肺變應(yīng)原攻擊的mRNA頻率的平均頻率值時將用腹膜內(nèi)共同施用緩沖液或者h(yuǎn)IgG處理的四只OVA攻擊的小鼠合并為一個集合。比較6只PBS處理的對照小鼠和四只OVA攻擊的小鼠之間平均肺mRNA頻率鑒定了246種覆蓋序列，其中APC為兩倍或者更大。在該基因集合中，132種滿足P＜0.05的第二種選擇標(biāo)準(zhǔn)并且在下表4中顯示。
表4.基因表達(dá)改變概述

·13,179個覆蓋序列存在的調(diào)用的mRNA轉(zhuǎn)錄物的總數(shù)。
在至少一個文件中存在的所有調(diào)用基因的平均總頻率(×10-3)滿足2倍或者更大平均倍數(shù)改變標(biāo)準(zhǔn)的基因數(shù)§滿足斯氏t檢驗標(biāo)準(zhǔn)P＜0.05的基因數(shù)。
‖滿足2倍AFC和斯氏t檢驗P＜0.05的雙重標(biāo)準(zhǔn)的基因數(shù)。
該變應(yīng)原誘導(dǎo)的基因集合隨后被過濾以除去在多數(shù)實驗測量中不存在的調(diào)用基因和冗余地覆蓋在寡核苷酸陣列的一些基因。對于僅施用緩沖液的對照小鼠、OVA攻擊的小鼠和共同施用IL-13拮抗劑的OVA攻擊的小鼠報告平均mRNA頻率值。用OVA誘導(dǎo)的表達(dá)和通過背景色表示的對照肺表達(dá)之間的相對AFC通過功能注釋對基因分類。發(fā)現(xiàn)肺變應(yīng)性應(yīng)答上調(diào)多種基因集合的表達(dá)，僅有三個統(tǒng)計學(xué)顯著降低。所誘導(dǎo)的變應(yīng)反應(yīng)基因集合的許多成員來自相關(guān)功能家族，包括Fc受體、蛋白酶、蛋白酶抑制劑、補體、殼多糖酶相關(guān)蛋白、免疫球蛋白和若干分泌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，包括趨化因子和三葉(trefoil)因子。一些基因和基因家族可以與上皮細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化和粘液分泌過多、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、呼吸道重塑和呼吸道高反應(yīng)性(AHR)的哮喘病理向關(guān)聯(lián)。
病理學(xué)研究表明含有Stat6-/-無效等位基因的小鼠中OVA攻擊引起肺嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、粘液過量產(chǎn)生和AHR的抑制(Kuperman，D.等人，J.Exp.Med.187939-948，1998；Akimoto，T.等人，J.Exp.Med.1871537-1542，1998；Miyata，S.等人，Clin.Exp。Allergy 29114-123，1999)。使用與對Balb/C野生型小鼠相同的方案，使Stat6-/-無效等位基因回交到Balb/C遺傳背景并用肺滴注mIL-13(n＝5)或者PBS緩沖液對照(n＝4)進(jìn)行處理。多劑mIL-13肺滴注后肺組織的表達(dá)譜在Stat6-/-小鼠中鑒定了AFC為2到3.2倍的28種基因，但是這些基因都不滿足T檢驗標(biāo)準(zhǔn)(p＜0.05)并且不能認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著的(表4)。此外，這28種基因都不相應(yīng)于Balb/C野生型背景中mIL-13誘導(dǎo)的基因。通過AFC在Balb/C背景中選擇的前25種統(tǒng)計學(xué)顯著的基因通過OVA攻擊的鼠肺組織中的表達(dá)進(jìn)行分類并與從相似處理的含有Stat-/-等位基因的小鼠得到的頻率值進(jìn)行比較。這些數(shù)據(jù)表明Balb/C野生型中所有測量的mIL-13介導(dǎo)的基因誘導(dǎo)需要Stat功能，這與對于Stat-/-無效小鼠中變應(yīng)原攻擊無生理應(yīng)答相一致。
作為對照，PBS緩沖液處理的Balb/C野生型(n＝4)中所測量的肺基因表達(dá)與僅緩沖液處理的含有Stat-/-無效等位基因的小鼠(n＝4)進(jìn)行比較。該比較鑒定了AFC為2倍或者更大的43種基因，和斯氏T檢驗P＜0.05的54種基因(表4)。然而，在這些基因頻率比較中，僅一種基因滿足該雙重選擇標(biāo)準(zhǔn)。血清清蛋白D-盒結(jié)合蛋白在Stat-/-無效小鼠中降低了3.2倍(P＝0.03)。除了血清清蛋白D-盒結(jié)合蛋白的一個例外，這些數(shù)據(jù)表明不存在免疫剌激時，來自Stat-/-無效等位基因的小鼠肺中總體基因表達(dá)的差異非常有限。除了比較Stat-/-mIL-13處理的和緩沖液對照小鼠之外，這些結(jié)果還提示用于過濾數(shù)據(jù)的雙重AFC和統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)可有效除去假陽性調(diào)用。
實施例2通過IL-13肺滴注誘導(dǎo)的小鼠肺中基因表達(dá)改變?yōu)榱髓b定肺基因表述中IL-13介導(dǎo)的改變，將6只Balb/c小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)用多劑5μg(0小時、24小時和48小時)肺滴注重組小鼠IL-13(mIL-13)進(jìn)行處理。對照Balb/C小鼠的第二組(n＝4)僅用緩沖液以相同的方案滴注。此外，將Stat6-/-無效小鼠用多劑mIL-13(n＝4)或者PBS緩沖液(n＝5)肺滴注進(jìn)行相同處理，之后在78小時時收獲所有肺以確定表達(dá)譜。比較通過氣管內(nèi)滴注mIL-13與僅用緩沖液對照處理的Balb/c小鼠的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)鑒定了在個體文件中存在的平均5306種調(diào)用基因中平均倍數(shù)差異大于2倍的279種基因。在這279種基因中，136種滿足第二種標(biāo)準(zhǔn)，即斯氏t檢驗P＜0.05(上表4)。
在通過變應(yīng)原攻擊和直接IL-13滴注介導(dǎo)的基因表達(dá)中存在明顯重疊。在OVA誘導(dǎo)的模型中觀察到未鑒定的IL-13上調(diào)的基因最可能地反映了直接滴注細(xì)胞因子提供的信號強度的不同。由于氣管內(nèi)IL-13施用或者IL-13的肺特異的轉(zhuǎn)基因超表達(dá)導(dǎo)致在變應(yīng)性哮喘的小鼠模型中看到的所有病理生理應(yīng)答，所以IL-13調(diào)節(jié)的基因最可能反映了疾病相關(guān)基因的擴大的集合。圖1表明CAT2和ARG1基因在接受OVA或者IL-13處理的Balb/c小鼠中受到上調(diào)。圖2顯示了OVA或者IL-13處理的Balb/c小鼠中ARG1的mRNA頻率。
實施例3在Balb/c小鼠中通過OVA或者腺病毒介導(dǎo)的IL-13表達(dá)誘導(dǎo)ARG1基因簡言之，將Balb/c小鼠鼻內(nèi)接種重組腺病毒表述鼠IL-13(Ad-IL13)或者鼠分泌的堿性磷酸酶(Ad-SBAP)的5×1010個顆粒。如實施例1中所述用PBS、OVA或者IL-13處理對照小鼠。接種后72小時處死動物并收獲肺用于RNA提取。用RN-easy Mini試劑盒(Qiagen)按照生產(chǎn)商的推薦從肺組織制備RNA。用Affymetrix Mu U74Av2寡核苷酸陣列確定ARG1表達(dá)。結(jié)果在圖3中顯示。mRNA頻率表達(dá)為百萬分之幾。
實施例4通過C57b1/6小鼠中腺病毒介導(dǎo)的IL-13表達(dá)誘導(dǎo)ARG1基因簡言之，將Ad-IL13或者Ad-SEAP的5×1010個顆粒鼻內(nèi)接種Balb/c小鼠。如實施例1中所述用PBS處理對照小鼠。接種后72小時處死動物。分離總肺RNA并如實施例2中描述的分析ARG1表達(dá)。結(jié)果在圖4中顯示。mRNA頻率表達(dá)為百萬分之幾。
實施例5用LPS和IL-13處理的鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7中CAT2和ARG1表達(dá)將匯合的RAW264.7細(xì)胞以1∶5分到補加了4mM L-谷氨酰胺(CTS)、10％胎牛血清(JRH Biosciences)、非必需氨基酸(Gibco)和10mM HEPES(Gibco)的20ml完全Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(cDME)中。用100ng/ml重組小鼠IL-13(R&D Systems)和/或1μg/ml來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型10的脂多糖(LPS)(Sigma)剌激分會合細(xì)胞24小時。24小時剌激后，從培養(yǎng)瓶刮取細(xì)胞，用冷的PBS洗滌1次，并將細(xì)胞沉淀在含有10μl/ml β-巰基乙醇的600μl緩沖液RLT(RN-easy Mini試劑盒，Qiagen)中裂解。裂解物在-80℃保存。
使用RN-easy Mini試劑盒(Qiagen)按照生產(chǎn)商的推薦從處理的RAW264.7細(xì)胞制備RNA。通過260nm的吸收定量RNA，從LPS/IL-13處理的樣品制做1∶6標(biāo)準(zhǔn)曲線，以150ng/反應(yīng)物開始。使用TaqManEZ RT-PCR試劑盒(Applied Biosystems)對所有剩余的樣品以50ng/反應(yīng)物測定Arg1、CAT1、CAT2A、CAT2B、CAT3和CAT4，并將GAPDH mRNA表達(dá)用于進(jìn)行規(guī)格化。用Primer Express軟件(Applied Biosystems)設(shè)計引物。Arg1、CAT1、CAT3和CAT2的輸入為來自GenBank的完整mRNA編碼序列，而對于CAT2僅使用CAT2A-和CAT2B-特異的外顯子。用引物序列對公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索以確保特異性。在Wyeth合成下面序列(5’－>3’)的引物和FAM-標(biāo)記的/TAMRA-淬滅的探針寡核苷酸表5引物

在ABI 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems)上使用EZ RT-PCR試劑盒中推薦的標(biāo)準(zhǔn)40輪循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴增。使用Fink等人(Fink等人，Nat.Medicine，41329-1333，1998)的方法，用閾值循環(huán)數(shù)產(chǎn)生表達(dá)指示。激光輔助的細(xì)胞挑選后進(jìn)行實時定量RT-PCR。
圖5表明CAT2A、CAT2B和ARG1表達(dá)由單獨的LPS輕微誘導(dǎo)，但是由LPS和IL-13的組合顯著誘導(dǎo)。
實施例6LPS和IL-13處理的RAW264.7細(xì)胞中的精氨酸攝入將溶于0.5ml cDME中的1×106個RAW264.7細(xì)胞鋪在24孔組織培養(yǎng)板上。貼壁2小時后，加入含有LPS(Sigma)和/或rhIL13(R&D Systems)的0.5ml培養(yǎng)基，其終濃度分別為1μ/ml和10ng/ml。在5％CO2和95％空氣的氣氛中于37℃溫育20小時后，將細(xì)胞用Arg洗滌緩沖液#1(140mM氯化膽堿、5mM KCl、0.9mMCaCl2、1mM MgSO4、5.6mM葡萄糖和25mM HEPES，pH 7.4)洗滌3次，然后用Arg轉(zhuǎn)運緩沖液(137mM氯化膽堿、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、1.2mM MgSO4、10mM HEPES，調(diào)節(jié)到pH 7.4)再洗滌4次。轉(zhuǎn)運緩沖液(0.5ml)中加入5mM L-亮氨酸(Sigma)和38nM L-[2，3，4，5-3H]精氨酸(Amersham)與L-精氨酸(Sigma)的混合物至終濃度為400μM L-精氨酸或者100μM L-精氨酸并在環(huán)境溫度溫育3分鐘。通過用含有5mM L-精氨酸的轉(zhuǎn)運緩沖液溫育每個處理的一式兩份的孔以定量非飽和結(jié)合。通過向轉(zhuǎn)運緩沖液中加入20mM L-賴氨酸(Sigma)對額外的一式兩份樣品進(jìn)行CAT2阻斷。通過用冰冷的Arg洗滌緩沖液#2(137mM NaCl，10mM Tris，10mM HEPES，pH 7.4)洗滌4次中止轉(zhuǎn)運。細(xì)胞在溶于10mM HEPES(pH 7.4)中的500μl 1.0％ SDS中裂解。用micro-BCA試劑盒(Pierce)進(jìn)行蛋白定量，并將400μl裂解物懸浮在10ml閃爍液中，裝入玻璃閃爍瓶，并進(jìn)行放射計數(shù)1分鐘。特定精氨酸吸收計算為飽和結(jié)合(CPM/mg蛋白400μM Arg)-非飽和結(jié)合(CPM/mg蛋白5mM Arg)。
如圖6中所示，通過用LPS和IL-13的組合處理RAW264.7細(xì)胞最佳誘導(dǎo)精氨酸吸收。然而，增加的精氨酸吸收受到賴氨酸的抑制(圖7)，賴氨酸是用于精氨酸轉(zhuǎn)運的CAT2的競爭性抑制劑。
實施例7用LPS和IL-13處理的RAW264.7細(xì)胞中的尿素產(chǎn)生對于精氨酸轉(zhuǎn)運研究(上文)，在24孔板中剌激RAW264.7巨噬細(xì)胞。剌激20小時后，用Arg洗滌緩沖液#1洗滌細(xì)胞三次，然后用Arg轉(zhuǎn)運緩沖液再洗滌4次。細(xì)胞在5％CO2和95％空氣的氣氛中在含有5mM L-亮氨酸、400μM L-精氨酸、+/-20mM L-賴氨酸的Arg轉(zhuǎn)運緩沖液中于37℃下溫育24小時。通過以12,000rpm離心10分鐘澄清上清液，并取100μl使用UV吸收試劑盒方法(R-Biopharma)按照生產(chǎn)商的使用說明一式三份地測定尿素，只是在總體積300μl/孔的96孔測定板中以1/10規(guī)模進(jìn)行。將細(xì)胞用500μl溶于10mM HEPES(pH 7.4)中的1.0％SDS裂解，并使用Micro-BCA試劑盒(Pierce)定量蛋白。尿素產(chǎn)生表達(dá)為μg尿素/mg蛋白裂解物。
圖8表明LPS/IL-13處理增加了RAW264.7細(xì)胞中的尿素產(chǎn)生。與圖6和7中顯示的精氨酸攝入數(shù)據(jù)一致，用于精氨酸轉(zhuǎn)運的CAT2的競爭性抑制劑賴氨酸抑制增加的尿素產(chǎn)生。
實施例8ARG1表達(dá)的誘導(dǎo)需要IL-4受體如圖1中描述的，將IL-4受體基因敲除小鼠(IL4R-/-)和IL-4基因敲除小鼠(IL4-/-)用OVA敏化，或者用PBS或者IL-13處理。分離總肺RNA并如實施例2中描述的分析ARG1表達(dá)。結(jié)果在圖10中顯示。mRNA頻率表達(dá)為百萬分之幾。
實施例9賴氨酸對氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的氣管收縮的影響將8-10周齡的大鼠用于該實驗。快速切開氣管并清除附著的結(jié)締組織。每個氣管切成長3-4mm，然后在含有載體、亮氨酸(25mM)、賴氨酸(100mM)的RPMI-1640和DMEM(v/v)培養(yǎng)基或者兩者的混合物中培養(yǎng)15-20小時。培養(yǎng)基的成分(mM)包括0.1非必需氨基酸、4％FBS、2.0谷氨酰胺、0.05β-巰基乙醇、100U/ml青霉素/100μg/ml鏈霉素。
將氣管用具有不銹鋼針的棒縱向支撐，該棒插入雙層的、玻璃器官浴的基座，該玻璃器官浴充滿了15ml Krebs-Henseleit(K-H)溶液(37℃)，其具有下面的組成(mM)118NaCl；4.7KCl；1.2KH2PO4；11.1葡萄糖；1.2MgSO4；2.8CaCl2；和25NaHCO3。在每個實驗期間對該溶液用5％CO2和95％O2的混合氣體連續(xù)充氣。上面的支撐物通過絲線環(huán)連接到TSD125力傳感器。氣管環(huán)的張力的改變通過MP150系統(tǒng)(BIOPAC Systems，Inc.)同步記錄并顯示在PC計算機上。
將用藥物處理的氣管用K-H溶液以10分鐘間隔洗滌3次。產(chǎn)生氨甲酰膽堿(10-2到10-5M)應(yīng)答曲線。僅當(dāng)對前面濃度的收縮穩(wěn)定時增加試劑的濃度。
在每個實驗結(jié)束時，所有氣管都在網(wǎng)墊上印跡并稱重。張力計算為毫克張力/毫克重量(mg/mg)并表達(dá)為不存在藥物時氣管的10-5M氨甲酰膽堿引起的力的個體百分比(％)。所有值都表達(dá)為平均值±SE。在該結(jié)果中使用斯氏成對t檢驗。認(rèn)為小于0.05的p值是顯著的。
如圖9中所示，氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的大鼠氣管收縮受到賴氨酸的抑制。
實施例10通過缺失CAT2基因減小氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的氣管收縮如實施例9中描述的處理CAT2基因敲除小鼠(CAT2-/-)。如圖11中所示，通過缺失CAT2基因也抑制了氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的氣管收縮，進(jìn)一步表明CAT2參與炎性疾病的病理生理。
實施例11ARG1mRNA表達(dá)的抑制與IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷的聯(lián)系將Balb/C處理的和未處理的小鼠對OVA敏化，用PBS、rIL-13或者sIL13Ra2.Fc處理，如圖1中描述。如實施例2中描述的分離總肺RNA并分析ARG1表達(dá)。結(jié)果在圖12中顯示。mRNA頻率表達(dá)為百萬分之幾。
盡管在附圖和前面的說明書中詳細(xì)闡明和描述了本發(fā)明，但是相應(yīng)地應(yīng)認(rèn)為所述附圖和本說明書僅是闡明性的并且不是限制性的，應(yīng)該理解僅展示和描述了優(yōu)選實施方案并且本發(fā)明范圍內(nèi)的所有改變和修飾都是受到保護(hù)的。
權(quán)利要求
1.一種方法，其包括對患有變應(yīng)性或者炎性疾病的哺乳動物施用治療有效量的試劑，其中所述試劑抑制受到所述疾病侵襲的組織中精氨酸代謝途徑的組分的活性或者表達(dá)，且所述組分不是氧化氮合酶(NOS)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是呼吸疾病。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述呼吸疾病是哮喘、慢性呼吸道重塑或者慢性阻塞性肺病(COPD)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述試劑能夠結(jié)合所述組分或者編碼所述組分的多核苷酸。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述組分是精氨酸酶。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述組分是陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述組分在所述途徑中精氨酸酶的下游。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述試劑通過RNA干涉或者反義機制抑制所述組分的表達(dá)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述試劑編碼或者含有能夠通過RNA干涉抑制所述組織中ARG1表達(dá)的siRNA。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述試劑編碼或者含有能夠通過RNA干涉抑制所述組織中CAT2表達(dá)的siRNA。
11.權(quán)利要求2的方法，其中所述試劑是α-二氟甲基鳥氨酸。
12.權(quán)利要求2的方法，其中所述試劑是賴氨酸或者陽離子多肽。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物是人。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述人患有哮喘或者COPD，并且所述組分是精氨酸酶或者陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，并且其中所述試劑能夠結(jié)合所述組分或者編碼所述組分的多核苷酸。
15.鑒定可以治療變應(yīng)性或者炎性疾病的試劑的方法，其包括將分子與受哮喘或者另一種變應(yīng)性或炎性疾病侵襲的組織接觸，其中所述分子能夠結(jié)合精氨酸代謝途徑的非-NOS組分或者編碼所述組分的多核苷酸；和確定所述分子是否能夠改善或者消除與所述哮喘或者疾病相關(guān)的綜合征或者表型。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述分子根據(jù)基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計或者根據(jù)篩選化合物文庫選擇或者產(chǎn)生。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述組分是精氨酸酶或者陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白。
18.一種方法，其包括檢測哺乳動物的生物樣品中至少一種基因的表達(dá)譜；和比較所述表達(dá)譜與所述至少一種基因的參考表達(dá)譜以確定所述哺乳動物是否患有或者有危險患有變應(yīng)性或者炎性疾病，其中所述一種基因編碼精氨酸酶代謝途徑的非-NOS組分。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病是哮喘。
20.藥物組合物，其含有藥學(xué)上可接受的載體和能夠抑制精氨酸酶代謝途徑的非-NOS組分的活性或者表達(dá)的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測或者治療哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性疾病的組合物和方法。一方面，本發(fā)明的方法包括抑制受哮喘或者其他變應(yīng)性或者炎性疾病侵襲的組織中精氨酸代謝途徑的組分的活性或者表達(dá)。在許多實施方案中，所抑制的組分是陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白、精氨酸酶或者精氨酸酶的下游組分。在許多其他實施方案中，所述組分的活性或者表達(dá)受到結(jié)合該組分的試劑的抑制。在許多其他實施方案中，所述組分的活性或者表達(dá)受到結(jié)合編碼所述組分的多核苷酸的試劑的抑制。
文檔編號C12Q1/68GK1798839SQ200480012037
公開日2006年7月5日 申請日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者M·R·鮑曼, D·埃利斯, M·T·福萊提, A·溫克勒, C·威廉斯, H·陳, W·劉 申請人:惠氏公司